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CN106083836B - 基于喹唑啉结构的h2s供体化合物及其应用 - Google Patents

基于喹唑啉结构的h2s供体化合物及其应用 Download PDF

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CN106083836B
CN106083836B CN201610477893.8A CN201610477893A CN106083836B CN 106083836 B CN106083836 B CN 106083836B CN 201610477893 A CN201610477893 A CN 201610477893A CN 106083836 B CN106083836 B CN 106083836B
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Abstract

本发明公开了一类基于喹唑啉结构的H2S供体化合物及及其应用，其为式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中，Ar为取代或非取代的苯基，其取代基选自：卤素、硝基、C1‑4烷基、C1‑4卤代烷基、C1‑4烷氧基、C1‑4卤代烷氧基中的一种或几种；X为C1‑4烷氧基、B‑NH‑或A‑CH2CO‑NH‑基团，Y为H、B‑CnH2nO‑或A‑CnH2nO‑基团，A或B分别为H2S供体基团，n为1～5的整数，且X为C1‑3烷氧基时Y不为H。本发明所设计合成的一系列基于4‑苯胺基喹唑啉结构的H2S供体化合物，通过H2S和4‑苯胺基喹唑啉衍生物的协同作用，进而提高药物的抗肿瘤活性。

Description

基于喹唑啉结构的H2S供体化合物及其应用
技术领域
本发明属于药物化合物领域，具体涉及一类基于喹唑啉结构的H2S供体化合物及其制备方法和应用。
背景技术
众所周知，硫化氢(H2S)是一种有臭鸡蛋气味的气体，几个世纪以来，H2S被认为是毒性大的空气污染物并且大量吸入会导致中毒。然而，最近这种气体分子被认为是继一氧化氮和一氧化碳之后又一重要的气体递质。内源性H2S的产生，至少和三种酶相关：胱硫醚β-合酶(CBS)，胱硫醚γ-裂解酶(CSE)和3-巯基丙酮酸硫转移酶(MPST)。在不同的组织或者器官中，这些酶将半胱氨酸或半胱氨酸衍生物转化为H2S，而H2S具有多种生物效应，包括血管舒张，抗炎，抗癌和心脏保护等。
据报道，H2S会导致蛋白质分子的二硫键水解(即形成-S-SH)，因此，H2S可能改变各种蛋白质和酶的生物学功能。同时，H2S也与S-亚硝基硫醇作用，产生巯基亚硝酸(HSNO)，少量的S-亚硝基硫醇可以自由通过细胞膜，促进蛋白质的亚硝基化。以上研究结果表明，调控H2S的水平在疾病的治疗中可能有较大的应用价值。
目前研究发现，外源性H2S通过激活MAP激酶和caspase-3诱导肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤的生长。在肝癌中，外源性H2S通过阻断STAT3信号通路，阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡，抑制肿瘤的生长。在人类结肠癌中，外源性H2S通过抑制NF-κB信号通路和Trx/TrxR的活性，从而抑制肿瘤的增殖。在乳腺癌中，外源性H2S通过裂解PARP和激活caspase-7诱导肿瘤细胞凋亡。在胃癌中，外源性H2S 通过调控相关凋亡蛋白Bax、CytC和caspase-3，从而抑制肿瘤增殖。由此可以看出，外源性H2S对肿瘤具有抑制作用，这为治疗肿瘤提供了一条可能的新途径。
在硫化氢领域，H2S供体是重要的研究工具。同时，研究结果证实H2S在许多肿瘤中具有抑制作用。在这些H2S供体中，最常用的是硫化盐，包括硫化钠(Na2S)和硫氢化钠(NaHS)。这些无机盐水溶性极好，特定浓度下对细胞无毒，能迅速提高H2S的浓度。然而它们在水溶液中自发的释放H2S，因此很难精确控制H2S的浓度。此外，由于H2S气体的挥发，它在水溶液的浓度会迅速降低，因此，大大限制了硫化钠和硫氢化钠的使用。
考虑到这些缺点，合成H2S供体已受到相当大的关注，且已有文献报道H2S供体化合物。例如，H2S 供体GYY4137，是Lawesson‘s试剂的衍生物。GYY4137已经被证实在体外和体内均能释放H2S，且可通过缓慢释放的H2S，阻断STAT3信号通路，从而对肝癌细胞产生抑制作用。目前报道的其它H2S供体主要有DATS、Z-ajoene、S-propylcysteine sulfoxide、ADT-OH、ACS-81和ACS-60等。以上H2S供体可以和具有生物活性的母体化合物进行拼合，得到活性更好的H2S供体化合物，如HS-sulindac， HS-ibuprofen，HS-naproxen，HS-aspirin和HS-ASA等。此类化合物进入体内后，在体内酶的作用下，缓慢释放H2S和母体化合物或其结构类似物，发挥二者的协同作用，从而表现出比母体化合物有更好的治疗效果或者更低的毒副作用。研究发现此类化合物对肺癌、结肠癌、乳腺癌及胰腺癌具有抑制作用。
Figure BDA0001030122650000021
喹唑啉是药物化学中研究最多的结构。喹唑啉生物碱具有潜在的抗疟疾、抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗高血压等活性。在过去的15年里，FDA已经批准了若干个4-苯胺基喹唑啉衍生物的抗癌药物，如吉非替尼，埃罗替尼和拉帕替尼等。这些4-苯胺基喹唑啉化合物均能够抑制EGFR激酶的活性。此外，一些以4-苯胺基喹唑啉为母核的激酶抑制剂的研究越来越多，且部分已进入临床研究阶段。
表皮生长因子受体家族(EGFR)为受体酪氨酸激酶家族一员，主要包括HER1(即EGFR)、HER2、 HER3及HER4等亚型，EGFR的高表达与上皮细胞肿瘤有密切联系，其高表达的肿瘤细胞侵袭性强，易转移，疗效差，患者愈后不佳。
吉非替尼(Gefitinb)具有4-苯胺基喹唑啉结构，是由Astra Zeneca公司开发的一个靶向EGFR 的小分子抑制剂。2002年首次于日本上市治疗不可手术或者复发的非小细胞肺癌，2003年在美国及澳大利亚获准作为三线单一治疗药物用于晚期非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)。实验研究表明，其体外抑制EGFR的IC50为0.037μM；埃罗替尼(Erlotinib)由OSI公司开发的4-苯胺基喹唑啉类EGFR小分子抑制剂。2004年11月美国FDA批准上市治疗局部晚期或转移性非小细胞肺癌 (NSCLC)，其抑制EGFR的IC50为0.002μM；拉帕替尼(Lapatinib)由葛兰素史克公司开发EGFR/HER2 双重抑制剂，是一种4-苯胺喹唑啉化合物，2007年美国FDA批准上市，用于治疗晚期或转移性乳腺癌。研究表明，在一些癌症细胞系(A549、PC3、MCF7等)，拉帕替尼均表现出较高的抗增殖活性，其抑制EGFR的IC50为0.010μM。此外还有一些Lapatinib类似物均在临床前研究阶段，如化合物1，对EGFR和HER-2具有抑制作用，其IC50值分别小于0.05和0.03nM。
Figure BDA0001030122650000031
Aurora激酶是一种重要的丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞有丝分裂中起重要的调控作用。Aurora激酶表达异常，干扰有丝分裂，可能导致基因的不稳定和肿瘤的生长。
AZD1152是由Astra Zeneca公司研发的4-苯胺基喹唑啉类Aurora B选择性抑制剂，其抑制Aurora B的IC50为0.37nM，而抑制Aurora A的IC50为1368nM。研究表明，AZD1152可以诱导人急性淋巴细胞和白血病细胞周期阻滞及凋亡，临床II期评价其治疗血液肿瘤、恶性实体瘤及晚期实体瘤。 ZM447439是最早报道的Aurora A和Aurora B抑制剂，是AstraZeneca公司从250000个化合物中筛选出具有Aurora A/B激酶抑制活性的4-苯胺基喹唑啉类先导物，其抑制Aurora A和B的IC50分别为 110和130nM。自2011年以来，喹唑啉Aurora激酶抑制剂已有多项专利报道。其中有专利 (WO2011144059)设计并合成了一系列喹唑啉衍生物，且表现出对Aurora B和EGFR的双重抑制作用，如化合物3在200μM时，对Aurora B和EGFR抑制率达到96％和98％。中国专利CN10409855 中设计并合成的化合物4，和AZD1152结构有高度同源性，且具有较好的Aurora激酶抑制活性，其抑制Aurora A的IC50为82nM，抑制Aurora B的IC50为0.15nM。
Figure BDA0001030122650000041
欧洲专利EP2708532描述了一系列关于4-苯胺基喹唑啉的衍生物，这类衍生物主要抑制HDAC-1 酶。其中化合物5的IC50值为178nM。US20120094997专利发现在喹唑啉的C-6位置上有异羟肟酸取代基时，对HDAC-6酶的选择性高于HDAC-1酶。
Figure BDA0001030122650000042
综上所述，4-苯胺基喹唑啉类衍生物作为EGFR抑制剂，Aurora激酶抑制剂及组蛋白去乙酰化酶抑制剂等，都表现出良好的抗肿瘤活性。
近几年来，肿瘤的发病率逐年上升，研发安全、高效且低毒的新型抗肿瘤药迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，设计合成了一系列基于4-苯胺基喹唑啉结构的H2S供体化合物，通过H2S和4-苯胺基喹唑啉衍生物的协同作用，从而提高药物的抗肿瘤活性。
本发明的另一目的是提供一种上述基于喹唑啉结构的H2S供体化合物的制备方法。
本发明的第三目的是提供一类上述基于喹唑啉结构的H2S供体化合物在抗肿瘤方面的应用。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
一类基于喹唑啉结构的H2S供体化合物，其为式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，
Figure BDA0001030122650000051
其中，
Ar为取代或非取代的苯基，其取代基选自：卤素、硝基、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、 C1-4卤代烷氧基中的一种或几种；
X为C1-4烷氧基、B-NH-或A-CH2CO-NH-基团，
Y为H、B-CnH2nO-或A-CnH2nO-基团，
A或B分别为H2S供体基团，
n为1～5的整数，
且X为C1-3烷氧基时Y不为H。
在一种优选方案中，Ar为取代或非取代的苯基，其取代基选自：氟、氯、溴、硝基、C1-3烷基、 C1-3卤代烷基、C1-3烷氧基中的一种或几种。
在一种更优选的方案中，Ar为取代或非取代的苯基，其取代基选自：氟、氯、溴、硝基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、三氟甲基中的一种或几种。
本发明中的A或B分别为H2S供体基团，在一种优选方案中，A为
Figure BDA0001030122650000052
B为
Figure BDA0001030122650000053
本发明中的n可以为1、2、3、4或5，优选2、3或4，最优选为3。
在一种优选方案中，X为C1-3烷氧基，Y为B-CnH2nO-或A-CnH2nO-基团。
在另一种优选方案中，X为B-NH-或A-CH2CO-NH-基团，Y为H。
在一种方案中，本发明的化合物可选为式(II)或式(III)所示的化合物，
Figure BDA0001030122650000054
其中，
R3为A或B基团，
R4为A-CH2CO-或B基团。
本发明所涉及的化合物或其药学上可接受的盐，其中化合物具体可选自：
Figure BDA0001030122650000061
本发明提供了一类式(II)化合物的合成路线，具体如下：
Figure BDA0001030122650000062
本发明提供了一类式(III)化合物的合成路线，具体如下：
Figure BDA0001030122650000071
本发明提供了一种药物组合物，该组合物以本发明所涉及的化合物或其药学上可接受的盐为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的辅料。
除非另外说明，在说明书和权利要求中使用的以下术语具有下面讨论的含义：
本发明中的“烷基”表示1-20个碳原子的饱和的脂烃基，包括直链和支链基团(本申请书中提到的数字范围，例如“1-20”，是指该基团，此时为烷基，可以含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，直至包括20个碳原子)。含1～4个碳原子的烷基(C1-4烷基)称为低级烷基。当低级烷基没有取代基时，称其为未取代的低级烷基。更优选的是，烷基是有1-10个碳原子的中等大小的烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基等。最好是，烷基为有1-4个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基或叔丁基等。烷基可以是取代的或未取代的。
本发明中的“卤素”表示氟、氯、溴或碘，优选为氟或氯。
本发明中的“硝基”表示“-NO2”基团
本发明中的“卤代烷基”表示卤素取代的烷基，优选如上所定义的卤素取代的低级烷基，它被一个或多个相同或不同的卤原子取代(如C1-4卤代烷基)，例如-CH2Cl、-CF3、-CH2CF3、-CH2CCl3等。
本发明中的“烷氧基”表示-O-(未取代的烷基)和-O-(未取代的环烷基)。代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基等。
本发明中的“卤代烷氧基”表示具有一个或多个相同或不同的卤原子取代的烷氧基。代表性实例包括但不限于三氟甲氧基、一氯甲氧基等。
本发明中的“药学上可接受的盐”表示保留母体化合物的生物有效性和性质的那些盐。这类盐包括：
(1)与酸成盐，通过母体化合物的游离碱与无机酸或有机酸的反应而得，无机酸包括盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、偏磷酸、硫酸、亚硫酸和高氯酸等，有机酸包括乙酸、三氟乙酸、丙酸、丙烯酸、己酸、环戊烷丙酸、羟乙酸、丙酮酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、富马酸、马来酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、γ-羟基丁酸、甲氧基苯甲酸、邻苯二甲酸、甲磺酸、乙磺酸、萘-1-磺酸、萘-2-磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、肉桂酸、十二烷基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、天冬氨酸、硬脂酸、扁桃酸、琥珀酸或丙二酸等。
(2)存在于母体化合物中的酸性质子被金属离子代替或者与有机碱配位化合所生成的盐，金属例子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子，有机碱例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、 N-甲基葡糖胺、奎宁等。
本发明中的“药物组合物”指将本发明中的化合物中的一个或多个或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或前药与别的化学成分，例如药学上可接受的载体，混合。药物组合物的目的是促进给药给动物的过程。
本发明所涉及的化合物或其药学上可接受的盐可应用于制备抗癌药物方面，特别是抗肝癌或肝癌药物方面。
本发明所设计合成的一系列基于4-苯胺基喹唑啉结构的H2S供体化合物，通过H2S和4-苯胺基喹唑啉衍生物的协同作用，进而提高药物的抗肿瘤活性。研究化合物的体外抗HepG2及A-549细胞增殖活性；在此基础上，检测化合物体外释放H2S水平；检测目标化合物分子水平EGFR抑制活性，以期发现综合评价较高的先导化合物，为新型抗肿瘤药物的研发提供新途径。
附图说明
图1是本发明化合物QHS-6定性释放H2S水平。
图中，左图A为：荧光探针NIR-HS(10μM)与化合物QHS-6(0，5，10，50，100，200μM)在PBS缓冲液(PBS:丙酮＝2:3)中孵育3h(37℃)，检测荧光强度。右图B为：在723nm处，检测化合物QHS-6(0，5，10，50，100，200μM)的荧光强度。
图2是本发明化合物QHS-13定性释放H2S水平。
图中，左图A为：荧光探针NIR-HS(10μM)与化合物QHS-13(0，5，10，50，100，200μM)在PBS缓冲液(PBS:丙酮＝2:3)中孵育3h(37℃)，检测荧光强度。右图B为：在723nm处，检测化合物QHS-13(0，5，10，50，100，200μM)的荧光强度。
图3是本发明化合物LHS-1定性释放H2S水平。
图中，左图A为：荧光探针NIR-HS(10μM)与化合物LHS-1(0，5，10，50，100，200μM)在PBS缓冲液(PBS:丙酮＝2:3)中孵育3h(37℃)，检测荧光强度。右图B为：在723nm处，检测化合物LHS-1(0，5，10，50，100，200μM)的荧光强度。
图4是Na2S标准曲线。
图中，左图A为：荧光探针NIR-HS(10μM)与Na2S(0，2，4，6，8μM)在PBS缓冲液(PBS:丙酮＝2:3)中孵育3h(37℃)，检测荧光强度。右图B为：Na2S标准曲线。
图5是化合物QHS-6、QHS-13和LHS-1定量释放H2S水平。
具体实施方式
本发明的一些方面和实施方案可以通过以下的具体实施例加以进一步说明。本发明中涵盖的化合物可以通过已知的传统技术合成。这些化合物可以从方便可用的起始原料便利地合成。以下是本发明合成的化合物一般合成方案。此处公开的这些方案是描述性的，并不表示限制本领域的技术人员使用其它可能的方法合成化合物。各种方法都是本领域中的常规技术。另外，不同的合成步骤可以应用在不同的方案中合成目标化合物。在此引用的所有文献都以参考文献的方式并入本文之中。
下面有代表性的例子旨在帮助阐述本发明，而不是有意也不应该被解释为限制本发明的范围。事实上，除了那些出现和描述于此的以外，本发明中文件的全部内容，包括依据此处引用的科技文献和专利的例子，以及由此产生的各种修饰和许多进一步变化对本专业内一般技术人员都是清晰明白的。还应当明白，这些参考文献的引用有助于陈述本文内容。下面的例子包含了重要的补充信息、范例和指导，可适应于本发明中各种变化及类似情况。
合成实施例
本发明的化合物主要涉及两类：QHS系列和LHS系列。其中，QHS系列包括醚键类QHS-a(QHS-1、 QHS-2、QHS-3、QHS-4、QHS-5、QHS-6)和酯键类QHS-b(QHS-13、QHS-15)，LHS系列包括LHS-a (FHS-1、LHS-1、XHS-1)和LHS-b(FHS-2、LHS-2、XHS-2)。具体化合物见表1和表2。
表1 QHS系列化合物
Figure BDA0001030122650000091
Figure BDA0001030122650000092
表2 LHS系列化合物
Figure BDA0001030122650000101
Figure BDA0001030122650000102
QHS系列化合物的整体合成路线及步骤
以4-羟基-3-甲氧基苯甲酸为原料，经酯化、硝化、还原、关环、氯代等一系列反应，合成中间体 (7a,7b,7c,7d,7e,7f)，再连接H2S供体，最终得到8个QHS系列化合物，具体合成路线如下。
Figure BDA0001030122650000103
4-羟基-3-甲氧基苯甲酸甲酯的合成(1)
Figure BDA0001030122650000111
向500mL三颈瓶中加入4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(20.0g，0.19mol)，甲醇250mL，浓硫酸0.8mL，加热至回流，约48h后停止反应。蒸掉甲醇，向残余物加水，饱和K2CO3溶液中和，用乙酸乙酯萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，母液减压浓缩得褐色油状物，用石油醚：乙酸乙酯(8:1)进行重结晶，得到白色固体(1)(19.6g，90.5％)，Mp:62-63℃。
3-甲氧基-4-(3-氯丙氧基)苯甲酸甲酯的合成(2)
Figure BDA0001030122650000112
将4.22g(23mmol)4-羟基-3-甲氧基苯甲酸甲酯(1)，5.06g(32.4mmol)1-溴-3-氯丙烷溶于20mLDMF 中，加入10.24g(74.2mmol)碳酸钾，100℃下反应12h。反应液冷却到室温后，将反应液倒入500mL 的冰水中，剧烈搅拌30min。抽滤得到类白色固体5.85g。乙酸乙酯重结晶，得到白色目标产物4.85g，收率80.7％，Mp:103-105℃。
2-硝基-5-甲氧基-4-(3-氯丙氧基)苯甲酸甲酯的合成(3)
Figure BDA0001030122650000113
0-5℃下，将9.3g(12.8mmol)3-甲氧基-4-(3-氯丙氧基)苯甲酸甲酯(2)溶于30mL乙酸和3mL 乙酸酐中，逐滴滴加浓硝酸(8.45mL，66％)，然后室温搅拌6h。将反应液倒入500mL冰水中，用乙酸乙酯萃取。合并有机层，依次用饱和碳酸氢钠水溶液，食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。蒸干溶剂，得到黄色油状物(13.0g)。乙酸乙酯/石油醚重结晶得到亮黄色固体8.13g，收率75％，Mp:57-59℃。 2-氨基-5-甲氧基-4-(3-氯丙氧基)苯甲酸甲酯的合成(4)
Figure BDA0001030122650000114
将5.0g(89.3mmol)还原铁粉加入到40mL乙酸中，50℃，氮气保护下搅拌15min后，缓慢加入 9.0g(25mmol)2-硝基-5-甲氧基-4-(3-氯丙氧基)苯甲酸甲酯(3)的甲醇溶液(30mL)，反应液在 50-60℃下反应30min。趁热滤除反应液中的铁泥，滤液减压蒸除溶剂至无溜出物，残余物倒入冰水中，乙酸乙酯萃取。有机层依次用饱和碳酸钾以及食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂得到棕色固体，乙酸乙酯/石油醚重结晶得到亮棕色固体6.34g，收率77％，Mp:67-69℃。
6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉-4(3H)-酮的合成(5)
Figure BDA0001030122650000121
将1.7g(6mmol)2-氨基-5-甲氧基-4-(3-氯丙氧基)苯甲酸甲酯(4)溶于20mL无水乙醇，加入 0.97g(9mmol)醋酸甲脒，回流24h。冷却，冰箱中静置后过滤，冷乙醇洗涤，得白色粉末状固体1.52g，收率94.4％，Mp:113-115℃。
4-氯-6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉的合成(6)
Figure BDA0001030122650000122
将1.0g(3.15mmol)6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉-4(3H)-酮(5)分批加入到8mL氯化亚砜中，然后慢慢滴加0.62mLDMF。回流反应4h。减压蒸去多余的氯化亚砜，得到黄色固体溶于氯仿中，依次用饱和碳酸钠溶液和水洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除有机溶剂，得类白色固体，乙酸乙酯重结晶，得白色固体0.91g，收率86％，Mp:146-148℃。
4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉的合成(7a)
Figure BDA0001030122650000123
2.0g(7mmol)4-氯-6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉(6)及2.1g(13.7mmol)3-氯-4-氟苯胺加入到10mL异丙醇中，回流反应3h。将反应液冷却至室温，冰箱中冷却过夜，抽滤，滤饼用冷的异丙醇洗涤。60-70℃下真空干燥，得到黄色固体2.73g，收率93％，Mp:170-173℃。
4-(4-溴苯胺基)-6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉的合成(7b)
Figure BDA0001030122650000124
2.0g(7mmol)4-氯-6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉(6)及2.36g(13.7mmol)4-溴苯胺加入到 10mL异丙醇中，回流反应3h。将反应液冷却至室温，冰箱中冷却过夜，抽滤，滤饼用冷的异丙醇洗涤。60-70℃下真空干燥，得到黄色固体1.42g，收率48％，Mp:165-167℃。
4-(4-硝基苯胺基)-6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉的合成(7c)
Figure BDA0001030122650000131
2.0g(7mmol)4-氯-6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉(6)及1.91g(13.7mmol)4-硝基苯胺加入到10mL异丙醇中，回流反应3h。将反应液冷却至室温，冰箱中冷却过夜，抽滤，滤饼用冷的异丙醇洗涤。60-70℃下真空干燥，得到黄色固体1.41g，收率53％，Mp:168-170℃。
4-(3-溴苯胺基)-6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉的合成(7d)
Figure BDA0001030122650000132
2.0g(7mmol)4-氯-6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉(6)及2.36g(13.7mmol)3-溴苯胺加入到 10mL异丙醇中，回流反应3h。将反应液冷却至室温，冰箱中冷却过夜，抽滤，滤饼用冷的异丙醇洗涤。60-70℃下真空干燥，得到黄色固体0.92g，收率31％，Mp:157-159℃。
4-(3-三氟甲基苯胺基)-6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉的合成(7e)
Figure BDA0001030122650000133
2.0g(7mmol)4-氯-6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉(6)及2.21g(13.7mmol)3-三氟甲基苯胺加入到10mL异丙醇中，回流反应3h。将反应液冷却至室温，冰箱中冷却过夜，抽滤，滤饼用冷的异丙醇洗涤。60-70℃下真空干燥，得到黄色固体1.24g，收率43％，Mp:167-169℃。
4-(3,4-二甲氧基苯胺基)-6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉的合成(7f)
Figure BDA0001030122650000134
2.0g(7mmol)4-氯-6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉(6)及2.0g(13.7mmol)3,4-二甲氧基苯胺加入到10mL异丙醇中，回流反应3h。将反应液冷却至室温，冰箱中冷却过夜，抽滤，滤饼用冷的异丙醇洗涤。60-70℃下真空干燥，得到黄色固体1.41g，收率50％，Mp:173-175℃。
5-对羟基苯基-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮(ADT-OH)的合成
Figure BDA0001030122650000141
向单口瓶中加入5-对甲氧基苯基-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮(0.24g，1mmol)和吡啶盐酸盐
(1.20g，10mmol)充分混匀。于210℃条件下熔融反应0.5h，TLC监测反应，反应结束后冷却至室温，加入1mol/L的稀盐酸，抽滤，得棕褐色固体，真空干燥。收率81％，Mp:185-187℃。
3-烯丙基二硫基丙酸(ACS-81)的合成
Figure BDA0001030122650000142
向三口瓶中加入二烯丙基二硫(5.85g，40mmol)，3-巯基丙酸(0.85g，8mmol)，甲醇：乙醚(2:1 V/V)混合溶剂，然后加入10mol/L NaOH(0.24g，6mmol)，通入氮气30min，25℃反应24h。TLC 监测反应，反应结束后，将反应液蒸干，加入1mol/L HCl，用乙醚萃取，减压蒸除溶剂，得米白色油状物1.2g。收率84％。
合成实施例1：QHS-1的合成
Figure BDA0001030122650000143
向单口瓶中加入4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉(7a)(0.395g，1mmol)，无水DMF10mL，碳酸钾(0.276g，2mmol)，催化量碘化钾，搅拌10min，加入ADT-OH(0.226g，1mmol)， 80℃下反应，TLC监测反应，反应结束后冷却至室温，将反应液倒入冰水中，搅拌30min，抽滤，真空干燥，经硅胶柱层析分离二氯甲烷：甲醇(120:1)得橙色固体0.12g，收率20％，Mp:104-106℃。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.66(s,1H),7.91(s,1H),7.64-7.59(m,2H),7.31(d,J＝16.0Hz,5H), 7.22-7.18(m,1H),7.03(d,J＝8.0Hz,2H),4.36(d,J＝36.0Hz,4H),4.04(s,3H),2.46(s,2H).
13C NMR(101MHz,DMSO)δ215.24,174.23,172.49,162.39,156.54,154.05,152.95,152.48,149.58, 134.63,129.49,124.21,124.01,122.87,122.80,119.36,119.17,117.10,116.89,116.01,109.24,108.14, 102.40,65.59,65.27,56.78,28.70.
LC-MSm/z:585.8[M-H]-.
合成实施例2：QHS-2的合成
Figure BDA0001030122650000151
向单口瓶中加入4-(4-溴苯胺基)-6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉(7b)(0.423g，1mmol)，无水DMF10mL，碳酸钾(0.276g，2mmol)，催化量碘化钾，搅拌10min，加入ADT-OH(0.226g，1mmol)， 80℃下反应，TLC监测反应，反应结束后冷却至室温，将反应液倒入冰水中，搅拌30min，抽滤，真空干燥，经硅胶柱层析分离二氯甲烷：乙酸乙酯(2:1)，加入1mL甲醇，得橙色固体0.1g，收率16％， Mp:113-115℃。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.66(s,1H),7.63(dd,J＝8.0,12.0Hz,3H),7.53(d,J＝8.0Hz,2H),7.39(s, 1H),7.29(d,J＝12.0Hz,3H),7.07-7.01(m,3H),4.39-4.29(m,4H),4.03(s,3H),2.47-2.44(m,2H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ195.70,172.99,169.69,167.96,162.15,154.11,149.86,134.67,132.03, 128.60,124.31,123.42,121.81,116.97,116.23,115.52,100.68,65.34,64.69,56.38,29.70.
LC-MSm/z:611.8[M-H]-.
合成实施例3：QHS-3的合成
Figure BDA0001030122650000152
向单口瓶中加入4-(4-硝基苯胺基)-6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉(7c)(0.389g，1mmol)，无水DMF10mL，碳酸钾(0.276g，2mmol)，催化量碘化钾，搅拌10min，加入ADT-OH(0.226g，1mmol)， 80℃下反应，TLC监测反应，反应结束后冷却至室温，将反应液倒入冰水中，搅拌30min，抽滤，真空干燥，经硅胶柱层析分离二氯甲烷：乙酸乙酯(1:2)，加入1mL甲醇，得橙色固体0.11g，收率16％， Mp:108-109℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.05(s,1H),8.65(s,1H),8.30(d,J＝8.0Hz,2H),8.20(d,J＝12.0Hz,2H), 7.92-7.87(m,2H),7.81-7.76(m,1H),7.31(s,1H),7.13(dd,J＝4.0Hz,2H),4.34(dd,J＝4.0,20.0Hz,4H), 4.01(s,3H),2.33-2.30(m,2H).
13C NMR(101MHz,DMSO)δ215.26,174.23,162.39,162.00,156.16,154.47,152.59,149.92,142.12, 134.65,129.50,128.73,125.07,124.22,121.15,116.56,116.03,109.85,108.03,102.52,65.74,65.26,56.89, 28.71.
LC-MSm/z:579.8[M+H]+.
合成实施例4：QHS-4的合成
Figure BDA0001030122650000161
向单口瓶中加入4-(3-溴苯胺基)-6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉(7d)(0.423g，1mmol)，无水DMF10mL，碳酸钾(0.276g，2mmol)，催化量碘化钾，搅拌10min，加入ADT-OH(0.226g，1mmol)， 80℃下反应，TLC监测反应，反应结束后冷却至室温，将反应液倒入冰水中，搅拌30min，抽滤，真空干燥，经硅胶柱层析分离二氯甲烷：乙酸乙酯(2:1)，加入1mL甲醇，得橙色固体0.12g，收率20％， Mp:104-106℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.53(s,1H),8.53(s,1H),8.16(s,1H),7.90-7.75(m,5H),7.34(d,J＝8.0Hz, 1H),7.27(d,J＝16.0Hz,2H),7.12(d,J＝8.0Hz,2H),4.30(d,J＝20.0Hz,4H),3.98(s,3H),2.30(s,2H).
13C NMR(101MHz,DMSO)δ215.26,174.24,162.40,156.47,154.03,153.05,149.59,147.32,141.73, 134.64,130.83,129.50,128.73,126.10,124.49,124.22,121.65,121.06,116.03,115.84,109.44,108.34, 102.42,65.60,65.28,56.79,28.72.
LC-MSm/z:611.7[M-H]-.
合成实施例5：QHS-5的合成
Figure BDA0001030122650000162
向单口瓶中加入4-(3-三氟甲基苯胺基)-6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉的合成(7e)(0.411g， 1mmol)，无水DMF10mL，碳酸钾(0.276g，2mmol)，催化量碘化钾，搅拌10min，加入ADT-OH(0.226g， 1mmol)，80℃下反应，TLC监测反应，反应结束后冷却至室温，将反应液倒入冰水中，搅拌30min，抽滤，真空干燥，经硅胶柱层析分离二氯甲烷：乙酸乙酯(2:1)，加入1mL甲醇，得橙色固体0.12g，收率20％，Mp:109-111℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.67(s,1H),8.54(s,1H),8.23(d,J＝8.0Hz,2H),7.87(d,J＝8.0Hz,3H), 7.75(s,1H),7.63(t,J＝8.0Hz,1H),7.44(d,J＝8.0Hz,1H),7.26(s,1H),7.13(d,J＝12.0Hz,2H), 4.35-4.28(m,4H),4.00(d,J＝5.0Hz,3H),2.32-2.29(m,2H).
13C NMR(101MHz,DMSO)δ215.24,174.22,170.79,162.40,156.51,154.07,153.01,149.62,147.42, 140.93,134.63,130.03,129.48,126.10,125.85,124.21,123.39,119.75,118.27,116.01,109.45,108.37, 102.40,65.58,65.28,56.79,28.72.
LC-MSm/z:602.8[M+H]+.
合成实施例6：QHS-6的合成
Figure BDA0001030122650000171
向单口瓶中加入4-(3,4-二甲氧基苯胺基)-6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉的合成(7f)(0.404g，1mmol)，无水DMF10mL，碳酸钾(0.276g，2mmol)，催化量碘化钾，搅拌10min，加入ADT-OH(0.226g， 1mmol)，80℃下反应，TLC监测反应，反应结束后冷却至室温，将反应液倒入冰水中，搅拌30min，抽滤，真空干燥，经硅胶柱层析分离二氯甲烷：乙酸乙酯(2:1)，加入1mL甲醇，得橙色固体0.1g，收率17％，Mp:116-118℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.39(s,1H),8.42(s,1H),7.90-7.83(m,3H),7.75(s,1H),7.38(s,1H),7.32 (d,J＝8.0Hz,1H),7.21(s,1H),7.13(d,J＝8.0Hz,2H),6.99(d,J＝12.0Hz,1H),4.32-4.29(m,4H),3.97 (s,3H),3.79(d,J＝8.0Hz,6H),2.32-2.29(m,2H).
13C NMR(101MHz,DMSO)δ215.25,174.24,162.40,157.10,153.73,149.31,148.91,145.88,134.64, 133.02,129.50,128.72,116.54,116.02,115.83,115.62,112.26,109.24,108.57,108.14,102.66,65.49,65.29, 56.78,56.23,56.07,28.75.
LC-MSm/z:594.9[M+H]+.
合成实施例7：QHS-13的合成
Figure BDA0001030122650000172
向单口瓶中加入4-(4-溴苯胺基)-6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉(7b)(0.423g，1mmol)，无水DMF10mL，碳酸钾(0.276g，2mmol)，催化量碘化钾，搅拌10min，加入ACS81(0.356g，2mmol)， 70℃下反应，TLC监测反应，反应结束后冷却至室温，将反应液倒入冰水中，搅拌30min，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，真空干燥，经硅胶柱层析分离石油醚：乙酸乙酯(1:2)，得米白色固体0.09g，收率16％，Mp:105-106℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.53(s,1H),8.49(s,1H),7.84(d,J＝12.0Hz,3H),7.57(d,J＝12.0Hz,2H), 7.22(d,J＝8.0Hz,1H),5.84-5.69(m,1H),5.21-5.15(m,1H),5.11-5.05(m,1H),4.33-4.24(m,4H),3.98(s, 3H),3.16(d,J＝8.0Hz,2H),2.67-2.61(m,2H),2.51(s,2H),2.20-2.14(m,2H).
13C NMR(101MHz,DMSO)δ171.98,168.85,156.54,153.93,153.16,147.44,139.45,134.98,131.67, 128.77,124.43,117.57,115.32,109.43,102.46,65.69,61.67,56.77,34.49,34.07,28.31.
LC-MSm/z:563.8[M-H]-.
合成实施例8：QHS-15的合成
Figure BDA0001030122650000181
向单口瓶中加入4-(3-溴苯胺基)-6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉(7d)(0.423g，1mmol)，无水DMF10mL，碳酸钾(0.276g，2mmol)，催化量碘化钾，搅拌10min，加入ACS81(0.356g，2 mmol)，70℃下反应，TLC监测反应，反应结束后冷却至室温，将反应液倒入冰水中，搅拌30min，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，真空干燥，经硅胶柱层析分离石油醚：乙酸乙酯(1:2)，得米白色固体0.11g，收率20％，Mp:101-103℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.54(s,1H),8.53(s,1H),8.16(s,1H),7.90(d,J＝8.0Hz,1H),7.84(s,1H), 7.36(t,J＝8.0Hz 1H),7.29(d,J＝8.0Hz,1H),7.24-7.22(m,1H),5.79-5.69(m,1H),5.14-5.05(m,2H), 4.33-4.23(m,4H),3.98(s,3H),3.16(d,J＝4.0Hz,2H),2.63(t,J＝4.0Hz,2H),2.52-2.51(m,2H), 2.17-2.11(m,2H).
13C NMR(101MHz,DMSO)δ171.98,165.97,156.44,153.99,153.11,149.55,147.51,134.97,130.82, 128.77,126.04,124.44,121.65,121.01,117.56,109.43,102.37,65.71,61.50,56.77,34.48,34.07,28.14.
LC-MSm/z:565.1[M+H]+.
LHS系列化合物的整体合成路及步骤
以2-氨基-5-硝基苯甲酸为原料，经关环、氯代、硝化、还原反应，合成中间体(4a,4b,4c)，再连接H2S供体，得到6个LHS系列化合物，具体合成路线如下。
Figure BDA0001030122650000191
6-硝基-4(3H)-喹唑酮的合成(1)
Figure BDA0001030122650000192
于100mL三口瓶中加入2-氨基-5-硝基苯甲酸(3.64g，20mmol)，醋酸甲脒(4.16g，40mmol)， 50mL乙二醇单甲醚，回流反应。TLC监测，反应完后，反应液倒入烧杯中，置-20℃冰柜中过夜，抽滤得黄色固体3.0g，收率78.5％，Mp:280-283℃。
4-(3-三氟甲基苯胺基)-6-硝基喹唑啉的合成(3a)
Figure BDA0001030122650000193
于250ml三口瓶中加入6-硝基-4(3H)-喹唑酮(1)(3.8g，20mmol)，加入SOCl240ml，缓慢滴加DMF 4mL，升温至80℃，回流反应1h后，补加20ml SOCl2和2ml DMF的混合液，继续回流反应。 TLC监测，反应完后，将反应液转移至250mL茄形瓶中，减压旋蒸除去SOCl2，加入石油醚，洗涤固体，将得到的固体加入已称有3-三氟甲基苯胺(6.64g，40mmol)和60mL异丙醇的250mL单口茄形瓶中，升温回流反应。TLC监测，反应完后，抽滤，用异丙醇洗涤滤饼，得黄色固体，收率60％。
4-(3-溴苯胺基)-6-硝基喹唑啉的合成(3b)
Figure BDA0001030122650000201
于250mL三口瓶中加入6-硝基-4(3H)-喹唑酮(1)(3.8g，20mmol)，加入氯化亚砜(SOCl2) 40mL，缓慢滴加N,N-二甲基甲酰胺(DMF)4mL，升温至80℃，回流反应1h后，补加20mL SOCl2和2mL DMF的混合液，继续回流反应。TLC监测，反应完后，将反应液转移至250mL茄形瓶中，减压蒸除SOCl2，加入石油醚，洗涤固体，将得到的固体加入已称有3-溴苯胺(6.88g，40mmol)和60ml 异丙醇的250ml单口茄形瓶中，升温回流反应，TLC监测，反应完后，抽滤，用异丙醇洗涤滤饼，得黄色固体，收率90％。
4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-硝基喹唑啉的合成(3c)
Figure BDA0001030122650000202
于250mL三口瓶中加入6-硝基-4(3H)-喹唑酮(1)(3.8g，20mmol)，加入氯化亚砜(SOCl2) 40mL，缓慢滴加N,N-二甲基甲酰胺(DMF)4mL，升温至80℃，回流反应1h后，补加20mL SOCl2和2mL DMF的混合液，继续回流反应。TLC监测，反应完后，将反应液转移至250mL茄形瓶中，减压旋蒸除去SOCl2，加入石油醚，洗涤固体，将得到的固体加入已称有3-氯-4-氟苯胺(5.87g，40mmol) 和60mL异丙醇的250mL单口茄形瓶中，升温回流反应，TLC监测，反应完后，抽滤，用异丙醇洗涤滤饼，得黄色固体，收率50％。
4-(3-三氟甲基苯胺基)-6-氨基喹唑啉的合成(4a)
Figure BDA0001030122650000203
于500mL三口瓶中加入4-(3-三氟甲基苯胺基)-6-硝基喹唑啉(3a)(4.3g)，乙醇150mL，乙酸50mL，机械搅拌，升温，将用盐酸活化好的铁粉(4.5g)分批加入瓶中，回流反应。TLC监测，反应完后，趁热过滤，滤液减压旋干，加入蒸馏水，搅拌后倒入500mL烧杯中，抽滤得淡绿色固体，收率60％。
4-(3-溴苯胺基)-6-氨基喹唑啉的合成(4b)
Figure BDA0001030122650000211
于500mL三口瓶中加入4-(3-溴苯胺基)-6-硝基喹唑啉(3b)(5.0g)，乙醇150mL，乙酸50mL，机械搅拌，升温，将用盐酸活化好的铁粉(5.0g)分批加入瓶中，回流反应。TLC监测，反应完后，趁热过滤，滤液减压旋干，加入蒸馏水，搅拌后倒入500mL烧杯中，抽滤得淡绿色固体，收率40％。 4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-氨基喹唑啉的合成(4c)
Figure BDA0001030122650000212
于500mL三口瓶中加入4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-硝基喹唑啉(3c)(3.8g)，乙醇150mL，乙酸 50mL，机械搅拌，升温，将用盐酸活化好的铁粉(4.5g)分批加入瓶中，回流反应。TLC监测，反应完后，趁热过滤，滤液减压旋蒸至干，加入蒸馏水，搅拌后倒入500mL烧杯中，抽滤得淡绿色固体，收率40％。
5-对羧乙氧基苯基-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮(ACS-60)的合成
Figure BDA0001030122650000213
向三口瓶中加入ADT-OH(0.45g，2mmol)、碳酸钾(0.55g，4mmol)和溴乙酸乙酯(0.66mL， 6mmol)，加入无水DMF30mL充分搅拌溶解，50℃反应3h，TLC监测，反应结束后冷却至室温，乙酸乙酯萃取，蒸馏水洗涤3次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得棕褐色油状物。将上步所得的油状物(0.31g，1mmol)直接用于下步反应，加入50％的硫酸(2.2mL，20mmol)，乙酸20mL， 100℃反应2h，TLC监测反应，反应结束后冷却至室温，加入蒸馏水，抽滤得深绿色固体，收率49％。
合成实施例9：FHS-1的合成
Figure BDA0001030122650000221
向单口瓶中加入ACS-60(0.312g，1.1mmol)，DMF10mL，搅拌使溶解，加入HATU(0.418g， 1.1mmol)，三乙胺(0.122g，1.2mmol)室温搅拌活化20min，缓慢加入4-(3-三氟甲基苯胺基)-6-氨基喹唑啉(0.30g，1.1mmol)(4a)，25℃反应24h，TLC监测反应，反应结束后，将反应液倒入100mL 冰水中，搅拌后抽滤得灰色固体，经硅胶柱层析分离得最终淡橙色固体产物0.095g，收率15％，Mp: 108-109℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.52(s,1H),10.05(s,1H),8.79(s,1H),8.60(s,1H),8.27(s,1H),8.20(d,J ＝8.0Hz,1H),7.96-7.91(m,3H),7.83(d,J＝8.0Hz,1H),7.76(d,J＝4.0Hz,1H),7.60(t,J＝8.0Hz,1H), 7.43(s,1H),7.20(d,J＝8.0Hz,2H),4.95(s,2H).
13C NMR(101MHz,DMSO)δ215.38,176.88,166.77,161.68,157.86,153.67,147.43,140.73,136.50, 134.86,129.92,129.87,129.55,129.45,129.02,128.71,128.10,128.07,126.16,124.84,124.55,118.66, 116.28,115.86,67.54.
LC-MSm/z:571.1[M+H]+.
合成实施例10：FHS-2的合成
Figure BDA0001030122650000222
向单口瓶中加入ACS81(0.267g，1.5mmol)，DMF10mL，搅拌使溶解，加入HATU(0.57g，1.5mmol)，三乙胺(0.167g，1.6mmol)室温搅拌活化20min，缓慢加入4-(3-三氟甲基苯胺基)-6-氨基喹唑啉(0.252g， 0.8mmol)(4a)，25℃反应24h，TLC监测反应，反应结束后，将反应液倒入100mL冰水中，搅拌后，用乙酸乙酯萃取，食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，真空干燥，经硅胶柱层析分离得最终米色固体产物0.06g，收率16％，Mp:107-108℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.37(s,1H),10.02(s,1H),8.76(s,1H),8.57 (s,1H),8.27-8.20(m,2H),7.82(dd,J＝8.0Hz,2H),7.60(d,J＝8.0Hz,1H),7.41(s,1H),5.90-5.80(m, 1H),5.19(dd,J＝16.0Hz,2H),3.43(d,J＝8.0Hz,2H),3.05(m,2H),2.51-2.50(m,2H).
13C NMR(101MHz,DMSO)δ169.88,157.82,149.53,147.12,140.82,137.33,134.03,129.91,128.96, 128.04,126.13,126.06,119.15,118.42,117.29,115.95,100.00,41.52,36.41,33.93.
LC-MSm/z:465.1[M+H]+.
合成实施例11：XHS-1的合成
Figure BDA0001030122650000231
向单口瓶中加入ACS-60(0.43g，1.5mmol)，DMF10mL，搅拌使溶解，加入HATU(0.57g， 1.5mmol)，三乙胺(0.182g，1.6mmol)室温搅拌活化20min，缓慢加入4-(3-溴苯胺基)-6-氨基喹唑啉(0.472g，1.5mmol)(4b)，25℃反应24h，TLC监测反应，反应结束后，将反应液倒入100mL 冰水中，搅拌后抽滤得灰色固体，经硅胶柱层析分离得最终淡橙色固体产物0.085g，收率10％，Mp: 112-113℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.55(s,1H),9.90(s,1H),8.77(s,1H),8.57(s,1H),8.17(s,1H),7.97(d,J ＝12.0Hz,1H),7.87(d,J＝8.0Hz,2H),7.79(d,J＝8.0Hz,2H),7.72(s,1H),7.30(d,J＝8.0Hz,1H),7.25 (s,1H),7.19(d,J＝8.0Hz,2H),4.93(s,2H).
13C NMR(101MHz,DMSO)δ215.34,173.94,166.71,161.66,157.80,153.69,147.40,141.55,136.42, 134.83,130.63,129.39,128.68,126.34,125.56,124.84,121.59,121.33,116.26,116.07,115.88,67.54.
LC-MSm/z:583.0[M+H]+.
合成实施例12：XHS-2的合成
Figure BDA0001030122650000232
向单口瓶中加入ACS81(0.267g，1.5mmol)，DMF10mL，搅拌使溶解，加入HATU(0.57g， 1.5mmol)，三乙胺(0.167g，1.6mmol)室温搅拌活化20min，缓慢加入4-(3-溴苯胺基)-6-氨基喹唑啉(0.252g，0.8mmol)(4b)，25℃反应24h，TLC监测反应，反应结束后，将反应液倒入100mL 冰水中，搅拌后，用乙酸乙酯萃取，食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，真空干燥，经硅胶柱层析分离得最终米色固体产物0.06g，收率16％，Mp:108-109℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.35(s,1H),9.88(s,1H),8.71(s,1H),8.57(d,J＝4.0Hz,H),8.17(t,J＝ 4.0Hz,1H),7.87(d,J＝8.0Hz,2H),7.78(dd,J＝4.0Hz,1H),7.32-7.25(m,2H),5.90-5.80(m,1H),5.18 (dd,J＝16.0Hz,2H),3.43(d,J＝8.0Hz,2H),3.04(t,J＝8.0Hz,2H),2.51-2.50(m,2H).
13C NMR(101MHz,DMSO)δ169.91,157.78,153.47,147.06,141.61,137.26,134.02,130.73,128.90, 126.37,124.82,121.59,121.37,119.17,115.92,100.00,41.50,36.39,33.93.
LC-MSm/z:476.0[M+H]+.
合成实施例13：LHS-1的合成
Figure BDA0001030122650000241
向单口瓶中加入ACS-60(0.313g，1.1mmol)，DMF10mL，搅拌使溶解，加入HATU(0.418g， 1.1mmol)，三乙胺(0.122g，1.2mmol)室温搅拌活化20min，缓慢加入4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6- 氨基喹唑啉(0.317g，1.1mmol)(4c)，25℃反应24h，TLC监测反应，反应结束后，将反应液倒入 100mL冰水中，搅拌后抽滤得灰色固体，经硅胶柱层析分离得最终淡橙色固体产物0.095g，收率15％， Mp:115-116℃。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.83(s,1H),8.76(s,1H),8.53(s,1H),7.98(d,J＝12.0Hz,2H),7.75-7.70 (m,3H),7.63(d,J＝8.0Hz,1H),7.57(d,J＝8.0Hz,1H),7.43(s,1H),7.22(d,J＝8.0Hz,1H),7.19-7.16 (m,2H),4.79(s,2H).
13C NMR(101MHz,DMSO)δ215.28,172.40,166.73,161.61,136.80,134.79,129.29,128.60,128.19, 124.85,124.74,119.53,119.35,116.88,116.66,116.22,116.02,113.08,100.00,67.49.
LC-MSm/z:556.0[M+H]+.
合成实施例14：LHS-2的合成
Figure BDA0001030122650000242
向单口瓶中加入ACS81(0.196g，1.1mmol)，DMF10mL，搅拌使溶解，加入HATU(0.418g， 1.1mmol)，三乙胺(0.122g，1.2mmol)室温搅拌活化20min，缓慢加入4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6- 氨基喹唑啉(0.317g，1.1mmol)(4c)，25℃反应24h，TLC监测反应，反应结束后，将反应液倒入 100mL冰水中，搅拌后，用乙酸乙酯萃取，食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，真空干燥，得米黄色固体，经硅胶柱层析分离得最终米色固体产物0.084g，收率17％，Mp:120-121℃。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.35(s,1H),9.90(s,1H),8.71(s,1H),8.54(s,1H),8.13(dd,J＝4.0Hz, 1H),7.86-7.75(m,3H),7.38(s,1H),5.90-5.80(m,1H),5.18(dd,J＝16.0Hz,2H),3.43(d,J＝8.0Hz,2H), 3.04(t,J＝8.0Hz,2H),2.51-2.50(m,2H).
13C NMR(101MHz,DMSO)δ169.86,157.79,153.43,152.59,147.03,137.27,137.13,134.02,128.91, 124.26,123.12,119.32,119.14,116.95,115.82,112.01,41.53,36.40,33.95.
LC-MSm/z:450.1[M+H]+.
生物活性研究
化合物的体外活性初步筛选
贴壁细胞的增殖抑制实验-SRB法：为了考察合成的化合物可能具有的生物活性，将处于对数生长期的细胞以一定数量接于96孔板(200μL/孔)，培养24h使之贴壁后加药。每个药物浓度设 2个复孔，并设相应的调零孔及空白对照。药物作用72h后，贴壁细胞加入50％TCA(50μL/ 孔)，4℃固定1h，倒掉固定液，用蒸馏水洗5次，自然干燥。每孔加入100μL4mg/mL SRB，室温染色15min，弃之，用1％冰醋酸洗5次，自然干燥。最后每孔加入150μL10mM Tris溶液，摇匀，用可调波长式微孔板酶标仪(VERSAmaxTM，Molecular Device)在565nm波长下测定OD值。用公式计算细胞生长抑制率。
抑制率(％)＝(OD值对照孔－OD值给药孔)/OD值对照孔×100％
根据各浓度抑制率，采用LOGIT法计算半数抑制浓度IC50。实验重复3次以上，数据表示为mean±SD。
化合物初筛结果
将处于对数生长期的细胞以一定数量接于96孔板(200μL/孔)，培养24h使之贴壁后加药。药物作用72h后，测定OD值并计算平均值，计算细胞增殖抑制率(表3)。
表3各化合物生长抑制率
Figure BDA0001030122650000251
Figure BDA0001030122650000261
a.检测目标化合物终浓度为20μM。阳性对照药MHS-1、MHS-3浓度分别为45μM、55μM。
b.化合物浓度10μM。c.化合物浓度50μM。
表4各化合物对HepG2细胞系的IC50值
Figure BDA0001030122650000262
(mean±SD，n＝3)
目标化合物释放H2S水平的测定
采用H2S检测的荧光探针技术对目标化合物释放的H2S进行测定。
探针溶液的配制：NIR-HS溶解于丙酮中配制1mM的储备液，将其稀释成200μM的溶液备用，探针溶液需要低温避光保存。
Na2S储备液的配制：5mg EDTA溶于10mL双蒸水中，向溶液中通氮气15min。在氮气保护下，将48mg Na2S·9H2O溶于溶液中，得到20mM Na2S储备液，将其稀释为100μM的溶液备用，需要现配现用。
PBS的配制：磷酸二氢钾(KH2PO4)0.24g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.44g，氯化钠(NaCl)8.0g，氯化钾(KCl)0.2g，加水至1000mL。pH＝7.4，需要低温储存。
QHS-6化合物的配制：将QHS-6溶解于丙酮中配制2.5mM的储备液，将其稀释为1.25mM、 625μM、100μM、50μM的溶液备用，需要低温储存。
QHS-13供体化合物的配制：将QHS-13溶解于丙酮中配制5mM的储备液，将其稀释为1mM、 500μM、100μM、50μM的溶液备用，需要低温储存。
LHS-1供体化合物的配制：将LHS-1溶解于丙酮中配制2.5mM的储备液，将其稀释为1.25mM、 625μM、100μM、50μM的溶液备用，需要低温储存。
3.1.2.3定性测定目标化合物释放的H2S
将H2S荧光探针NIR-HS(终浓度为10μM)与目标化合物(0μM、5μM、10μM、50μM、100μM和200μM)在PBS缓冲液(PBS:丙酮＝2:3)中孵育3h(37℃)。之后，用F4600荧光分光光度计测定荧光发射光谱(λex＝670nm，λem＝723nm)，每个浓度至少有三个平行样品，至少测定3次。
定量测定目标化合物释放的H2S
(1)标准曲线的建立：
将H2S荧光探针NIR-HS(终浓度为10μM)与Na2S(0μM、2μM、4μM、6μM、8μM)在PBS 缓冲液(PBS:丙酮＝2:3)中孵育3h(37℃)。之后，用F4600荧光分光光度计测定荧光发射光谱(λex＝670nm，λem＝723nm)，并根据荧光强度，做出标准曲线。每个浓度至少有三个平行样品，至少测定3次。
(2)H2S释放的定量测定：
将H2S荧光探针NIR-HS(终浓度为10μM)与目标化合物(20μM)在PBS缓冲液(PBS:丙酮＝2:3) 中分别孵育0min、5min、30min、60min、90min、120min、150min、180min(37℃)。之后，测定荧光发射光谱(λex＝670nm，λem＝723nm)，
根据Na2S标准曲线，换算出每个供体化合物释放H2S的量。每个时间点至少有三个平行样品，至少测定3次。
H2S水平的测定结果
1.目标化合物释放H2S的定性测定
在QHS-a系列、QHS-b系列、LHS-a系列化合物中分别选取活性相对较好的化合物(QHS-6、QHS-13 和LHS-1)，测定其H2S的释放。
实验结果表明：化合物QHS-6(10,50,100,200μM)与荧光探针NIR-HS(10μM)孵育后，产生显著的荧光响应，荧光强度(10μM,33.77±1.55；50μM,50.15±2.10；100μM,66.08±3.59；200μM,97.27 ±3.27)与未加入供体(0μM,29.65±1.42)相比显著增加(**P<0.01)(图1)，并且随着化合物浓度的增加，荧光强度逐渐增强。这说明，化合物QHS-6能够在PBS缓冲液中释放H2S。结果见图1。
实验结果表明：化合物QHS-13(10,50,100,200μM)与荧光探针NIR-HS(10μM)孵育后，产生显著的荧光响应，荧光强度(10μM,48.41±5.95；50μM,66.58±6.34；100μM,84.95±5.48；200μM, 120.39±7.21)与未加入供体(0μM,36.78±1.29)相比显著增加(**P<0.01)(图2)，并且随着化合物浓度的增加，荧光强度逐渐增强。这说明，化合物QHS-13能够在PBS缓冲液中释放H2S。
实验结果表明：化合物LHS-1(10,50,100,200μM)与荧光探针NIR-HS(10μM)孵育后，产生显著的荧光响应，荧光强度(10μM,41.10±2.65；50μM,83.35±2.83；100μM,116.11±12.59； 200μM,204.02±14.38)与未加入供体(0μM,29.04±1.08)相比显著增加(*P<0.05,**P<0.01)(图3)，并且随着化合物浓度的增加，荧光强度逐渐增强。这说明，化合物LHS-1能够在PBS缓冲液中释放 H2S。
2.目标化合物释放H2S的定量测定
探针NIR-HS的荧光强度与Na2S浓度(0,2,4,6,8μM)的标准曲线如图4所示，呈现良好的线性关系(0μM,1.0±0.0；2μM,2.05±0.045；4μM,3.45±0.24；6μM,4.78±0.39；8μM,5.78±0.23)。
将化合物(QHS-6、QHS-13、LHS-1，20μM)与荧光探针NIR-HS孵育，每隔30min检测荧光强度，然后，根据标准曲线，将荧光强度值换算为H2S的浓度，即得到H2S浓度-时间曲线。
实验结果表明：化合物QHS-6、QHS-13、LHS-1都能够释放H2S。化合物QHS-13的H2S释放量明显多于化合物QHS-6和LHS-1。1h内，化合物QHS-13的H2S释放速度较快，2h后H2S的释放趋于平稳；2h内，化合物LHS-1的H2S释放速度较缓慢，2h后释放H2S速度加快；化合物QHS-6在 0-3h，释放H2S速度较缓慢(表5,图5)。
表5各供试化合物的释放的H2S浓度变化
Figure BDA0001030122650000281
(mean±SD，n＝3)。

Claims (3)

1.化合物或其药学上可接受的盐，
Figure FDA0003081516560000011
2.一种药物组合物，其特征在于该组合物以权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的辅料。
3.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肝癌药物方面的应用。
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