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CN106075584B - 可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶及其制备方法 - Google Patents

可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶及其制备方法。本发明将同种或异种软骨经过脱细胞处理制备软骨细胞外基质，同时将同种或异种骨组织经过脱脂、脱钙、脱细胞处理制备脱钙骨基质，二者按照一定比例混合后再经过胃蛋白酶消化，在中性pH、37℃和适宜盐浓度条件下固化成可注射性水凝胶。使用本发明所述方法制备的软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶具有良好的生物可降解性，最重要的是具有可注射性；同时，由于进行脱细胞处理，免疫原性大大降低，具有较好的生物相容性，生物排斥反应降低；本发明取材简单，操作方便，可用于各种软骨缺损填充及微创骨科软骨修复治疗，具有良好的临床应用前景。

Description

可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶及其制备 方法
技术领域
本发明涉及生物组织工程技术，具体是一种可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶及其制备方法。
背景技术
临床上由退变、创伤、各种炎症、肿瘤等因素导致关节软骨损伤、缺损一直是骨科临床面临的问题，关节软骨绝大多数属透明软骨,无血供、淋巴组织及神经支配，自我修复能力有限,自我再生能力差。关节软骨损伤治疗成为目前骨关节外科难题之一。
每年临床上有数百万患者因关节软骨损伤而接受治疗。目前自身软骨移植和异体软骨移植均具有一定的局限性，自身软骨移植产生新的软骨缺损，异体软骨移植存在免疫原性反应。自二十世纪80年代以来, 软骨细胞治疗关节软骨损伤引起了人们兴趣,即在软骨缺损处移植软骨细胞来实现软骨缺损的修复。但是单纯移植软骨细胞,细胞无法种植和增殖,导致效果不佳。所以长期以来，骨软骨损伤的再生和修复一直是困扰骨科临床的难题之一，也是临床和基础研究的热点之一。近年来，随着高分子医学材料、生物化学、材料学、分子生物学、基础医学、临床医学多学科的迅猛发展，软骨组织工程也得到了迅速的发展，为解决这个难题提供了新的途径。
基于上述原因，人们在寻找一种理想的软骨修复材料——抗原性低且具有软骨诱导和软骨特性。目前国内和国外公认的修复软骨技术是第二代 ACI 技术（自体软骨细胞移植）：MACI 技术（自体软骨复合细胞外基质移植），目前已经用于临床，具体方法就是可体内降解的支架材料复合软骨细胞然后植入到软骨缺损部位。
二十世纪末期开始脱细胞组织胞外基质的研究，细胞被认为是免疫原性的根源，脱去组织的细胞就去除组织的大部分免疫抗原成分。组织经过脱细胞步骤可以去除细胞膜、细胞质成分及细胞内可溶性蛋白质等可以诱发免疫排斥的物质，剩余的胞外基质组成具有一定的生物活性。目前很多组织的脱细胞基质作为组织工程中的支架材料，例如心肌细胞外基质已经注射治疗心肌梗塞应用于临床。
外科临床手术操作呈现微创化趋势。骨科手术亦如此，尤其是微创关节外科发展迅速，避免常规切开手术，软骨损伤微创修复术对于可注射性植骨材料需求越来越多。
水凝胶是具有亲水性的三维网状结构的聚合物，在水中无法溶解，具有流动性和良好的生物相容性，具有可注射性，原位凝胶化，操作简单。
骨软骨组织由软骨细胞和细胞外基质组成，细胞外基质由Ⅱ型胶原和氨基葡糖多聚糖(GAG)组成。关节软骨大约 70%水分，20%Ⅱ型胶原，5%蛋白多糖和 5%软骨细胞。软骨细胞位于软骨基质内的小腔——软骨陷窝中。软骨囊位于陷窝周围，富含硫酸软骨素。软骨细胞由间充质干细胞分化，位于细胞外基质中。关节软骨细胞外基质主要成分是蛋白多糖，对细胞及其形态具有支持和调节作用，调节细胞代谢、分化增殖等分子水平的信号传导。关节软骨中胶原以Ⅱ型胶原蛋白为主,占软骨胶原总量的90%～95%。
骨组织是坚硬的结缔组织，由细胞和基质组成。基质分为有机质和无机质，有机质含有大量的胶原纤维，无机质是大量的无机钙盐，胶原包埋在钙盐基质中。
胶原是人体和脊椎动物的主要结构蛋白,是支持组织和结缔组织(皮肤、肌键和骨骼的有机部分)的主要成分,胶原分子结构为三条多肽链，呈三维螺旋结构，具有免疫惰性，适合作为软骨组织工程支架，可促进不同类型细胞粘结、生长、分化及移动。胶原是一种天然的水凝胶，可满足临床对注射性植骨材料的需要。
发明内容
本发明就是为了提供一种新的满足临床需要的注射性植骨材料，所提出的一种可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质（DBM）水凝胶及其制备方法。
本发明是按照以下技术方案实现的。
一种可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶，所述水凝胶是由同种或异种软骨经过脱细胞处理，同种或异种骨组织经过脱脂、脱钙、脱细胞处理，二者按照一定比例混合后所形成的在弱酸下溶解，在生理温度、中性PH值和适宜盐浓度（0.O1～0.1mol/L）的条件下固化成具有一定粘性且含有成骨活性因子的骨胶原水凝胶。
所述同种或异种软骨和骨组织分别来源于猪、或牛、或羊、或人的软骨和松质骨。
所述水凝胶含有软骨细胞外基质和松质骨细胞外基质、粘多糖、I型胶原、Ⅱ型胶原。
一种上述的可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
a制备软骨脱细胞外基质冻干海绵
①用含苯甲基磺酰氟的Tris-HCl缓冲液浸泡同种或异种软骨块，并将软骨粉碎，蒸馏水反复冲洗；
②加入含Triton X-100和苯甲基磺酰氟的Tris-HCl缓冲液震荡12～24h；
③超纯水反复冲洗、沥干；
④加入DNase I与RNase A震荡消化12～24h，超纯水反复冲洗；
⑤冷冻干燥；
b 制备含脱钙骨基质冻干海绵
①用含苯甲基磺酰氟的Tris-HCl缓冲液浸泡同种或异种骨组织，并将骨组织粉碎，蒸馏水反复冲洗；
②用氯仿和甲醇进行脱脂12～72h，蒸馏水反复冲洗；
③用HCl溶液进行脱钙12～72h，蒸馏水反复冲洗；
④加入CaCl2溶液搅拌1～3h ，蒸馏水反复冲洗；加入EDTA溶液搅拌1～3h，蒸馏水反复冲洗；加入LiCl溶液搅拌1～3h，蒸馏水反复冲洗；
⑤加入含Triton X-100和苯甲基磺酰氟的Tris-HCl缓冲液震荡12～24h；
⑥ 超纯水反复冲洗、沥干；
⑦ 加入DNase I与RNase A震荡消化12～24h，超纯水反复冲洗；
⑧冷冻干燥；
c 软骨细胞外基质混合含脱钙骨基质水凝胶的制备
①按照一定比例混合步骤a和步骤b中获得的冻干软骨细胞外基质和冻干骨基质，用HCl溶液溶解并加入胃蛋白酶，搅拌12～96h；
②溶液pH调至中性，加入10×PBS和1×PBS混匀；
③20～37℃条件下放置20～60分钟固化成水凝胶。
所述步骤a①和b①中的软骨和骨组织粉碎成0～5mm×0～5mm×0～5mm大小的颗粒。
所述步骤a①②和b①⑤中Tris-HCl缓冲液浓度为0.01～0.1mol/L，pH7.4～7.5；步骤a①②和b①⑤中苯甲基磺酰氟浓度为0.035～0.35 mmol/L；步骤a②和b⑤中TritonX-100浓度为0.1～1 mmol/L；步骤b②中氯仿和甲醇的体积比为1:1～2:1；步骤b③中HCl浓度0.01～0.5 mol/L；步骤b④中CaCl2溶液的浓度为2～3.6mol/L，EDTA溶液的浓度为0.01～0.5mol/L，LiCl溶液的浓度为2～8mol/L；步骤a④和b⑦中DNase I与RNase A浓度分别为10～50 U/ml，1～5 U/ml。
所述步骤c①中HCl浓度为0.01～0.5 mol/L；胃蛋白酶：软骨细胞外基质混合冻干骨基质=50～150mg：1g；步骤c②中调整pH值至中性的NaOH浓度0.01～1mol/L。
所述步骤c①中软骨细胞外基质和冻干骨基质的质量比小于1：1。
所述步骤c①中软骨细胞外基质和冻干骨基质的质量比例为1：2。
所述步骤a、b除消化外均在0-4℃条件下进行；步骤c②在0～4℃条件下进行。
本发明获得了如下有益效果。
在本发明中，软骨脱细胞后获得的软骨胞外基质中的II型胶原能够诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化成软骨细胞并具有软骨细胞的特点，而且II型胶原能够在37℃条件下形成水凝胶，具有可注射性、很好的生物可降解性和生物相容性。松质骨经过脱钙、脱脂、脱细胞等处理，去掉了除骨诱导形成蛋白（BMP）之外绝大多数非胶原蛋白，大大降低了骨修复材料的抗原性，并且具有良好的组织相容性和可降解性。其水凝胶状态具有天然网格三维孔隙结构，具有一定弹性，可注射性强，且含有骨诱导形成蛋白，可支持和诱导软骨细胞种植和增殖。将软骨胞外基质和松质骨胞外基质这两种天然的细胞外基质材料复合制成水凝胶，可以作为软组织工程中复合软骨细胞的支架，两种胞外基质材料优势互补，可以弥补各自单独的不足。松质骨胞外基质含有BMP-2，其对软骨细胞的分化有促进作用，氨基葡糖多聚糖(GAG)和 II 型胶原是软骨细胞分泌产生的，BMP-2可以提高其分泌水平。本发明取材简单，操作方便，成本低，可用于软骨缺损填充及微创骨科软骨修复治疗，具有良好的临床应用前景。
附图说明
图1是本发明可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶的主视图；
图2是本发明可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶的侧视图；
图3是本发明可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶冻干海绵的主视图；
图4是本发明可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶冻干海绵的俯视图；
图5是本发明可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶冻干大体显微镜镜下图；
图6是本发明可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶扫描电镜图（×500）；
图7是本发明可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶HE染色图（×100）；
图8是本发明可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶番红“O”染色图（×100）；
图9是本发明可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶甲苯胺蓝染色图（×100）；
图10是本发明可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶I型胶原免疫组化图；
图11是本发明可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶II型胶原免疫组化图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的说明。
本发明的一种可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶的制备方法如下：
a制备软骨脱细胞外基质冻干海绵（以下操作除消化外均在0～4℃条件下）
取新鲜猪透明软骨，①用pH7.4，浓度0.01mol/L 的Tris-HCl缓冲液（含0.035mmol/L苯甲基磺酰氟）浸泡透明软骨块，用粉碎机（BILON,型号DS-1）将软骨制成5mm×5mm×5mm大小颗粒状，蒸馏水反复冲洗；
②加入含1 mmol/L Triton X-100和0.035 mmol/L苯甲基磺酰氟的Tris-HCl缓冲液震荡12～24h；
③超纯水反复冲洗、沥干；
④加入50U/ml DNase I与5U/mlRNase A在37℃下震荡消化12h，超纯水反复冲洗；
⑤冷冻干燥，-20℃保存备用。
b 制备含脱钙骨基质冻干海绵（以下操作除消化外均在0～4℃条件下）
取新鲜猪松质骨，①用pH7.4，0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液（含0.035 mmol/L苯甲基磺酰氟）浸泡松质骨块，用粉碎机（BILON,型号DS-1）将松质骨制成5mm×5mm×5mm大小颗粒状，蒸馏水反复冲洗；
②用氯仿：甲醇=1:1混合液脱脂12～72h，蒸馏水反复冲洗；
③用0.01mol/L HCl溶液（25～30ml/g骨）脱钙12～72h，蒸馏水反复冲洗；
④用2mol/L CaCl2搅拌1h，蒸馏水反复冲洗；0.5mol/L EDTA搅拌1h，蒸馏水反复冲洗；8mol/L LiCl搅拌1h,蒸馏水反复冲洗；
⑤加入含1 mmol/L Triton X-100和0.035 mmol/L苯甲基磺酰氟的Tris-HCl缓冲液震荡12～24h；
⑥超纯水反复冲洗、沥干；
⑦加入50U/ml DNase I与5U/ml RNase A在37℃下震荡消化12h，超纯水反复冲洗；
⑧冷冻干燥，-20℃保存备用；
c 软骨细胞外基质混合含脱钙骨基质水凝胶的制备
①取0.5g软骨细胞外基质混合1g含脱钙骨基质冻干海绵，溶于20ml 0.01mol/LHCl溶液，加入胃蛋白酶150mg，搅拌24h；
②4℃条件下，取0.5ml混合细胞外基质，用 0.1mol/L NaOH调整PH值至中性，加入0.11ml 10×PBS及0.29ml 1×PBS混匀；
③37℃下放置20分钟，即可固化成水凝胶。
图1、2为使用本发明所述方法制备的软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶，水凝胶直径1cm，高度1cm，乳白色，表面光滑湿润。
图3、4为使用本发明所述方法制备的软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶的冻干品，外观奶白色，有弹性，类似海绵。
图5为使用本发明所述方法制备的软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶的冻干品大体显微镜下观，成孔性好，类似海绵。
图6扫描电镜图显示使用本发明所述方法制备的软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶富含空隙，且孔隙互通。
图7显示使用本发明所述方法制备的软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶苏木和伊红（HE）染色未见苏木蓝染细胞核（证实脱细胞彻底，细胞是免疫原性的主要来源，这样水凝胶的排斥反应明显降低），均可见伊红染色的细胞外基质。
图8显示使用本发明所述方法制备的软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶番红“O”染色：可见染色的蛋白多糖（GAG）。
图9显示使用本发明所述方法制备的软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶甲苯胺蓝染色显示染色胶原阳性。
图10显示使用本发明所述方法制备的软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶免疫组化Ⅰ型胶原阳性。
图11显示使用本发明所述方法制备的软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶免疫组化Ⅱ型胶原阳性。

Claims (9)

1.一种可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶的制备方法，所述水凝胶是由同种或异种软骨经过脱细胞处理，同种或异种骨组织经过脱脂、脱钙、脱细胞处理，二者按照一定比例混合后所形成的在HCl溶液下溶解，在37℃、中性PH值和适宜盐浓度的条件下固化成具有一定粘性且含有成骨活性因子的骨胶原水凝胶；其特征在于：包括以下步骤：
a制备软骨脱细胞外基质冻干海绵
①用含苯甲基磺酰氟的Tris-HCl缓冲液浸泡同种或异种软骨块，并将软骨粉碎，蒸馏水反复冲洗；
②加入含Triton X-100和苯甲基磺酰氟的Tris-HCl缓冲液震荡12～24h；
③超纯水反复冲洗、沥干；
④加入DNase I与RNase A震荡消化12～24h，超纯水反复冲洗；
⑤冷冻干燥；
b制备含脱钙骨基质冻干海绵
①用含苯甲基磺酰氟的Tris-HCl缓冲液浸泡同种或异种骨组织，并将骨组织粉碎，蒸馏水反复冲洗；
②用氯仿和甲醇进行脱脂12～72h，蒸馏水反复冲洗；
③用HCl溶液进行脱钙12～72h，蒸馏水反复冲洗；
④加入CaCl2溶液搅拌1～3h，蒸馏水反复冲洗；加入EDTA溶液搅拌1～3h，蒸馏水反复冲洗；加入LiCl溶液搅拌1～3h，蒸馏水反复冲洗；
⑤加入含Triton X-100和苯甲基磺酰氟的Tris-HCl缓冲液震荡12～24h；
⑥超纯水反复冲洗、沥干；
⑦加入DNase I与RNase A震荡消化12～24h，超纯水反复冲洗；
⑧冷冻干燥；
c软骨细胞外基质混合含脱钙骨基质水凝胶的制备
①按照一定比例混合步骤a和步骤b中获得的冻干软骨细胞外基质和冻干骨基质，用HCl溶液溶解并加入胃蛋白酶，搅拌12～96h；
②溶液pH调至中性，加入10×PBS和1×PBS混匀；
③37℃条件下放置20～60分钟固化成水凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶，其特征在于：所述同种或异种软骨和骨组织分别来源于猪、或牛、或羊、或人的软骨和松质骨。
3.根据权利要求2所述的一种可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶，其特征在于：所述水凝胶含有软骨细胞外基质和松质骨细胞外基质、粘多糖、I型胶原、Ⅱ型胶原。
4.根据权利要求1所述的一种可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤a①和b①中的软骨和骨组织粉碎成0～5mm×0～5mm×0～5mm大小的颗粒。
5.根据权利要求1所述的一种可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤a①②和b①⑤中Tris-HCl缓冲液浓度为0.01～0.1mol/L，pH7.4～7.5；步骤a①②和b①⑤中苯甲基磺酰氟浓度为0.035～0.35mmol/L；步骤a②和b⑤中Triton X-100浓度为0.1～1mmol/L；步骤b②中氯仿和甲醇的体积比为1:1～2:1；步骤b③中HCl浓度0.01～0.5mol/L；步骤b④中CaCl2溶液的浓度为2～3.6mol/L，EDTA溶液的浓度为0.01～0.5mol/L，LiCl溶液的浓度为2～8mol/L；步骤a④和b⑦中DNase I与RNase A浓度分别为10～50U/ml，1～5U/ml。
6.根据权利要求1所述的一种可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤c①中HCl浓度为0.01～0.5mol/L；胃蛋白酶：软骨细胞外基质混合冻干骨基质＝50～150mg：1g；步骤c②中调整pH值至中性的NaOH浓度0.01～1mol/L。
7.根据权利要求1所述的一种可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤c①中软骨细胞外基质和冻干骨基质的质量比小于1：1。
8.根据权利要求7所述的一种可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤c①中软骨细胞外基质和冻干骨基质的质量比例为1：2。
9.根据权利要求1所述的一种可注射性软骨脱细胞外基质混合脱钙骨基质水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤a、b除消化外均在0～4℃条件下进行；步骤c②在0～4℃条件下进行。
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