CN106085922A - 小型微生物生态系统法制备多功能复合微生物菌剂与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开小型微生物生态系统法制备多功能复合微生物菌剂与应用。本发明首先建立小型微生物生态系统，将三种以上互不拮抗的微生物种子接种到小型微生物生态系统混合培养，获得具有微生物复合酶的多种复合菌群种子，然后将分解不同植物材料酶类的真菌按常规方法培养，获得真菌摇瓶种子，再将多种复合菌群种子与真菌摇瓶种子按比例接种到固体营养基固态发酵，发酵结束后制备成多功能复合微生物菌剂。本发明可解决现有应用于农业与环境的微生物菌剂功能单一，适应性差，菌种间协同作用能力弱，无法产生新的、功能强大的复合酶系、生产成本高的难题，实现微生物菌剂低成本、高效清洁化处理并资源化利用农业与环境污染废弃物。

Description

小型微生物生态系统法制备多功能复合微生物菌剂与应用

技术领域

本发明属于生物制造及农业与环境技术领域，涉及复合微生物菌剂与应用，具体涉及小型微生物生态系统法制备多功能复合微生物菌剂与应用。

背景技术

在当前，动物排泄物、人类生产活动产生的固体废弃物对环境污染日趋严重，将这些污染物无害化处理、资源化利用面临巨大挑战。

在农业与环境领域，用于实现染物无害化处理、资源化利用的各类微生物产品、生物菌剂不断涌现，具有如下特点：（1）大部分微生物产品技术含量低、产品雷同，制备简单粗放；（2）自然挖掘与选育应用于农业与环境的优良新菌种比较少；（3）工程菌技术要求高，且其功能具有特定性，释放到环境中因土著微生物的存在，其稳定性与安全性需要很长时间评估，无法短时间内大规模用于农业与环境。

现有菌剂产品中的微生物大部分都是按照各种简单方法反复配比进行混合、液态发酵、载体吸附、干燥等工艺进行制备。按照现有技术，在菌株培养与菌剂制备过程中，多种微生物混菌发酵一次性获得产品比较少，且成本高昂。绝大多数采用单菌种纯菌培养，最后将各个单菌种按照随意确定的比例混合获得产品，这些产品应用到农业与环境中，不能实现多种微生物间的互生、共生、共代谢，产品中的微生物与原土著微生物间的群落关系不稳定，适应性差，微生物间的协同作用能力弱，无法产生新的、功能强大的复合酶系，产品功能性目标无法实现。特别是应用于环境污染处理时，这些产品对多变的环境污染物进行生物无害化处理不彻底，资源化利用难度加大。

因此，探索发明微生物混菌培养的新方法与技术路线，开发低成本、用途广、新型多功能复合微生物菌剂成为当前的必然需求。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种利用小型微生物生态系统法制备多功能复合微生物菌剂的方法，同时提供由上述方法制备得到的多功能复合微生物菌剂及其应用；可以解决现有应用于农业与环境的微生物菌剂功能单一，适应性差，微生物菌种间协同作用能力弱，无法产生新的、功能强大的复合酶系、生产成本高的难题，实现微生物菌剂低成本、高效清洁化处理农业与环境污染废弃物，并资源化利用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：多功能复合微生物菌剂的制备方法，通过小型微生物生态系统法实现，包括如下步骤：

步骤一：建立小型微生物生态系统，将三种以上互不拮抗的微生物种子接种到小型微生物生态系统混合培养，培育能互生、共生、共代谢良好的微生物群，共同在同一环境中增殖，获得多种微生物群落的复合菌体，将复合菌体摇瓶培养，获得复合菌群种子；所述微生物可以是细菌、真菌、放线菌等；所述微生物种子可以是自然分离与选育菌株，也可以在国家微生物保藏中心购买获得；

步骤二：同步采用常规方法生产分解不同植物材料酶类的真菌摇瓶种子；

步骤三：将复合菌群种子与真菌摇瓶种子接种到固体营养基，经接种好的固体营养基进行固态发酵，发酵结束后制备成多功能复合微生物菌剂。

本发明多功能生物菌剂的制备方法是采用微生物生态系统法制备来实现，具体包括如下步骤：

步骤一：建立小型微生物生态系统：包括自然培养物制备、初始培养液制备、初始培养液灭菌、无菌试验、小型微生态系统形成；

（1）自然培养物制备：

①按照重量百分比计，1000g自然培养物含有的物质及比例为：动物新鲜粪便30%-50%、活性污泥5%-10%、过筛40-60目自然土壤5%-10%、细度80目的秸秆粉10%-15%、过筛40-60目有机垃圾5%-10%、糖渣15%-20%、普通啤酒5L；

②将动物新鲜粪便、活性污泥、过筛40-60目自然土壤、细度80目秸秆粉、过筛40-60目有机垃圾、糖渣混合成均匀的初始原基，然后将初始原基与5L啤酒初步混合均匀，将混合过含啤酒的初始原基置于搅拌器中搅拌混合5-10分钟，均匀后制备成自然培养物，置于容器中备用；

（2）初始培养液制备：将上述备用自然培养物加热煮沸30-40分钟，静置冷却2-5小时，待比重大于水的物质沉淀，器皿中上液处于微透明、小颗粒物半悬浮状时，过滤后取液体转入体积为1 L三角瓶中，每个三角瓶装液量为500ml，作为初始培养液备用；

（3）初始培养液灭菌：将装有初始培养液的三角瓶放入高压蒸汽灭菌锅，在蒸汽压力1.05kg/cm²、温度121℃，灭菌40～50min，灭菌结束后备用；

（4）无菌试验：在无菌条件下，取备用灭菌后的初始培养液2-5ml，接入无菌平皿中，放入恒温培养箱35℃-37℃度恒温培养18-24小时，无微生物长出，则将步骤（3）灭菌后的初始培养液作为无菌的初始培养液使用；如有微生物生长，则按步骤（1）-（4）重新制备；

（5）小型微生态系统形成

①将无菌的初始培养液在洁净条件下分装于灭菌后的5个三角瓶中，三角瓶的体积为500ml，每个三角瓶的装液量为250ml，在自然pH条件下，在每个三角瓶内形成独立的小型生态体系；所述三角瓶的数量也可以根据待接种微生物种类确定；

②在洁净条件下，每个三角瓶中接种1-5种互不拮抗的微生物，放入无菌箱常温下自然生长18-24 小时；所述微生物为芽孢杆菌或者真菌中的一种；

③18-24小时后，取出无菌箱中经步骤②处理的三角瓶，在洁净条件下按照等体积、等比例混合，然后将三角瓶内物质全部转入无菌容器；将无菌容器密闭，放置于洁净环境中常温自然培育10-16 小时，得多菌种混菌液，备用；或将无菌容器中的芽孢杆菌或者真菌经脱水干燥，获得复合微生物的休眠菌体；

步骤二：同步采用常规方法生产分解不同植物材料酶类的真菌摇瓶种子，具体制备方法是，

（1）分别制作PDA斜面培养基、种子培养基、产酶培养基，将真菌菌种接种至PDA斜面培养基培养，获得真菌斜面活菌种，然后将真菌斜面活菌种转接至种子培养基进行液态培养，获得液态真菌种子，再将液态真菌种子转接于产酶培养基培养，获得生产分解不同植物材料特定酶类的真菌液态种子，保存，备用；

（2）种子活化培养：将真菌液态种子接种到活化培养摇瓶中，活化培养获得液体发酵种子，即制得真菌摇瓶种子；

步骤三：多菌种混菌培育

（1）复合菌种子制备：将步骤一常温自然培育的多菌种混菌液，在洁净条件下分装在灭菌后的三角瓶中，摇床振荡培养24-72小时，摇床转速100-200r/min，培养初始温度为常温，每隔3小时升温1-2℃，培育24-72 小时后，当摇瓶中微生物数量≥2x10⁷cfu/ml时，得到活化的摇瓶复合微生物种子；所述摇床振荡培养时，当接种微生物为芽孢杆菌时，培养温度38±1℃时，停止升温，当接种微生物为真菌时，培养温度控制在23-35℃；

（2）复合微生物菌剂制备：将步骤二得到的真菌摇瓶种子与步骤三（1）中得到的复合微生物种子分别按照8-10%（v/w，ml/g）的接种量接种到固体培养基中，固体培养基可以是由麸皮50%-70%、豆饼10%-15%、糖渣5%-10%、秸秆粉5%-10%、食品加工下脚料5%-10%按照重量百分比制备而成；所述食品加工下脚料可以是黑茶粉、甘蔗粉、马铃薯粉、木薯粉中的一种或几种；复合微生物种子接种到固体培养基后，在发酵室固态发酵48-96小时，获得固体复合微生物种子；用获得的固体复合微生物种子继续接种到固体培养基中扩大发酵培养，接种量为重量百分比5%-6%，送入发酵室固态发酵48-96小时，发酵过程温度控制在32-37℃，水分控制在65%左右，pH自然，扩大发酵结束后，微生物数量≥2x10⁸cfu/g时，55-60℃干燥，水分控制在15%-20%；经粉碎、过筛至60-80目，获得多功能复合微生物菌剂，常温保存。

其中，在按照上述步骤二进行真菌摇瓶种子的制备时，可采用常规方法针对不同的真菌选择不同的培养基配方和活化培养基配方。在PDA培养基上大多数真菌都可良好生长，PDA培养基主要用于用于转接真菌斜面活菌种；种子培养基，用于真菌斜面活菌种再次转接液态培养，使培养基营养更为丰富和全面,真菌菌丝可以生长的更好，成为液态真菌种子；产酶培养基用于将液态真菌种子再次转接于产酶培养基进行培养。优选的培养基配方可以是如下：

①斜面培养基（PDA）：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，其做法是称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加15g葡萄糖和18g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约10ml，121℃灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用；

②种子培养基：可溶性淀粉2-3％，葡萄糖1-1.5％，KH₂PO₄0.1-0.25％，MgSO₄0.1-0.3％，酵母膏0.5-0.75％，NaNO₃0.2-0.35％，自然pH，121℃高压灭菌20min；

③产酶培养基：麦皮4-6％，(NH₄)₂SO₄ 0.1-0.2％，KH₂PO₄0.2-0.35％，醋酸钠0.1-0.2％,抗坏血酸0.1-0.2％，MgSO₄0.15-0.25％，尿素0.25-0.5％，自然pH，121℃高压灭菌20min；

④真菌种子活化培养配方及方法：蛋白胨 5.0-5.5 g/L，葡萄糖 10.0-15 g/L，硫酸镁0.5-0.8 g/L，酵母浸出粉 2.0 -3.0g/L，磷酸氢二钾1-3g/L，pH7.0-7.2营养液，摇瓶转速为100-160rpm，在23-35℃温度下培养25h-28h。

本发明方法所形成的小型微生物生态系统主要用于各种芽孢杆菌的混菌培养，也可用于真菌的混菌培养。本发明所述小型微生物生态系统原理如下：该系统按照各种芽孢杆菌在自然状态下的群落间的互生、共生、共代谢原理，完全不采用化学试剂与生化制剂作为营养源；系统内的营养来源为废弃物及污染物的剩余养分，系统中自然pH及温度不断变化，营养条件接近污染环境中野生菌株生活状态，使多种微生物在仿自然的状态下，共同生存在同一环境中；该系统可培养所需要的多种目标菌群，替代现有的高成本液态混菌发酵方法及设备。

较优的技术方案可以是通过如下步骤实现：

步骤一：建立小型微生物生态系统，包括自然培养物制备、初始培养液制备、初始培养液灭菌、无菌试验、小型微生态系统形成；

（1）自然培养物制备

①按以下重量百分比制备自然培养物，1000g自然培养物含有的物质及比例为：动物新鲜粪便30%-50%、活性污泥5%-10%、过筛40-60目自然土壤5%-10%、细度80目秸秆粉10%-15%、过筛40-60目有机垃圾5%-10%、糖渣15%-20%、普通啤酒5L；

②自然培养物的制备方法：将动物新鲜粪便、活性污泥、过筛40-60目自然土壤、细度80目秸秆粉、过筛40-60目有机垃圾、糖渣混合成均匀的初始原基，然后将初始与5L啤酒初步混合均匀，将混合过含啤酒的初始原基置于搅拌器中搅拌混合5-10分钟，均匀后制备成自然培养物，置于容器中备用；

（2）始培养液制备：将上述备用自然培养物加热煮沸30-40分钟，静置冷却2-5小时，待比重大于水的物质沉淀，器皿中上液处于微透明、小颗粒物半悬浮状时，过滤后取上部分液体，转入3-5个1 L三角瓶中作为初始培养液备用；

（3）初始培养液灭菌：将初始培养液放入高压蒸汽灭菌锅，在蒸汽压力1.05kg/cm2、温度121℃条件下，灭菌40～50min，灭菌结束后，备用；

（4）无菌试验：取步骤（3）的灭菌后的初始培养液0.5-1ml，直接在准备好的无菌LB培养基平皿中，35℃-37℃恒温培养18-24小时，无微生物长出，获得无菌的初始培养液；如有微生物生长，重新按步骤（1）-（4）制备；

（5）小型微生态系统形成

①将步骤（1）-（4）制得无菌的初始培养液在洁净条件下分装于8个灭菌后的三角瓶中，菌种pH自然，每个三角瓶内形成独立的小型生态体系；

②在洁净条件下，分别将枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌接种到三角瓶中，每2个三角瓶接种同一种菌种，接种完毕放入无菌箱常温下自然生长18-24 小时；

③18-24小时后，取出无菌箱中的三角瓶，在洁净条件下按照等体积比1：1：1：1依次混合，然后转入无菌容器，在无菌容器中形成具有多种微生物种及多种微生物群落的小型微生物生态系统；将无菌容器放置于洁净环境中常温自然培育10-16小时后成为多菌种混菌液，取出，置于冰箱4℃保存备用；或者将混菌种子脱水干燥后保存，得复合微生物休眠菌体；

步骤二：同步采用常规方法生产黑曲霉摇瓶种子、冠突散囊菌摇瓶种子：

（1）分别制作PDA斜面培养基、种子培养基、产酶培养基，将黑曲霉、冠突散囊菌菌种分别接种至PDA斜面培养基培养，获得斜面活菌种，然后将斜面活菌种转接至种子培养基进行液态培养，获得液态真菌种子，再将液态真菌种子转接于产酶培养基培养，分别获得黑曲霉液态种子和冠突散囊菌液态种子，保存，备用；

①PDA斜面培养基制备：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，其做法是称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加15g葡萄糖和18g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约10ml，121℃灭菌20分钟后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用；

②种子培养基制备：可溶性淀粉2-3％，葡萄糖1-1.5％，KH₂PO₄ 0.1-0.25％，MgSO₄ 0.1-0.3％，酵母膏0.5-0.75％，NaNO₃0.2-0.35％，自然pH，121℃高压灭菌20min；

③产酶培养基制备：麦皮4-6％，(NH₄)₂SO₄ 0.1-0.2％，KH₂PO₄0.2-0.35％，醋酸钠0.1-0.2％，抗坏血酸0.1-0.2％，MgSO₄0.15-0.25％，尿素0.25-0.5％，自然pH，121℃高压灭菌20min；

（2）种子活化培养：将黑曲霉液态种子接种到活化培养摇瓶中，活化配方为：蛋白胨5.0-5.5 g/L，葡萄糖 10.0-15 g/L，硫酸镁 0.5-0.8 g/L，酵母浸出粉 2.0 -3.0g/L，磷酸氢二钾1-3g/L，pH7.0-7.2营养液中，摇瓶转速为100-160rpm，在23-35℃温度下培养25h-28h，获得液体发酵种子，即得黑曲霉的真菌摇瓶种子；将冠突散囊菌液态种子接种到活化培养摇瓶中活化培养，摇瓶中营养液配方为：蔗糖 60-80g/L、100目细度黑茶粉10-20g/L或者黑茶浸提液0.8-1%、磷酸氢二钾3-5g/L，pH5.5-6.5，摇瓶转速为100-130rpm，在26-32℃下培养90-100小时，获得液体发酵种子，即冠突散囊菌的真菌摇瓶种子；

步骤三：多菌种混菌培育

（1）复合菌群芽孢杆菌种子培育：将步骤一第（5）项第③步获得的多菌种混菌液分装在含有初始培养液的5-10个三角瓶中，三角瓶体积为1L，装液量为500ml，在活化摇床上振荡变温培养40-72h，振荡变温培养条件如下：摇床转速160-200r/min，初始温度为20℃，每隔3小时上调1-2℃，当温度上调至38±1℃时，停止上调；振荡变温培养结束，获得液体发酵复合种子液；然后将液体发酵种子液按照10%的接种比例（v/w，ml/g）接种到10kg由麸皮、米糠、豆饼、玉米粉按照质量比10:1:3:2混合制备的固体培养基中，充分混匀，在37℃下培养3天，得到主要复合菌群芽孢杆菌固体种子；

（2）真菌菌群黑曲霉及冠突散囊菌种子培育：

①将黑曲霉的真菌摇瓶种子按照10%的接种比例（v/w，ml/g）接种到5kg由麸皮、米糠、豆饼、马铃薯粉按照质量比7:1:1:1混合的固体培养基中，充分混匀，在37℃下培养培养3天，得到黑曲霉固体种子；

②将冠突散囊菌的真菌摇瓶种子按照5%的接种比例（v/w，ml/g）接种到5kg由黑茶粉、甘蔗粉按照质量比1:1混合的固体培养基中，充分混匀，初期温度25℃，48小时后，将温度调节到28℃-32℃，湿度为70%，pH值调节至5-5.5，连续培养5天，得到冠突散囊菌固体种子；

③固体扩大培养：将上述制备得到的主要复合菌群芽孢杆菌固体种子、辅助菌群黑曲霉固体种子、冠突散囊菌固体种子按照重量比7:2:1均匀混合，按照6-8%的接种比例添加到100kg由麸皮、豆饼、玉米粉、黑茶粉按照质量比8:1:0.5:0.5混合制得的固体培养基中，充分混匀，在初期温度32℃，24小时后候将温度调节到35℃-37℃，pH自然的条件下连续培养5-7天；培养结束后，在55-65℃干燥，获得产物有效活性菌≧2x10⁹cfu/g，含水量15%-20%，经链条式粉碎机粉碎，过60-100目筛，制得多功能复合微生物菌剂。

本发明所述的微生物种群可以是细菌、真菌、放线菌等，所述的微生物种子可以是自然分离与选育菌株，也可以在国家微生物保藏中心购买获得。

采用本发明方法制备得到的多功能生物菌剂可应用于有机物料腐熟剂处理固体有机废弃物，也可以用作生态饲料添加剂，添加到饲料中，还可以用作生物肥料。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

（1）经混菌培育后得到的芽孢杆菌或者真菌混合液体种子，连续直接扩大培养，可直接成为复合菌剂产品；

（2）经混菌培育后得到的芽孢杆菌或者真菌混合液体种子经脱水干燥保存后，可与多种微生物混合制备各种复合微生物菌剂；

（3）实现了多菌种的混菌培养，节约投资，工艺简单，操作方便，可降低微生物菌剂生产成本40%-60%，经济效益十分明显；

（4）因微生物在共同的生态系统中繁殖，形成了良好的互生、共生、共代谢关系，新的复合酶系自然形成，对开发新型多功能微生物菌剂提供了新的方法与技术路线。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1具体制备复合微生物菌剂产品：本实施例所用菌种来源于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，菌种及编号为：枯草芽孢杆菌CGMCC1.1086、多粘芽孢杆菌CGMCC1.0548、巨大芽孢杆菌CGMCC1.0217、嗜热脂肪芽孢杆菌CGMCC1.3380、黑曲霉CGMCC3.0316、冠突散囊菌CGMCC3.0448。

采用以下步骤实现：

步骤一：建立小型微生物生态系统，包括自然培养物制备、初始培养液制备、初始培养液灭菌、无菌试验、小型微生态系统形成与混菌种子生产；

（1）自然培养物制备：

①按照重量百分比计，1000g自然培养物含有的物质及比例为：动物新鲜粪便40%、活性污泥10%、过筛40-60目自然土壤10%、细度80目的秸秆粉10%、过筛40-60目有机垃圾5%、糖渣20%、普通啤酒5L；

②将动物新鲜粪便、活性污泥、过筛40-60目自然土壤、细度80目秸秆粉、过筛40-60目有机垃圾、糖渣混合成均匀的初始原基，然后将初始原基与5L啤酒初步混合均匀，将混合过含啤酒的初始原基置于搅拌器中搅拌混合10分钟，均匀后制备成自然培养物，置于容器中备用；

（2）初始培养液制备：将上述备用自然培养物加热煮沸30分钟，静置冷却4小时，待比重大于水的物质沉淀，器皿中上液处于微透明、小颗粒物半悬浮状时，过滤后取液体转入体积为1 L三角瓶中，每个三角瓶装液量为500ml，作为初始培养液备用；

（3）初始培养液灭菌：将装有初始培养液的三角瓶放入高压蒸汽灭菌锅，在蒸汽压力1.05kg/cm²、温度121℃，灭菌50min，灭菌结束后备用；

（4）无菌试验：在无菌条件下，取备用灭菌后的初始培养液2-5ml，接入无菌平皿中，放入恒温培养箱35℃-37℃度恒温培养18-24小时，无微生物长出，则将步骤（3）灭菌后的初始培养液作为无菌的初始培养液使用；如有微生物生长，则按步骤（1）-（4）重新制备；

（5）小型微生态系统形成与混菌种子生产

①将步骤（1）-（4）制得无菌的初始培养液在洁净条件下分装于8个灭菌后的三角瓶中，菌种pH自然，每个三角瓶内形成独立的小型生态体系；

②在洁净条件下，分别将枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌接种到三角瓶中，每2个三角瓶接种同一种菌种，接种完毕放入无菌箱常温下自然生长18-24 小时；

③18-24小时后，取出无菌箱中的三角瓶，在洁净条件下按照等体积比1：1：1：1依次混合，然后转入无菌容器，在无菌容器中形成具有多种微生物种及多种微生物群落的小型微生物生态系统；将无菌容器放置于洁净环境中常温自然培育10-16小时后成为混菌种子取出，置于冰箱4℃保存备用（或者脱水干燥后保存复合微生物休眠菌体）；

步骤二：同步采用常规方法生产分解不同植物材料酶类的真菌摇瓶种子，选择真菌菌种为黑曲霉菌、冠突散囊菌，分别制作PDA斜面培养基、种子培养基、产酶培养基，将黑曲霉、冠突散囊菌菌种分别接种至PDA斜面培养基培养，获得斜面活菌种，然后将斜面活菌种转接至种子培养基进行液态培养，获得液态真菌种子，再将液态真菌种子转接于产酶培养基培养，分别获得黑曲霉液态种子和冠突散囊菌液态种子，保存，备用，具体制备方法如下：

（1）按以下培养基配方采用常规方法分别制备PDA斜面培养基、种子培养基、产酶培养基：

①PDA斜面培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，其做法是称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加15g葡萄糖和18g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约10ml，121℃灭菌20分钟后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用；

②种子培养基：可溶性淀粉2％，葡萄糖1％，KH₂PO₄ 0.2％，MgSO₄ 0.2％，酵母膏0.5-0.75％，NaNO₃0.3％，自然pH，121℃高压灭菌20min；

③产酶培养基：麦皮4-6％，(NH₄)₂SO₄0.2％，KH₂PO₄0.3％，醋酸钠0.1％，抗坏血酸0.1％，MgSO₄0.2％，尿素0.3％，自然pH，121℃高压灭菌20min；

（2）种子活化培养：将黑曲霉液态种子接种到活化培养摇瓶中，活化配方为：蛋白胨5.2 g/L，葡萄糖 12g/L，硫酸镁 0.5 g/L，酵母浸出粉 2.0g/L，磷酸氢二钾2g/L，pH7.0-7.2营养液，摇瓶转速为100-160rpm，在23-35℃温度下培养25h-28h，获得液体发酵种子，即得黑曲霉真菌摇瓶种子；将冠突散囊菌液态种子接种到活化培养摇瓶中活化培养，摇瓶中营养液配方为：蔗糖70g/L、黑茶浸提液0.9%、磷酸氢二钾4g/L，pH5.5-6.5，摇瓶转速为120rpm，在26-32℃下培养90-100小时，获得液体发酵种子，即冠突散囊菌的真菌摇瓶种子；

步骤三：多菌种混菌培育

（1）复合菌群芽孢杆菌种子培育：将步骤一第（5）项第③步中置于冰箱4℃保存备用的枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌混菌种子分装在含有初始培养液的5-10个三角瓶中，三角瓶体积为1L，装液量为500ml。在活化摇床上振荡变温培养40-72h，振荡变温培养条件如下：摇床转速160-200r/min，初始温度为20℃，每隔3小时上调1-2℃，当温度上调至38±1℃时，停止上调；振荡变温培养结束，获得液体发酵复合种子液；然后将液体发酵种子液按照10%的接种比例（v/w，ml/g）接种到10kg由麸皮、米糠、豆饼、玉米粉按照质量比10:1:3:2混合制备固体培养基中，充分混匀，在37℃下培养3天，得到主要复合菌群芽孢杆菌固体种子；

（2）真菌菌群黑曲霉固体种子及冠突散囊菌固体种子培育：

①将黑曲霉的真菌摇瓶种子按照10%的接种比例（v/w，ml/g）接种到5kg由麸皮、米糠、豆饼、马铃薯粉按照质量比7:1:1:1混合的固体培养基中，充分混匀，在37℃下培养培养3天，得到黑曲霉固体种子；

②将冠突散囊菌的真菌摇瓶种子按照5%的接种比例（v/w，ml/g）接种到5kg由黑茶粉、甘蔗粉按照质量比1:1混合的固体培养基中，充分混匀，初期温度25℃，48小时后，将温度调节到28℃-32℃，湿度为70%，pH值调节至5-5.5，连续培养5天，得到冠突散囊菌固体种子；

③固体扩大培养：将上述制备得到的主要复合菌群芽孢杆菌固体种子、辅助菌群黑曲霉固体种子、冠突散囊菌固体种子按照重量比7:2:1均匀混合，按照6-8%的接种比例添加到100kg由麸皮、豆饼、玉米粉、黑茶粉按照质量比8:1:0.5:0.5混合制得的固体培养基中，充分混匀，在初期温度32℃，24小时后候将温度调节到35℃-37℃，pH自然的条件下连续培养5-7天；培养结束后，在55-65℃干燥，获得产物有效活性菌≧2x10⁹cfu/g，含水量15%-20%，经链条式粉碎机粉碎，过60-100目筛，制得多功能复合微生物菌剂。

实施例2多功能复合微生物菌剂在农业与环境领域中的应用：本发明制备得到的多功能复合微生物菌剂具有很好的生物酶活性，经测定，其中的纤维素酶、糖化酶、淀粉酶性、尿素酶、蛋白酶、果胶酶、木聚糖酶、超氧化物歧化酶（SOD）、脂肪酶、植酸酶等酶活性很高，各种酶活在280-350U/g之间；生物毒素如黄曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)、赭曲霉毒素、霉菌毒素等未检出；其他国家规定的生物肥料及生物发酵剂相关的指标全部合格。本发明制备得到的多功能复合微生物菌剂主要的应用方式可以是：（1）作为有机物料腐熟剂处理固体有机废弃物，实现固体有机废弃物的资源化利用；（2）作为生态饲料添加剂使用；（3）作为生物肥料使用，对这几种应用方式的说明如下。

一、作为有机物料腐熟剂处理固体有机废弃物

1、基本原理：畜禽粪便+秸杆+有机垃圾+多功能生物菌剂=清洁化+资源化

（1）畜禽粪便+秸杆+有机垃圾是由含氮的有机物（蛋白质类——氨基酸，非蛋白质类——尿酸，尿素，马尿酸）、碳水化合物（多糖类——淀粉，纤维素，半纤维素，木质素，果胶质，双糖类——麦芽糖，蔗糖，乳糖，单糖类——葡萄糖，半乳糖，果糖，木糖，甘露糖）；脂类（脂肪——甘油，脂肪酸）、磷类物质（磷脂，核酸，植酸）、硫物质（半胱氨酸，亮氨酸，维生素B，硫安素，生物素，硫辛酸素）等组成；

（2）蛋白质的分解：蛋白质在蛋白酶的作用下分解成多肽，二肽（氨基酸）。微生物在生长及代谢过程中产生特定的酶，每一种微生物产生不同的酶，是酶在起作用。酶就像是催化剂，如人体的胆质分解脂肪一样。微生物量越多分泌的酶越多，作用越强。氨基酸在脱氨基酶的作用下产生氨，羧酸，酮酸；在脱羧基酶的作用下，产生二氧化碳，胺类物质；在氨氧化酶的作用下变成醛；醛在有氧的条件下生成有机酸。氨基酸在厌氧条件下分解（称为腐败作用）产生强力恶臭，因要形成大量中间产物，如硫醇，酪酸，吲哚，甲醛吲哚，硫化氢和氨氮等。氨基酸在有氧条件下分解（称为腐化作用）甲烷，CO₂，氨，水和氢，这就要求不断地翻堆充氧；

（3）非蛋白质的分解，非蛋白物质在有氧条件下，分解成氨和CO₂，然后在硝化细菌的作用下，变成硝态氨（无机氮）可供植物直接吸收（链霉素，诺卡氏，青霉素等）。硝化细菌都是典型的好气型自养微生物，能利用化学反应放出的能量将CO₂合成有机物。同时在厌氧的条件下，还有一类细菌对硝态氮进行反硝化作用，即把硝酸盐还原成氮或中间产物亚硝酸盐、氨等过程，其结果会造成粪尿中的氮流失；

（3）碳水化合物的分解：淀粉、纤维素、半纤维素、木质素、果胶质在不同的微生物酶的作用下，由多糖水解成双糖，水解成单糖，氧化成葡萄糖，葡萄糖在有氧化条件下，生成CO₂、水、ATP，大量能量（发热），在厌氧条件下，产生有机酸、醇类、甲烷、CO₂、氢（芽胞杆菌、霉菌、放线菌等）；

（4）脂肪在有氧条件下，在脂肪酶的作用下产生甘油，通过多次分解最后生成CO₂、水、能量（ATP、发热）；脂肪酸在氧化条件下最后也产生CO₂、水、能量；

（5）脂类（卵磷脂、脑磷脂）通过各种酶的作用，变成甘油、脂肪酸、磷酸、胆碱、胆氨再进入以上循环；

（6）磷类物质分解，磷脂核酸在核酸酶的作用下，变成核苷酸，水解无机磷（核苷、磷酸）被植物吸收。植酸在植酸酶的作用下，变成磷酸、肌醇；

（7）含硫物质，含硫物质在好氧的条件下，最后产生硫酸根和某些重金属反应产生盐类，也可被微生物同化，结合进生物量中；在无氧条件下产生硫化氢（臭鸡蛋味）。

2、采用本发明的多功能微生物菌剂处理固体有机废弃物的方法：将本发明多功能复合微生物菌剂加入到固体废弃物中，混合均匀，将固体有机废弃物进行腐熟制备有机肥。例如：按照重量百分比配制需要发酵处理的污染环境的固体有机废弃物，如畜禽粪便55-70%、秸杆15-20%、有机垃圾5-20%，然后加入本发明的多功能微生物菌剂0.01-0.05%，混合均匀，C/N 控制在20-25:1范围，水分含量控制在60%以下，建堆高度1.5米-1.8米，宽度2-5米，长度依据场地条件设定，保证氧气供应，堆温达到60℃左右，24-48小时内翻堆一次。一般72小时内脱臭，10-15天腐熟，直接作为有机肥使用。

此应用方式既解决了环境污染问题，又实现了废弃物的资源利用。

二、作为生态饲料添加剂使用：将本发明的多功能复合微生物菌剂添加到饲料中，添加量0.1%-0.5%（质量百分比），疫病流行期、应激、疾病治疗、换料期间添加量适当增加到1%。

此种应用方式可以实现：

①抑制有害菌的繁殖，使肠内菌群保持平衡；抑制和阻止肠内有害菌的繁殖，使有益菌数量占据优势；可以抑制病原大肠菌、梭状芽胞杆菌、沙门氏菌、β溶血性类细菌等的繁殖；

②产生消化酶，合成维生素，可以产生淀粉酶和蛋白酶等消化酶以及维生素B群，另外维生素A的合成也已被证实；

③增强免疫作用，通过刺激肠道内免疫系细胞，增加局部抗体的形成，从而增加巨噬细胞活性；微生物饲料添加剂可使肝脏内大量蓄集有增强免疫作用的维生素A；

④产生过氧化氢，过氧化氢对几种潜在的病原微生物均有损害作用，它是由一些特殊的物质在一些基质上形成的；

⑤优化生态环境：益生素、酶制剂在动物肠道代谢过程中，分解了不易被动物吸收利用的粗蛋白质、植酸酶及抗营养因子，明显防治了蝇蛆的滋生，有效切断了氨气、臭气的来源，使动物粪便中有害气体的浓度得到了有效降低，改善了饲养环境，降低了氨气对人体的侵害，预防了畜禽呼吸道及肠道疾病的发生。

三、作为生物肥料使用：本发明的多功能复合微生物菌剂可用作生物肥料，适用于各种农作物与经济作物，每亩使用2-3公斤，可做基肥与追肥；配合有机肥料使用效果更佳，每亩作物区配合施用有机肥料200-250公斤。复合微生物菌剂作为生物肥料使用，具有以下优势与功效。

1.改良土壤

（1）通过有益菌的大量繁殖，大量有益菌在植物的根系周围形成了优势种群，抑制了其他有害菌的生命活动；

（2）快速分解土壤有机物质，促进土壤团粒的形成，且通过有益菌的活动能够疏松土壤，土壤的保肥、供肥、保水、供水及透气性都得到很好的调节；

（3）分解土壤中的农药残留，避免残留农药对下季作物产生药害。还对植物生长过程通过根系排放的有害物质进行分解。

2.固氮、解磷、解钾功能。能够部分利用空气中的氮，通过有益菌生长代谢产生相应的酶和酸，可对土壤中难溶性的磷、钾肥(土壤中难溶性磷肥占95%，难溶性钾占98%)进行分解，从而成为植物所能吸收的磷钾肥。因此能够大大提高作物对肥料的利用率，从而减少肥料的施用。

3.提高作物品质。解磷、解钾的同时，能够促使土壤中微量元素的释放，被作物所利用，同时有益菌代谢产生多种植物所需的物质，如小分子氨基酸、生长刺激物质、维生素等。

4.达到生物防治病害的效果，灌根可抑制土壤中的病菌，喷到叶面，可防止病害的入侵。

5.促进作物早熟和延长采收期。由于土壤理化性质得到改善，土壤养分丰富且平衡，土壤中肥料能够更好的被作物很好的吸收，因此能够促进作物早熟和延长采收期。

6.和有机肥配合使用，能够持续不断的改良土壤，2-3年就可使土壤完全达到生产有机作物的标准，且因为有益菌能够快速分解有机物质为作物吸收，所以克服了有机肥料肥效慢的特点，单施有机肥产量低的特点。

7.生物菌肥不像化肥那样，一次性将过量的可溶性营养元素带入土壤，生物菌肥可避免环境污染，且有益菌不断的在植物根系周围不断的繁殖代谢，持续地、非过量的向作物提供营养。

8.经田间使用试验，对作物品质具有明显的改善作用。施用多功能生物菌剂的蔬菜硝酸盐含量减少38.9～67.1mg/kg，比传统施肥降低约30%；维生素C含量增加了139.5mg/kg，糖分含量平均增加了8.3mg/kg。

9.增产效果，在作物区与化肥结合施用条件下，比传统化肥施用方式增产8%～10%，占增产总数的27.9.%，增产10%～15%的占到24.8%，增产15%～20%的占23.2%，增产20%以上的占24.1%。

本发明的多功能复合微生物菌剂，除了上述几种常见的应用方式，也可以进一步开发其在农业与环境技术领域中的其他应用。

Claims (6)

1.小型微生物生态系统法制备多功能复合微生物菌剂的方法，其特征在于：采用小型微生物生态系统法实现，所述小型微生物生态系统法包括如下步骤：

步骤一：建立小型微生物生态系统，将三种以上互不拮抗的微生物种子接种到小型微生物生态系统混合培养，培育能互生、共生、共代谢良好的微生物群，共同在同一环境中增殖，获得多种微生物群落的复合菌体，将复合菌体摇瓶培养，获得复合菌群种子；

步骤二：采用常规方法生产分解不同植物材料酶类的真菌摇瓶种子；

步骤三：将复合菌群种子与真菌摇瓶种子接种到固体营养基，经接种好的固体营养基进行固态发酵，发酵结束后制备成多功能复合微生物菌剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：包括如下具体步骤：

步骤一：建立小型微生物生态系统，包括自然培养物制备、初始培养液制备、初始培养液灭菌、无菌试验、小型微生态系统形成：

（1）自然培养物制备：

①按照重量百分比计，1000g自然培养物含有的物质及比例为：动物新鲜粪便30%-50%、活性污泥5%-10%、过筛40-60目自然土壤5%-10%、细度80目的秸秆粉10%-15%、过筛40-60目有机垃圾5%-10%、糖渣15%-20%、普通啤酒5L；

②将动物新鲜粪便、活性污泥、过筛40-60目自然土壤、细度80目秸秆粉、过筛40-60目有机垃圾、糖渣混合成均匀的初始原基，然后将初始原基与5L啤酒初步混合均匀，将混合过含啤酒的初始原基置于搅拌器中搅拌混合5-10分钟，均匀后制备成自然培养物，置于容器中备用；

（2）初始培养液制备：将上述备用自然培养物加热煮沸30-40分钟，静置冷却2-5小时，待比重大于水的物质沉淀，器皿中上液处于微透明、小颗粒物半悬浮状时，过滤后取液体转入体积为1 L三角瓶中，每个三角瓶装液量为500ml，作为初始培养液备用；

（3）初始培养液灭菌：将装有初始培养液的三角瓶放入高压蒸汽灭菌锅，在蒸汽压力1.05kg/cm²、温度121℃，灭菌40～50min，灭菌结束后备用；

（4）无菌试验：在无菌条件下，取备用灭菌后的初始培养液2-5ml，接入无菌平皿中，放入恒温培养箱35℃-37℃度恒温培养18-24小时，无微生物长出，则将步骤（3）灭菌后的初始培养液作为无菌的初始培养液使用；如有微生物生长，则按步骤（1）-（4）重新制备；

（5）小型微生态系统形成

①将无菌的初始培养液在洁净条件下分装于灭菌后的5个三角瓶中，三角瓶的体积为500ml，每个三角瓶的装液量为250ml；在自然pH条件下，在每个三角瓶内形成独立的小型生态体系；

②在洁净条件下，每个三角瓶中接种1-5种互不拮抗的微生物，放入无菌箱常温下自然生长18-24小时；所述微生物为芽孢杆菌或者真菌中的一种；

③18-24小时后，取出无菌箱中经步骤②处理的三角瓶，在洁净条件下按照等体积、等比例混合，然后将三角瓶内物质全部转入无菌容器；将无菌容器密闭，放置于洁净环境中常温自然培育10-16 小时，得多菌种混菌液，备用；或将无菌容器中的芽孢杆菌或者真菌经脱水干燥，获得复合微生物的休眠菌体；

步骤二：采用常规方法生产分解不同植物材料酶类的真菌摇瓶种子：

（1）分别制作PDA斜面培养基、种子培养基、产酶培养基，将真菌菌种接种至PDA斜面培养基培养，获得真菌斜面活菌种，然后将真菌斜面活菌种转接至种子培养基进行液态培养，获得液态真菌种子，再将液态真菌种子转接于产酶培养基培养，获得生产分解不同植物材料特定酶类的真菌液态种子，保存，备用；

（2）种子活化培养：将真菌液态种子接种到活化培养摇瓶中，活化培养获得液体发酵种子，即制得真菌摇瓶种子；

步骤三：多菌种混菌培育

（1）复合菌种子制备：将步骤一常温自然培育的多菌种混菌液，在洁净条件下分装在灭菌后的三角瓶中，摇床振荡培养24-72小时，摇床转速100-200r/min，培养初始温度为常温，每隔3小时升温1-2℃，培育24-72 小时后，当摇瓶中微生物数量≥2x10⁷cfu/ml时，得到活化的摇瓶复合微生物种子；所述摇床振荡培养时，当接种微生物为芽孢杆菌时，培养温度38±1℃时，停止升温，当接种微生物为真菌时，培养温度控制在23-35℃；

（2）复合微生物菌剂制备：将步骤二得到的真菌摇瓶种子与步骤三（1）中得到的复合微生物种子按照8-10%（v/w，ml/g）的接种量接种到固体培养基中，固体培养基由麸皮50%-70%、豆饼10%-15%、糖渣5%-10%、秸秆粉5%-10%、食品加工下脚料5%-10%按照重量百分比制备而成；所述食品加工下脚料为黑茶粉、甘蔗粉、马铃薯粉、木薯粉中的一种或几种；复合微生物种子接种到固体培养基后，在发酵室固态发酵48-96小时，获得固体复合微生物种子；用获得的固体复合微生物种子继续接种到固体培养基中扩大发酵培养，接种量为固体培养基重量的5%-6%，送入发酵室固态发酵48-96小时，发酵过程温度控制在32-37℃，水分控制在60-65%，pH自然；扩大发酵结束后，微生物数量≥2x10⁸cfu/g时，55-60℃干燥，水分控制在15%-20%；经粉碎、过筛至60-80目，获得多功能复合微生物菌剂，常温保存。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：采用该方法制备多功能复合微生物菌的具体步骤如下：

步骤一：建立小型微生物生态系统，包括自然培养物制备、初始培养液制备、初始培养液灭菌、无菌试验、小型微生态系统形成；

（1）自然培养物制备

①按以下重量百分比制备自然培养物，1000g自然培养物含有的物质及比例为：动物新鲜粪便30%-50%、活性污泥5%-10%、过筛40-60目自然土壤5%-10%、细度80目秸秆粉10%-15%、过筛40-60目有机垃圾5%-10%、糖渣15%-20%、普通啤酒5L；

②自然培养物的制备方法：将动物新鲜粪便、活性污泥、过筛40-60目自然土壤、细度80目秸秆粉、过筛40-60目有机垃圾、糖渣混合成均匀的初始原基，然后将初始与5L啤酒初步混合均匀，将混合过含啤酒的初始原基置于搅拌器中搅拌混合5-10分钟，均匀后制备成自然培养物，置于容器中备用；

（2）始培养液制备：将上述备用自然培养物加热煮沸30-40分钟，静置冷却2-5小时，待比重大于水的物质沉淀，器皿中上液处于微透明、小颗粒物半悬浮状时，过滤后取上部分液体，转入3-5个1 L三角瓶中作为初始培养液备用；

（3）初始培养液灭菌：将初始培养液放入高压蒸汽灭菌锅，在蒸汽压力1.05kg/cm2、温度121℃条件下，灭菌40～50min，灭菌结束后，备用；

（4）无菌试验：取步骤（3）的灭菌后的初始培养液0.5-1ml，直接在准备好的无菌LB培养基平皿中，35℃-37℃恒温培养18-24小时，无微生物长出，获得无菌的初始培养液；如有微生物生长，重新按步骤（1）-（4）制备；

（5）小型微生态系统形成

①将步骤（1）-（4）制得无菌的初始培养液在洁净条件下分装于8个灭菌后的三角瓶中，菌种pH自然，每个三角瓶内形成独立的小型生态体系；

②在洁净条件下，分别将枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌接种到三角瓶中，每2个三角瓶接种同一种菌种，接种完毕放入无菌箱常温下自然生长18-24 小时；

③18-24小时后，取出无菌箱中的三角瓶，在洁净条件下按照等体积比1：1：1：1依次混合，然后转入无菌容器，在无菌容器中形成具有多种微生物种及多种微生物群落的小型微生物生态系统；将无菌容器放置于洁净环境中常温自然培育10-16小时后成为多菌种混菌液，取出，置于冰箱4℃保存备用；或者将混菌种子脱水干燥后保存，得复合微生物休眠菌体；

步骤二：同步采用常规方法生产黑曲霉摇瓶种子、冠突散囊菌摇瓶种子：

（1）分别制作PDA斜面培养基、种子培养基、产酶培养基，将黑曲霉、冠突散囊菌菌种分别接种至PDA斜面培养基培养，获得斜面活菌种，然后将斜面活菌种转接至种子培养基进行液态培养，获得液态真菌种子，再将液态真菌种子转接于产酶培养基培养，分别获得黑曲霉液态种子和冠突散囊菌液态种子，保存，备用；

①PDA斜面培养基制备：马铃薯葡萄糖琼脂培养基，其做法是称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加15g葡萄糖和18g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约10ml，121℃灭菌20分钟后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用；

②种子培养基制备：可溶性淀粉2-3％，葡萄糖1-1.5％，KH₂PO₄ 0.1-0.25％，MgSO₄ 0.1-0.3％，酵母膏0.5-0.75％，NaNO₃ 0.2-0.35％，自然pH，121℃高压灭菌20min；

③产酶培养基制备：麦皮4-6％，(NH₄)₂SO₄ 0.1-0.2％，KH₂PO₄0.2-0.35％，醋酸钠0.1-0.2％，抗坏血酸0.1-0.2％，MgSO₄ 0.15-0.25％，尿素0.25-0.5％，自然pH，121℃高压灭菌20min；

（2）种子活化培养：将黑曲霉液态种子接种到活化培养摇瓶中，活化配方为：蛋白胨5.0-5.5 g/L，葡萄糖 10.0-15 g/L，硫酸镁 0.5-0.8 g/L，酵母浸出粉 2.0 -3.0g/L，磷酸氢二钾1-3g/L，pH7.0-7.2营养液中，摇瓶转速为100-160rpm，在23-35℃温度下培养25h-28h，获得液体发酵种子，即得黑曲霉摇瓶种子；将冠突散囊菌液态种子接种到活化培养摇瓶中活化培养，摇瓶中营养液配方为：蔗糖 60-80g/L、100目细度黑茶粉10-20g/L或者黑茶浸提液0.8-1%、磷酸氢二钾3-5g/L，pH5.5-6.5，摇瓶转速为100-130rpm，在26-32℃下培养90-100小时，获得液体发酵种子，即冠突散囊菌的摇瓶种子；

步骤三：多菌种混菌培育

（1）复合菌群芽孢杆菌种子培育：将步骤一第（5）项第③步获得的多菌种混菌液分装在含有初始培养液的5-10个三角瓶中，三角瓶体积为1L，装液量为500ml，在活化摇床上振荡变温培养40-72h，振荡变温培养条件如下：摇床转速160-200r/min，初始温度为20℃，每隔3小时上调1-2℃，当温度上调至38±1℃时，停止上调；振荡变温培养结束，获得液体发酵复合种子液；然后将液体发酵种子液按照10%的接种比例（v/w，ml/g）接种到10kg由麸皮、米糠、豆饼、玉米粉按照质量比10:1:3:2混合制备的固体培养基中，充分混匀，在37℃下培养3天，得到主要复合菌群芽孢杆菌固体种子；

（2）真菌菌群黑曲霉及冠突散囊菌种子培育：

①将黑曲霉的摇瓶种子按照10%的接种比例（v/w，ml/g）接种到5kg由麸皮、米糠、豆饼、马铃薯粉按照质量比7:1:1:1混合的固体培养基中，充分混匀，在37℃下培养培养3天，得到黑曲霉固体种子；

②将冠突散囊菌的摇瓶种子按照5%的接种比例（v/w，ml/g）接种到5kg由黑茶粉、甘蔗粉按照质量比1:1混合的固体培养基中，充分混匀，初期温度25℃，48小时后，将温度调节到28℃-32℃，湿度为70%，pH值调节至5-5.5，连续培养5天，得到冠突散囊菌固体种子；

③固体扩大培养：将上述制备得到的主要复合菌群芽孢杆菌固体种子、黑曲霉固体种子、冠突散囊菌固体种子按照重量比7:2:1均匀混合，按照6-8%的接种比例添加到100kg由麸皮、豆饼、玉米粉、黑茶粉按照质量比8:1:0.5:0.5混合制得的固体培养基中，充分混匀，在初期温度32℃，24小时后候将温度调节到35℃-37℃，pH自然的条件下连续培养5-7天；培养结束后，在55-65℃干燥，获得产物有效活性菌≧2x10⁹cfu/g，含水量15%-20%，经链条式粉碎机粉碎，过60-100目筛，制得多功能复合微生物菌剂。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：采用该方法制备得到的多功能复合微生物菌剂作为有机物料腐熟剂处理固体有机废弃物。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：采用该方法制备得到的多功能复合微生物菌剂所述用作生态饲料添加剂。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：采用该方法制备得到的多功能复合微生物菌剂用作生物肥料 。