[go: up one dir, main page]

CN106103713A - 用于经控制dna片段化的方法 - Google Patents

用于经控制dna片段化的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106103713A
CN106103713A CN201480077065.4A CN201480077065A CN106103713A CN 106103713 A CN106103713 A CN 106103713A CN 201480077065 A CN201480077065 A CN 201480077065A CN 106103713 A CN106103713 A CN 106103713A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
transposon ends
transposons
dna
transposase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201480077065.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106103713B (zh
Inventor
M·乌卡尼斯
A·卢比斯
R·塔莫谢维丘什
E·盖达毛斯卡斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Thermo Fisher Scientific Baltics UAB
Original Assignee
Thermo Fisher Scientific Baltics UAB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Thermo Fisher Scientific Baltics UAB filed Critical Thermo Fisher Scientific Baltics UAB
Publication of CN106103713A publication Critical patent/CN106103713A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106103713B publication Critical patent/CN106103713B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1082—Preparation or screening gene libraries by chromosomal integration of polynucleotide sequences, HR-, site-specific-recombination, transposons, viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C12Q1/6855—Ligating adaptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/50—Other enzymatic activities
    • C12Q2521/507—Recombinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2535/00—Reactions characterised by the assay type for determining the identity of a nucleotide base or a sequence of oligonucleotides
    • C12Q2535/122—Massive parallel sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/04—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis using dynamic combinatorial chemistry techniques
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B70/00—Tags or labels specially adapted for combinatorial chemistry or libraries, e.g. fluorescent tags or bar codes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B80/00—Linkers or spacers specially adapted for combinatorial chemistry or libraries, e.g. traceless linkers or safety-catch linkers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种用于核酸的经控制活体外片段化的组合物和方法。转座酶与经修饰转座子末端形成催化活性复合物，所述经修饰转座子末端在其末端内含有序列简并、脱嘌呤/脱嘧啶位点、切口或核苷酸缺口，以在控制方法中片段化或剪切标靶核酸样品。此方法产生所需平均核酸片段尺寸。本发明组合物和方法可以应用于产生含有缩短转座子末端序列的DNA片段以促进随后反应、以便产生不对称带尾DNA片段等。

Description

用于经控制DNA片段化的方法
本申请要求2014年2月3日提交的美国临时申请第61/934,879号的优先权。
在本申请中，引用各种公开、专利和/或专利申请。这些公开、专利和/或专利申请的公开内容在此以全文引用的方式并入本申请中以便更充分地描述本发明所涉及的目前最先进的水平。
技术领域
本发明涉及核酸的控制片段化的领域。
发明内容
在一些实施例中，本发明大体上涉及包含转座体(transpososome)复合物的组合物以及相关方法、系统、试剂盒以及设备。
在一些实施例中，转座体复合物包含：(i)多种转座酶，(ii)含有第一转座子末端序列的多核苷酸，以及(iii)含有第二转座子末端序列的多核苷酸。
在一些实施例中，第一转座子末端序列能够结合到多种转座酶。
在一些实施例中，第二转座子末端序列能够结合到多种转座酶。
在一些实施例中，第一转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第一或第二转座子末端序列缺乏修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列具有相同或不同序列。
在一些实施例中，转座体复合物包含：(i)多种转座酶；(ii)含有第一转座子末端序列的多核苷酸，其中所述第一转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点；以及(iii)含有第二转座子末端序列的多核苷酸，其中所述第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。在一些实施例中，第一转座子末端序列能够结合到多种转座酶。在一些实施例中，第二转座子末端序列能够结合到多种转座酶。任选地，转座体复合物包含两种、三种、四种或更多种转座酶。
在一些实施例中，转座体复合物含于单一反应混合物中。举例来说，单一反应混合物可以含于单个反应容器中或单个孔中。
在一些实施例中，可以通过进行本文中描述的任何制备转座子复合物的方法或任何活体外使DNA片段化的方法产生转座体复合物。
在一些实施例中，本发明大体上涉及包含转座体/标靶核酸复合物的组合物，以及相关方法、系统、试剂盒以及设备。
在一些实施例中，转座体/标靶核酸复合物包含：(i)多种转座酶；(ii)含有第一转座子末端序列的多核苷酸；(iii)含有第二转座子末端序列的多核苷酸；以及(iv)标靶核酸分子。在一些实施例中，标靶核酸分子包含标靶DNA分子。
在一些实施例中，第一转座子末端序列能够结合到多种转座酶。
在一些实施例中，第二转座子末端序列能够结合到多种转座酶。
在一些实施例中，第一转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第一或第二转座子末端序列缺乏修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列具有相同或不同序列。
在一些实施例中，转座体/标靶核酸复合物包含：(i)多种转座酶；(ii)含有第一转座子末端序列的多核苷酸，其中所述第一转座子末端序列能够结合到多种转座酶并且其中所述第一转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点；(iii)含有第二转座子末端序列的多核苷酸，其中所述第二转座子末端序列能够结合到多种转座酶并且其中所述第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点；以及(iv)标靶核酸分子。在一些实施例中，标靶核酸分子包含标靶DNA分子。任选地，转座体复合物包含两种、三种、四种或更多种转座酶。
在一些实施例中，转座体/标靶DNA复合物可以通过进行本文中描述的任何制备转座体/标靶DNA复合物的方法或任何活体外使DNA片段化的方法来产生。
在一些实施例中，本发明大体上涉及包含核酸片段化反应混合物的组合物，以及相关方法、系统、试剂盒以及设备。
在一些实施例中，核酸片段化反应混合物包含：(i)多种转座酶；(ii)含有第一转座子末端序列的多核苷酸；(iii)含有第二转座子末端序列的多核苷酸；(iv)标靶核酸分子；以及(v)活化阳离子。
在一些实施例中，第一转座子末端序列能够结合到多种转座酶。
在一些实施例中，第二转座子末端序列能够结合到多种转座酶。
在一些实施例中，第一转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第一或第二转座子末端序列缺乏修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列具有相同或不同序列。
在一些实施例中，活化剂包括镁和/或锰的一种或任何组合。
在一些实施例中，核酸片段化反应混合物包含：(i)多种转座酶；(ii)含有第一转座子末端序列的多核苷酸，其中所述第一转座子末端序列能够结合到多种转座酶并且其中所述第一转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点；(iii)含有第二转座子末端序列的多核苷酸，其中所述第二转座子末端序列能够结合到多种转座酶并且其中所述第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点；(iv)标靶核酸分子；以及(v)活化阳离子(例如镁或锰)。在一些实施例中，标靶核酸分子包含标靶DNA分子。
在一些实施例中，核酸片段化反应混合物进一步包含缓冲剂(例如Tris-HCl)、碱金属(例如NaCl和/或KCl)、清洁剂(例如TritonX-100、TritonX-114、NP-40、Brij、Tween-20、SDS或CHAPS)以及活化阳离子(例如镁或锰)。任选地，核酸片段化反应混合物缺乏任何活化阳离子(例如镁或锰)。举例来说，活化阳离子包括为转座酶所需用于催化转座反应的任何阳离子。在一些实施例中，核酸片段化反应混合物缺乏活化阳离子(或含有极低含量的活化阳离子)。
在一些实施例中，本发明大体上涉及包含片段化核酸分子的组合物，以及相关方法、系统、试剂盒以及设备。
在一些实施例中，片段化核酸分子包含：(i)接合到第一转座子末端序列的DNA分子的第一端，和(ii)接合到第二转座子末端序列的DNA分子的第二端。
在一些实施例中，第一转座子末端序列包括至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第二转座子末端序列包括至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第一或第二转座子末端序列缺乏修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列具有相同或不同序列。
在一些实施例中，片段化DNA分子或多个片段化DNA分子可以通过进行本文中描述的任何制备多种转座子复合物的方法或任何活体外使DNA片段化的方法产生。
在一些实施例中，多个片段化DNA分子的尺寸范围是约100-2000bp，或约100-250bp，或约250-500bp，或约500-750bp，或约750-1000bp，或约1000-1250bp，或约1250-1500bp，或约1500-1750bp，或约1750-2000bp。
在一些实施例中，本发明大体上涉及组合物，以及相关方法、系统、试剂盒以及设备，其包含：含有核酸扩增反应混合物的单一反应混合物。
在一些实施例中，扩增步骤通过在用于进行核酸片段化步骤而无任何插入步骤来去除片段化反应混合物的同一反应混合物中，和同一反应容器中进行扩增反应来流水线化。还可以使用用于片段化标靶DNA分子，使用本文中描述的转座体复合物中的任一种或转座体/标靶核酸复合物中的任一种的反应混合物来扩增片段化DNA分子。任选地，核酸片段化和扩增步骤在不同反应混合物中，在相同或不同反应容器中进行。
在一些实施例中，含有核酸扩增反应混合物的单一反应混合物包含：核酸片段化反应混合物、至少一个片段化DNA分子以及至少一种用于扩增核酸的组分。
举例来说，用于扩增核酸的组分包括以下中的任何一种或任何组合：引物、聚合酶和/或核苷酸。
在一些实施例中，含有核酸扩增反应混合物的单一反应混合物包含：(i)核酸片段化反应混合物；(ii)至少一个片段化DNA分子；(iii)一种或多种引物，所述引物和至少一部分所述片段化DNA分子或与所述片段化DNA分子互补的序列杂交；(iv)一种或多种聚合酶；以及(v)一种或多种核苷酸。
举例来说，核酸片段化反应混合物包括以下中的任何一种或任何组合：缓冲剂(例如Tris-HCl)、盐(例如NaCl和/或KCl)、清洁剂(例如TritonX-100)和/或活化阳离子(例如镁或锰)。
在一些实施例中，片段化DNA分子的至少一端接合到具有至少一种修饰的第一转座子末端序列。任选地，至少一种修饰包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，片段化DNA分子的至少一端接合到具有至少一种修饰的第二转座子末端序列。任选地，至少一种修饰包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，片段化DNA分子在第一端接合到第一转座子末端序列，并且在第二端接合到第二转座子末端序列，并且第一和第二转座子末端序列具有相同或不同序列。
在一些实施例中，本发明大体上涉及在一种或多种稳定剂存在下包含转座体复合物的组合物，以及相关方法、系统、试剂盒以及设备。
在一些实施例中，转座体复合物包含：(i)多种转座酶；(ii)含有第一转座子末端序列的多核苷酸；(iii)含有第二转座子末端序列的多核苷酸；以及(iv)至少一种稳定剂。
在一些实施例中，第一转座子末端序列能够结合到多种转座酶。
在一些实施例中，第二转座子末端序列能够结合到多种转座酶。
在一些实施例中，第一转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第一或第二转座子末端序列缺乏修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列具有相同或不同序列。
在一些实施例中，稳定剂包括稳定蛋白质或酶的结构、构形和/或活性的任何化合物。在一些实施例中，稳定剂包括增加蛋白质或酶于溶液中的溶解性的任何化合物。在一些实施例中，稳定剂包括减少蛋白质聚集的任何化合物。
在一些实施例中，在形成转座体复合物之前、期间或之后添加一种或多种稳定剂。在一些实施例中，稳定剂包括当添加到转座体复合物中时，帮助保留一些或所有转座体介导的活性的任何化合物。举例来说，一种或多种稳定剂的存在可以保留约5-20％，或约20-40％，或约40-60％，或约60-80％，或约80-95％，或约95-100％活性。任选地，可以通过添加一种或多种稳定剂来延伸转座体复合物的存放期。任选地，在至少一种稳定剂存在下，在装运期间转座体复合物可以保留一些或所有酶活性。在一些实施例中，在至少一种稳定剂存在下，转座体复合物可以在约-20℃下储存或装运。
在一些实施例中，转座体复合物包含：(i)多种转座酶；(ii)含有第一转座子末端序列的多核苷酸，其中所述第一转座子末端序列能够结合到多种转座酶并且其中所述第一转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点；(iii)含有第二转座子末端序列的多核苷酸，其中所述第二转座子末端序列能够结合到多种转座酶并且其中所述第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点；以及(iv)至少一种稳定剂。
举例来说，稳定剂包括任何氨基酸，包括带电氨基酸。任选地，稳定剂包括精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸中的任何一种或任何组合(Golovanvo等人，2004《美国化学学会会志(Journal of Am.Chem.Soc.)》126(29)：8933-8939，Baynes，Wang和Trout 2005《生物化学(Biochemistry)》44(12)：4919-4925，Shukla和Trout 2011《物理化学杂志(Journal of Phys.Chem)》B 115(41)：11831)。在一些实施例中，稳定剂包括精氨酸和谷氨酸的混合物。在一些实施例中，稳定剂包含多元醇。在一些实施例中，稳定剂包括二醇、丙二醇和/或甘油中的任何一种或任何组合。在一些实施例中，稳定剂包含多糖。在一些实施例中，稳定剂包含蔗糖、海藻糖、多元醇、葡萄糖(例如L-或D-葡萄糖)和/或半乳糖(例如D-半乳糖)中的任何一种或任何组合。在一些实施例中，转座体复合物包括BSA。
在一些实施例中，本发明大体上涉及试剂盒，以及相关组合物、方法、系统以及设备，其包含用于组装转座体复合物的组分，所述转座体复合物包括：(i)多种转座酶；(ii)含有第一转座子末端序列的多核苷酸；以及(iii)含有第二转座子末端序列的多核苷酸。
在一些实施例中，本发明大体上涉及包含预组装转座体复合物的试剂盒，以及相关组合物、方法、系统以及设备，所述复合物包括：(i)多种转座酶；(ii)多种含有第一转座子末端序列的多核苷酸；以及(iii)多种含有第二转座子末端序列的多核苷酸。任选地，预组装转座体复合物包含两种、三种、四种或更多种转座酶。
在一些实施例中，第一转座子末端序列能够结合到多种转座酶。
在一些实施例中，第二转座子末端序列能够结合到多种转座酶。
在一些实施例中，第一转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，至少一个第一转座子末端序列缺乏修饰(例如损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点)。
在一些实施例中，多个第一转座子末端序列包括多种具有第一链(例如攻击链(attacking strand))和第二链(例如非攻击链)的双链多核苷酸。
在一些实施例中，第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，至少一个第二转座子末端序列缺乏修饰(例如损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点)。
在一些实施例中，多个第二转座子末端序列包括多种具有第一链(例如攻击链)和第二链(例如非攻击链)的双链多核苷酸。
在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列具有相同或不同序列。
在一些实施例中，试剂盒，以及相关组合物、方法、系统以及设备进一步包含一种或多种活化阳离子。举例来说，活化阳离子包括镁和锰。
在一些实施例中，试剂盒，以及相关组合物、方法、系统以及设备进一步包含一种或多种稳定剂。举例来说，稳定剂包括稳定蛋白质或酶的结构、构形和/或活性的任何化合物。在一些实施例中，稳定剂包括增加蛋白质或酶于溶液中的溶解性的任何化合物。在一些实施例中，稳定剂包括减少蛋白质聚集的任何化合物。举例来说，稳定剂包括任何氨基酸，包括带电氨基酸。任选地，稳定剂包括精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸中的任何一种或任何组合(Golovanvo等人，2004《美国化学学会会志》126(29)：8933-8939，Baynes，Wang和Trout 2005《生物化学》44(12)：4919-4925，Shukla和Trout 2011《物理化学杂志》B115(41)：11831)。在一些实施例中，稳定剂包括精氨酸和谷氨酸的混合物。在一些实施例中，稳定剂包含多元醇。在一些实施例中，稳定剂包括二醇、丙二醇和/或甘油中的任何一种或任何组合。在一些实施例中，稳定剂包含多糖。在一些实施例中，稳定剂包含蔗糖、海藻糖、多元醇、葡萄糖(例如L-或D-葡萄糖)和/或半乳糖(例如D-半乳糖)中的任何一种或任何组合。在一些实施例中，试剂盒，以及相关组合物、方法、系统以及设备进一步包含BSA。
在一些实施例中，试剂盒，以及相关组合物、方法、系统以及设备进一步包含一个或多个容器，其用于容纳用于组装转座体复合物的组分或预组装转座体复合物。
在一些实施例中，试剂盒，以及相关组合物、方法、系统以及设备还可以包括缓冲剂和试剂。举例来说，缓冲剂可以包括Tris、麦黄酮(Tricine)、FIEPES或MOPS，或螯合剂，例如EDTA或EGTA。缓冲剂或试剂可以包括单价离子，例如KCl、K-乙酸盐、NFi4-乙酸盐、K-谷氨酸盐、NH4Cl或硫酸铵。在又另一实例中，试剂可以包括二价离子，例如Ca2+、Mg2+、Mn2+或CaCl2、MgCl2、MnCl2或Mg-乙酸盐等。
在一些实施例中，试剂盒，以及相关组合物、方法、系统以及设备还可以包括用于进行经控制核酸片段化反应的说明书。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于制备多种转座体复合物的方法，以及相关组合物、系统、试剂盒以及设备。
在一些实施例中，制备多种转座体复合物的方法包含使多种转座酶与多种多核苷酸接触。
在一些实施例中，在单一反应混合物中使多种转座酶与多种多核苷酸接触。举例来说，单一反应混合物可以含于单个反应容器或单个孔中。
在一些实施例中，制备多种转座体复合物的方法包含在单一反应混合物中使多种转座酶与多种多核苷酸接触。
在一些实施例中，多种多核苷酸含有多个第一转座子末端序列、多个第二转座子末端序列或第一和第二转座子末端序列的混合物。
在一些实施例中，第一转座子末端序列能够识别并且结合转座酶。
在一些实施例中，多个第一转座子末端序列包括至少一种修饰。任选地，至少一种修饰包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，至少一个第一转座子末端序列缺乏修饰(例如损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点)。
在一些实施例中，多个第一转座子末端序列包括多种具有第一链(例如攻击链)和第二链(例如非攻击链)的双链多核苷酸。
在一些实施例中，第二转座子末端序列能够识别并且结合转座酶。
在一些实施例中，多个第二转座子末端序列包括至少一种修饰。任选地，至少一种修饰包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，至少一个第二转座子末端序列缺乏修饰(例如损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点)。
在一些实施例中，多个第二转座子末端序列包括多种具有第一链(例如攻击链)和第二链(例如非攻击链)的双链多核苷酸。
在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列具有相同或不同序列。
在一些实施例中，在形成转座体复合物之前、期间或之后添加一种或多种稳定剂。举例来说，稳定剂包括任何氨基酸，包括带电氨基酸。任选地，稳定剂包括精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸中的任何一种或任何组合(Golovanvo等人，2004《美国化学学会会志》126(29)：8933-8939，Baynes，Wang和Trout 2005《生物化学》44(12)：4919-4925，Shukla和Trout 2011《物理化学杂志》B 115(41)：11831)。在一些实施例中，稳定剂包括精氨酸和谷氨酸的混合物。在一些实施例中，稳定剂包含多元醇。在一些实施例中，稳定剂包括二醇、丙二醇和/或甘油中的任何一种或任何组合。在一些实施例中，稳定剂包含多糖。在一些实施例中，稳定剂包含蔗糖、海藻糖、多元醇、葡萄糖(例如L-或D-葡萄糖)和/或半乳糖(例如D-半乳糖)中的任何一种或任何组合。在一些实施例中，转座体复合物包括BSA。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于制备多种转座体复合物的方法，以及相关组合物、系统、试剂盒以及设备，其包含：(a)在单一反应混合物中使以下接触：(i)多种转座酶，(ii)多种含有第一转座子末端序列的多核苷酸，其中所述第一转座子末端序列能够结合到来自所述多种转座酶的转座酶；以及(iii)多种含有第二转座子末端序列的多核苷酸，其中所述第二转座子末端序列能够结合到来自所述多种转座酶的转座酶；和(b)形成至少一种具有转座酶、第一转座子末端序列以及第二转座子末端序列的转座体复合物，其中所述第一转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如至少一个切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点，并且其中所述第二转座子末端序列任选地含有至少一种修饰，包括损伤，例如至少一个切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。任选地，转座体复合物可以含有多种转座酶，包括两种、三种、四种或更多种转座酶。任选地，在形成转座体复合物之后添加一种或多种稳定剂。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于片段化核酸的方法，以及相关组合物、系统、试剂盒以及设备。
在一些实施例中，片段化核酸的方法包含使多种转座体复合物与多种标靶多核苷酸接触。
在一些实施例中，在活体外反应中使多种转座体复合物与多种标靶多核苷酸接触。
在一些实施例中，在单一反应混合物中使多种转座体复合物与多种标靶多核苷酸接触。举例来说，单一反应混合物可以含于单个反应容器或单个孔中。
在一些实施例中，片段化核酸的活体外方法包含在单一反应混合物中使多种转座体复合物与多种标靶多核苷酸接触。
在一些实施例中，多种转座体复合物中的至少一种转座体复合物包含第一转座子末端序列和第二转座子末端序列。
在一些实施例中，多种转座体复合物中的至少一种转座体复合物包含具有至少一种修饰的第一转座子末端序列。任选地，至少一种修饰包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，多种转座体复合物中的至少一种转座体复合物包含具有至少一种修饰的第二转座子末端序列。任选地，至少一种修饰包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，多种转座体复合物中的至少一种转座体复合物包含缺乏修饰(例如损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点)的第一或第二转座子末端序列。
在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列具有相同或不同序列。
在一些实施例中，片段化核酸的活体外方法包含将第一或第二转座子末端序列转座到标靶DNA分子中并且将所述标靶DNA分子片段化，并且将DNA片段的第一端接合到第一转座子末端序列或第二转座子末端序列。
在一些实施例中，片段化核酸的活体外方法包含将第一和第二转座子末端序列转座到标靶DNA分子中并且将所述标靶DNA分子片段化，并且将DNA片段的第一端接合到第一转座子末端序列并且任选地将DNA片段的第二端接合到第二转座子末端序列。
在一些实施例中，片段化DNA分子的至少一端接合到具有至少一种修饰的第一转座子末端序列。任选地，至少一种修饰包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，片段化DNA分子的至少一端接合到具有至少一种修饰的第二转座子末端序列。任选地，至少一种修饰包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，片段化DNA分子在第一端接合到第一转座子末端序列，并且在第二端接合到第二转座子末端序列，并且第一和第二转座子末端序列具有相同或不同序列。
在一些实施例中，在形成转座体复合物之前、期间或之后添加一种或多种稳定剂。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于活体外使DNA片段化的方法，以及相关组合物、系统、试剂盒以及设备，其包含：(a)通过在单一反应混合物中使以下接触来形成多种转座体复合物：(i)多种转座酶；(ii)多种含有第一转座子末端序列的多核苷酸，其中所述第一转座子末端序列能够结合到来自所述多种转座酶的转座酶；以及(iii)多种含有第二转座子末端序列的多核苷酸，其中所述第二转座子末端序列能够结合到来自所述多种转座酶的转座酶，其中所述第一转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如至少一个切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点，并且其中所述第二转座子末端序列任选地含有至少一种修饰，包括损伤，例如至少一个切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点；(b)使所述多种转座体复合物与多种标靶核酸(例如标靶DNA)接触；以及(c)将所述第一和所述第二转座子末端序列转座到所述标靶DNA分子中并且将所述标靶DNA分子片段化，并且将DNA片段的第一端接合到所述第一转座子末端序列并且任选地将所述DNA片段的第二端接合到所述第二转座子末端序列。任选地，转座体复合物可以含有多种转座酶，包括两种、三种、四种或更多种转座酶。任选地，在形成转座体复合物之后(例如在步骤(b)之前)添加一种或多种稳定剂。任选地，第一和第二转座子末端序列具有相同或不同序列。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于制备多种转座体复合物或用于活体外使DNA片段化的方法，以及相关组合物、系统、试剂盒以及设备，其进一步包含：产生至少一个片段化DNA分子，这是通过将第一和第二转座子末端序列转座到标靶DNA分子中并且将所述标靶DNA分子片段化，并且将DNA片段的第一端接合到第一转座子末端序列并且任选地将DNA片段的第二端接合到第二转座子末端序列。任选地，接合到标靶DNA分子的末端的第一和第二转座子末端序列具有相同或不同序列。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于制备多种转座体复合物或用于活体外使DNA片段化的方法，以及相关组合物、系统、试剂盒以及设备，其进一步包含：通过使多种转座体复合物与多个标靶核酸分子接触来形成至少一种转座体/标靶DNA复合物。任选地，多个标靶核酸分子包含DNA分子。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于制备多种转座体复合物或用于活体外使DNA片段化的方法，以及相关组合物、系统、试剂盒以及设备，其进一步包含：产生至少一个片段化DNA分子，这是通过将第一和第二转座子末端序列转座到标靶DNA分子中并且将所述标靶DNA分子片段化，并且将DNA片段的第一端接合到第一转座子末端序列并且任选地将DNA片段的第二端接合到第二转座子末端序列。
任选地，至少一个片段化DNA分子包括具有至少一种修饰的第一转座子末端序列，所述修饰包括损伤，例如至少一个切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
任选地，至少一个片段化DNA分子包括具有至少一种修饰的第二转座子末端序列，所述修饰包括损伤，例如至少一个切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
任选地，第一和第二转座子末端序列具有相同或不同序列。
在一些实施例中，改进的工作流程可以包括减少或消除用于去除转座酶的可能防止随后步骤的单独步骤。假设转座酶保持结合于DNA片段(其在末端接合到转座子末端序列)，并且抑制随后PCR反应。用本文中描述的转座子末端序列进行转座子介导的DNA片段化反应的一个优势是第一和/或第二转座子末端序列具有至少一个切口或缺口，其可以减少转座子末端序列的第一和第二链之间的氢键数目，这可以使得转座子末端序列的单链末端部分离解而不需要单独去除或提取步骤。转座子末端序列的末端部分不存在可能引起在转座子介导的片段化步骤之后，转座酶从转座子末端序列离解。在转座子末端序列的末端部分和转座酶从片段化DNA解离后，可以在同一反应混合物中(并且在同一反应容器中)进行PCR反应。因为单独化学提取步骤不是必需的，并且片段化DNA无需转移到单独反应容器中，工作流程可以流水线化并且自动化。
在一些实施例中，制备多种转座体复合物的方法或活体外使DNA片段化的方法进一步包含：通过在第一切口的位置截断攻击链的末端部分(即崩解)来减少接合到标靶DNA的第一转座子末端序列的长度。
在一些实施例中，制备多种转座体复合物的方法或活体外使DNA片段化的方法进一步包含：通过在第二切口的位置截断非攻击链的末端部分(即崩解)来减少接合到标靶DNA的第一转座子末端序列的长度。
在一些实施例中，制备多种转座体复合物的方法或活体外使DNA片段化的方法进一步包含：通过在第一切口的位置截断攻击链的末端部分(即崩解)来减少接合到标靶DNA的第二转座子末端序列的长度。
在一些实施例中，制备多种转座体复合物的方法或活体外使DNA片段化的方法进一步包含：通过在第二切口的位置截断非攻击链的末端部分(即崩解)来减少接合到标靶DNA的第二转座子末端序列的长度。
在一些实施例中，可以手动或通过自动进行以下步骤中的任何一个或任何组合，包括：制备多种转座体复合物，形成多种转座体/标靶DNA复合物，产生至少一个片段化DNA分子，扩增所述片段化DNA分子(例如经由PCR)，使扩增的标靶DNA变性，将多个单链片段化DNA固定到载体，测序，和/或片段化标靶DNA。举例来说，任何用于进行这些步骤中的任一个的试剂可以在一个或多个反应容器中共同反应(接触)。试剂的非限制性实例包括：转座酶、第一转座子末端序列、第二转座子末端序列、标靶DNA分子、PCR试剂(例如扩增聚合酶、引物和/或核苷酸)、测序试剂(例如测序聚合酶、引物和/或核苷酸)、活化剂(例如镁和/或锰)和/或稳定剂。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于制备多种转座体复合物或用于活体外使DNA片段化的方法，以及相关组合物、系统、试剂盒以及设备，其进一步包含：控制片段化DNA分子的平均长度，其可以通过以下中的任何一个或任何组合来实现：(i)改变与多个标靶DNA接触的转座体复合物的量，(ii)改变与转座体复合物接触的标靶DNA的量，(iii)改变转座反应的时间量，和/或(iv)改变转座子末端序列上切口或缺口的位置。
在一些实施例中，制备多种转座体复合物的方法或活体外使DNA片段化的方法进一步包含：扩增至少一个片段化DNA分子以产生经扩增的片段化DNA分子。
在一些实施例中，扩增步骤可以通过以下来进行：聚合酶链反应(PCR)(均授予Mullis的美国专利4,683,195和4,683,202)；连接酶链反应(LCR)(Barany 1991《美国国家科学院院刊(Proceedings National Academy of Science USA)》88：189-193，Barnes1994《美国国家科学院院刊》91：2216-2220)；或等温自动维持序列反应(Kwoh 1989《美国国家科学院院刊》86：1173-1177，WO 1988/10315，以及美国专利5,409,818、5,399,491和5,194,370)；或重组酶聚合酶扩增(RPA)(Zarling的美国专利第5,223,414号，均属于Sena的美国专利第5,273,881号和第5,670,316号，以及美国专利第7,270,981号、第7,399,590号、第7,435,561号、第7,666,598号、第7,763,427号、第8,017,339号、第8,030,000号、第8,062,850号和第8,071,308号)。
在一些实施例中，扩增至少一个DNA分子包含：使至少一个片段化DNA分子与以下接触：(i)与至少一部分片段化DNA分子或与片段化DNA分子互补的序列杂交的一种或多种引物；(ii)一种或多种聚合酶；以及(iii)一种或多种核苷酸。任选地，扩增可以在等温或热循环条件下进行。任选地，一种或多种聚合酶包含热稳定或热不稳定聚合酶。任选地，可以在牛血清白蛋白(BSA)存在下进行扩增。
在一些实施例中，扩增步骤在用于进行核酸片段化步骤的同一反应混合物中，和同一反应容器中进行。还可以使用用于片段化DNA分子，使用本文中描述的转座体复合物中的任一种或转座体/标靶核酸复合物中的任一种的反应混合物来扩增片段化DNA分子。举例来说，转座体复合物可以在含有缓冲剂(例如Tris-HCl)、盐(例如NaCl和/或KCl)、清洁剂(例如TritonX-100)以及活化阳离子(例如镁或锰)的反应混合物中与标靶DNA分子接触以片段化标靶DNA分子。任选地，可以单独地添加活化剂以起始扩增反应。任选地，使用同一反应容器将用于扩增核酸的组分(例如引物、聚合酶以及核苷酸)添加到片段化反应混合物中以扩增片段化DNA分子。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于制备多种转座体复合物或用于活体外使DNA片段化的方法，以及相关组合物、系统、试剂盒以及设备，其进一步包含：使片段化DNA分子或扩增标靶DNA变性以产生多种单链片段化DNA。任选地，可以使用化学物质或热使片段化DNA分子变性。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于制备多种转座体复合物或活体外使DNA片段化的方法，以及相关组合物、系统、试剂盒以及设备，其进一步包含：将多个片段化DNA(单链或双链)附接到载体。在一些实施例中，附接到载体的多个片段化DNA包括附接到载体的表面或载体的内部支架。在一些实施例中，多个片段化DNA是与附接到载体的捕获寡核苷酸杂交。在一些实施例中，多个片段化DNA通过化合物在无与捕获寡核苷酸的杂交的情况下附接到载体。在一些实施例中，可以使用任何可以用于将核酸附接到载体的化合物来将片段化DNA分子或捕获寡核苷酸附接到载体。举例来说，载体可以涂布有丙烯酰胺、羧酸或胺化合物以便附接核酸(例如捕获寡核苷酸或片段化DNA)。在另一个实例中，氨基修饰的核酸可以附接到涂布有羧酸的载体。在一些实施例中，氨基修饰的核酸可以与乙基(二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)或EDAC反应以便附接到羧酸涂布的载体(有或无N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))。在又另一个实例中，核酸可以固定到载体上的丙烯酰胺化合物涂层。在一些实施例中，载体可以涂布有抗生物素蛋白样化合物(例如抗生蛋白链菌素)以便结合生物素标记的核酸。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于制备多种转座体复合物或活体外使DNA片段化的方法，以及相关组合物、系统、试剂盒以及设备，其进一步包含：用大规模平行测序反应将多个单链片段化DNA测序。
在一些实施例中，大规模平行测序反应包含并入核苷酸(例如核酸序列，通过合成反应)或连接类反应(例如SOLiD测序，应用生物系统公司(Applied Biosystems)/生命技术公司(Life Technologies))。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于制备多种转座体复合物或活体外使DNA片段化的方法，以及相关组合物、系统、试剂盒以及设备，其中大规模平行测序反应包含提供具有多个反应位点(例如阵列)的表面。任选地，多个反应位点以经组织或随机模式布置。
在一些实施例中，至少一个反应位点可操作地连接于一个或多个传感器。
在一些实施例中，一个或多个传感器检测核苷酸并入反应的至少一种副产物或裂解产物。
在一些实施例中，核苷酸并入反应的副产物或裂解产物包括离子(例如氢离子)、质子、磷酸酯基，包括焦磷酸酯基。
在一些实施例中，一个或多个传感器检测离子、氢离子、质子、磷酸酯基(包括焦磷酸酯基)中的变化。
在一些实施例中，一个或多个传感器包含场效应晶体管(FET)。
任选地，传感器包含离子敏感场效应晶体管(ISFET)。
在一些实施例中，可以通过进行本文中描述的任何方法和任何转座体复合物产生多个片段化DNA分子。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于制备多种转座体复合物或活体外使DNA片段化的方法，以及相关组合物、系统、试剂盒以及设备，其中多个第一转座子末端序列包括多种具有第一和第二链的双链多核苷酸。
在一些实施例中，第一转座子末端序列包括含有至少一种修饰(例如至少一种修饰包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点)的第一链。
在一些实施例中，第一转座子末端序列包括任选地含有至少一种修饰(例如至少一种修饰包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点)的第二链。
在一些实施例中，第一转座子末端序列包括双链多核苷酸，其含有具有至少一种修饰的第一链和含有至少一种修饰的第二链，其中第一链上的修饰位于与第二链上的修饰不同的位置。任选地，修饰包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第一转座子末端序列包括含有第一和第二链的双链多核苷酸，其中至少一个第一链或至少一个第二链缺乏修饰。
在一些实施例中，第一转座子末端序列包括鉴测序列(例如条形码序列)、引物延伸序列或与引物延伸序列互补的序列。任选地，引物延伸序列包括扩增引物序列或测序引物序列。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于制备多种转座体复合物或活体外使DNA片段化的方法，以及相关组合物、系统、试剂盒以及设备，其中多个第二转座子末端序列包括多种具有第一和第二链的双链多核苷酸。
在一些实施例中，第二转座子末端序列包括含有至少一种修饰(例如至少一种修饰包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点)的第一链。
在一些实施例中，第二转座子末端序列包括任选地含有至少一种修饰(例如至少一种修饰包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点)的第二链。
在一些实施例中，第二转座子末端序列包括双链多核苷酸，其含有具有至少一种修饰的第一链和含有至少一种修饰的第二链，其中第一链上的修饰位于与第二链上的修饰不同的位置。任选地，修饰包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第二转座子末端序列包括含有第一和第二链的双链多核苷酸，其中至少一个第一链或至少一个第二链缺乏修饰。
在一些实施例中，第二转座子末端序列包括鉴测序列(例如条形码序列)、引物延伸序列或与引物延伸序列互补的序列。任选地，引物延伸序列包括扩增引物序列或测序引物序列。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于制备多种转座体复合物或活体外使DNA片段化的方法，以及相关组合物、系统、试剂盒以及设备，其中第一和第二转座子末端序列具有相同或不同序列。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于制备多种转座体复合物或活体外使DNA片段化的方法，以及相关组合物、系统、试剂盒以及设备，其中第一转座子末端序列包含具有第一攻击链和第一非攻击链的双链多核苷酸。
在一些实施例中，第一攻击链包括至少一种修饰，包括损伤，例如至少一个切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第一非攻击链包括至少一种修饰，包括损伤，例如至少一个切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
任选地，第一转座子末端序列包括第一攻击链和第一非攻击链，其中第一攻击链和/或第一非攻击链包括至少一种修饰，包括损伤，例如至少一个切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第一转座子末端序列包括第一攻击链和第一非攻击链，其中第一攻击链或第一非攻击链缺乏修饰。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于制备多种转座体复合物，或活体外使DNA片段化的方法，以及相关组合物、系统、试剂盒以及设备，其中第二转座子末端序列包含具有第二攻击链和第二非攻击链的双链多核苷酸。
在一些实施例中，第二攻击链包括至少一种修饰，包括损伤，例如至少一个切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第二非攻击链包括至少一种修饰，包括损伤，例如至少一个切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
任选地，第二转座子末端序列包括第二攻击链和第二非攻击链，其中第二攻击链和/或第二非攻击链包括至少一种修饰，包括损伤，例如至少一个切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。
在一些实施例中，第二转座子末端序列包括第一攻击链和第一非攻击链，其中第一攻击链或第一非攻击链缺乏修饰。
任选地，第一和/或第二转座子末端序列包括具有切口的攻击链，所述切口位于任何位置，包括在始于攻击链的3′端的第六、第八、第十、第十四、第十六、第十八、第十九或第二十七核苷酸之后(参见图8)。
任选地，第一和/或第二转座子末端序列包括具有切口的非攻击链，所述切口位于任何位置，包括在始于攻击链的5′端的第十一、第十三、第二十五或第二十七核苷酸之后(参见图8)。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于制备多种转座体复合物，或活体外使DNA片段化的方法，以及相关组合物、系统、试剂盒以及设备，其中转座体复合物包括转座酶，其包含任何转座酶，包括DDE转座酶，例如来自IS、Tn3、Tn5、Tn7以及Tn10的原核转座酶；来自噬菌体Mu的细菌噬菌体转座酶(Nagy和Chandler 2004，由Craig等人2002综述；美国专利第6,593,113号)以及真核“剪贴”转座酶(Jurka等人2005；Yuan和Wessler 2011)。在一些实施例中，转座酶包括逆转录病毒转座酶，例如HIV(Dyda等人1994；Haren等人1999；Rice等人1996；Rice和Baker 2001)。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于制备多种转座体复合物，或活体外使DNA片段化的方法，以及相关组合物、系统、试剂盒以及设备，其中转座体复合物包括第一和/或第二转座子末端序列，其包含来自以下的任何转座子序列(例如转座子末端序列)：原核插入序列，包括(IS)、Tn3、Tn5、Tn7以及Tn10；包括细菌噬菌体的噬菌体Mu(Nagy和Chandler2004，由Craig等人2002综述)；以及真核“剪贴”转座子(Jurka等人2005；Yuan和Wessler2011)。在一些实施例中，第一和/或第二转座子末端序列包括来自逆转录病毒(例如HIV)的任何转座子序列(Dyda等人1994；Haren等人1999；Rice等人1996；Rice和Baker 2001)。
在一些实施例中，第一转座子末端序列包含MuA转座子末端序列、Mosl转座子末端序列、哈氏弧菌(Vibrio harvey)转座子末端序列或Tn5转座子末端序列。
在一些实施例中，第二转座子末端序列包含MuA转座子末端序列、Mosl转座子末端序列、哈氏弧菌转座子末端序列或Tn5转座子末端序列。
在一些实施例中，转座酶包含MuA、Mosl、哈氏弧菌、IS、Tn3、Tn5、Tn7或Tn10转座酶。
在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列包含MuA转座子末端序列并且转座酶包含MuA转座酶。
在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列包含Mosl转座子末端序列并且转座酶包含Mosl转座酶。
在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列包含哈氏弧菌转座子末端序列并且转座酶包含哈氏弧菌转座酶。
在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列包含Tn5转座子末端序列并且转座酶包含Tn5转座酶。
在一些实施例中，本发明大体上涉及用于制备多种转座体复合物，或活体外使DNA片段化的方法，以及相关组合物、系统、试剂盒以及设备，其中用于进行本文中描述的任何步骤或反应的试剂的任何组合可以任何顺序(包括依序或基本上同时或两者的组合)沉积到一个或多个反应容器中。试剂的非限制性实例包括：转座酶、第一转座子末端序列、第二转座子末端序列、标靶DNA分子、PCR试剂(例如扩增聚合酶、引物和/或核苷酸)、测序试剂(例如测序聚合酶、引物和/或核苷酸)、活化剂和/或稳定剂。
附图说明
图1显示当使用标准全长(天然)转座子末端、具有预带切口的攻击链的转座子末端以及具有两条预带切口的链的转座子末端时，具有均匀转座子末端的片段化标靶DNA的结构。
图2显示当全长(天然)转座子末端和各种预带切口的转座子末端用于MuA转座体形成和随后DNA片段化时，片段化大肠杆菌基因组DNA(gDNA)的安捷伦(Agilent)2100生物分析仪曲线。
图3显示使用MuA-预带切口的转座子末端复合物片段化的人类gDNA、HeLadscDNA、金黄色葡萄球菌(Stap砂lococcus aureus)gDNA、大肠杆菌gDNA以及嗜热栖热菌(T.thermophilus)gDNA的安捷伦2100生物分析仪曲线。
图4显示片段化大肠杆菌gDNA的安捷伦2100生物分析仪曲线，其展示DNA片段长度对在DNA片段化反应中使用的MuA-预带切口的转座子末端复合物的量(0.25μl-2μl)的依赖性。
图5显示使用含有44-6预带切口的转座子末端的MuA转座体(曲线A)和具有连接衔接子的最终尺寸经选择的DNA库(曲线B)片段化，用于DNA模板制备和随后在Ion TorrentPGM上测序的大肠杆菌gDNA的安捷伦2100生物分析仪曲线。
图6显示Ion Torrent PGM DNA库，其由用含有44-6预带切口的转座子末端的MuA转座体片段化的大肠杆菌gDNA制备，运行概述片段：ISP密度图、芯片孔细节、读取长度细节、比对概述、原始精确度。
图7显示片段化(使用天然转座子末端和34-16预带切口的转座子末端)并且随后扩增的人类gDNA的安捷伦2100生物分析仪曲线。
图8显示经设计用于使用含有带切口转座子末端和含缺口转座子末端的MuA转座体的DNA片段化实验(实例4-6)的转座子末端结构。
图9显示使用含有天然转座子末端、38-12带切口转座子末端以及带缺口转座子末端(缺口42-6、缺口40-8)的MuA转座体片段化的大肠杆菌gDNA的安捷伦2100生物分析仪曲线。
图10(A)和(B)显示片段化大肠杆菌gDNA的安捷伦2100生物分析仪曲线，其说明DNA片段长度对组装到MuA转座体中的转座子末端结构、含有天然转座子末端、38-12带切口转座子末端或具有缺口的42-6转座子末端的MuA转座体的量(0.5μL、1.5μL)以及活体外转座反应时间(1.5min、5min、10min)的依赖性。
图11显示片段化大肠杆菌gDNA的安捷伦2100生物分析仪曲线，其说明使用固定量(1.5μl)的含有天然转座子末端或42-6带缺口转座子末端的MuA转座体、延长活体外转座反应时间(30min)以及较低标靶DNA输入(25ng、50ng以及100ng)的活体外转座反应的效率。
图12显示片段化大肠杆菌gDNA的安捷伦2100生物分析仪曲线，其说明MuA-天然转座子末端复合物和MuA-42-6带缺口转座子末端复合物的活体外转座反应时间的变量，而输入DNA(100ng)和含有天然转座子末端或42-6带缺口转座子末端的MuA转座体(3μl)的量相同。
图13表示自MuA转座子末端序列中核苷酸替换(简并)的理论预期分布的偏差。
图14A-E显示用包含经修饰(简并)转座子末端的转座体复合物获得的片段化大肠杆菌gDNA的安捷伦2100生物分析仪概况。
图15显示MuA-修饰转座子复合物的EMSA分析。
图16显示片段化(使用天然转座子末端和34-16预带切口的转座子末端)并且随后扩增的人类gDNA的安捷伦2100生物分析仪曲线。
具体实施方式
本发明涉及核酸的控制片段化的领域。
含有带切口的DNA链的人工转座子和其在应用，包括(但不限于)下一代测序(NGS)库制备中的用途。
一种基于活体外转座反应，在转座酶和一对特别设计的转座子末端(任一个或两个具有经修饰序列)存在下产生所需长度的核酸片段的方法。经修饰序列涵盖两个简并序列，定义为除野生型以外的序列，和含有人工引入的脱嘌呤位点、脱嘧啶位点、切口或核苷酸缺口的序列，其可以一般称为人工引入的损伤。将含有经修饰序列和/或经修饰以含有脱嘌呤/脱嘧啶位点、切口或缺口的转座酶和转座子末端组装到催化活性复合物中并且用于在产生所需平均核酸片段尺寸的控制片段化方法中以酶方式剪切核酸样品。当在产生DNA测序模板中使用时，转座酶和经修饰转座子末端的此类复合物与目前可用的转座子类DNA片段化试剂盒相比，提供优势。此类优势包括转座子末端序列段缩短，添加特定衔接子的能力以及在产生不对称带尾DNA片段，即仅在处理DNA片段的一端具有全长经转座转座子末端是优选的应用中使用的能力。本发明进一步涉及包含具有经修饰序列的转座子DNA末端序列的转座子核酸。
在攻击链中或在两个DNA链中含有经修饰序列的转座子可以用于形成转座子/转座酶复合物和随后使所关注的DNA片段化。因此，转座反应产物(剪切DNA片段)含有均匀末端序列，其长度和结构通过在主要转座子中的经修饰转座子末端序列位置预期，并且其与使用全长人工转座子相比显著较短。在转座子的特定位置引入经修饰转座子末端序列确保显著较高的PCR效率并且允许形成可以用于与携带互补粘性末端的衔接子连接的已知结构的粘性末端。
本发明转座酶类DNA剪切方法是其它DNA剪切技术的强大替代方案。其需要极低量的输入DNA物质。除DNA片段化以外，其在所得DNA片段的两端产生特定均匀DNA序列。
在实施例中，源自转座子的序列用于粘接PCR引物。对于转座酶类方法，如果PCR意图用于扩增反应产物，那么对于引物粘接，均匀片段末端一般足够长，例如约10nt-25nt。所得片段的较长互补末端使得形成极稳定的二级DNA结构，称为“茎-环”，其防止引物粘接并且大幅度抑制PCR效率。当使用全长转座子时，末端互补末端是50bp长并且因此需要用于随后缺口填充的特别条件和链置换步骤来确保充分较高的PCR效率。
使用在攻击DNA链中具有内部经修饰序列的转座子解决此类缺点，使得形成最优长度的互补末端。取决于实验条件，基于将经修饰序列引入到用于DNA剪切的合适转座子位置，这些互补末端可以在几个到几十个核苷酸范围内变化。举例来说，在PCR辅助的衔接子添加反应中，当用含有经修饰序列或损伤的转座子(当进一步应用最近研发的400bp或更长的测序方案时其提供优势)剪切DNA时，与较短片段相比，较长片段是优选的。然而，如果连接意图用于添加特定衔接子，那么用于DNA片段化的转座子应在攻击链中或两条转座子链中具有经修饰序列。转座子的后一修饰导致在DNA片段的两端出现粘性末端，其适用于与具有互补粘性末端的衔接子连接。PCR或连接反应或两者的产物可以在各种分析中使用，包括(但不限于)NGS和微阵列分析。
除非具体定义或不同描述，否则本发明使用以下术语和描述。
如本文所用的术语“转座子”是经转座酶或整合酶识别并且是能够转座的功能核酸-蛋白质复合物(“转座体复合物”)的必需组分的核酸区段。在一个实施例中本发明转座子属于II类可转座DNA元件，其使用基本上类似反应以便其在基因组内和之间移动，即转座反应通过转座酶通过双链或单链DNA中间物催化并且转座子DNA以“剪贴”方式在基因组内易位。如本文所用的术语“转座子”还包括最初可转座元件的所有衍生物，例如小转座子或能够转座的最小核酸-蛋白质复合物的其它重复，包括(但不限于)两个个别不互连转座子末端，或所述末端通过一些人工连接子接合。
如本文所用的术语“转座酶”指酶，其是能够转座的功能核酸-蛋白质复合物组分并且介导转座。
术语“转座子末端”或“转座子末端序列”是经形成突触复合物或“转座体复合物”所必需的转座酶识别的序列，其足以使随后转座事件活体外出现。“足以使随后转座事件活体外出现”意思指为识别和结合转座酶所必需的转座子末端序列，包括约五个碱基对的核苷酸的末端段，最后两个碱基对是攻击5′-CA，这五个碱基对为转座反应出现所必需。转座子末端和转座酶蛋白质形成“复合物”或“突触复合物”或“转座体复合物”，复合物能够将转座子末端插入或转座到与其一起在活体外转座反应中培育的标靶DNA中。转座体含有转座酶蛋白质的多个子单元，其结合于来自两个转座子末端的DNA序列。这些蛋白质-DNA复合物也被称为“突触复合物”，因为其集合转座子DNA的两个末端。噬菌体Mu转座酶MuA在溶液中是单体但在结合到转座子末端附近的特异性DNA识别位点后形成四聚体。模拟Mu转座到外部标靶DNA中的重要反应步骤可以使用MuA转座酶、50bp Mu R端DNA区段以及标靶DNA作为唯一大分子组分活体外重建(Haapa等人《活体外小Mu转座子的高效和精确整合：用于功能基因分析和分子生物学应用的通用方法(An efficient and accurate integration ofmini-Mu transposons in vitro：A general methodology for functional geneticanalysis and molecular biology applications)》.《核酸研究(Nucleic Acids Res)》27(1999)2777-2784)。
如本文所用的术语“衔接子”指提供处理与其接合的核酸片段的方式的非标靶核酸组分，一般是DNA。举例来说，衔接子包含准许鉴定、识别和/或分子或生物化学处理与衔接子附接(例如通过提供用于粘接寡核苷酸的位点，寡核苷酸例如通过DNA聚合酶延伸的引物，或用于捕获或用于连接反应的寡核苷酸)的DNA的核苷酸序列。
如本文所用的术语“等摩尔浓度”指转座酶蛋白质-转座子核酸比率，其允许形成完全组装的转座体复合物，其中利用所有复合物搭配物并且无过量复合物搭配物在溶液中保持游离。对于Mu转座系统，此类比率表示能够与MuA相互作用的四个MuA转座酶蛋白质分子和两个Mu转座子末端序列，而对于Tn5系统，此类比率是两个Tn5转座酶蛋白质分子和两个Tn5转座子末端序列。在本发明方法中，在针对转座体复合物形成优化的更浓的转座酶/转座子末端反应混合物(以对应于每2个转座子末端，4个转座酶分子的浓度(“等摩尔浓度”))中进行转座体组装。在组装之后，稀释预先形成的复合物并且添加标靶DNA。与标靶DNA的反应混合物对于复合物形成是次优的，因此除缺乏转座酶转换以外，此是引起预先形成的活性转座体复合物耗尽的另一个因素并且反应在特定DNA降解水平下停止。
在一些实施例中，“载体”包含平坦表面，以及凹面、凸面或其表面的任何组合。在一些实施例中，“载体”包括珠粒、粒子、微粒、球体、过滤器、流槽、孔、微孔、凹槽、通道储存器、凝胶或毛细管的内壁。任选地，载体包括毛细管的内壁、通道、孔、微孔、凹槽、通道、储存器。任选地，载体包括包括质地(例如蚀刻、空穴化、孔、三维支架或凸块)。任选地，载体可以是多孔、半多孔或无孔。任选地，载体包括一个或多个具有空穴或孔的珠粒，或可以包括三维支架。任选地，载体包括Ion SphereTM粒子(来自Ion Torrent，生命技术公司的一部分，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad，California))。任选地，粒子具有任何形状，包括球形、半球形、圆柱形、桶形、环形、棒状、盘状、圆锥形、三角形、立方形、多边形、管状、线状或不规则。在一些实施例中，载体可以由任何材料制成，包括玻璃、硼硅酸盐玻璃、二氧化硅、石英、熔融石英、云母、聚丙烯酰胺、塑料聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯(PMA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、硅、锗、石墨、陶瓷、硅、半导体、高折射率电介质、晶体、凝胶、聚合物或膜(例如金、银、铝或金刚石膜)。在一些实施例中，载体可以是磁性或顺磁。在一些实施例中，载体包括附接有抗生蛋白链菌素(例如来自加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen)的DynabeadsTM M-270)的顺磁珠粒。任选地，珠粒或粒子可以具有铁芯，或包含水凝胶或琼脂糖(例如SepharoseTM)。任选地，载体耦合到至少一个检测核苷酸并入反应的物理化学副产物的传感器，其中副产物包括焦磷酸酯、氢离子、电荷转移或热。
各种转座酶与其底物DNA(转座子末端)的相互作用描述在现有技术中，其程度为允许所属领域的技术人员确定用于各种转座体复合物的转座子末端的边界(Montano和Rice 2011.《使DNA在周围移动：DNA转座和逆转录病毒整合(Moving DNA around：DNAtransposition and retroviral integration)》.《现代结构生物学评论(Curr.Opin.Struct.Biol)》.21，370-378)。科学文献可以参考转座子末端作为转座酶蛋白质的初级底物，其为转座体复合物组装所必需。然而，仅完全组装的转座体可以攻击标靶DNA，因此标靶DNA是经组装转座体复合物的底物，而非转座酶的底物。
常规DNA测序方法目前被允许数百万核酸分子同时测序的所谓的“下一代”技术或“大规模平行测序”平台代替。这些方法依赖于合成测序方法，而其它平台是基于连接测序技术。所有这些新颖技术依赖于测序模板池(DNA库)，其稍后可以通过使用DNA扩增技术倍增。
在DNA库制备中存在两种主要方法。所谓的常规DNA库制备程序包括DNA片段化(水剪切(hydroshearing)、超声处理、喷雾或酶剪切)，接着DNA修复和的末端补平(钝端或A-突出端)，并且最终平台-特异性衔接子连接。转座子类DNA库制备程序使用活体外转座来制备测序-即用DNA库：在通过转座酶-转座子末端复合物催化的活体外转座期间，链转移经由标靶DNA中的随机、交错双链DNA断裂和转移的转座子链的3′端与标靶DNA的5′端的共价连接发生。当参与活体外转座反应的两个转座子末端不互连时，标靶DNA片段化并且转座子末端寡核苷酸的转移链共价连接到DNA片段的5′端。还可以通过用工程改造的衔接子序列附接转座子末端序列将独立标签添加到片段化DNA中。在延伸之后，测序衔接子允许通过乳液PCR(emPCR)、桥式PCR(bPCR)以及其它方法扩增。
呈DNA库制备试剂盒形式的商业常规和转座子类DNA库制备方法可获得(例如亿明达(Illumina)、生命技术公司、新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，但这些面临限制：多步方案需要许多DNA操作步骤，其导致长并且费力的工作流程并且可能导致显著DNA样品损失和有限产量。
转座子类DNA库制备方法，尽管一般需要较少动手时间并且对于用户来说更方便，也具有限制：当变性成单链DNA时，在两端具有互补转座子末端序列的活体外转座产物倾向于形成分子内环结构。当片段化DNA经受PCR扩增时，此尤其是个问题。
此外，大规模平行测序平台通常需要最初长的多核苷酸链减小到具有如序列读取器的操作设置指定的碱基对平均长度的较小核酸片段。目前测序读取长度在50bp到1000bp范围内变化。对于一些大规模平行测序平台，应用需要5kb到40kb的核酸片段的配偶对测序库制备方法。常规核酸片段化方法(例如酶消化、喷雾、水剪切以及超声处理)是基于随机核酸剪切，因此具有与序列读取器的操作设置对应的长度的所需核酸片段需要另外自核酸片段的混合物通过各种尺寸选择方案纯化。
仍需要允许将DNA样品片段化到所需预定平均DNA片段尺寸，并且促进由活体外转座步骤获得的片段化DNA的下游处理的方法。
推荐克服由活体外转座事件产生的互补转座子末端序列的自动粘接的方法。举例来说，在采用Tn5转座酶-转座子末端复合物的Nextera DNA样品制备试剂盒中，用不互补的测序引物序列附接转座子末端。
Grunenwald美国公开专利申请第2010/0120098号公开使用转座酶和转座子末端来活体外产生双链标靶DNA的广泛片段化和5′标记的方法。方法是基于在片段化之后在不进行PCR扩增反应的情况下使用DNA聚合酶产生5′-和3′-标记的单链DNA片段。公开经标记的转座子末端，但所用转座子的实际转座子末端序列与天然Tn5转座子序列相对应。与天然转座子末端组合的标签结构域可以包含可裂解位点的序列或结构，其中方法包含用裂解酶培育自片段化步骤获得的标记DNA片段的步骤。所述申请描述在附接到转座子末端序列的5′-端的标签序列中，而非在转座子末端序列自身中具有裂解位点的转座子末端。
Kavanagh美国公开专利申请第20130017978号传授在DNA片段化之后截断转座子末端，进而使其不互补的方法。方法包含以下步骤：(a)在转座子末端、转座酶以及标靶DNA存在下引发活体外转座反应，其中转座子末端包含可经转座酶识别的转座子末端序列，转座子末端序列包含一个或多个经修饰位置，其中一个或多个经修饰位置将裂解位点引入到转座子末端序列中，并且其中活体外转座反应引起标靶DNA的片段化和转座子末端并入到片段化标靶DNA的5′端中；和(b)用对裂解位点具有特异性的酶培育片段化标靶DNA，因此并入到片段化标靶DNA中的转座子末端在裂解位点裂解。提供此类修饰/裂解的实例：含有尿嘧啶的转座子可以使用UDG和随后热或核酸内切酶处理截断；含有m5C的转座子可以使用甲基化敏感限制性核酸内切酶Sgel截断；以及含有RNA/DNA杂合部分的转座子可以使用RNA酶H截断。
尽管这些方法可以用于高效转座子末端截断，其具有限制。由于非天然转座子末端结构，使用尿嘧啶、m5C或RNA可以妨碍转座酶-转座子末端复合物形成或抑制其活体外活性(DNA片段化能力)。将此类修饰引入到转座子末端中的需要增加转座子末端寡核苷酸的合成成本。转座子末端截断是需要复杂最优化并且延伸DNA库制备工作流程时间的酶方法。在培育之后，用于裂解的酶需要失活或去除以避免稍后DNA库制备步骤中的可能负面影响。
本发明方法提供引入转座子末端的某些位置中的修饰，修饰包括损伤，例如切口、核苷酸缺口或经修饰序列，包括简并转座子末端序列，其在复合此类转座子末端与转座酶之后，产生突触复合物，所述突触复合物尽管与转座子末端序列的亲和力降低，在活体外转座反应混合物中充分稳定，并且可以进行活体外转座事件，引起将DNA样品减小到所需平均DNA片段尺寸的经控制DNA片段化。此类转座酶/经修饰转座子末端(含有脱嘌呤/脱嘧啶位点、切口或缺口)复合物可以应用于产生预定长度的DNA片段，或如在DNA损伤的情况下，用于产生含有缩短的转座子末端序列段的预定长度的DNA片段并且用于产生不对称带尾DNA片段。
阐述MuA转座酶适应并且处理各种含有具MuA结合位点R1和R2的右侧转座子末端的不同发夹结构化底物的可能性(Saariaho等人，《核酸研究(Nucleic Acids Research)》34(2006)3139-3149)。因此，大部分Mu特异性发夹底物由两种寡核苷酸产生，并且因此这些发夹底物在R1MuA结合位点内含有切口。通过与带切口和对应不带切口发夹底物相互作用的MuA转座酶催化的活体外转座反应的直接比较指示此切口不干扰活体外转座反应。解析结晶MuA最终链转移复合物的结构，所述复合物含有截断MuA蛋白质的四聚体、细菌噬菌体Mu末端DNA的两个拷贝以及一个标靶DNA(Montano等人，《自然(Nature)》491(Nov 15，2012)413-417)。组装Mu末端DNA双螺旋以模拟通过MuA转座酶的初始细菌噬菌体Mu转座子DNA裂解的转座反应产物，产生预裂解的右侧转座子末端，暴露能够攻击标靶DNA的5′-端的游离3′-OH基团。因此，通过以相等摩尔量混合四种含有用于识别的R1和R2结合位点的单链寡核苷酸并且结合四种MuA蛋白质，在双螺旋的各链上在不干扰转座体组装的位置产生切口来制备Mu末端DNA双螺旋。MuA转座机制包容转座子末端序列的某些变化(Goldhaber-Gordon等人《生物化学杂志(J Biol Chem.)》277(2002)7703-12)。然而，这些公开中无一个提出与转座酶组装成催化活性复合物的带切口或缺口或带简并序列的转座子末端可以应用于经控制DNA片段化、产生含有缩短转座子末端序列段的DNA片段或产生不对称带尾DNA片段。
使用预带切口的转座子末端或具有核苷酸缺口的转座子末端是酶截断的快速和简单的替代方案。预带切口的转座子末端或具有核苷酸缺口的转座子末端不含有可能扭曲DNA结构的任何复杂修饰，因此复合物形成方法效率与天然转座子末端特有的效率类似。在活体外转座反应之后，此类转座子末端通过弱氢键保持在互补DNA上并且取决于互补区域的长度，紧接在活体外转座反应之后或在初始衔接子添加PCR(AA-PCR)伸长步骤之后(在那些情况下当远离攻击链的3′端引入切口或缺口时)，自片段化DNA自身崩解。因为转座子末端截断由攻击转座子链中的切口或缺口位置确定，所以其可以容易地变化。经由切口或缺口引入的转座子末端截断可以用于在DNA库构筑中产生较短互补转座子末端，引起片段化DNA的更有效扩增并且产生仅在处理DNA片段的一端具有全长转座子末端的不对称带尾DNA片段。
本文提供的资料展现出人意料地，由约等摩尔浓度的转座酶和包含切口或核苷酸缺口或简并核苷酸序列的经修饰转座子末端形成的转座体可以形成活性转座体。由于对其底物(经修饰转座子末端)的较低转座酶亲和力，完全组装的转座体的实际有效浓度比使用天然转座子末端获得的浓度低。此允许通过改变转座反应混合物中标靶基因组DNA或预组装转座体复合物的量产生所需长度的DNA片段。众所周知DDE转座酶通常不转化并且MuA复合物如此稳定以至于其保持紧密地结合于标靶DNA直到其以ATP依赖性方式通过CIpX蛋白质去除(Gueguen等人，《微生物学进展(TRENDS in Microbiology)》13(2005)543；Nakai等人《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci US A.)》98(2001)8247-54)，因此反应混合物中转座事件的数目由预组装转座体的有效量决定，因为二级转座不出现并且反应终止(所有添加到反应混合物中的预组装转座体复合物耗尽)，并且因此获得某一平均长度的DNA片段。DDE转座酶普遍存在并且代表大部分表征转座酶，其总体催化机制已知(Mizuuchi1992a；由Mizuuchi 1992b综述)。DDE转座酶家族的成员携带酸性残基的保守三合物：DDE基元。三个酸性残基在催化所需的二价金属离子配位中至关重要(Kulkosky等人，1992)。丰富DDE转座酶家族包括原核插入序列(IS)、转座子的Tn3家族成员、Tn7、Tn5和Tn 10家族以及可转座噬菌体，例如噬菌体Mu(Nagy和Chandler 2004，由Craig等人2002综述)和真核“剪贴”转座子(Jurka等人2005；Yuan和Wessler 2011)。家族可以延伸到包括逆转录病毒，例如HIV，其编码与DDE转座酶类似的催化整合酶蛋白质(Dyda等人1994；Haren等人1999；Rice等人1996；Rice和Baker 2001)。“转化率”定义酶可以在规定时间内将其‘转化’成产物的底物分子的最大数目。根据文献，DDE转座酶不在正常反应条件下转化，即在将一种插入催化到标靶DNA中之后，转座酶保持结合于标靶DNA并且不释放，因此同一酶分子无法参与第二转座体复合物的组装并且无法催化第二转座事件。因此，转座事件的数目依赖于添加到反应混合物中的催化活性转座体复合物的有效量，在添加之后反应停止产生某一平均长度的DNA片段。
本发明预组装转座体可以用作允许产生具有预定平均长度的DNA片段的通用和经控制DNA片段化工具。通过以下非限制性实例和图式说明实施例。
所属领域的技术人员将发现显然，与含有无碱基位点、切口或缺口的其相关转座子末端复合的各种转座酶可以用于实践本发明的全部范围。举例来说，在Mosl和Mu转座体中，转座子末端通过二重DNA结合结构域的螺旋-转角-螺旋-基元结合。转座子DNA-结合的类似架构指示缺口或切口可以有效地容纳在转座子末端DNA片段中而无Mosl转座体中的显著功能缺失，此处显示对MuA也是这样。用于实践本发明的适合酶的另一个实例是Tn5转座体复合物。与Tn5转座酶产生稳定二聚转座体复合物所需的转座子末端公开于美国专利申请公开第2010/0120098号中。已显示，如同MuA转座酶，Tn5转座酶包容在其转座子末端的某些位置中的核苷酸取代、无碱基位点以及甚至核苷酸缺失(Jilk等人《转座子Tn5的外端的组织(The organization of the outside end of transposon Tn5)》，《细菌学杂志(J.Bacteriol.)》178(1996)1671-1679)并且仍能够活体外结合到此类底物。因此合理地预期当与预带切口的转座子末端或含有缺口的转座子末端复合时此酶应还进行本发明中公开的经控制DNA片段化。类似地，来自哈氏弧菌的转座酶包容其结合序列IRR中的取代(EP2,527,438，《通过转座酶进行DNA片段化和标记的方法和组合物(Methods andcompositions for DNA fragmentation and tagging by transposases)》，因此，考虑Tn5转座酶蛋白质与哈氏弧菌转座酶之间的显著同源性(40％同源性)，合理地预期此转座酶还可以用作又一种用来实践本发明的酶。本文提供的数据足以传授所属领域的技术人员转座子末端内的哪个序列必须通过转化为简并序列来修饰，以获得与其底物-转座子末端的亲和力降低的转座体，产生用于转座体复合物的较慢转座反应速率和/或与转座体复合物内的其底物(转座子)的较低转座酶亲和力。通过降低反应速率和/或亲和力，转座体复合物在较低速率下使标靶DNA片段化。标靶DNA片段化的较低速率通过改变以下来增强对所得DNA片段的平均长度的控制：(a)转座子复合物的量，(b)反应复合物中的标靶DNA的量，(c)转座反应的培育时间，(d)引入的简并序列的量，(e)简并序列的位置。操控用于经修饰转座子末端序列的反应条件准许确定产生特定平均片段长度的反应条件，例如，培育时间。那些经确定的条件可以随后用于产生包含所需、预定平均片段长度的DNA库。
在一些实施例中，已经根据本发明传授内容产生的任何片段化核酸可以通过任何测序方法来测序，包括合成测序、涉及使用场效应晶体管(例如FET和ISFET)检测测序副产物的离子类测序、化学降解测序、连接类测序、杂交测序、焦磷酸酯检测测序、毛细电泳法、凝胶电泳、下一代、大规模平行测序平台、检测氢离子或其它测序副产物的测序平台以及单分子测序平台。在一些实施例中，可以使用至少一种可以与核酸模板的任何部分(包括核酸衔接子或标靶多核苷酸)杂交的测序引物进行测序反应。
在一些实施例中，可以使用检测核苷酸并入的一种或多种副产物的方法将已经根据本发明传授内容产生的任何片段化核酸模板测序。通过检测延伸反应的物理化学副产物来检测聚合酶延伸可以包括焦磷酸酯、氢离子、电荷转移、热等，如例如Rothberg等人的美国专利第7,948,015号和Rothberg等人的美国专利公开第2009/0026082号中所公开，所述专利以全文引用的方式并入在此。检测聚合酶类延伸的方法的其它实例可以例如见于Pourmand等人，《美国国家科学院院刊》，103：6466-6470(2006)；Purushothaman等人，IEEEISCAS，IV-169-172；Anderson等人，《传感器与执行器B化学(Sensors and Actuators BChem.)》，129∶79-86(2008)；Sakata等人，《应用化学(Angew.Chem.)》118：2283-2286(2006)；Esfandyapour等人，美国专利公开第2008/01666727号；以及Sakurai等人，《分析化学(Anal.Chem.)》64：1996-1997(1992)，其以全文引用的方式并入在此。
广泛进行涉及产生和检测离子的反应。使用直接离子检测方法来监测此类反应的进展可以简化许多目前生物分析。举例来说，可以通过检测作为由聚合酶催化的核苷酸并入的天然副产物产生的氢离子来监测通过聚合酶的模板依赖性核酸合成。离子敏感测序(还称为“pH类”或“离子类”核酸测序)利用作为核苷酸并入的副产物产生的离子副产物(例如氢离子)的直接检测。在用于离子类测序的一个示例性系统中，可以在微孔中捕获待测序的核酸，并且核苷酸可以在核苷酸并入条件下一次一个地流动通过孔。聚合酶将合适核苷酸并入到生长链中，并且释放的氢离子可以改变溶液中的pH，其可以通过与孔耦合的离子传感器检测。此技术不需要标记核苷酸或昂贵光学组件，并且允许快得多地完成测序操作。此类离子类核酸测序方法和平台的实例包括Ion Torrent PGMTM或ProtonTM测序仪(IonTorrentTM Systems，生命技术公司)。
在一些实施例中，任何使用本发明传授内容的方法、系统以及试剂盒产生的片段化核酸可以用作通过传感器(包括场效应晶体管(FET))检测和/或监测的生物或化学反应的底物。在各种实施例中，FET是chemFET或ISFET。“chemFET”或化学场效应晶体管是充当化学传感器的场效应晶体管类型。其是MOSFET晶体管的结构类似物，其中闸极电极上的电荷通过化学方法施加。“ISFET”或离子敏感场效应晶体管用于测量溶液中的离子浓度；当离子浓度(例如H+)改变时，通过晶体管的电流将因此改变。ISFET的操作的详细理论在“《ISFET学的三十年：过去30年内发生了什么和随后30年内可能发生什么(Thirty years ofISFETOLOGY：what happened in the past 30 years and what may happen in the next30years)》”，P.Bergveld，《传感器与执行器(Sens.Actuators)》，88(2003)，第1-20页中给出。
在一些实施例中，FET可以是FET阵列。如本文所用，“阵列”是例如传感器或孔等元件的平面布置。阵列可以是一维或二维的。一维阵列可以是在第一维度具有一列(或行)元件并且在第二维度具有多个列(或行)的阵列。第一和第二维度中的列(或行)的数目可以相同或不同。FET或阵列可以包含102、103、104、105、106、107或更多FET。
在一些实施例中，可以在FET传感器阵列上制造一个或多个微流体结构以提供生物学或化学反应的容纳或约束。举例来说，在一个实施方案中，微流体结构可以配置成一个或多个安置在阵列的一个或多个传感器上的孔(或微孔，或反应腔室，或反应孔，所述术语在本文中可互换地使用)，使得上面安置有指定孔的一个或多个传感器检测和/或测量指定孔中分析物的存在、含量或浓度。在一些实施例中，FET传感器和反应孔之间可存在1∶1对应。
微孔或反应腔室是通常具有定义明确的形状和体积，可以制造成衬底并且可以使用常规微型制造技术制造的空穴或孔，所述技术例如以下参考文献中所公开：Doering和Nishi，编，《半导体制造技术手册(Handbook of Semiconductor ManufacturingTechnology)》，第二版(CRC出版社，2007)；Saliterman，《生物医学和医学微装置原理(Fundamentals of BioMEMS and Medical Microdevices)》(SPIE出版物，2006；Elwenspoek等人，《硅微机械加工(Silicon Micromachining)》(剑桥大学出版社(Cambridge University Press)，2004)；等。微孔或反应腔室的配置(例如间隔、形状以及体积)的实例公开于Rothberg等人，美国专利公开2009/0127589；Rothberg等人，英国专利申请GB24611127(其以全文引用的方式并入在此)中。
在一些实施例中，生物或化学反应可以在溶液或与FET(例如chemFET或ISFET)接触、可操作地耦合或电容耦合的反应腔室中进行。FET(或chemFET或ISFET)和/或反应腔室可以分别是FET或反应腔室的阵列。
在一些实施例中，生物或化学反应可以在反应腔室的二维阵列中进行，其中各反应腔室可以耦合到FET，并且各反应腔室的体积不大于10pm3(即，1pL)。在一些实施例中，各反应腔室的体积不大于0.34pL、0.096pL或甚至0.012pL。反应腔室的顶部横截面积可以任选地不大于2、5、10、15、22、32、42、52、62、72、82、92或102平方微米。优选地，阵列具有至少102、103、104、105、106、107、108、109或更多个反应腔室。在一些实施例中，反应腔室中的至少一个可操作地耦合到FET中的至少一个。
除在CMOS制造中常规地采用的那些技术以外，如在根据本发明的各种实施例中所使用的FET阵列可以根据常规CMOS制造技术以及修改的CMOS制造技术以及其它半导体制造技术制造。另外，各种光刻技术可以用作阵列制造方法的一部分。
适用于所公开的方法的示例性FET阵列以及微孔和伴随流体学以及制造其的方法例如公开于美国专利公开第20100301398号；美国专利公开第20100300895号；美国专利公开第20100300559号；美国专利公开第20100197507号；美国专利公开第20100137143号；美国专利公开第20090127589号；以及美国专利公开第20090026082号中，所述专利以全文引用的方式并入。
在一个方面中，所公开的方法、组合物、系统、设备以及试剂盒可以用于进行无标签核酸测序，并且具体来说，离子类核酸测序。无标签检测核苷酸并入的概念已经描述在文献中，包括以引用的方式并入的以下参考文献：Rothberg等人，美国专利公开2009/0026082；Anderson等人，《传感器与执行器B化学》，129：79-86(2008)；以及Pourmand等人，《美国国家科学院院刊》，103：6466-6470(2006)(其以全文引用的方式并入在此)。简单来说，在核酸测序应用中，通过测量聚合酶催化的延伸反应的天然副产物，包括氢离子、聚磷酸酯、PPi以及Pi(例如在焦磷酸酶存在下)测定核苷酸并入。此类离子类核酸测序方法和平台的实例包括Ion Torrent PGMTM或ProtonTM测序仪(Ion TorrentTM Systems，生命技术公司)。
在一些实施例中，本发明大体上涉及将核酸模板测序的方法。在一个示例性实施例中，本发明大体上涉及自多核苷酸获得序列信息的方法，其包含：在核酸模板的可延伸末端并入核苷酸；和使用检测来自核苷酸并入反应的副产物(例如裂解产物)的传感器检测指示核苷酸并入的非光学信号。在一些实施例中，测序方法包含：(a)提供表面，其包括一个或多个含有聚合酶和具有可延伸末端或与可延伸末端杂交的核酸模板的反应位点；(b)通过使反应位点中的一个或多个与包括一种或多种类型的核苷酸的第一溶液接触来进行第一核苷酸流动；(c)使用聚合酶在反应位点中的至少一个内含有的核酸模板的可延伸末端并入至少一种类型的核苷酸；以及(d)使用附接或可操作地连接到至少一个反应位点的传感器检测指示核苷酸并入的非光学信号。任选地，传感器包含FET传感器。任选地，至少一个反应位点包括一个或多个FET传感器。任选地，方法采用核苷酸、核苷酸类似物和/或终止子核苷酸中的任何一个或任何组合。任选地，采用一种或多种终止子核苷酸用于测序的方法进一步包括：将并入的终止子核苷酸去阻断。任选地，测序方法进一步包括：通过使反应位点中的一个或多个与包括一种或多种类型的核苷酸的第二溶液接触来进行第二核苷酸流动，其中第二溶液含有一种或多种终止子核苷酸、一种或多种非终止子核苷酸或两种类型的核苷酸的混合物。任选地，测序方法进一步包括：并入至少一种第二核苷酸，其中第二核苷酸是来自第二溶液的终止子核苷酸或非终止子核苷酸。任选地，测序方法进一步包括：使用附接或可操作地连接到至少一个反应位点的传感器检测指示第二并入核苷酸的第二非光学信号。
在一些实施例中，模板依赖性合成包括以模板依赖性方式将一种或多种核苷酸并入到新合成的核酸链中。
任选地，方法可以进一步包括产生此类核苷酸并入的一种或多种离子副产物。
在一些实施例中，方法可以进一步包括检测一种或多种核苷酸并入到测序引物中。任选地，检测可以包括检测氢离子的释放。
在另一个实施例中，本发明大体上涉及将核酸测序的方法，其包含：将核酸模板置于多个反应腔室中，其中反应腔室中的一个或多个与场效应晶体管(FET)接触。任选地，方法进一步包括使置于反应腔室中的一个中的核酸模板与聚合酶接触，进而通过依序并入一种或多种核苷酸(例如终止子核苷酸或非终止子核苷酸)到核酸分子(例如可延伸末端)中来合成新核酸链。任选地，方法进一步包括产生一个或多个氢离子作为此类核苷酸并入的副产物。任选地，方法进一步包括通过使用FET检测一个或多个氢离子的产生来检测一种或多种核苷酸的并入。
在一些实施例中，检测包括响应于一个或多个氢离子的产生来检测在阵列内的至少一个FET处的电压和/或电流的变化。
在一些实施例中，FET可以选自由以下组成的群组：离子敏感FET(isFET)和化学敏感FET(chemFET)。
一种涉及经由检测核苷酸并入的离子副产物测序的示例性系统是IonTorrentPGMTM或ProtonTM测序仪(生命技术公司)，其是通过检测作为核苷酸并入的副产物产生的氢离子来将核酸模板测序的离子类测序系统。通常，氢离子作为使用聚合酶的模板依赖性核酸合成期间发生的核苷酸并入的副产物形式释放。Ion Torrent PGMTM或ProtonTM测序仪通过检测核苷酸并入的氢离子副产物来检测核苷酸并入。Ion Torrent PGMTM或ProtonTM测序仪可以包括多个待测序的模板模板，各模板置于阵列中的各别测序反应孔内。阵列的孔可以各自耦合到至少一个离子传感器，所述传感器可以检测作为核苷酸并入的副产物产生的H+离子的释放或溶液pH的变化。离子传感器包含耦合到离子敏感检测层的场效应晶体管(FET)，所述检测层可以感应H+离子的存在或溶液pH的变化。离子传感器可以提供指示核苷酸并入的输出信号，其可以表示为量值与各别孔或反应腔室中的H+离子浓度相关的电压变化。不同核苷酸类型可以连续流入反应腔室中，并且可以通过聚合酶以通过模板序列确定的顺序并入到延伸引物(或聚合位点)中。各核苷酸并入可以伴随着反应孔中的H+离子释放，连同局部pH中的伴随改变。可以通过传感器的FET登记H+离子的释放，所述FET产生指示发生核苷酸并入的信号。在特定核苷酸流动期间未并入的核苷酸可能不产生信号。来自FET的信号的幅值也可以与并入到延伸核酸分子中的特定类型的核苷酸数目有关，进而允许解析均聚物区域。因此，在测序仪操作期间，多个核苷酸流入反应腔室中，以及多个孔或反应腔室上的并入监测可以允许仪器同时解析许多核酸模板的序列。关于组合物、设计以及Ion Torrent PGMTM或ProtonTM测序仪的操作的其它细节可以见于例如现以美国专利公开第2009/0026082号公布的美国专利申请第12/002781号、现以美国专利公开第2010/0137143号公布的美国专利申请第12/474897号以及现以美国专利公开第2010/0282617号公布的美国专利申请第12/492844号中，所述申请均以全文引用的方式并入本文中。
在各种示例性实施例中，本文中所描述的方法、系统以及计算机可读媒体可以有利地用于处理和/或分析从电子或电荷类核酸测序获得的数据和信号。在电子或电荷类测序(例如，pH类测序)中，可以通过检测作为聚合酶催化的核苷酸延伸反应的天然副产物产生的离子(例如，氢离子)来确定核苷酸并入事件。此可以用于对样品或模板核酸测序，样品或模板核酸可以是例如所关注的核酸序列的片段，并且可以作为克隆种群直接或间接附着到固体载体，例如粒子、微粒、珠粒等。样品或模板核酸可以可操作地结合到引物和聚合酶，并且可以经历核苷酸添加(其在本文中可以被称作“核苷酸流动”，从中可以产生核苷酸并入)和洗涤的重复循环或“流动”。引物可以粘接到样品或模板，使得每当添加与模板中的下一基底互补的核苷酸时引物的3′端可以通过聚合酶延伸。接着，基于核苷酸流动的已知序列和基于从化学传感器所测得的指示在每个核苷酸流动期间的离子浓度的输出信号，可以确定与耦合到化学传感器的反应区中存在的样品核酸结合的核苷酸的类型、序列以及数目的鉴别。
在离子类核酸测序的典型实施例中，可以通过检测通过聚合酶催化的延伸反应产生的氢离子的存在和/或浓度检测核苷酸并入。在一个实施例中，任选地预结合于测序引物和/或聚合酶的模板可以装载到反应腔室(例如Rothberg等人中公开的在本文中引用的微孔)中，在其之后可以进行核苷酸添加和洗涤的重复循环。在一些实施例中，此类模板可以作为克隆种群附着到固体载体，例如粒子、珠粒等，并且将所述克隆种群装载到反应腔室中。
在另一个实施例中，任选地结合于聚合酶的模板分布、沉积或位于阵列的不同位点。阵列的位点包括引物并且方法可以包括将不同模板与不同位点内的引物杂交。
在循环的各添加步骤中，仅当模板中的下一碱基是添加的核苷酸的补体时，聚合酶才可以通过并入添加的核苷酸来延伸引物。如果存在一个互补碱基，那么存在一次并入，如果存在两个互补碱基，那么存在两次并入，如果存在三个互补碱基，那么存在三次并入，以此类推。各此类并入存在所释放的氢离子，并且模板释放氢离子群体共同地改变反应腔室的局部pH。氢离子的产生与模板中的相邻互补碱基数目(以及具有引物和聚合酶的参与延伸反应的模板分子总数)单调相关。因此，当模板中存在许多相邻一致互补碱基(即，均聚物区域)时，所产生的氢离子的数目以及因此局部pH变化的幅值可以与相邻一致互补碱基的数目成正比。如果模板中的下一个碱基不与所添加的核苷酸互补，那么不会发生并入并且不会释放氢离子。在一些实施例中，在添加核苷酸的各个步骤之后，可以进行额外步骤，其中使用在预定pH下的无缓冲洗涤溶液来去除前述步骤的核苷酸以防止随后循环中的误并入。在一些实施例中，在添加核苷酸的各个步骤之后，可以进行额外步骤，其中用核苷酸破坏剂(例如腺苷三磷酸双磷酸酶)处理反应腔室以消除残留在腔室中的可能在随后循环中产生假延伸的任何残余核苷酸。
在一个示例性实施例中，将不同种类的核苷酸依序添加到反应腔室，以使得各反应物可以一次一个地暴露于不同核苷酸。举例来说，可以按以下顺序添加核苷酸：dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dATP、dCTP、dGTP、dTTP等；各暴露接着是洗涤步骤。取决于所需序列信息长度，循环可以重复50次、100次、200次、300次、400次、500次、750次或更多次。
在一些实施例中，可以根据与PGMTM或ProtonTM测序仪一起提供的用户方案进行测序。实例3提供使用Ion Torrent PGMTM测序仪(Ion TorrentTM Systems，加利福尼亚州的生命技术公司)的用于离子类测序的一种示例性方案。
在一些实施例中，本发明大体上涉及将一群模板多核苷酸测序的方法，其包含：(a)通过将多种模板多核苷酸克隆地扩增到多个表面上来产生多种扩增子，其中扩增在反应混合物的单一连续相内进行并且其中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％所得扩增子在本质上是基本上单克隆。在一些实施例中，在单一扩增反应中产生足够数目的基本上单克隆扩增子以在Ion Torrent PGMTM314、316或318测序仪上产生至少100MB、200MB、300MB、400MB、500MB、750MB、1GB或2GB的AQ20测序读数。如本文所用，术语“AQ20”和其变化形式指测量Ion Torrent PGMTM测序仪中的测序精确度的特定方法。可以关于类似Phred的Q分数测量精确度，所述Q分数在对数尺度上测量精确度：Q10＝90％，Q20＝99％，Q30＝99.9％，Q40＝99.99％，以及Q50＝99.999％。举例来说，在特定测序反应中，可以经由预测算法或经由与已知参考基因组的实际比对来计算精确度度量值。预测的质量分数(“Q”分数)可以从查看输入信号的固有特性的算法导出并且关于测序“阅读”中所包括的给定单一碱基是否将比对获得极其精确的估计值。在一些实施例中，此类预测的质量分数可以适用于在下游比对之前过滤并且去除较低质量读数。在一些实施例中，可以关于在对数尺度上测量精确度的类似Phred的Q分数报告精确度以使得：Q10＝90％，Q17＝98％，Q20＝99％，Q30＝99.9％，Q40＝99.99％，以及Q50＝99.999％。在一些实施例中，可以过滤获自给定聚合酶反应的数据以仅仅测量聚合酶读数，其测量“N”个核苷酸或更长核苷酸并且具有超过一定阈值的Q分数，例如Q10、Q17、Q100(在本文中被称作“NQ17”分数)。举例来说，100Q20分数可以指示获自给定反应的读数数目，其长度是至少100个核苷酸并且Q分数是Q20(99％)或更大。类似地，200Q20分数可以指示长度是至少200个核苷酸并且Q分数是Q20(99％)或更大的读数数目。
在一些实施例中，也可以基于使用参考基因组序列的适当比对计算精确度，在本文中被称作“原始”精确度。与测量作为多个读数结果的与共同序列的误差率的共同精确度相反，这是涉及测量与单一读数相关的“真实”每个碱基误差的单向精确度。原始精确度测量值可以在“AQ”分数(针对比对质量)方面报告。在一些实施例中，可以过滤获自给定聚合酶反应的数据以仅仅测量聚合酶读数，其测量“N”个核苷酸或更长核苷酸，具有超过一定阈值的AQ分数，例如AQ10、AQ17、AQ100(在本文中被称作“NAQ17”分数)。举例来说，100AQ20分数可以指示获自给定聚合酶反应的读数数目，其长度是至少100个核苷酸并且AQ分数是AQ20(99％)或更大。类似地，200AQ20分数可以指示长度是至少200个核苷酸并且AQ分数是AQ20(99％)或更大的读数数目。
实例
酶组合物和方法的实例涉及核酸的经控制活体外片段化、含有缩短的转座子末端序列段的DNA片段的产生以及不对称带尾DNA片段的产生。材料和方法
除非另外指示，否则所有酶(除单独MuA转座酶外)和试剂来自用于Ion Torrent的MuSeek库制备试剂盒(目录号K1331，赛默科技(Thermo Scientific))。
单独MuA转座酶来自赛默科技(目录号F-750)。所有寡核苷酸在Metabion合成。
通过在粘接缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、50mM NaCl)中粘接等摩尔量的引物来制备在60μM的最终浓度下的用于实例1到3的转座子末端：
Cut-key4(无切口)和非-cut-key4或
Cut-key4(1切口45-5)、Cut-key4(2切口45-5)和非-cut-key4或
Cut-key4(1切口44-6)、Cut-key4(2切口44-6)和非-cut-key4或
Cut-key4(1切口42-8)、Cut-key4(2切口42-8)和非-cut-key4或
Cut-key4(1切口40-10)、Cut-key4(2切口40-10)和非-cut-key4或
Cut-key4(1切口38-12)、Cut-key4(2切口38-12)和非-cut-key4或
Cut-key4(1切口36-14)、Cut-key4(2切口36-14)和非-cut-key4或
Cut-key4(1切口34-16)、Cut-key4(2切口34-16)和非-cut-key4或
Cut-key4(1切口32-18)、Cut-key4(2切口32-18)和非-cut-key4或
Cut-key4(1切口31-19)、Cut-key4(2切口31-19)和非-cut-key4或
Cut-key4(1切口23-27)、Cut-key4(2切口23-27)和非-cut-key4
通过在粘接缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、50mM NaCl)中粘接等摩尔量的引物来制备在40μM的最终浓度下的用于实例4到6的转座子末端：
Cut-key4(无切口)和非-cut-key4或
Cut-key4(1切口38-12)、Cut-key4(2切口38-12)和非-cut-key4或
Cut-key4(1缺口42-6)、Cut-key4(2缺口42-6)和非-cut-key4或
Cut-key4(1缺口40-8)、Cut-key4(2缺口40-8)和非-cut-key4或
通过使用PCR仪器艾本德Mastercycler ep Gradient S(艾本德(Eppendorf))和以下程序实现寡核苷酸的粘接：95℃持续5min，70个循环，各持续40秒并且在各循环结束时自95℃开始并且以25℃结束逐渐使区块的温度降低1℃，接着在10℃下培育直到粘接寡核苷酸用于复合物形成。用于转座子末端制备的所有寡核苷酸序列显示在表1和表2中。
下表1显示用于形成各种预带切口的转座子末端或全长转座子末端的寡核苷酸的序列以及用于DNA扩增的寡核苷酸的序列。
下表2显示用于形成全长(天然)转座子末端、预带切口的转座子末端以及具有缺口的转座子末端的用于使用含有带切口和带缺口转座子末端的MuA转座体进行DNA片段化实验(实例4-6)的寡核苷酸序列。
图8显示经设计用于实例4-6中的实验的转座子末端的结构。
复合物组装缓冲液是150mM Tris-HCl pH6.0、50％(v/v)甘油、0.025％(w/v)Triton X-100、150mM NaCl、0.1mM EDTA。
额外DMSO是最终浓度下的4.6％DMSO。
片段化反应缓冲液是MuSeek片段化反应缓冲液(用于Ion TorrentTM的赛默科技MuSeek库制备试剂盒，编号K1331)或替换地36mM Tris-HCl(pH 8.0)、137mM NaCl、0.05％Triton X-100、10mM MgCl2、4.6％DMSO以及6.8％甘油。
稀释缓冲液是在最终浓度下的47.2％甘油、200mM NaCl以及2mM EDTA。
实例1
MuA转座酶与预带切口的转座子末端形成催化活性复合物。
通过使用用数个不同预带切口的转座子末端形成的MuA转座体将大肠杆菌基因组DNA片段化来直接显示MuA转座酶与预带切口的转座子末端形成催化活性复合物的能力。
在具有额外DMSO的复合物组装缓冲液中形成MuA转座体。转座子末端的最终浓度是8μM并且对于MuA转座酶是在复合物组装反应中1.65g/l(此是用于MuA转座体形成的等摩尔浓度)。在30℃下培育一小时之后，用稀释缓冲液稀释复合物组装混合物。最终稀释的MuA转座体复合物浓度是约0.48g/l。在使用之前在-70℃下储存MuA转座体复合物至少16小时。
使用由10个不同的预带切口的转座子末端和一个全长(天然)转座子末端制成的转座体将大肠杆菌菌株K-12亚株DH10B gDNA片段化。在单独管中使用于片段化反应缓冲液中的100ng大肠杆菌gDNA进行十一个片段化反应中的每一个。紧接在添加转座体混合物(1μl到最终反应体积30μl)，涡旋以及短下旋之后，在30℃下培育管五分钟。通过添加3μl4.4％SDS停止片段化反应。在短暂涡旋之后，管保持在室温下。
通过Agencourt AMPure XP PCR纯化(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))系统如下纯化片段化DNA。将片段化DNA转移到1.5ml管中。随后将49.5μl彻底混合的Agencourt AMPure XP(贝克曼库尔特公司)珠粒添加到反应中并且通过上下吸液十次小心地混合。将相同程序应用于片段化DNA的所有十一个样品。在室温下培育样品五分钟。在短旋转之后，将管置于磁性架中直到溶液澄清。在不干扰珠粒的情况下小心地抽吸上清液并且丢弃。管保持在磁性架中并且添加400μl新制备的70％乙醇。在培育30秒之后去除上清液。重复乙醇洗涤步骤。随后通过打开管的帽盖两分钟，允许剩余乙醇蒸发来风干珠粒。自磁性架移出管，并且通过上下吸液十次使珠粒悬浮于25μl无核酸酶的水中。随后将管放回到磁性架中并且在溶液变得澄清之后，将所有11份含有纯化片段化DNA的上清液小心地转移到新无菌管中。
使用安捷伦2100生物分析仪(安捷伦生物技术)和安捷伦高敏感性DNA试剂盒(安捷伦生物技术)遵循制造商的建议分析纯化片段化DNA。在分析之前，通过添加相等体积的无核酸酶的水稀释片段化DNA。
片段化反应产物的分析(图2)披露gDNA缩短，在所有情况下指示包含切口的转座子末端一般不干扰转座酶催化活性。活体外转座反应产生长度在约100bp到2000bp范围内的DNA片段。当使用标准全长转座子末端(即用于活体外转座反应对照的天然转座子末端)和在始于Cut-key4寡核苷酸的3′端的第6、第8、第10、第14、第16、第18、第19、第27位置之后含有切口的转座子末端时，观测到DNA片段长度分布的类似曲线。然而，在始于Cut-key4寡核苷酸的3′端的第5和第12位置之后引入切口降低DNA片段化反应效率。
实例2
MuA转座酶与预带切口的转座子末端的组合可以用作适用于NGS和其它需要DNA剪切的分子生物学下游应用的通用和良好控制的DNA片段化工具
通过将各种DNA底物片段化来展现MuA转座酶/预带切口的转座子末端片段化方法的变通性：高复杂性人类gDNA、由自HeLa细胞分离的mRNA制成的双链复本DNA以及GC含量显著不同的三种微生物gDNA：50％GC(大肠杆菌菌株K-12亚株DH10B)、高GC(嗜热栖热菌菌株HB8)以及高AT(金黄色葡萄球菌菌株Mu50)。使用不同量的产生不同转座体量依赖性平均长度的DNA片段的MuA转座酶-预带切口的转座子末端复合物通过剪切大肠杆菌gDNA证明良好控制的片段化。使用经剪切大肠杆菌gDNA证明在用含切口转座子末端剪切所关注的DNA之后得到的DNA片段用于下一代测序的适合性以制备Ion Torrent PGM(生命技术公司)相容DNA库，其随后测序以证明指示良好DNA库质量的运行概述区段。
通过在10mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、50mM NaCl和在以上材料和方法中描述的以下条件中粘接等摩尔量的引物Cut-key4(1切口44-6)、Cut-key4(2切口44-6)以及非cut-key4来制备转座子末端(最终浓度60μM)。
在具有DMSO的复合物组装缓冲液中形成MuA转座体。转座子末端的最终浓度是8μM并且对于MuA转座酶是在复合物组装反应中1.65g/l(此是用于MuA转座体形成的等摩尔浓度)。在30℃下培育一小时之后，用稀释缓冲液稀释复合物组装混合物。最终稀释的MuA转座体复合物浓度是约0.48g/l。在使用之前在-70℃下储存MuA转座体复合物至少16小时。
使用Maxima H minus双链cDNA合成试剂盒(赛默科技)根据制造商的方案自500ngHeLa mRNA合成HeLa双链复本DNA。在ds cDNA合成之后，使用GeneJET PCR纯化试剂盒(赛默科技)遵循制造商建议纯化样品。用20μL洗脱缓冲液洗脱双链cDNA。
使用含有44-6预带切口的转座子末端的MuA转座体将人类gDNA、HeLA双链cDNA、大肠杆菌菌株K-12亚株DH10B gDNA、嗜热栖热菌菌株HB8以及金黄色葡萄球菌菌株Mu50 gDNA片段化。在单独管中使用于片段化反应缓冲液中的100ng任何DNA进行片段化反应。紧接在添加转座体混合物(1μl到30μl的最终反应体积，或在经控制大肠杆菌gDNA片段化的情况下，0.25μl、0.5μl、1.5μl以及2μl到30μl的最终反应体积)，涡旋以及短下旋之后，在30℃下培育管五分钟。随后，通过添加3μl 4.4％SDS停止片段化反应。在短暂涡旋之后，管保持在室温下。
使用Agencourt AMPure XP PCR纯化(贝克曼库尔特公司)系统纯化片段化DNA。将片段化DNA转移到1.5ml管中。随后将49.5μl彻底混合的AMPure XP(贝克曼库尔特公司)珠粒添加到反应混合物中并且通过上下吸液十次小心地混合。在室温下培育样品五分钟。在短旋转之后，将管置于磁性架中直到溶液澄清。在不干扰珠粒的情况下小心地抽吸上清液并且丢弃。管保持在架中并且添加400μl新制备的70％乙醇。在培育30秒之后，小心地去除上清液，并且重复相同洗涤程序。随后风干珠粒两分钟，自磁性架移出管，并且通过上下吸液十次使珠粒再悬浮于25μl无核酸酶的水中。将管放回磁性架中直到溶液变得澄清，并且将含有洗脱纯化片段化DNA的上清液转移到新管中。
使用安捷伦2100生物分析仪(安捷伦生物技术)和安捷伦高敏感性DNA试剂盒(安捷伦生物技术)遵循制造商的建议分析纯化片段化DNA。在分析之前，通过添加相等体积的无核酸酶的水稀释片段化DNA。
完整大肠杆菌gDNA 1.5ng也在安捷伦2100生物分析仪(安捷伦生物技术)上分析并且充当未裂解对照。
由100ng大肠杆菌gDNA制备易于在Ion Torrent PGM(生命技术公司)仪器上测序的DNA片段库，所述大肠杆菌gDNA用由预带切口的转座子末端44-6制成的1.5μl MuA转座体片段化。将纯化DNA片段的末端补平并且使用ClaSeek库制备试剂盒(赛默科技)根据制造商的方案连接Ion Torrent-相容衔接子在衔接子连接之后，使用MagJet NGS净化和尺寸选择试剂盒(赛默科技)纯化反应产物并且选择尺寸用于200bp测序。在安捷伦2100生物分析仪(安捷伦生物技术)上分析在衔接子连接之前和之后，所得DNA片段的尺寸分布，结果显示在图5中。使用离子库定量试剂盒(生命技术公司)将DNA库定量，使用Ion PGM模板OT2200试剂盒(生命技术公司)制备测序模板并且随后在Ion Torrent PGM(生命技术公司)上使用IonPGM 200测序试剂盒(生命技术公司)根据制造商的方案测序。用TorrentSuite(生命技术公司)软件，版本3.6产生测序报告。
用各种DNA底物证明MuA转座酶与预带切口的44-6转座子末端一起使用作为通用和经控制DNA片段化工具的可行性。测试五种DNA样品：高复杂性人类gDNA、由HeLa mRNA制成的双链复本DNA、特征在于低GC含量(33％)的金黄色葡萄球菌菌株Mu50 gDNA、GC含量是51％的大肠杆菌菌株K-12亚株DH10B gDNA以及嗜热栖热菌菌株HB8 gDNA(GC含量69％)。在所有情况下，片段化反应产生长度在100bp到2000bp范围内的DNA片段，如图3中所示。在大肠杆菌gDNA片段化实验中证明调节共有DNA片段的长度的能力。结果指示DNA片段化水平反向依赖于使用的MuA-转座体复合物的量：添加0.25μl裂解基因组DNA到平均1850bp的片段，0.5μl-约800bp，1.5μl-约450bp，2μl-约400bp，其显示在图4中。所属领域的技术人员将理解DNA剪切的水平可以通过改变添加的转座体的量以及通过减少或增加输入DNA的量来操控，并且共有的水平取决于输入DNA的完整性：为了实现极大gDNA片段的相同DNA片段化水平，与部分降解的低质量DNA样品相比，需要添加更多转座体。通过使用由预带切口的转座子末端44-6制成的1.5μl转座体制备的大肠杆菌gDNA库的测序结果(图6)披露良好DNA库质量(即少量低质量读数，较高比对读数百分比，较高平均原始精确度)，清楚地指示利用预带切口的转座子末端的DNA剪切方法可以用于制备NGS的高质量DNA库。重要的是注意用于可行性研究的预带切口的转座子末端44-6在始于Cut-key4寡核苷酸的3′端的第6位置之后含有切口并且因此在共有DNA的各末端留下6个来源于转座子末端的核苷酸。因此，在测序数据分析期间将在补平共有DNA片段末端之后剩余的转座子末端与衔接子序列一起删掉。此解释为何平均测序读取长度(图6)比用于测序的DNA库(图5，曲线B)短约100bp。所属领域的技术人员将理解衔接子与补平DNA片段末端的钝端连接可以容易地被粘性末端衔接子连接代替，所述粘性末端衔接子连接使用特别地设计的衔接子，其特征在于粘性末端，所述粘性末端与通过用由预带切口的转座子末端制得的转座体进行DNA片段化产生的那些末端互补。
实例3
使用MuA转座酶与预带切口的转座子末端的组合用于DNA片段化产生更高效地扩增的DNA片段
使用含有34-16预带切口的转座子末端的MuA转座体产生的DNA片段具有改进的PCR效率。此通过比较用含有所述带切口的转座子末端的MuA转座体和含有标准全长转座子末端的MuA转座体片段化的人类gDNA的PCR结果证明。
通过在10mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、50mM NaCl中，遵循在材料和方法中描述的条件粘接等摩尔量的引物Cut-key4(1切口34-16)、Cut-key4(2切口34-16)以及非cut-key4或Cut-key4(无切口)和非cut-key4来制备转座子末端(最终浓度60μM)。
在具有额外DMSO的复合物组装缓冲液中形成MuA转座体。转座子末端的最终浓度是8μM并且对于MuA转座酶在复合物组装反应中是1.65g/l。在30℃下培育一小时之后，用稀释缓冲液稀释复合物组装混合物。最终稀释的MuA转座体复合物浓度是约0.48g/l。在使用之前在-70℃下储存MuA转座体复合物至少16小时。
人类gDNA与含有34-16预带切口的转座子末端或标准全长转座子末端的MuA转座体并行片段化。使用于片段化反应缓冲液中的100ng人类DNA进行反应。紧接在添加转座体混合物(1μl到最终反应体积30μl)，涡旋以及短下旋之后，在30℃下培育管五分钟。通过添加3μl4.4％SDS停止反应。在短暂涡旋之后，管保持在室温下。
使用Agencourt AMPure XP PCR纯化(贝克曼库尔特公司)系统遵循实例1中描述的方案纯化片段化DNA。
纯化片段化人类gDNA充当用Phusion热启动II高保真DNA聚合酶(赛默科技)和4种引物进行的PCR扩增的模板：A和P1-具有转座子末端序列的离子平台特异性衔接子、A′和P1′-PCR扩增引物。
A-5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTTCGTGCGTCAGTTCA-3′，
P1-5′-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATTTCGTGCGTCAGTTCA-3′，
A′-5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTC-3′，
P1′-5′-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG-3′。
使用含20μl片段化DNA(最终体积是200μl)的10mM Tris-HCl，pH 8.8、110mM KCl、1，5mM MgCl2、0.1％(w/v)Triton X-100、200μM dATP、200μM dTTP、200μM dCTP、200μMdGTP使用以下循环条件进行反应：66℃3′，1×98℃30″；9×98℃10″，60℃50″，72℃10″；1×72℃1′。
使用Agencourt AMPure XP PCR纯化(贝克曼库尔特公司)系统纯化扩增DNA。将片段化DNA转移到1.5ml管中。随后将360μl彻底混合的Agencourt AMPure XP(贝克曼库尔特公司)珠粒添加到反应中并且通过上下吸液十次小心地混合。在室温下培育样品五分钟。在短旋转之后，将管置于磁性架中直到溶液澄清。在无珠粒破坏的情况下小心地抽吸上清液并且丢弃。管保持在架中并且添加1000μl新制备的70％乙醇。在培育30秒之后去除上清液。重复乙醇洗涤步骤。风干珠粒，自磁性架移出管，并且通过上下吸液十次将珠粒悬浮于20μl无核酸酶的水中。随后将管置于磁性架中直到溶液变得澄清并且将含有洗脱DNA的上清液转移到新管中。
使用安捷伦2100生物分析仪(安捷伦生物技术)和安捷伦高敏感性DNA试剂盒(安捷伦生物技术)分析在PCR扩增之前和之后的DNA样品。在分析之前，片段化DNA用无核酸酶的水稀释2倍，而扩增样品稀释4倍。
结果显示在图7中。其披露分析的DNA样品之间PCR扩增结果的差异。用含有在Cut-key4寡核苷酸的第16位置(始于3′端)之后具有切口的转座子末端的MuA转座体片段化的DNA样品产生减少量的在NGS中不需要的短DNA片段，因此显著改进PCR扩增的DNA库的质量。
实例4
MuA转座酶与含有缺口的转座子末端形成催化活性复合物
通过使用用数个具有缺口的不同转座子末端形成的MuA转座体将大肠杆菌基因组DNA片段化来证明MuA转座酶与含有核苷酸缺口的转座子末端形成催化活性复合物的能力。
如材料和方法中所描述制备在40μM的最终浓度下的转座子末端。
在具有额外DMSO的复合物组装缓冲液中形成MuA-转座子末端复合物(转座子混合物)。转座子末端的最终浓度是8μM并且对于MuA转座酶是在复合物组装反应中1.65g/l(此是用于MuA转座体形成的等摩尔浓度)。在30℃下培育一小时之后，用稀释缓冲液稀释复合物组装混合物。最终稀释的MuA-转座子末端复合物浓度是约0.48g/l。在使用之前在-70℃下储存MuA-转座子末端复合物至少16小时。
使用由38-12预带切口的转座子末端、具有缺口的42-6转座子末端和具有缺口的40-8转座子末端或用作活体外转座反应的对照的在图中缩写为“MuSeek”的全长天然转座子末端制成的MuA转座体将大肠杆菌菌株K-12底物DH10B gDNA片段化。在单独管中使用于片段化反应缓冲液中的100ng大肠杆菌gDNA进行四种片段化反应中的每一个。紧接在添加MuA-转座子末端复合物(1.5μl到最终反应体积30μl)，涡旋以及短下旋之后，在30℃下培育管五分钟。通过添加3μl 4.4％SDS停止片段化反应。在短暂涡旋之后，管保持在室温下。使用GeneJET NGS纯化试剂盒(赛默科技)纯化片段化DNA并且使用安捷伦2100生物分析仪(安捷伦生物技术)和安捷伦高敏感性DNA试剂盒(安捷伦生物技术)分析。
显示在图9中的结果证明MuA转座酶与在图中缩写为“MuSeek”的全长天然转座子末端形成高度催化活性复合物，产生在宽长度范围上分布的随机DNA片段。具有核苷酸缺口的转座子末端(缺口42-6、缺口40-8)也与MuA转座酶形成催化活性复合物并且能够将DNA片段化。MuA转座酶-带缺口转座子末端复合物的DNA片段化概况类似于使用MuA转座酶-带切口(38-12)转座子末端复合物的先前DNA片段化实验。
实例5
含有具缺口的转座子末端的MuA转座体可以用作允许产生具有预定平均长度的DNA片段的经控制DNA片段化工具
通过使用用天然转座子末端、带切口的转座子末端或具有核苷酸缺口的转座子末端形成的MuA转座体将大肠杆菌基因组DNA片段化来显示DNA片段长度对组装到MuA转座体中的转座子末端结构、MuA转座体的量以及活体外转座反应时间的依赖性。
如材料和方法中所描述制备在40μM的最终浓度下的转座子末端。
在具有额外DMSO的复合物组装缓冲液中形成MuA-转座子末端复合物(转座体混合物)。转座子末端的最终浓度是8μM并且对于MuA转座酶是在复合物组装反应中1.65g/l(此是用于MuA转座体形成的等摩尔浓度)。在30℃下培育一小时之后，用稀释缓冲液稀释复合物组装混合物。最终稀释的MuA-转座子末端复合物浓度是约0.48g/l。在使用之前在-70℃下储存MuA-转座体复合物至少16小时。
使用由38-12预带切口的转座子末端、具有缺口的42-6转座子末端或用作活体外转座反应的对照的在图中缩写为“MuSeek”的全长天然转座子末端制成的MuA转座体将大肠杆菌菌株K-12亚株DH10B gDNA片段化。在单独管中进行各片段化反应，所述单独管在30℃下培育含100ng大肠杆菌gDNA的具有不同量(0.5μl和1.5μl，最终反应体积30μl)的MuA-转座体复合物的片段化反应缓冲液分别持续1.5分钟、5分钟以及10分钟的不同时间段。通过添加3μl 4.4％SDS停止片段化反应。在短暂涡旋之后，管保持在室温下。使用GeneJET NGS纯化试剂盒(赛默科技)纯化片段化DNA并且使用安捷伦2100生物分析仪(安捷伦生物技术)和安捷伦高敏感性DNA试剂盒(安捷伦生物技术)分析。
显示在图10中的结果指示在1.5min-10min的活体外转座反应时间下使用1.5μlMuA-天然转座子末端复合物的DNA片段化产生在约200bp到2000bp的宽长度范围上的随机DNA片段分布。使用相同或更低量的MuA-带切口转座子末端(切口38-12)复合物或MuA-具缺口转座子末端(缺口42-6)复合物的在1.5min-10min的活体外转座反应下的DNA片段化产生特定DNA片段化概况，其中仅产生预定长度的DNA片段，其自约1kb到6kb分布。这些结果支持通过转座子末端经修饰以含有缺口或切口的MuA转座体催化的DNA片段化反应进行地比通过MuA-天然转座子末端复合物催化的DNA片段化反应慢的假设。随后，使用较低DNA输入和延长的培育时间研究活体外转座反应的效率。将25ng、50ng以及100ng的量的大肠杆菌gDNA与1.5μl MuA-天然转座子末端复合物和MuA-具缺口转座子末端(缺口42-6)复合物一起培育30分钟。如上文所指示纯化并且分析片段化DNA。显示在图11中的结果证明对于MuA天然转座子末端复合物和MuA-具缺口转座子末端(缺口42-6)复合物，片段化反应混合物中的较低量的DNA输入和延长的培育时间引起DNA片段化反应产物朝向较短长度偏移。这些结果披露DNA片段化反应产物的长度可以通过操控催化活性MuA-转座子末端复合物的量、活体外转座反应时间或DNA输入量来预定。举例来说，对于输入DNA(100ng)和含有天然转座子末端或具有缺口的42-6转座子末端的MuA转座体(3μl)的量相同的DNA片段化反应，通过将经由含有具缺口42-6转座子末端的MuA转座体催化的DNA片段化反应时间延长到10min实现类似DNA片段化概况(图12)。
实例支持本发明的新颖传授内容，所述传授内容是基于转座子末端经修饰以含有缺口、切口或脱嘌呤/脱嘧啶位点的转座体保留其以酶方式剪切各种DNA底物的能力，并且转座子末端内的缺口、切口或脱嘌呤/脱嘧啶位点减缓由转座酶催化的活体外转座反应速率的观测结果。因此，可以调节DNA片段化反应动力学(即转座酶-转座子末端复合物量、DNA输入量和/或DNA片段化反应时间)使得仅产生预定平均长度的DNA片段，提供通用和经控制DNA片段化。
实例6
MuA转座酶与含有简并序列的经修饰转座子末端形成催化活性复合物并且可以用作允许产生具有预定平均长度的DNA片段的经控制DNA片段化工具
分析基本上与野生型MuA转座子序列(天然序列)不同的许多转座子末端序列参与转座反应的能力。制备转座子库，其包含具有在基于科学文献，称为保守位点的位置中引入的简并核苷酸的转座子末端，并且用于由MuA催化的转座反应。将所得转座产物测序并且关于序列变异分析。
结果显示在图13中。在此实验中，制备简并核苷酸混合物，因此各N表示特别摆动混合物，其中在野生型转座子序列中发现的核苷酸在70％频率下保留，而其它三种核苷酸在10％∶10％∶10％的相等频率下插入。竖轴上的数字1表示预期核苷酸分布频率(70％∶10％∶10％∶10％)与自测序数据计算的实际频率之间的100％一致。竖轴上的数字越小，在某一位置观测到越高的与预期核苷酸分布频率的偏差。为简单起见，仅仅显示转移DNA链。
发现并非所有保守位置都对于实验框架中的转座效率高度重要。然而，MuA转座酶对转座子中的许多位置具有一些偏好。因此，所属领域的技术人员可以设计MuA转座酶对于其具有较低亲和力的不同转座子。然后，选择并且分析虽然具有较低效率，但仍能够支持转座反应的数种经修饰转座子。
在第一实验中选择为能够支持转座的数种不同转座子(表3)用于以如上文所描述的等摩尔浓度与MuA转座酶形成转座体复合物。转座子DNA的最终浓度是8μM并且对于MuA转座酶在复合物组装反应中是1.65g/l。在30℃下培育一小时之后，用稀释缓冲液稀释复合物组装混合物。最终稀释的MuA转座体复合物浓度是约0.48g/l。在使用之前在-70℃下储存MuA转座体复合物至少16小时。随后，使用预先形成的复合物使大肠杆菌基因组DNA经受片段化反应。通过Agencourt AMPure XP系统(贝克曼库尔特公司)纯化片段化反应产物并且在安捷伦2100生物分析仪上使用安捷伦高敏感性DNA试剂盒(安捷伦生物技术)遵循制造商的建议分析。图14显示当使用对照转座子(天然转座子末端序列)时，gDNA片段化极高效，而对于经修饰转座子末端，片段化仅仅在转座子第5号、第10号以及第11号的情况下显而易见。当使用转座子第9号时，片段化完全消除。
并行地，对在第一实验中使用的所有预先形成的MuA-转座子复合物(表3)进行EMSA分析。EMSA分析结果显示在图15中。使用琼脂糖凝胶电泳在于1XTBE缓冲液中的含有87μg/ml BSA和87μg/ml肝素的2％琼脂糖凝胶中分析由转座体复合物形成引起的DNA偏移。DNA用溴化乙锭染色。结果显示仅仅当MuA转座酶与对照(天然)转座子复合时形成强复合物。用转座子第5号、第10号、第11号形成较弱复合物。这些数据与图13中的结果密切相关。在转座子第9号的情况下，不存在显而易见的复合物形成，指示MuA不结合到此特定DNA序列。此解释图13中显示的使用此转座体复合物的片段化不存在。
图13和14中呈现的实验结果清楚地指示用经修饰转座子获得的降低的片段化水平(效率)是MuA转座酶对经修饰转座子末端的亲和力降低的结果。因此，可以通过改变天然转座子末端的序列或通过改变基因组DNA和包含经修饰转座子末端的预组装转座体复合物的量来改变片段化水平和片段化产物的平均长度。
表3.双链转座子序列.
实例7
使用含有带切口或带缺口转座子末端的Tn5转座体作为允许产生具有预定平均长度的DNA片段的经控制DNA片段化工具
在大肠杆菌中合成、克隆以及过度表达高变Tn5转座酶基因。纯化Tn5转座酶蛋白质并且用相关转座子末端制得突触复合物，所述相关转座子末端是完整的或在数个位置中具有无碱基位点、切口或缺口，其中已经表明此类经修饰序列不干扰转座酶结合到其识别序列。评估此类转座体复合物以控制方式剪切DNA的能力。
说明书中显示和描述的实施例仅仅是作为所属领域的技术人员的发明人的特定实施例并且不以任何方式限制。因此，可以在不脱离本发明精神的情况下在以上权利要求书的范围中对那些实施例作出各种改变、修改或变更。引用的参考文献以全文引用的方式明确并入本文中。
实例8
使用MuA转座酶与预带切口的转座子末端的组合用于在单一管中进行DNA片段化、衔接子添加以及扩增反应。
使用含有Cut key4(34-16)和非cut key4(42-11)预带切口的转座子末端的MuA转座体并且在于同一管中片段化之后产生的DNA片段产生AA-PCR。此通过比较用含有所述带切口的转座子末端的MuA转座体和含有标准全长转座子末端的MuA转座体片段化的大肠杆菌gDNA的PCR结果证明。
通过在10mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、50mM NaCl中，遵循在材料和方法中描述的条件粘接等摩尔量的引物Cut-key4(1切口34-16)、Cut-key4(2切口34-16)以及非cut-key4(1切口42-11)、非cut-key4(2切口42-11)或Cut-key4(无切口)以及非cut-key4来制备转座子末端(最终浓度60μM)。
在具有额外DMSO的复合物组装缓冲液中形成MuA转座体。转座子末端的最终浓度是8μM并且对于MuA转座酶在复合物组装反应中是1.65g/l。在30℃下培育一小时之后，用稀释缓冲液稀释复合物组装混合物。最终稀释的MuA转座体复合物浓度是约0.48g/l。在使用之前在-70℃下储存MuA转座体复合物至少16小时。
大肠杆菌gDNA与含有34-16/42-11预带切口的转座子末端或标准全长转座子末端的MuA转座体并行地片段化。使用于AA-PCR反应缓冲液中的100ng大肠杆菌DNA进行反应。紧接在添加转座体混合物(1.5μl到最终反应体积30μl)，涡旋以及短下旋之后，在30℃下培育管五分钟。
片段化大肠杆菌gDNA充当用Phusion热启动II高保真DNA聚合酶(赛默科技)和4种引物进行的PCR扩增的模板：A和P1-具有转座子末端序列的离子平台特异性衔接子、A′和P1′-PCR扩增引物。
A-5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTTCGTGCGTCAGTTCA-3′，
P1-5′-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATTTCGTGCGTCAGTTCA-3′，
A′-5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTC-3′，
P1′-5′-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG-3′。
使用含30μl片段化DNA(最终体积是50μl)的10mM Tris-HCl，pH 8.8、110mM KCl、1，5mM MgCl2、0.1％(w/v)Triton X-100、200μM dATP、200μM dTTP、200μM dCTP、200μMdGTP使用以下循环条件进行反应：66℃3′，1×98℃30"；9×98℃10″，60℃50"，72℃10″；1×72℃1′。
使用GeneJET NGS净化试剂盒(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))系统纯化扩增DNA。将扩增DNA转移到1.5ml管中。随后将250μl彻底混合的GeneJET NGS净化试剂盒(赛默飞世尔科技)结合缓冲液和50μl 96％乙醇添加到含样品的管中并且涡旋。在短旋转之后，将溶液转移到预组装有收集管的纯化柱中并且在10 000xg下离心30秒。丢弃流出物。将200μl预洗涤缓冲液添加到预组装有收集管的纯化柱中并且在10 000x g下离心30秒。丢弃流出物。将700μl洗涤(补充有乙醇)缓冲液添加到预组装有收集管的纯化柱中并且在10 000x g下离心30秒。丢弃流出物。同样再重复洗涤步骤一次。空柱在14 000g下旋转2min以完全去除残余洗涤缓冲液。将纯化柱转移到干净的1.5mL微量离心管中。将20μlH2O添加到纯化柱的中心并且在14 000x g下离心1min。收集含有洗脱DNA的上清液。
使用安捷伦2100生物分析仪(安捷伦生物技术)和安捷伦高敏感性DNA试剂盒(安捷伦生物技术)分析在PCR扩增之后的DNA样品。在分析之前，片段化DNA用无核酸酶的水稀释2倍，而扩增样品稀释4倍。
结果显示在图16中。其披露片段化反应和AA-PCR可以在同一管中组合而不需要在片段化之后纯化。用含有具有在Cut-key4寡核苷酸的第16位置(始于3′端)之后的切口和在非cut-key4寡核苷酸的第11位置(始于5′端)之后的切口的转座子末端的MuA转座体片段化的DNA样品引起DNA片段的量减少，在片段化之后的不需要的蛋白质-DNA复合物随后在同一管中产生一种以上反应，因此显著改进PCR-扩增DNA库的质量。

Claims (63)

1.一种用于经控制DNA片段化的活体外方法，所述方法包含
(a)使形成包含以下的转座体复合物的转座子和转座酶与标靶DNA接触，
第一转座子，其具有可经所述转座酶识别的第一转座子核苷酸末端序列，和
第二转座子，其具有可经所述转座酶识别的第二转座子核苷酸末端序列，
形成反应混合物，
其中所述第一转座子末端序列、所述第二转座子末端序列或所述第一转座子末端序列和所述第二转座子末端序列包含选自由以下组成的群组的经修饰序列：简并序列、脱嘌呤位点、脱嘧啶位点、切口、核苷酸缺口，以及其组合；和
b)在用于转座反应的条件下培育所述反应混合物，产生标靶DNA片段，和
将所述第一转座子末端序列、所述第二转座子末端序列、或所述第一转座子末端序列和所述第二转座子末端序列并入到所述标靶DNA的至少一个5′端中，
其中相对于未经修饰的转座子末端序列，转座酶对含有所述修饰的所述第一、第二或第一和第二转座子末端序列的亲和力降低，产生经控制DNA片段化。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含(c)在不存在补平或接合衔接子的情况下，在扩增反应中使用与所述标靶DNA片段的所述5′端中的转座子末端的第二部分互补的第一和第二寡核苷酸引物扩增所述片段化标靶DNA。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一和第二引物任选地包含5′衔接子尾部。
4.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含(c)将衔接子补平和/或接合到所述标靶DNA片段的至少一端，
其中补平产生钝端或A-突出端，并且
其中接合添加钝端或粘性末端衔接子。
5.根据权利要求1所述的方法，其中当所述修饰包含所述核苷酸缺口或切口时，由所述修饰界定并且并入到所述标靶DNA中的所述转座子末端的一部分在所述转座反应之后或在随后扩增反应之后或期间自所述标靶DNA崩解，其中所述转座子末端的所述部分自所述标靶DNA片段崩解增强所述标靶DNA片段的扩增效率，和/或产生不对称带尾标靶DNA片段。
6.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含使包含在所述5′端的所述转座子末端的所述标靶DNA片段与具有5′-3′核酸外切酶或链置换活性的DNA聚合酶接触，由所述标靶DNA片段产生完全双链DNA的步骤。
7.根据权利要求1所述的方法，其产生长度是100bp到2000bp的标靶DNA片段。
8.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含通过以下中的一个将所得标靶DNA片段的bp长度改变为预定平均长度：(a)改变转座子复合物的量，(b)改变所述反应复合物中标靶DNA的量，或(c)改变所述转座反应的培育时间。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述转座子末端选自Mu转座子末端、Mos1转座子末端、哈氏弧菌(Vibrio harvey)转座子末端和/或Tn5转座子末端。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述转座酶选自MuA转座酶、Mos1转座酶、哈氏弧菌转座酶或Tn5转座酶。
11.根据权利要求1所述的方法，其使用Mu转座子末端和MuA转座酶。
12.根据权利要求1所述的方法，其使用Mos1转座子末端和Mos1转座酶。
13.根据权利要求1所述的方法，其使用Tn5转座子末端和Tn5转座酶。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述经修饰序列是在始于3′转座子末端的第6、第8、第10、第14、第16、第18、第19或第27核苷酸位置处的切口，并且在一个链的相邻核苷酸之间不存在磷酸二酯键。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述经修饰序列是在至少一个链的序列中的1、2或3个核苷酸的缺口。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述脱嘌呤位点或脱嘧啶位点分别包含选自甲基化碱基、无碱基位点和尿嘧啶的非嘌呤和非嘧啶核苷酸。
17.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一和/或所述第二寡核苷酸引物的所述5′衔接子尾部包含选自由以下组成的群组的标签：扩增标签、测序标签、检测标签以及其组合。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一和所述第二寡核苷酸引物的所述衔接子尾部包含测序标签，并且所述方法进一步包含使来自(c)的扩增产物变性以产生单链DNA；将所述单链DNA粘接到固体载体，所述固体载体涂布有与所述测序标签互补的寡核苷酸；以及使用固定到所述固体载体的所述单链DNA作为模板将DNA测序。
19.根据权利要求5所述的方法，其使得待测序的转座子DNA的量最小化。
20.根据权利要求1所述的方法，其使得产生所需标靶DNA片段长度。
21.一种转座体复合物，其包含以下的双链转座子：具有可经转座酶识别的第一转座子核苷酸末端序列的第一转座子，和具有可经所述转座酶识别的第二转座子核苷酸末端序列的第二转座子，并且其中所述第一转座子末端序列、所述第二转座子末端序列或所述第一转座子末端序列和所述第二转座子末端序列包含选自以下的引入的经修饰序列：简并序列、脱嘌呤/脱嘧啶位点、切口和/或核苷酸缺口。
22.一种转座体复合物，其包含以下的双链转座子：第一转座子，其具有第一转座子核苷酸末端序列，所述第一转座子核苷酸末端序列可经转座酶识别并且含有切口；和第二转座子，其具有第二转座子核苷酸末端序列，所述第二转座子核苷酸末端序列可经所述转座酶识别并且如果所述第一转座子核苷酸末端序列不含切口，那么所述第二转座子核苷酸末端序列含有切口，或如果所述第一转座子核苷酸末端序列含有切口，那么所述第二转座子核苷酸末端序列任选地含有切口。
23.一种转座体复合物，其包含以下的双链转座子：第一转座子，其具有第一转座子核苷酸末端序列，所述第一转座子核苷酸末端序列可经转座酶识别并且含有缺口；和第二转座子，其具有第二转座子核苷酸末端序列，所述第二转座子核苷酸末端序列可经所述转座酶识别并且如果所述第一转座子核苷酸末端序列不含缺口，那么所述第二转座子核苷酸末端序列含有缺口，或如果所述第一转座子核苷酸末端序列含有缺口，那么所述第二转座子核苷酸末端序列任选地含有缺口。
24.一种转座体复合物，其包含以下的双链转座子：第一转座子，其具有第一转座子核苷酸末端序列，所述第一转座子核苷酸末端序列可经转座酶识别并且含有脱嘌呤位点；和第二转座子，其具有第二转座子核苷酸末端序列，所述第二转座子核苷酸末端序列可经所述转座酶识别并且如果所述第一转座子核苷酸末端序列不含脱嘌呤位点，那么所述第二转座子核苷酸末端序列含有脱嘌呤位点，或如果所述第一转座子核苷酸末端序列含有脱嘌呤位点，那么所述第二转座子核苷酸末端序列任选地含有脱嘌呤。
25.一种转座体复合物，其包含以下的双链转座子：第一转座子，其具有第一转座子核苷酸末端序列，所述第一转座子核苷酸末端序列可经转座酶识别并且含有脱嘧啶位点；和第二转座子，其具有第二转座子核苷酸末端序列，所述第二转座子核苷酸末端序列可经所述转座酶识别并且如果所述第一转座子核苷酸末端序列不含脱嘧啶位点，那么所述第二转座子核苷酸末端序列含有脱嘧啶位点，或如果所述第一转座子核苷酸末端序列含有脱嘧啶位点，那么所述第二转座子核苷酸末端序列任选地含有脱嘧啶位点。
26.一种试剂盒，其包含形成包含以下的转座子复合物的转座子和转座酶：具有可经转座酶识别的第一转座子核苷酸末端序列的第一转座子，和具有可经所述转座酶识别的第二转座子核苷酸末端序列的第二转座子，其中所述第一转座子末端序列、所述第二转座子末端序列或所述第一转座子末端序列和所述第二转座子末端序列包含选自由以下组成的群组的经修饰序列：简并序列、脱嘌呤位点、脱嘧啶位点、切口、核苷酸缺口以及其组合；和使用所述转座子复合物产生平均预定DNA片段长度的DNA库的说明书。
27.一种试剂盒，其包含形成如权利要求21到25中任一权利要求所述的转座体复合物的转座子和转座酶。
28.一种用于经控制DNA剪切以获得平均预定长度的DNA片段的方法，所述方法包含
a)使形成包含以下的转座体复合物的转座子和转座酶与标靶DNA接触：具有可经所述转座酶识别的第一转座子核苷酸末端序列的第一转座子，和具有可经所述转座酶识别的第二转座子核苷酸末端序列的第二转座子，形成反应混合物，其中所述第一转座子末端序列、所述第二转座子末端序列或所述第一转座子末端序列和所述第二转座子末端序列包含选自简并序列或损伤的修饰，所述损伤选自脱嘌呤位点、脱嘧啶位点、切口和/或核苷酸缺口，和
b)在用于转座反应的条件下培育所述反应混合物，产生平均预定长度的标靶DNA片段，其中所述方法引起较慢转座反应速率和/或转座酶对所述转座体复合物内的所述转座子的较低亲和力。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述标靶DNA片段的所得平均预定长度通过改变转座子复合物的量、所述反应复合物中标靶DNA的量、所述转座反应的培育时间中的至少一个，改变所述简并序列的量或改变所述简并序列的位置来实现。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述损伤是分别包含选自甲基化碱基、无碱基位点和尿嘧啶的非嘌呤和非嘧啶核苷酸的脱嘌呤或脱嘧啶位点，其中所述损伤引起所述转座体复合物的DNA片段化速率降低。
31.根据权利要求1所述的方法，其中所述转座体复合物通过组合等摩尔浓度的转座酶与转座子预先形成。
32.根据权利要求28所述的方法，其中所述转座体复合物通过组合等摩尔浓度的转座酶与转座子预先形成。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述预先形成的转座体复合物在与所述标靶DNA接触之前稀释，产生次优反应混合物。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述预先形成的转座体复合物在与所述标靶DNA接触之前稀释，产生次优反应混合物。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述次优反应混合物引起预先形成的转座体复合物耗尽，并且所述转座反应在所希望的DNA降解水平下停止。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述次优反应混合物引起预先形成的转座体复合物耗尽，并且所述转座反应在所希望的DNA降解水平下停止。
37.一种制备多种转座体复合物的方法，其包含：
a)在单一反应混合物中接触
(i)多种转座酶，与
(ii)多种含有第一转座子末端序列的多核苷酸，其中所述第一转座子末端序列能够结合到来自所述多种转座酶的转座酶并且其中所述第一转座子末端序列含有至少一个切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点，和
(iii)多种含有第二转座子末端序列的多核苷酸，其中所述第二转座子末端序列能够结合到来自所述多种转座酶的转座酶并且其中所述第二转座子末端序列含有至少一个切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点；和
b)形成多种转座体复合物，至少一种转座体复合物包括转座酶、第一转座子末端序列以及第二转座子末端序列。
38.根据权利要求37所述的方法，其进一步包含：通过使所述多种转座体复合物与多个标靶DNA分子接触形成多种转座体/标靶DNA复合物。
39.根据权利要求38所述的方法，其进一步包含：通过将所述第一和所述第二转座子末端序列转座到所述标靶DNA分子中并且将所述标靶DNA片段化来产生至少一个片段化DNA分子，其具有接合到所述第一转座子末端序列的第一端和接合到所述第二转座子末端序列的第二端，其中所述至少一个片段化DNA分子包括具有至少一个切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点的所述第一转座子末端序列和具有至少一个切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点的第二端。
40.根据权利要求39所述的方法，其进一步包含：扩增所述至少一个片段化DNA分子以产生经扩增的片段化DNA分子。
41.根据权利要求40所述的方法，其进一步包含：使所述经扩增的标靶DNA变性以产生多个单链片段化DNA。
42.根据权利要求41所述的方法，其进一步包含：将所述多个单链片段化DNA固定到载体。
43.根据权利要求42所述的方法，其进一步包含：用大规模平行测序反应将所述多个单链片段化DNA测序。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述大规模平行测序反应包含并入核苷酸。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述大规模平行测序反应包含提供具有多个反应位点的阵列的表面，并且所述反应位点可操作地连接于传感器。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述传感器检测离子、氢离子、质子、磷酸酯基，包括焦磷酸酯基中的变化。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述传感器检测核苷酸并入反应的至少一种副产物或裂解产物。
48.根据权利要求47所述的方法，其中核苷酸并入反应的所述副产物或裂解产物包括离子(例如氢离子)、质子、磷酸酯基，包括焦磷酸酯基。
49.根据权利要求45所述的方法，其中所述传感器包含ISFET。
50.根据权利要求37所述的方法，其中所述第一转座子末端序列包含具有第一攻击链(attacking strand)和第一非攻击链的双链核酸。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述第一攻击链包括第一切口或第一缺口。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述第一非攻击链包括第一切口或第一缺口。
53.根据权利要求50所述的方法，其中所述第一转座子末端序列包括具有第一切口或第一缺口的第一攻击链和具有第一切口或第一缺口的第一非攻击链。
54.根据权利要求51所述的方法，其中所述第一攻击链中的所述切口或缺口位于始于所述攻击链的3′端的第六、八十、第十、第十四、第十六、第十八、第十九或第二十七核苷酸之后。
55.根据权利要求37所述的方法，其中所述第二转座子末端序列包含具有第二攻击链和第二非攻击链的双链核酸。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述第二攻击链包括第二切口或第二缺口。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述第二非攻击链包括第二切口或第二缺口。
58.根据权利要求55所述的方法，其中所述第二转座子末端序列包括具有第二切口或第二缺口的第二攻击链和具有第二切口或第二缺口的第二非攻击链。
59.根据权利要求56所述的方法，其中所述第二攻击链中的所述切口位于始于所述攻击链的3′端的第六、八十、第十、第十四、第十六、第十八、第十九或第二十七核苷酸之后。
60.多个片段化DNA分子，其通过根据权利要求39所述的方法产生。
61.根据权利要求39所述的方法，其中所述多个片段化DNA分子的尺寸范围是100-2000bp。
62.根据权利要求39所述的方法，其中所述多个中的所述片段化DNA分子的平均长度可以通过以下来控制：(i)改变与所述多个标靶DNA接触的转座体复合物的量，(ii)改变与所述转座体复合物接触的标靶DNA的量，(iii)改变所述转座反应的时间量，或(iv)改变所述转座子末端序列上所述切口或缺口的位置。
63.一种用于将DNA片段化的活体外方法，其包含：
a)通过在单一反应混合物中接触以下来形成多种转座体复合物
(i)多种转座酶，与
(ii)多种含有第一转座子末端序列的多核苷酸，其中所述第一转座子末端序列能够结合到来自所述多种转座酶的转座酶并且其中所述第一转座子末端序列含有至少一个切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点，和
(iii)多种含有第二转座子末端序列的多核苷酸，其中所述第二转座子末端序列能够结合到来自所述多种转座酶的转座酶并且其中所述第二转座子末端序列含有至少一个切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点；和
b)使所述多种转座体复合物与多个标靶DNA分子接触；以及
c)通过将所述第一和所述第二转座子末端序列转座到所述标靶DNA分子中并且将所述标靶DNA片段化来产生至少一个片段化DNA分子，其具有接合到所述第一转座子末端序列的第一端和接合到所述第二转座子末端序列的第二端，其中所述至少一个片段化DNA分子包括具有至少一个切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点的所述第一转座子末端序列和具有至少一个切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点的第二端。
CN201480077065.4A 2014-02-03 2014-12-30 用于经控制dna片段化的方法 Active CN106103713B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461934879P 2014-02-03 2014-02-03
US61/934,879 2014-02-03
PCT/EP2014/079473 WO2015113725A1 (en) 2014-02-03 2014-12-30 Method for controlled dna fragmentation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106103713A true CN106103713A (zh) 2016-11-09
CN106103713B CN106103713B (zh) 2021-05-28

Family

ID=52432770

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480077065.4A Active CN106103713B (zh) 2014-02-03 2014-12-30 用于经控制dna片段化的方法
CN201680066568.0A Pending CN108368503A (zh) 2014-02-03 2016-11-16 用于受控dna片段化的方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680066568.0A Pending CN108368503A (zh) 2014-02-03 2016-11-16 用于受控dna片段化的方法

Country Status (4)

Country Link
US (2) US20170009288A1 (zh)
EP (2) EP3102691B1 (zh)
CN (2) CN106103713B (zh)
WO (2) WO2015113725A1 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106801044A (zh) * 2017-01-09 2017-06-06 北京全式金生物技术有限公司 一种环状转座子复合物及其应用
CN111615560A (zh) * 2018-01-05 2020-09-01 牛津纳米孔技术公司 用于基于酶相互作用持续时间选择多核苷酸的方法
CN112689673A (zh) * 2018-07-11 2021-04-20 埃克斯基因美国公司 转座体使能的dna/rna测序（ted rna-seq）
CN113227468A (zh) * 2018-11-21 2021-08-06 卡里乌斯公司 感染性疾病的检测和预测
CN117867090A (zh) * 2024-03-12 2024-04-12 北京雅康博生物科技有限公司 Dna片段化水平定量用标准品及其制备方法和应用

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10400280B2 (en) 2012-08-14 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CA2881685C (en) 2012-08-14 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Microcapsule compositions and methods
CA2894694C (en) 2012-12-14 2023-04-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
KR20230003659A (ko) 2013-02-08 2023-01-06 10엑스 제노믹스, 인크. 폴리뉴클레오티드 바코드 생성
WO2014189957A2 (en) 2013-05-23 2014-11-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Transposition into native chromatin for personal epigenomics
US10287622B2 (en) 2013-11-07 2019-05-14 Agilent Technologies, Inc. Plurality of transposase adapters for DNA manipulations
US11136576B2 (en) 2014-02-03 2021-10-05 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Method for controlled DNA fragmentation
EP3102691B1 (en) * 2014-02-03 2019-09-11 Thermo Fisher Scientific Baltics UAB Method for controlled dna fragmentation
BR112016023625A2 (pt) 2014-04-10 2018-06-26 10X Genomics, Inc. dispositivos fluídicos, sistemas e métodos para encapsular e particionar reagentes, e aplicações dos mesmos
AU2015279548B2 (en) 2014-06-26 2020-02-27 10X Genomics, Inc. Methods of analyzing nucleic acids from individual cells or cell populations
CA2953469A1 (en) 2014-06-26 2015-12-30 10X Genomics, Inc. Analysis of nucleic acid sequences
JP2017532042A (ja) 2014-10-29 2017-11-02 １０エックス ゲノミクス，インコーポレイテッド 標的化核酸配列決定のための方法及び組成物
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
BR112017014902A2 (pt) 2015-01-12 2018-03-13 10X Genomics Inc processos e sistemas para a preparação de bibliotecas de sequenciamento de ácido nucleico e bibliotecas preparadas usando os mesmos
CN107002153B (zh) * 2015-02-04 2020-10-27 深圳华大生命科学研究院 一种构建长片段测序文库的方法
EP3262407B1 (en) 2015-02-24 2023-08-30 10X Genomics, Inc. Partition processing methods and systems
JP2018505688A (ja) 2015-02-24 2018-03-01 １０エックス ゲノミクス，インコーポレイテッド 標的化核酸配列包括度（ｃｏｖｅｒａｇｅ）のための方法
JP6698708B2 (ja) 2015-06-09 2020-05-27 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 分子タグ付けのための方法、システム、組成物、キット、装置、及びコンピュータ可読媒体
ES2926495T3 (es) 2015-12-04 2022-10-26 10X Genomics Inc Métodos y composiciones para el análisis de ácidos nucleicos
AU2017237199B2 (en) 2016-03-25 2020-11-05 Karius, Inc. Synthetic nucleic acid spike-ins
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
US10240196B2 (en) 2016-05-27 2019-03-26 Agilent Technologies, Inc. Transposase-random priming DNA sample preparation
EP3875603A1 (en) 2016-07-12 2021-09-08 Life Technologies Corporation Compositions and methods for detecting nucleic acid regions
WO2018057779A1 (en) * 2016-09-23 2018-03-29 Jianbiao Zheng Compositions of synthetic transposons and methods of use thereof
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2018140966A1 (en) 2017-01-30 2018-08-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
SG11201810639RA (en) * 2017-02-21 2018-12-28 Illumina Inc Tagmentation using immobilized transposomes with linkers
US20180340169A1 (en) 2017-05-26 2018-11-29 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
EP3445876B1 (en) 2017-05-26 2023-07-05 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
WO2019060722A2 (en) * 2017-09-22 2019-03-28 X Gen Us Co. METHODS AND COMPOSITIONS FOR USE IN PREPARING POLYNUCLEOTIDES
CN111051523B (zh) 2017-11-15 2024-03-19 10X基因组学有限公司 功能化凝胶珠
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
EP3749765A4 (en) * 2018-02-08 2021-10-06 Universal Sequencing Technology Corporation DBA UST Corporation METHODS AND COMPOSITIONS FOR MONITORING THE ORIGIN OF NUCLEIC ACID FRAGMENTS FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING
EP3775271B1 (en) 2018-04-06 2025-03-12 10X Genomics, Inc. Systems and methods for quality control in single cell processing
WO2020061529A1 (en) * 2018-09-20 2020-03-26 13.8, Inc. Methods for haplotyping with short read sequence technology
WO2021048444A1 (en) 2019-09-12 2021-03-18 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Recombinant transposon ends
JP7489455B2 (ja) * 2019-10-25 2024-05-23 チャンピン ナショナル ラボラトリー 哺乳類ｄｎａのメチル化の検出及び分析
IL294909A (en) 2020-02-13 2022-09-01 Zymergen Inc Metagenomic library and natural product discovery platform
WO2022232631A1 (en) * 2021-04-30 2022-11-03 Quantum-Si Incorporated Universal adaptor for sequencing
EP4334442A1 (en) * 2021-05-03 2024-03-13 European Molecular Biology Laboratory Methods for isolating and/or obtaining captured polynucleotide fragments
CN117940622A (zh) * 2021-08-26 2024-04-26 因美纳有限公司 用于检测基因组甲基化的方法和组合物

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100120098A1 (en) * 2008-10-24 2010-05-13 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
US20130017978A1 (en) * 2011-07-11 2013-01-17 Finnzymes Oy Methods and transposon nucleic acids for generating a dna library

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
IL86724A (en) 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
CA1340807C (en) 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
CA2020958C (en) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
US5273881A (en) 1990-05-07 1993-12-28 Daikin Industries, Ltd. Diagnostic applications of double D-loop formation
US5223414A (en) 1990-05-07 1993-06-29 Sri International Process for nucleic acid hybridization and amplification
ATE153707T1 (de) 1990-05-07 1997-06-15 Daikin Ind Ltd Diagnostische anwendungen der bildung von doppelten d-loops.
US5194370A (en) 1990-05-16 1993-03-16 Life Technologies, Inc. Promoter ligation activated transcription amplification of nucleic acid sequences
US5677170A (en) 1994-03-02 1997-10-14 The Johns Hopkins University In vitro transposition of artificial transposons
FI103809B1 (fi) 1997-07-14 1999-09-30 Finnzymes Oy In vitro -menetelmä templaattien tuottamiseksi DNA-sekventointia varten
US8030000B2 (en) 2002-02-21 2011-10-04 Alere San Diego, Inc. Recombinase polymerase amplification
CA2476481C (en) 2002-02-21 2016-01-26 Asm Scientific, Inc. Recombinase polymerase amplification
US7399590B2 (en) 2002-02-21 2008-07-15 Asm Scientific, Inc. Recombinase polymerase amplification
FI20020746A (fi) 2002-04-18 2003-10-19 Finnzymes Oy Menetelmä ja materiaalit polypeptidien deleetiojohdannaisten tuottamiseksi
EP1769077A2 (en) 2004-07-20 2007-04-04 The University Of Warwick Adenovirus vector and method to manipulate the adenovirus genome
US8062850B2 (en) 2005-07-25 2011-11-22 Alere San Diego, Inc. Methods for multiplexing recombinase polymerase amplification
WO2007053491A2 (en) 2005-10-28 2007-05-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method and kit for evaluating rna quality
WO2008035205A2 (en) 2006-05-04 2008-03-27 Asm Scientific, Inc. Recombinase polymerase amplification
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
US7948015B2 (en) 2006-12-14 2011-05-24 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
US7932034B2 (en) 2006-12-20 2011-04-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Heat and pH measurement for sequencing of DNA
WO2012044847A1 (en) * 2010-10-01 2012-04-05 Life Technologies Corporation Nucleic acid adaptors and uses thereof
GB2461127B (en) 2008-06-25 2010-07-14 Ion Torrent Systems Inc Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
US8546128B2 (en) 2008-10-22 2013-10-01 Life Technologies Corporation Fluidics system for sequential delivery of reagents
US20100301398A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
CA2750054C (en) * 2008-10-24 2018-05-29 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
US11634747B2 (en) 2009-01-21 2023-04-25 Streck Llc Preservation of fetal nucleic acids in maternal plasma
NO2398912T3 (zh) 2009-02-18 2018-02-10
US8673627B2 (en) 2009-05-29 2014-03-18 Life Technologies Corporation Apparatus and methods for performing electrochemical reactions
AU2012212148B8 (en) 2011-02-02 2017-07-06 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Massively parallel contiguity mapping
US9005935B2 (en) 2011-05-23 2015-04-14 Agilent Technologies, Inc. Methods and compositions for DNA fragmentation and tagging by transposases
US9145623B2 (en) 2011-07-20 2015-09-29 Thermo Fisher Scientific Oy Transposon nucleic acids comprising a calibration sequence for DNA sequencing
US9683230B2 (en) 2013-01-09 2017-06-20 Illumina Cambridge Limited Sample preparation on a solid support
CA2839051A1 (en) 2013-01-14 2014-07-14 Streck, Inc. Blood collection device for stabilizing cell-free rna in blood during sample shipping and storage
US9328382B2 (en) * 2013-03-15 2016-05-03 Complete Genomics, Inc. Multiple tagging of individual long DNA fragments
US10287622B2 (en) * 2013-11-07 2019-05-14 Agilent Technologies, Inc. Plurality of transposase adapters for DNA manipulations
US9944924B2 (en) 2014-01-16 2018-04-17 Illumina, Inc. Polynucleotide modification on solid support
US9677132B2 (en) 2014-01-16 2017-06-13 Illumina, Inc. Polynucleotide modification on solid support
EP3102691B1 (en) 2014-02-03 2019-09-11 Thermo Fisher Scientific Baltics UAB Method for controlled dna fragmentation
US11136576B2 (en) 2014-02-03 2021-10-05 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Method for controlled DNA fragmentation
US10443087B2 (en) 2014-06-13 2019-10-15 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for preparing sequencing libraries
JP6698708B2 (ja) 2015-06-09 2020-05-27 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 分子タグ付けのための方法、システム、組成物、キット、装置、及びコンピュータ可読媒体

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100120098A1 (en) * 2008-10-24 2010-05-13 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
US20130017978A1 (en) * 2011-07-11 2013-01-17 Finnzymes Oy Methods and transposon nucleic acids for generating a dna library

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GOLDHABER-GORDON 等: "Sequence and positional requirements for DNA Sites in a Mu Transpososome", 《JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106801044A (zh) * 2017-01-09 2017-06-06 北京全式金生物技术有限公司 一种环状转座子复合物及其应用
CN106801044B (zh) * 2017-01-09 2021-03-23 北京全式金生物技术有限公司 一种环状转座子复合物及其应用
CN111615560A (zh) * 2018-01-05 2020-09-01 牛津纳米孔技术公司 用于基于酶相互作用持续时间选择多核苷酸的方法
CN112689673A (zh) * 2018-07-11 2021-04-20 埃克斯基因美国公司 转座体使能的dna/rna测序（ted rna-seq）
CN113227468A (zh) * 2018-11-21 2021-08-06 卡里乌斯公司 感染性疾病的检测和预测
CN117867090A (zh) * 2024-03-12 2024-04-12 北京雅康博生物科技有限公司 Dna片段化水平定量用标准品及其制备方法和应用
CN117867090B (zh) * 2024-03-12 2024-06-11 北京雅康博生物科技有限公司 Dna片段化水平定量用标准品及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP3102691B1 (en) 2019-09-11
WO2017087555A1 (en) 2017-05-26
US10731152B2 (en) 2020-08-04
WO2015113725A1 (en) 2015-08-06
CN108368503A (zh) 2018-08-03
EP3377625A1 (en) 2018-09-26
EP3102691A1 (en) 2016-12-14
CN106103713B (zh) 2021-05-28
US20160177359A1 (en) 2016-06-23
EP3377625B1 (en) 2020-07-08
US20170009288A1 (en) 2017-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106103713A (zh) 用于经控制dna片段化的方法
AU2019203198B2 (en) Methods And Compositions For Nucleic Acid Sequencing
Picelli et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2
Wang et al. RNA-seq based transcriptomic analysis of single bacterial cells
RU2565550C2 (ru) Прямой захват, амплификация и секвенирование днк-мишени с использованием иммобилизированных праймеров
KR20200035942A (ko) 감소된 증폭 편향을 갖는 고속대량 단일 세포 서열분석
KR20190034164A (ko) 단일 세포 전체 게놈 라이브러리 및 이의 제조를 위한 조합 인덱싱 방법
Raabe et al. The rocks and shallows of deep RNA sequencing: Examples in the Vibrio cholerae RNome
Dominissini et al. Transcriptome-wide mapping of N6-methyladenosine by m6A-seq
Keszthelyi et al. Mapping ribonucleotides in genomic DNA and exploring replication dynamics by polymerase usage sequencing (Pu-seq)
CA3113841A1 (en) High-throughput single-nuclei and single-cell libraries and methods of making and of using
JP2022513343A (ja) 次世代シーケンスにおいて低サンプルインプットを扱うための正規化対照
Gelderman et al. Discovery of posttranscriptional regulatory RNAs using next generation sequencing technologies
Wang et al. Base-resolution analysis of deoxyuridine at the genome scale based on the artificial incorporation modified nucleobase
CN113832216A (zh) 使用发卡寡核苷酸扩增核酸的方法
Hartig et al. Small circular DNAs for synthesis of the human telomere repeat: varied sizes, structures and telomere-encoding activities
Quarato et al. Global Run-On sequencing to measure nascent transcription in C. elegans
US11136576B2 (en) Method for controlled DNA fragmentation
US10160968B2 (en) RNA tagging
Faircloth et al. Illumina library prep protocol
Boyle et al. High-throughput biochemical profiling reveals Cas9 off-target binding and unbinding heterogeneity
Stojković et al. miCLIP-MaPseq identifies substrates of radical SAM RNA-methylating enzyme using mechanistic cross-linking and mismatch profiling
Korfhage et al. Whole‐transcriptome amplification of single cells for next‐generation sequencing
Korfhage et al. Parallel WGA and WTA for comparative genome and transcriptome NGS analysis using tiny cell numbers
Smith Genetic and Epigenetic Identity of Centromeres

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant