CN106083854B - 一种低氧激活agt蛋白抑制剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种如通式(I)所示的具有低氧激活特性的AGT蛋白抑制剂及其制备方法与应用：R1＝R2＝H，或R1＝H，R2＝CH3，或R1＝R2＝CH3；R3＝H，NO2，NH2，OCH3，CH2OH或CO2CH3。该化合物具有良好的低氧激活特性和肿瘤细胞靶向性，能够在低氧环境下靶向性地抑制实体瘤中AGT的活性，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性；本发明化合物与ACNU联合用药对多种实体瘤细胞系均有明显的抑制作用；与烷化剂类抗癌药物联合使用时，可明显提高肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性，可用于恶性肿瘤的靶向联合化疗。
Description
技术领域
本发明涉及制药领域，具体涉及一种新型的靶向性AGT蛋白抑制剂、其制备方法和应用。
背景技术
哺乳动物细胞中含有多种具有烷化损伤修复作用的酶，其中O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)是重要的DNA修复蛋白之一。AGT蛋白可将DNA鸟嘌呤O6位上的甲基、氯乙基、苄基和苄基等共价转移到自身活性中心的第145位半胱氨酸残基上，从而修复DNA的烷化损伤。例如，AGT酶可修复氯乙基亚硝基脲类化疗药物导致的DNA烷化产物O6-氯乙基鸟嘌呤和N1,O6-桥亚乙基鸟嘌呤，从而阻断了这两种烷化产物进一步与胞嘧啶反应形成dG-dC股间交联，最终导致肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性。为了阻断AGT对肿瘤细胞DNA烷化损伤的修复作用以降低肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，设计开发有效的AGT抑制剂并将其与烷化剂类抗癌药物联合应用于肿瘤化疗，已成为增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性、提高化疗效果的重要途径。
目前，已经进入临床试验阶段的AGT抑制剂主要包括O6-苄基鸟嘌呤和Lomeguatrib(PaTrin-2)，这两种化合物可以消耗肿瘤细胞中的AGT酶，从而降低AGT的活性。例如，O6-苄基鸟嘌呤能有效降低人脑神经胶质瘤细胞SF767和结肠癌细胞HT29中的AGT水平，显著提高肿瘤细胞对二氯乙基亚硝基脲的敏感性。然而，现有的AGT抑制剂均不具有肿瘤细胞靶向性，在其与化疗药物的联合使用过程中，这些非靶向性的AGT抑制剂在抑制肿瘤细胞AGT活性的同时也大大降低了正常细胞中AGT的活性，使得正常细胞不能及时修复由化疗药物造成的DNA损伤，从而引起化疗药物的骨髓抑制毒性显著增强，最终导致化疗失败。
低氧是实体瘤发展过程中的重要特征，研究表明，70％以上实体瘤内的氧分压明显低于正常组织。利用肿瘤组织存在低氧微环境的特性，设计开发具有低氧激活特异性的新型AGT抑制剂前体化合物，使该化合物能够靶向性地在肿瘤组织低氧环境下分解释放AGT抑制剂，而在正常组织中的常氧环境下不发挥AGT抑制作用，从而将其与烷化剂类药物联合使用实现肿瘤的靶向化疗。因此，设计开发具有低氧激活特性的新型AGT抑制剂，使其能够特异性地作用于肿瘤细胞并发挥AGT抑制活性，对于提高肿瘤细胞敏感性、同时保护正常细胞不受化疗药物损伤，从而实现高效低毒的化疗策略具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的低氧激活AGT抑制剂、其制备方法及应用。
为了实现本发明目的，本发明提供的一种具有低氧激活特性的AGT抑制剂，所述抑制剂为具有如通式(I)结构所示的化合物：
R1＝R2＝H，或R1＝H，R2＝CH3，或R1＝R2＝CH3；
R3＝H，NO2，NH2，OCH3，CH2OH，CO2CH3；
优选地，当R3＝NO2时，所述抑制剂为4-硝基苄基-(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)氨基甲酸酯(化合物1)、1-(4-硝基苯)乙基-(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)氨基甲酸酯(化合物2)、2-(4-硝基苯)丙基-(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)氨基甲酸酯(化合物3)。
本发明还提供所述以上三种AGT蛋白抑制剂的制备方法，所述方法的反应历程为：
发明所提供化合物的具体合成步骤如下：
(1)将4-噻吩基甲醇溶于N,N-二甲基甲酰胺中，向反应液中依次加入氢化钠和化合物a，搅拌反应，反应结束后，加入乙酸乙酯和水按照体积为1:1组成的混合液进行萃取，有机相经饱和氯化铵溶液洗涤后，经无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，所得粗产物溶于甲醇，过滤除去杂质沉淀，重结晶后得到化合物b；
(2)化合物b中加入含有乙醇钠的乙醇溶液使其溶解，搅拌反应10-45min后，真空抽干溶剂，得到的固体溶于有机溶剂中，向溶液中加入特戊酸氯甲酯，搅拌，反应结束后，加入乙酸乙酯和水按照体积为1:1组成的混合液进行萃取，有机相经饱和食盐水洗涤后，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得到粗产物经硅胶柱层析法分离纯化，得到化合物c；
(3)将步骤(2)所得的化合物c溶于二氯甲烷中，加入三光气，在惰性气体保护下搅拌反应，所得产物化合物d继续与反应，减压蒸馏，得到粗产物经硅胶柱层析法分离纯化，得化合物e；
(4)将步骤(3)所得的化合物e溶于含有氨水的甲醇溶液中，搅拌反应，薄层色谱监测反应进程，反应结束后，过滤收集固体，得化合物f，即本发明的具有低氧激活特性的AGT蛋白抑制剂。
上述方法中：
所述步骤(1)中：
所述化合物a、氢化钠与4-溴噻吩基甲醇的摩尔比为1:1-4:2-5，优先1:2-3:3-4；
反应时间控制在1-4h，优选2-3h；
反应温度控制在20-35℃，优选25-35℃；
减压蒸馏温度控制在30-60℃，优选30-40℃。
所述步骤(2)中：
所述化合物b、乙醇钠与特戊酸氯甲酯的摩尔比为1:1-3:2-5，优先1:1-2:2-3；
所选有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜，优选N,N-二甲基甲酰胺；
化合物b与乙醇钠的反应时间控制在10-45min，优选20-30min；反应温度控制在20-35℃，优选25-35℃；减压蒸馏温度控制在30-60℃，优选30-40℃；
化合物b与乙醇钠反应得到的固体与特戊酸氯甲酯的反应时间控制在1-3h，优选1-2h；反应温度控制在20-35℃，优选25-35℃；减压蒸馏温度控制在30-60℃，优选30-40℃；
硅胶柱层析所用的洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯，采用梯度洗脱，石油醚/乙酸乙酯体积比为1:1-1:4。
所述步骤(3)中：
所述化合物c、三光气、的摩尔比为1:1-4:2-5，优选1:1-2:2-3；
所选惰性保护气体为氮气或氩气，优选氩气；
化合物c与三光气的反应温度控制在0-25℃，反应时间为3-8h，优选4-6h，得到化合物d；
化合物d与的反应温度控制在25-40℃，优选25-35℃；
反应时间为3-8h，优选4-6h；
减压蒸馏温度控制在25-40℃，优选25-35℃；
硅胶柱层析所用的洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯，采用梯度洗脱，石油醚/乙酸乙酯体积比为1:2-1:5。
所述步骤(4)中：
所述化合物e与氨水的摩尔比为1:0.1-1(mmol:mL)，优选1:0.1-0.5(mmol:mL)；
反应时间控制在20-40h，优选30-40h；
反应温度控制在20-35℃，优选25-35℃。
本发明还提供了一种药物组合物，包括a)烷化剂类抗肿瘤化合物和b)本发明所述的具有低氧激活特性的靶向性AGT蛋白抑制剂。
所述烷化剂类抗肿瘤化合物为尼莫司汀。
本发明所述的低氧激活AGT蛋白抑制剂在制备抗肿瘤药物中的用途属于本发明的保护范围。
本发明上述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的用途也属于本发明的保护范围。
在本发明的实施例中体现了低氧激活AGT蛋白抑制剂的抗肿瘤活性，所述的肿瘤为白血病、肺癌、黑色素瘤、T淋巴瘤、脑神经胶质瘤、肝癌。
本发明提供的新型低氧激活AGT抑制剂具有以下优点：
(一)本发明提供的式(Ⅰ)化合物能够选择性的在低氧环境下被实体瘤细胞中的还原酶激活，4-硝基苄基被还原为4-硝基氨基或4-硝基羟胺，释放AGT的假底物O6-4-溴噻吩甲基鸟嘌呤，从而靶向性地抑制实体瘤中AGT的活性，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。
(二)与现有的AGT蛋白抑制剂相比，本发明提供的式(Ⅰ)化合物具有较高的靶向性、AGT抑制活性和水溶性。
(三)本发明对式(Ⅰ)中的化合物进行的体外抗肿瘤筛选试验表明，在低氧条件下式(Ⅰ)中的化合物与ACNU联合用药作用于人白血病细胞HL-60、人肺癌细胞A549、人黑色素瘤细胞A375细胞、人T淋巴瘤细胞HUT102、人脑神经胶质瘤细胞H4、人肝癌细胞BEL-7402等多种实体瘤细胞系均显示出明显的抑制作用；而在有氧条件下，式(Ⅰ)中的化合物对上述肿瘤细胞的抑制作用并不明显。因此，式(Ⅰ)中的化合物具有良好的低氧激活特性和肿瘤细胞靶向性，与烷化剂类抗癌药物联合使用时，可明显提高肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性，可用于恶性肿瘤的靶向联合化疗。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例中涉及到的药品无特殊说明，均可市购获得；涉及到的操作，无特殊说明，均为本领域常规的操作。
以下实施例中涉及的化合物1、化合物2、化合物3的结构式如下：
实施例1 4-硝基苄基-(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)氨基甲酸酯(化合物1)的合成
1)(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)胺的合成
称取4-溴噻吩基甲醇(1.38g,7.2mmol)加入到100mL圆底烧瓶中，加入20mL N,N-二甲基甲酰胺，向反应液中加入氢化钠(0.115g,4.8mmol)和2-氨基嘌呤-6-三甲基铵盐氯化物(0.547g,2.4mmol)，25℃,搅拌反应2h。反应结束后，加入乙酸乙酯和水按照体积为1:1组成的混合液进行萃取，有机相经饱和氯化铵溶液洗涤后，经无水硫酸钠干燥，30℃减压蒸馏，所得粗产物溶于甲醇，过滤除去杂质沉淀，重结晶后得到(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)胺(0.52g,1.6mmol)，产率67％。
UVλ:246,283nm。
IR(KBr压片)v/cm-1:3380.1(N-H)；2956.8(C-H)；1695.7(C＝C)；1094.8(C-N)；703.8(C-Br)；610.8(C-S)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:5.16(s,2H,OCH2)；6.54(s,2H,NH2)；6.65-6.87(s,2H,C4H2BrS)；8.25(s,1H,H8)；13.25(s,H,NH)。
ESI-MS:m/z326(M+H)+。
2)(2-氨基-6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-9)戊酸甲酯的合成
称取(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)胺(0.52g,1.6mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入3.2mL含有乙醇钠(0.218g,3.2mmol)的乙醇溶液使其溶解。25℃,反应20min后，真空抽干溶剂，得到的固体溶于10mL无水N,N-二甲基甲酰胺。向溶液中加入特戊酸氯甲酯(0.692mL,4.8mmol)，25℃,搅拌反应1h。待反应结束后，加入乙酸乙酯和水按照体积为1:1组成的混合液进行萃取，有机相经饱和食盐水洗涤后，无水硫酸钠干燥，30℃,减压蒸馏，得到粗产物经硅胶柱层析法分离纯化，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯，采用梯度洗脱，石油醚/乙酸乙酯的体积比从1:1逐渐增加到1:4，得到(2-氨基-6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-9)戊酸甲酯(0.505g,1.15mmol)，产率72％。
UVλ:266,283nm。
IR(KBr压片)v/cm-1:3380.4(N-H)；2956.8(C-H)；1690.8(C＝C)；1215.9(C-O-C)；1087.5(C-N)；706.3(C-Br)；614.6(C-S)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ：1.16(s,3H,CH3)；5.18(s,2H,OCH2)；5.37(s,2H,NCH2)；6.56(s,2H,NH2)；6.67-6.88(s,2H,C4H2BrS)；8.21(s,1H,H8)。
ESI-MS:m/z440(M+H)+。
3)(6-(4-溴噻吩甲氧基)-2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)氨基-9氢-嘌呤-9)戊酸甲酯的合成
称取三光气(0.341g,1.15mmol)加入到两口烧瓶瓶中，加入7mL二氯甲烷溶解，将所得固体(2-氨基-6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-9)戊酸甲酯(0.505g,1.15mmol)，加入12mL二氯甲烷溶解，再加入0.5mL无水吡啶，在冰浴、氩气保护的条件下将(2-氨基-6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-9)戊酸甲酯溶液逐滴滴加到三光气溶液中，滴加完毕后，将温度缓慢升到25℃，搅拌反应4h；向反应液中加入7mL含有对硝基苯甲醇(0.352g,2.3mmol)的二氯甲烷溶液，25℃，搅拌反应4h，薄层色谱法监测反应进程。待反应无原料点后，30℃减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析法分离纯化，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯，采用梯度洗脱，石油醚/乙酸乙酯的体积比从1:2逐渐增加到1:5，30℃真空干燥得到白色固体(6-(4-溴噻吩甲氧基)-2-((((4-硝基苄基)氧)羰基)氨基-9氢-嘌呤-9)戊酸甲酯(0.445g,0.72mmol)，产率63％。
UVλ:264,285nm。
IR(KBr压片)v/cm-1:3425.6(N-H)；2956.8(C-H)；1791.6(C＝O)；1617.8(C＝C)；1427.2(N-O)；1224.5(C-O-C)；1094.5(C-N)；713.6(C-Br)；618.1(C-S)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ：1.19(s,3H,CH3)；5.17(s,2H,OCH2)；5.34(s,2H,OCH2Ar)；5.39(s,2H,NCH2)；6.68-6.89(s,2H,C4H2BrS)；7.76-8.42(m,4H,Ar)；8.06(s,1H,H8)；10.20(s,H,NH)；。
ESI-MS：m/z619(M+H)+。
4)4-硝基苄基-(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)氨基甲酸酯的合成
将(6-(4-溴噻吩甲氧基)-2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)氨基-9氢-嘌呤-9)戊酸甲酯(0.445g,0.72mmol)溶于含有0.072mol/L氨(0.11mL氨水)的40mL甲醇溶液中，25℃，搅拌反应40h，薄层色谱监测反应进程，待反应至无原料点后，过滤收集固体，得到固体4-硝基苄基-(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)氨基甲酸酯(0.305g,0.605mmol)，产率为84％。
UVλ:264,281nm。
IR(KBr压片)v/cm-1:3418.6(N-H)；2963.5(C-H)；1787.8(C＝O)；1625.3(C＝C)；1431.7(N-O)；1232.6(C-O-C)；1134.1(C-N)；724.5(C-Br)；615.8(C-S)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:5.18(s,2H,OCH2)；5.34(s,2H,OCH2Ar)；6.63-6.85(s,2H,C4H2BrS)；7.74-8.27(m,4H,Ar)；8.06(s,1H,H8)；10.51(s,1H,NHCO)；13.27(s,H,H9)。
ESI-MS:m/z505(M+H)+。
实施例2 4-硝基苄基-(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)氨基甲酸酯(化合物1)的合成
1)(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)胺的合成
称取4-溴噻吩基甲醇(1.32g,6.9mmol)加入到100mL圆底烧瓶中，加入18mL N,N-二甲基甲酰胺，向反应液中加入氢化钠(0.110g,4.6mmol)和2-氨基嘌呤-6-三甲基铵盐氯化物(0.525g,2.3mmol)，30℃,搅拌反应2h。反应结束后，加入乙酸乙酯和水按照体积为1:1组成的混合液进行萃取，有机相经饱和氯化铵溶液洗涤后，经无水硫酸钠干燥，30℃减压蒸馏，所得粗产物溶于甲醇，过滤除去杂质沉淀，重结晶后得到(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)胺(0.517g,1.59mmol)，产率69％。
UVλ:246,283nm。
IR(KBr压片)v/cm-1:3385.3(N-H)；2963.5(C-H)；1689.3(C＝C)；1085.3(C-N)；706.2(C-Br)；614.7(C-S)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:5.18(s,2H,OCH2)；6.59(s,2H,NH2)；6.62-6.89(s,2H,C4H2BrS)；8.31(s,1H,H8)；13.21(s,H,NH)。
ESI-MS:m/z326(M+H)+。
2)(2-氨基-6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-9)戊酸甲酯的合成
称取(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)胺(0.517g,1.59mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入3.18mL含有乙醇钠(0.216g,3.18mmol)的乙醇溶液使其溶解。30℃,反应20min后，真空抽干溶剂，得到的固体溶于10mL无水N,N-二甲基甲酰胺。向溶液中加入特戊酸氯甲酯(0.687mL,4.77mmol)，30℃,搅拌反应1h。反应结束后，加入乙酸乙酯和水按照体积为1:1组成的混合液进行萃取，有机相经饱和食盐水洗涤后，无水硫酸钠干燥，30℃，减压蒸馏，得到粗产物经硅胶柱层析法分离纯化，采用梯度洗脱，石油醚/乙酸乙酯的体积比从1:1逐渐增加到1:4，得到(2-氨基-6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-9)戊酸甲酯(0.509g,1.16mmol)，产率73％。
UVλ:266,283nm。
IR(KBr压片)v/cm-1:3385.1(N-H)；2963.6(C-H)；1696.1(C＝C)；1219.3(C-O-C)；1085.8(C-N)；709.5(C-Br)；617.2(C-S)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.15(s,3H,CH3)；5.19(s,2H,OCH2)；5.39(s,2H,NCH2)；6.61(s,2H,NH2)；6.64-6.89(s,2H,C4H2BrS)；8.25(s,1H,H8)。
ESI-MS:m/z440(M+H)+。
3)(6-(4-溴噻吩甲氧基)-2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)氨基-9氢-嘌呤-9)戊酸甲酯的合成
称取三光气(0.344g,1.16mmol)加入到两口烧瓶瓶中，加入6mL二氯甲烷溶解，将所得固体(2-氨基-6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-9)戊酸甲酯(0.509g,1.16mmol)，加入11mL二氯甲烷溶解，再加入0.45mL无水吡啶，在冰浴、氩气保护的条件下将(2-氨基-6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-9)戊酸甲酯溶液逐滴滴加到三光气溶液中，滴加完毕后，将温度缓慢升到25℃，搅拌反应4h；向反应液中加入6mL含有对硝基苯甲醇(0.355g,2.32mmol)的二氯甲烷溶液，30℃，搅拌反应4h，薄层色谱法监测反应进程。待反应无原料点后，30℃减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析法分离纯化，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯，采用梯度洗脱，石油醚/乙酸乙酯的体积比从1:2逐渐增加到1:5，30℃真空干燥得到白色固体(6-(4-溴噻吩甲氧基)-2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)氨基-9氢-嘌呤-9)戊酸甲酯(0.464g,0.75mmol)，产率65％。
UVλ:264,284nm。
IR(KBr压片)v/cm-1:3429.3(N-H)；2964.2(C-H)；1782.8(C＝O)；1625.3(C＝C)；1435.1(N-O)；1236.8(C-O-C)；1081.3(C-N)；718.5(C-Br)；613.7(C-S)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.18(s,3H,CH3)；5.19(s,2H,OCH2)；5.37(s,2H,OCH2Ar)；5.42(s,2H,NCH2)；6.65-6.87(s,2H,C4H2BrS)；7.74-8.45(m,4H,Ar)；8.09(s,1H,H8)；10.34(s,H,NH)；。
ESI-MS:m/z619(M+H)+。
4)4-硝基苄基-(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)氨基甲酸酯的合成
将(6-(4-溴噻吩甲氧基)-2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)氨基-9氢-嘌呤-9)戊酸甲酯(0.464g,0.75mmol)溶于含有0.075mol/L氨(0.12mL氨水)的40mL甲醇溶液中，30℃，搅拌反应38h，薄层色谱监测反应进程，待反应至无原料点后，过滤收集固体，得到固体4-硝基苄基-(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)氨基甲酸酯(0.322g，0.638mmol)，产率为85％。
UVλ：264,282nm。
IR(KBr压片)v/cm-1:3426.2(N-H)；2972.1(C-H)；1779.3(C＝O)；1631.6(C＝C)；1437.9(N-O)；1235.6(C-O-C)；1128.5(C-N)；721.7(C-Br)；613.6(C-S)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:5.19(s,2H,OCH2)；5.37(s,2H,OCH2Ar)；6.61-6.87(s,2H,C4H2BrS)；7.72-8.26(m,4H,Ar)；8.09(s,1H,H8)；10.52(s,1H,NHCO)；13.25(s,H,H9)。
ESI-MS:m/z505(M+H)+。
实施例3 1-(4-硝基苯)乙基-(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)氨基甲酸酯(化合物2)
1)(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)胺的合成
称取4-溴噻吩基甲醇(1.50g,7.8mmol)加入到100mL圆底烧瓶中，加入20mLN,N-二甲基甲酰胺，向反应液中加入氢化钠(0.125g,5.2mmol)和2-氨基嘌呤-6-三甲基铵盐氯化物(0.593g,2.6mmol)，25℃,搅拌反应2h。反应结束后，加入乙酸乙酯和水按照体积为1:1组成的混合液进行萃取，有机相经饱和氯化铵溶液洗涤后，经无水硫酸钠干燥，30℃减压蒸馏，所得粗产物溶于甲醇，过滤除去杂质沉淀，重结晶后得到(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)胺(0.585g,1.8mmol)，产率69％。
UVλ:246,283nm。
IR(KBr压片)v/cm-1:3375.4(N-H)；2967.3(C-H)；1683.4(C＝C)；1086.4(C-N)；705.2(C-Br)；615.3(C-S)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:5.18(s,2H,OCH2)；6.57(s,2H,NH2)；6.61-6.87(s,2H,C4H2BrS)；8.23(s,1H,H8)；13.24(s,H,NH)。
ESI-MS:m/z326(M+H)+。
2)(2-氨基-6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-9)戊酸甲酯的合成
称取(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)胺(0.585g,1.8mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入3.6mL含有乙醇钠(0.245g,3.6mmol)的乙醇溶液使其溶解，25℃，搅拌反应20min后，真空抽干溶剂，得到的固体溶于12mL无水N,N-二甲基甲酰胺。向溶液中加入特戊酸氯甲酯(0.778mL,5.4mmol)，25℃，搅拌反应1h。反应结束后，加入乙酸乙酯和水按照体积为1:1组成的混合液进行萃取，有机相经饱和食盐水洗涤后，无水硫酸钠干燥，30℃，减压蒸馏，得到粗产物经硅胶柱层析法分离纯化，采用梯度洗脱，石油醚/乙酸乙酯的体积比从1:1逐渐增加到1:4，得到(2-氨基-6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-9)戊酸甲酯(0.584g,1.33mmol)，产率74％。
UVλ:267,283nm。
IR(KBr压片)v/cm-1:3349.5(N-H)；2972.3(C-H)；1685.9(C＝C)；1226.5(C-O-C)；1093.4(C-N)；709.2(C-Br)；626.8(C-S)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.15(s,3H,CH3)；5.19(s,2H,OCH2)；5.36(s,2H,NCH2)；6.58(s,2H,NH2)；6.69-6.87(s,2H,C4H2BrS)；8.25(s,1H,H8)。
ESI-MS:m/z440(M+H)+。
3)(6-(4-溴噻吩甲氧基)-2-(((4-硝基苯)乙氧基)羰基)氨基-9氢-嘌呤-9)戊酸甲酯的合成
称取三光气(0.395g,1.33mmol)加入到两口烧瓶瓶中，加入9mL二氯甲烷溶解，将所得固体(2-氨基-6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-9)戊酸甲酯(0.584g,1.33mmol)，加入14mL二氯甲烷溶解，再加入0.6mL无水吡啶，在冰浴、氩气保护的条件下将(2-氨基-6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-9)戊酸甲酯溶液逐滴滴加到三光气溶液中，滴加完毕后，将温度缓慢升到25℃，搅拌反应4h；向反应液中加入9mL含有对1-(4-硝基苯基)乙醇(0.445g,2.66mmol)的二氯甲烷溶液，25℃，搅拌反应4h，薄层色谱法监测反应进程。待反应无原料点后，30℃减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析法分离纯化，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯，采用梯度洗脱，石油醚/乙酸乙酯的体积比从1:2逐渐增加到1:5，30℃真空干燥得到白色固体(6-(4-溴噻吩甲氧基)-2-(((4-硝基苯)乙氧基)羰基)氨基-9氢-嘌呤-9)戊酸甲酯(0.512g,0.81mmol)，产率61％。
UVλ:267,285nm。
IR(KBr压片)v/cm-1:3468.3(N-H)；2937.9(C-H)；1764.2(C＝O)；1636.4(C＝C)；1435.6(N-O)；1237.5(C-O-C)；1125.7(C-N)；721.3(C-Br)；624.5(C-S)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.15(s,3H,C(CH3)3)；1.65(d,3H,CH3)；5.16(s,2H,OCH2)；5.45(s,2H,NCH2)；6.06(s,H,CH3 CH)；6.61-6.84(s,2H,C4H2BrS)；7.56-8.26(m,4H,Ar)；8.04(s,1H,H8)；10.34(s,H,NH)。
ESI-MS:m/z633(M+H)+。
4)1-(4-硝基苯)乙基-(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)氨基甲酸酯的合成
将(6-(4-溴噻吩甲氧基)-2-(((4-硝基苯)乙氧基)羰基)氨基-9氢-嘌呤-9)戊酸甲酯(0.512g,0.81mmol)溶于含有0.081mol/L氨(0.14mL氨水)的45mL甲醇溶液中，25℃，搅拌反应40h，薄层色谱监测反应进程，待反应至无原料点后，过滤收集固体，得到固体1-(4-硝基苯)乙基-(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)氨基甲酸酯(0.357g，0.69mmol)，产率为85％。
UVλ:267,280nm。
IR(KBr压片)v/cm-1:3425.3(N-H)；2974.8(C-H)；1769.6(C＝O)；1639.1(C＝C)；1435.3(N-O)；1237.4(C-O-C)；1136.7(C-N)；728.2(C-Br)；621.5(C-S)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.84(d,3H,CH3)；5.19(s,2H,OCH2)；5.96(q,H,CH3 CH)；6.64-6.88(s,2H,C4H2BrS)；7.76-8.31(m,4H,Ar)；8.09(s,1H,H8)；10.34(s,H,NHCO)；13.22(s,H,H9)。
ESI-MS:m/z519(M+H)+。
实施例4 1-(4-硝基苯)乙基-(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)氨基甲酸酯(化合物2)
1)(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)胺的合成
称取4-溴噻吩基甲醇(1.56g,8.1mmol)加入到100mL圆底烧瓶中，加入25mLN,N-二甲基甲酰胺，向反应液中加入氢化钠(0.130g,5.4mmol)和2-氨基嘌呤-6-三甲基铵盐氯化物(0.616g,2.7mmol)，30℃,搅拌反应2h。反应结束后，加入乙酸乙酯和水按照体积为1:1组成的混合液进行萃取，有机相经饱和氯化铵溶液洗涤后，经无水硫酸钠干燥，30℃减压蒸馏，所得粗产物溶于甲醇，过滤除去杂质沉淀，重结晶后得到(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)胺(0.605g,1.86mmol)，产率69％。
UVλ:246,283nm。
IR(KBr压片)v/cm-1:3352.6(N-H)；2968.1(C-H)；1685.2(C＝C)；1087.3(C-N)；708.1(C-Br)；618.1(C-S)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:5.19(s,2H,OCH2)；6.58(s,2H,NH2)；6.62-6.84(s,2H,C4H2BrS)；8.24(s,1H,H8)；13.25(s,H,NH)。
ESI-MS:m/z326(M+H)+。
2)(2-氨基-6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-9)戊酸甲酯的合成
称取(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)胺(0.605g,1.86mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入3.72mL含有乙醇钠(0.253g,3.72mmol)的乙醇溶液使其溶解，30℃，搅拌反应20min后，真空抽干溶剂，得到的固体溶于15mL无水N,N-二甲基甲酰胺。向溶液中加入特戊酸氯甲酯(0.804mL,5.58mmol)，30℃，搅拌反应1h。反应结束后，加入乙酸乙酯和水按照体积为1:1组成的混合液进行萃取，有机相经饱和食盐水洗涤后，无水硫酸钠干燥，30℃，减压蒸馏，得到粗产物经硅胶柱层析法分离纯化，采用梯度洗脱，石油醚/乙酸乙酯的体积比从1:1逐渐增加到1:4，得到(2-氨基-6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-9)戊酸甲酯(0.615g,1.4mmol)，产率75％。
UVλ:266,283nm。
IR(KBr压片)v/cm-1:3342.4(N-H)；2975.3(C-H)；1686.3(C＝C)；1231.7(C-O-C)；1087.5(C-N)；712.5(C-Br)；624.3(C-S)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.16(s,3H,CH3)；5.24(s,2H,OCH2)；5.34(s,2H,NCH2)；6.59(s,2H,NH2)；6.64-6.89(s,2H,C4H2BrS)；8.27(s,1H,H8)。
ESI-MS:m/z440(M+H)+。
3)(6-(4-溴噻吩甲氧基)-2-(((4-硝基苯)乙氧基)羰基)氨基-9氢-嘌呤-9)戊酸甲酯的合成
称取三光气(0.415g,1.4mmol)加入到两口烧瓶瓶中，加入10mL二氯甲烷溶解，将所得固体(2-氨基-6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-9)戊酸甲酯(0.615g,1.4mmol)，加入15mL二氯甲烷溶解，再加入0.7mL无水吡啶，在冰浴、氩气保护的条件下将(2-氨基-6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-9)戊酸甲酯溶液逐滴滴加到三光气溶液中，滴加完毕后，将温度缓慢升到25℃，搅拌反应4h；向反应液中加入10mL含有对1-(4-硝基苯基)乙醇(0.468g,2.8mmol)的二氯甲烷溶液，30℃，搅拌反应4h，薄层色谱法监测反应进程。待反应无原料点后，30℃减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析法分离纯化，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯，采用梯度洗脱，石油醚/乙酸乙酯的体积比从1:2逐渐增加到1:5，30℃真空干燥得到白色固体(6-(4-溴噻吩甲氧基)-2-(((4-硝基苯)乙氧基)羰基)氨基-9氢-嘌呤-9)戊酸甲酯(0.556g,0.88mmol)，产率63％。
UVλ:267,285nm。
IR(KBr压片)v/cm-1:3471.2(N-H)；2935.8(C-H)；1758.5(C＝O)；1627.5(C＝C)；1438.4(N-O)；1239.2(C-O-C)；1128.5(C-N)；725.1(C-Br)；625.6(C-S)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.18(s,3H,C(CH3)3)；1.66(d,3H,CH3)；5.18(s,2H,OCH2)；5.47(s,2H,NCH2)；6.08(s,H,CH3 CH)；6.63-6.85(s,2H,C4H2BrS)；7.54-8.28(m,4H,Ar)；8.05(s,1H,H8)；10.35(s,H,NH)。
ESI-MS:m/z633(M+H)+。
4)1-(4-硝基苯)乙基-(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)氨基甲酸酯的合成
将(6-(4-溴噻吩甲氧基)-2-(((4-硝基苯)乙氧基)羰基)氨基-9氢-嘌呤-9)戊酸甲酯(0.556g,0.88mmol)溶于含有0.088mol/L氨(0.16mL氨水)的48mL甲醇溶液中，30℃，搅拌反应38h，薄层色谱监测反应进程，待反应至无原料点后，过滤收集固体，得到固体1-(4-硝基苯)乙基-(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)氨基甲酸酯(0.394g，0.76mmol)，产率为86％。
UVλ:267,281nm。
IR(KBr压片)v/cm-1:3429.4(N-H)；29741.5(C-H)；1765.8(C＝O)；1635.4(C＝C)；1438.2(N-O)；1235.6(C-O-C)；1084.7(C-N)；723.6(C-Br)；625.2(C-S)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.86(d,3H,CH3)；5.17(s,2H,OCH2)；5.94(q,H,CH3 CH)；6.61-6.87(s,2H,C4H2BrS)；7.73-8.31(m,4H,Ar)；8.07(s,1H,H8)；10.32(s,H,NHCO)；13.21(s,H,H9)。
ESI-MS:m/z519(M+H)+。
实施例5 2-(4-硝基苄基)丙基-(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)氨基甲酸酯(化合物3)的合成
1)(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)胺的合成
称取4-溴噻吩基甲醇(1.44g,7.5mmol)加入到100mL圆底烧瓶中，加入20mLN,N-二甲基甲酰胺，向反应液中加入氢化钠(0.12g,5.0mmol)和2-氨基嘌呤-6-三甲基铵盐氯化物(0.570g,2.5mmol)，搅拌，25℃，反应2h。反应结束后，加入乙酸乙酯和水按照体积为1:1组成的混合液进行萃取，有机相经饱和氯化铵溶液洗涤后，经无水硫酸钠干燥，30℃减压蒸馏，所得粗产物溶于甲醇，过滤除去杂质沉淀，重结晶后得到(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)胺(0.553g,1.7mmol)，产率68％。
UVλ:246,283nm。
IR(KBr压片)v/cm-1:3432.6(N-H)；2947.2(C-H)；1670.1(C＝C)；1098.5(C-N)；707.3(C-Br)；615.4(C-S)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:5.18(s,2H,OCH2)；6.53(s,2H,NH2)；6.67-6.83(s,2H,C4H2BrS)；8.25(s,1H,H8)；13.21(s,H,NH)。
ESI-MS:m/z326(M+H)+。
2)(2-氨基-6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-9)戊酸甲酯的合成
称取(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)胺(0.553g,1.7mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入3.4mL含有乙醇钠(0.231g,3.4mmol)的乙醇溶液使其溶解，25℃，搅拌反应20min后，真空抽干溶剂，得到的固体溶于12mL无水N,N-二甲基甲酰胺。向反应液中加入特戊酸氯甲酯(0.735mL,5.1mmol)，25℃，搅拌反应1h，反应结束后，加入乙酸乙酯和水按照体积为1:1组成的混合液进行萃取，有机相经饱和食盐水洗涤后，无水硫酸钠干燥，30℃减压蒸馏，得到粗产物经硅胶柱层析法分离纯化，采用梯度洗脱，石油醚/乙酸乙酯的体积比从1:1逐渐增加到1:4，得到(2-氨基-6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-9)戊酸甲酯(0.544g,1.24mmol)，产率73％。
UVλ:266,283nm。
IR(KBr压片)v/cm-1:3438.3(N-H)；2942.4(C-H)；1685.7(C＝C)；1236.3(C-O-C)；1094.6(C-N)；712.5(C-Br)；609.7(C-S)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.15(s,3H,CH3)；5.19(s,2H,OCH2)；5.35(s,2H,NCH2)；6.58(s,2H,NH2)；6.69-6.85(s,2H,C4H2BrS)；8.25(s,1H,H8)。
ESI-MS:m/z440(M+H)+。
3)(6-(4-溴噻吩甲氧基)-2-(((4-硝基苯)丙氧基)羰基)氨基-9氢-嘌呤-9)戊酸甲酯的合成
称取三光气(0.368g,1.24mmol)加入到两口烧瓶瓶中，加入8mL二氯甲烷溶解，将所得固体(2-氨基-6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-9)戊酸甲酯(0.544g,1.24mmol)，加入14mL二氯甲烷溶解，再加入0.55mL无水吡啶，在冰浴、氩气保护的条件下将(2-氨基-6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-9)戊酸甲酯溶液逐滴滴加到三光气溶液中，滴加完毕后，将温度缓慢升到25℃，搅拌反应4h；向反应液中加入8mL含有对2-(4-硝基苯基)-2-丙醇(0.449g,2.48mmol)的二氯甲烷溶液，25℃，搅拌反应4h，薄层色谱法监测反应进程。待反应无原料点后，30℃减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析法分离纯化，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯，采用梯度洗脱，石油醚/乙酸乙酯的体积比从1:2逐渐增加到1:5，30℃真空干燥得到白色固体(6-(4-溴噻吩甲氧基)-2-(((4-硝基苯)乙氧基)羰基)氨基-9氢-嘌呤-9)戊酸甲酯(0.504g,0.78mmol)，产率63％。
UVλ:268,285nm。
IR(KBr压片)v/cm-1:3445.3(N-H)；2948.5(C-H)；1784.7(C＝O)；1627.4(C＝C)；1431.7(N-O)；1219.8(C-O-C)；1083.6(C-N)；715.7(C-Br)；614.3(C-S)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.13(s,3H,CH3)；1.87(s,3H,CH3)；5.18(s,2H,OCH2)；5.58(s,2H,NCH2)；6.63-6.87(s,2H,C4H2BrS)；7.29-8.19(m,4H,Ar)；7.97(s,1H,H8)；10.36(s,H,NH)。
ESI-MS:m/z647(M+H)+。
4)2-(4-硝基苯)丙基-(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)氨基甲酸酯的合成
将(6-(4-溴噻吩甲氧基)-2-(((4-硝基苯)丙氧基)羰基)氨基-9氢-嘌呤-9)戊酸甲酯(0.504g,0.78mmol)溶于含有0.078mol/L氨(0.135mL氨水)的45mL甲醇溶液中，25℃，搅拌反应40h，薄层色谱监测反应进程，待反应至无原料点后，过滤收集固体，得到固体2-(4-硝基苯)丙基-(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)氨基甲酸酯(0.353g，0.663mmol)，产率为85％。
UVλ:268,283nm。
IR(KBr压片)v/cm-1:3439.2(N-H)；2958.9(C-H)；1792.5(C＝O)；1637.2(C＝C)；1426.8(N-O)；1235.9(C-O-C)；1095.6(C-N)；715.8(C-Br)；627.4(C-S)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.84(s,3H,CH3)；5.18(s,2H,OCH2)；6.67-6.85(s,2H,C4H2BrS)；7.46-8.34(m,4H,Ar)；8.19(s,1H,H8)；10.36(s,1H,NHCO)；13.21(s,H,H9)。
ESI-MS:m/z533(M+H)+。
实施例6 2-(4-硝基苄基)丙基-(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)氨基甲酸酯(化合物3)的合成
1)(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)胺的合成
称取4-溴噻吩基甲醇(1.27g,6.6mmol)加入到100mL圆底烧瓶中，加入18mLN,N-二甲基甲酰胺，向反应液中加入氢化钠(0.106g,4.4mmol)和2-氨基嘌呤-6-三甲基铵盐氯化物(0.502g,2.2mmol)，搅拌，30℃，反应2h。反应结束后，加入乙酸乙酯和水按照体积为1:1组成的混合液进行萃取，有机相经饱和氯化铵溶液洗涤后，经无水硫酸钠干燥，30℃减压蒸馏，所得粗产物溶于甲醇，过滤除去杂质沉淀，重结晶后得到(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)胺(0.494g,1.52mmol)，产率69％。
UVλ:246,283nm。
IR(KBr压片)v/cm-1:3429.2(N-H)；2937.5(C-H)；1675.3(C＝C)；1085.9(C-N)；709.5(C-Br)；618.1(C-S)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:5.19(s,2H,OCH2)；6.56(s,2H,NH2)；6.64-6.85(s,2H,C4H2BrS)；8.25(s,1H,H8)；13.25(s,H,NH)。
ESI-MS:m/z326(M+H)+。
2)(2-氨基-6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-9)戊酸甲酯的合成
称取(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)胺(0.494g,1.52mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入3.04mL含有乙醇钠(0.207g,3.04mmol)的乙醇溶液使其溶解，30℃，搅拌反应20min后，真空抽干溶剂，得到的固体溶于10mL无水N,N-二甲基甲酰胺。向溶液中加入特戊酸氯甲酯(0.657mL,4.56mmol)，30℃，搅拌反应1h，反应结束后，加入乙酸乙酯和水按照体积为1:1组成的混合液进行萃取，有机相经饱和食盐水洗涤后，无水硫酸钠干燥，30℃减压蒸馏，得到粗产物经硅胶柱层析法分离纯化，采用梯度洗脱，石油醚/乙酸乙酯的体积比从1:1逐渐增加到1:4，得到(2-氨基-6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-9)戊酸甲酯(0.492g,1.12mmol)，产率74％。
UVλ:266,283nm。
IR(KBr压片)v/cm-1:3426.1(N-H)；2937.5(C-H)；1674.2(C＝C)；1247.5(C-O-C)；1105.7(C-N)；713.6(C-Br)；613.2(C-S)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.16(s,3H,CH3)；5.21(s,2H,OCH2)；5.37(s,2H,NCH2)；6.56(s,2H,NH2)；6.65-6.84(s,2H,C4H2BrS)；8.26(s,1H,H8)。
ESI-MS:m/z440(M+H)+。
3)(6-(4-溴噻吩甲氧基)-2-(((4-硝基苯)丙氧基)羰基)氨基-9氢-嘌呤-9)戊酸甲酯的合成
称取三光气(0.332g,1.12mmol)加入到两口烧瓶瓶中，加入5mL二氯甲烷溶解，将所得固体(2-氨基-6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-9)戊酸甲酯(0.492g,1.12mmol)，加入10mL二氯甲烷溶解，再加入0.4mL无水吡啶，在冰浴、氩气保护的条件下将(2-氨基-6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-9)戊酸甲酯溶液逐滴滴加到三光气溶液中，滴加完毕后，将温度缓慢升到25℃，搅拌反应4h；向反应液中加入5mL含有对2-(4-硝基苯基)-2-丙醇(0.406g,2.24mmol)的二氯甲烷溶液，30℃，搅拌反应4h，薄层色谱法监测反应进程。待反应无原料点后，30℃减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析法分离纯化，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯，采用梯度洗脱，石油醚/乙酸乙酯的体积比从1:2逐渐增加到1:5，30℃真空干燥得到白色固体(6-(4-溴噻吩甲氧基)-2-(((4-硝基苯)乙氧基)羰基)氨基-9氢-嘌呤-9)戊酸甲酯(0.470g,0.728mmol)，产率65％。
UVλ:268,285nm。
IR(KBr压片)v/cm-1:3425.4(N-H)；2935.2(C-H)；1785.9(C＝O)；1632.6(C＝C)；1435.6(N-O)；1215.6(C-O-C)；1085.1(C-N)；716.8(C-Br)；617.4(C-S)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.14(s,3H,CH3)；1.89(s,3H,CH3)；5.19(s,2H,OCH2)；5.57(s,2H,NCH2)；6.62-6.87(s,2H,C4H2BrS)；7.28-8.17(m,4H,Ar)；8.03(s,1H,H8)；10.35(s,H,NHCO)；。
ESI-MS:m/z 647(M+H)+。
4)2-(4-硝基苯)丙基-(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)氨基甲酸酯的合成
将(6-(4-溴噻吩甲氧基)-2-(((4-硝基苯)丙氧基)羰基)氨基-9氢-嘌呤-9)戊酸甲酯(0.470g,0.728mmol)溶于含有0.0728mol/L氨(0.112mL氨水)的40mL甲醇溶液中，30℃，搅拌反应40h，薄层色谱监测反应进程，待反应至无原料点后，过滤收集固体，得到固体2-(4-硝基苯)丙基-(6-(4-溴噻吩甲氧基)-9氢-嘌呤-2)氨基甲酸酯(0.333g，0.626mmol)，产率为86％。
UVλ:268,283nm。
IR(KBr压片)v/cm-1:3418.7(N-H)；2943.5(C-H)；1783.2(C＝O)；1629.7(C＝C)；1435.3(N-O)；1238.1(C-O-C)；1127.6(C-N)；718.2(C-Br)；614.9(C-S)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.85(s,3H,CH3)；5.17(s,2H,OCH2)；6.65-6.87(s,2H,C4H2BrS)；7.45-8.36(m,4H,Ar)；8.21(s,1H,H8)；10.35(s,1H,NHCO)；13.23(s,H,H9)。
ESI-MS:m/z533(M+H)+。
实施例7 AGT蛋白抑制剂对肿瘤细胞生物学活性评价
1、实验材料与仪器
供试化合物：上述制备实施例中制得的化合物1、2和3；
细胞系：人白血病细胞HL-60、人肺癌细胞A549、人黑色素瘤细胞A375细胞、人T淋巴瘤细胞HUT102、人脑神经胶质瘤细胞H4、人肝癌细胞BEL-7402。
2、实验方法分别在常氧和低氧条件下，设置尼莫司汀(ACNU)组(实验组1)、ACNU+化合物1联合用药组(实验组2)、ACNU+化合物2联合用药组(实验组3)、ACNU+化合物3联合用药组(实验组4)，同时设置空白组和对照组。
六种肿瘤细胞分别以2000/孔接种96孔板，在37℃，5％CO2培养24小时后，实验组1以系列浓度(0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM)的ACNU处理细胞24h；实验组2、
3、4分别经化合物1、2、3处理细胞3h后，换以系列浓度的ACNU处理细胞24h(常氧条件下氧气含量约为21％，低氧条件下氧气含量约为1％)。然后，向每孔中加10μL含有CCK-8的培养基，作用4小时。最后，测定在450nm处的吸光度值，按以下公式计算细胞活性，并通过回归分析计算半数抑制率IC50。
细胞存活率(％)＝(A实验组–A空白组)/(A对照组–A空白组)×100
A实验组为具有肿瘤细胞、CCK-8和药物(ACNU+化合物1/2/3)的孔的吸光度；
A空白组为只有培养基和CCK-8，没有肿瘤细胞和药物的孔的吸光度；
A对照组为具有肿瘤细胞和CCK-8，没有药物的孔的吸光度。
3、实验结果：见表1
表1 肿瘤细胞的半数抑制率(IC50,μM)
表1结果显示，在常氧环境下，与ACNU组相比，化合物1、2或3与ACNU联合用药对六种肿瘤细胞的IC50值相近，表明在常氧条件下，化合物1、2和3对六种肿瘤细胞中AGT活性的抑制作用很弱。
然而在低氧环境下，与ACNU组相比，化合物1、2或3与ACNU联合用药对六种肿瘤细胞的IC50值显著降低，表明化合物1、2和3在低氧环境下能够特异性地被还原并释放出O6-苄基鸟嘌呤类似物作为AGT抑制剂，降低了肿瘤细胞中AGT的活性，从而有效增强了肿瘤细胞对ACNU的敏感性，提高了药物对肿瘤细胞的抑制活性。
对比常氧和低氧条件下化合物1、2和3的IC50值，可以看出低氧条件比常氧条件下三种化合物对六种肿瘤细胞的AGT抑制活性显著提高，表明化合物1、2和3能够特异性地在低氧条件下被激活。因此，化合物1、2和3能够靶向作用于处于低氧状态下的肿瘤细胞，避免了影响正常细胞中的AGT活性，从而达到化疗药物靶向作用于肿瘤细胞的目的。
实验结果表明，本发明提供的化合物在低氧条件下具有较强的AGT蛋白抑制活性，在常氧条件下无明显抑制作用。与现有的AGT蛋白抑制剂O6-苄基鸟嘌呤相比，具有显著的低氧靶向性，以及更好的水溶性和AGT抑制活性。因此，本发明提供的化合物可用于作为烷化剂类化疗药物的辅药，靶向性地作用于肿瘤细胞，从而提高了肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，增强了烷化剂类药物的化疗效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了
详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神
的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种低氧激活AGT蛋白抑制剂，所述AGT蛋白抑制剂具有如通式(I)结构所示的化合物：
其中，R1＝R2＝H，或R1＝H，R2＝CH3，或R1＝R2＝CH3；
R3＝H，NO2，NH2，OCH3，CH2OH或CO2CH3。
2.如权利要求1所述的AGT蛋白抑制剂，其特征在于，所述AGT蛋白抑制剂为：
3.权利要求1或2所述的低氧激活AGT蛋白抑制剂的制备方法，其特征在于，所述方法的反应历程为：
包括如下反应步骤：
(1)将4-溴噻吩-2-基甲醇溶于N,N-二甲基甲酰胺中，向反应液中依次加入氢化钠和化合物a，搅拌反应，待反应结束后，加入乙酸乙酯和水按照体积为1:1组成的混合液进行萃取，有机相经饱和氯化铵溶液洗涤后，经无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，重结晶得到化合物b；
(2)化合物b中加入含有乙醇钠的乙醇溶液使其溶解，搅拌反应10-45min后，真空抽干溶剂，将得到的固体溶于有机溶剂中，向溶液中加入特戊酸氯甲酯，搅拌，反应结束后，加入乙酸乙酯和水按照体积为1:1组成的混合液进行萃取，有机相经饱和食盐水洗涤后，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得到粗产物经硅胶柱层析法分离纯化，得到化合物c；
(3)将步骤(2)所得的化合物c溶于二氯甲烷中，加入三光气，在惰性气体保护下搅拌反应，所得产物化合物d与反应，减压蒸馏，得到粗产物经硅胶柱层析法分离纯化，得化合物e；
(4)将步骤(3)所得的化合物e溶于含有氨水的甲醇溶液中，搅拌反应，薄层色谱监测反应进程，反应结束后，过滤收集固体，得到低氧激活AGT蛋白抑制剂即化合物f。
4.权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，化合物a、氢化钠与4-溴噻吩基甲醇的摩尔比为1:1-4:2-5；搅拌反应的温度控制在20-35℃，减压蒸馏温度为30-60℃。
5.权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述化合物b、乙醇钠与特戊酸氯甲酯的摩尔比为1:1-3:2-5，有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜，两个搅拌反应温度均控制在20-35℃，减压蒸馏温度均为30-60℃；所述硅胶柱层析法所用的洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯，采用梯度洗脱，石油醚与乙酸乙酯体积比为1:1-1:4。
6.权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述化合物c、三光气、的摩尔比为1:1-4:2-5；
化合物c与三光气的反应温度控制在0-25℃，反应时间为3-8h，得到化合物d；
化合物d与在25-40℃条件下反应，反应时间为3-8h；
硅胶柱层析法所用的洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯，采用梯度洗脱，石油醚/乙酸乙酯体积比为1:2-1:5。
7.权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述化合物e与氨水的摩尔体积比为1mmol:0.1-1mL；反应时间为20-40h；反应温度控制在20-35℃。
8.一种药物组合物，其特征在于，包括a)烷化剂类抗肿瘤化合物；b)权利要求1-2任意一项所述的具有低氧激活特性的靶向性AGT抑制剂。
9.权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述烷化剂类抗肿瘤化合物为尼莫司汀。
10.权利要求1或2所述的低氧激活AGT蛋白抑制剂或权利要求8或9所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
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