CN106062181A - 自发组织用细胞集合体的制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明发现对于在体外从大量的细胞(数万～数百万个)制作细胞集合体必要的要件，同时提供能实现肝脏或肾脏等的复杂的高级结构或与其他器官的相互作用的自发组织用细胞集合体的形成方法。在体外制作细胞集合体的方法，其包括培养总细胞数40万个以上的任意的种类的细胞及/或组织和10万～40万个的间质细胞的混合物，使大小1mm以上的细胞集合体形成。由上述方法制作的细胞集合体。三维组织结构的制作方法，其包括使由上述方法制作的细胞集合体自发组织，使附加高级结构的三维组织结构形成。培养的侧截面是U或V字的形状的凝胶状培养支持体。
Description
【技术领域】
本发明涉及自发组织用细胞集合体的制作方法，更具体而言，涉及对于诱导向作为目的的组织－器官的自发组织必要的细胞集合体的制作方法。
【背景技术】
近年，作为形成有复杂的结构的组织－器官的方法，利用细胞原本有的自发组织能力(Self-Organization)的方法受到关注(非专利文献1,2)。自发组织是指，1种或少数的种类的要素无需从外部受成为特别的“指示”的信息，发挥自身内在的特性而组织复杂的高级结构。例如，如雪的结晶形成等一样，观察到在无模式的集合体之中，产生自发的秩序而形成模式的自然现象，在纳米技术或光学结晶的制作等的工程学中也利用。
作为用于诱导自发组织的要件，由高密度环境形成由均一的细胞组成的集合体(Aggregate)变得必要。从进行培养的ES·iPS细胞制成集合体制作脑、眼杯、垂体、齿等有被报告(非专利文献3-6)。作为这样的用于制作集合体的方法，通过使用底面具有U或V状的结构的如96孔等一样用于在底面集合的基材，主要使用从少数的细胞(数千个程度)的细胞集合体形成数百μm水平的组织的方法。但是，难以达成自多数的细胞(数万～数百万个)形成大型(200μm以上～)的细胞集合体。因此，制作由各种各样的种类的细胞组成的集合体难以适应以往的方法。
从而，与小鼠等的小型动物的组织－器官比较，期望制作用于利用自发组织制作如人等一样大型的复杂的组织－器官的集合体的方法的开发。
【现有技术文献】
【非专利文献】
非专利文献1：Camazine，S.，Deneubourg，J.-L.，Franks，N.R.，Sneyd，J.，Theraulaz，G.&Bonabeau，E.Self-Organization in Biological Systems(PrincetonUniv.Press，2001)。
非专利文献2：Takeichi，M.Self-organization of animal tissues：cadherin-mediated processes.Dev.Cell 21，24-26(2011).)
非专利文献3：Eiraku，E.et al.Self-organizing optic-cup morphogenesis inthree-dimensional culture.Nature 472，51-56(2011)。
非专利文献4：Eiraku，M.et al.Self-organized formation of polarizedcortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsicsignals.Cell Stem Cell 3，519-532(2008)。
非专利文献5：Suga，H.et al.Self-formation of functional adenohypophysisin three-dimensional culture.Nature 480，57-62(2011)。
非专利文献6：Sato，T.et al.Single Lgr5stem cells build crypt-villusstructures体外without a mesenchymal niche.Nature 459，262-265(2009)。
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
发明人通过活用3种不同的细胞谱系的时空间的相互作用，确立使“基于器官的再构成的器官细胞的分化诱导”实现化的革新的的三维培养技术。即，通过使对于器官发生的初期过程必须的器官细胞和血管细胞和间质细胞的细胞间相互作用再现化诱导更立体的器官的原基(器官的种)，确立使有血管网的功能性的器官的创造成为可能的基盘技术(Nature,499(7459)，481-484、PCT/JP2012/074840：组织及器官的制作方法)。
一方面，为了对肾脏或肝脏－肺脏等的疾病的药品开发或再生医疗的实现，不仅血管结构，例如，如尿管结构或胆管结构、气管结构等一样，必须再现附加进一步的高级结构的3维的复杂的结构或细胞极性。进一步说，通过经与其他器官的相互作用达成目的器官的诱导。
从而，为了使自多能性干细胞诱导的组织或自个体分离的组织的功能最大化，有必要使多样的高级结构或与其他器官的连续性的再构建成为可能的三维组织体的形成。但是，在以往考案的方法中，仅从3种细胞或组织制作仅有血管结构的组织体，未提及用于制作更复杂的高级结构(尿管结构或胆管结构、气管结构)的方法。
在本发明中旨在发现对于在体外从多个细胞(数万～数百万个)制作细胞集合体的必要的要件，同时提供肝脏或肾脏等的复杂的高级结构或能实现与其他器官的相互作用的自发组织用细胞集合体的形成方法。
【解决课题的技术方案】
本发明人由下述1～4的操作，成功从单离的多种细胞或组织制作有复杂的高级结构的三维组织－器官，从而完成本发明。
【1.必要的细胞－组织的调制】
(A)调制对于向有复杂的结构的组织的自发组织必要的任意的种类的细胞或组织。不限种类或组合数。
(B)相对于总细胞数200万个左右的，由任意的种类的细胞或组织组成的混合液，混合10～40万个左右单离的间质细胞。
【2.支持体的制作】
(A)在细胞培养用的培养皿上形成适当的硬度的支持体，固层化。此时，作为支持体的材料，优选使用水凝胶(聚丙烯酰胺凝胶等)，但不限于此。
(B)在制作的支持体上实施化学－物理修饰。此时，向支持体的修饰的赋予是不必须的要件。作为化学因子，优选使用基质胶或层粘连蛋白，但不限于此。
(C)还有，根据作为目的的集合体的形－尺寸－量，支持体的硬度没必要均一，通过为硬度设定空间的－时间的梯度或模式化，能在之后的实验中使用。
【3.细胞集合体的制作－培养】
将1.中制作的细胞－组织的混合液在2.中制作的支持体上接种，形成集合体。形成的集合体通过延长培养期间，能在试管内作为目的的器官的自发组织中使用。
还有，通过将使细胞在底面集合的培养基材和间质细胞组合，自少数的细胞即可制作集合体。
【4.细胞集合体的移植】
通过将3.中制作的集合体长期培养或向活体内移植，诱导血液灌流，通过向有复杂的结构的高级组织的自发组织，制作有与成体组织同等的高度成秩序的组织结构的组织－器官变得可能。
通过这样将间质细胞和支持体的物理－化学特性组合，制作由任意的种类的细胞组成的复杂的细胞集合体的方法在过去不存在，被认为是新颖性的极高的方法。
本发明的要点如下。
(1)在体外制作细胞集合体的方法，其包括培养任意的种类的细胞及/或组织和间质细胞的混合物，使细胞集合体形成。
(2)(1)所述的方法，其中细胞集合体可由自发组织形成附加高级结构的三维组织结构。
(3)(1)或(2)所述的方法，其中将任意的种类的细胞及/或组织和间质细胞的混合物在间质细胞能收缩的凝胶状支持体上培养。
(4)(3)所述的方法，其中培养是二维培养。
(5)(3)或(4)所述的方法，其中凝胶状支持体是平面，或者凝胶状支持体的培养的侧截面是U或V字的形状。
(6)(3)～(5)之任一项所述的方法，其中凝胶状支持体的中心部的硬度比周边部的硬度硬。
(7)(3)～(5)之任一项所述的方法，其中凝胶状支持体的周边部的硬度比中心部的硬度硬。
(8)(3)～(5)之任一项所述的方法，其中凝胶状支持体经模式化，有1个以上中心部的硬度比周边部的硬度硬的模式。
(9)(3)～(5)之任一项所述的方法，其中凝胶状支持体经模式化，有1个以上周边部的硬度比中心部的硬度硬的模式。
(10)(1)～(9)之任一项所述的方法，其中任意的种类的细胞及/或组织是总细胞数40万个以上，间质细胞是10万～40万个。
(11)(1)～(10)之任一项所述的方法，其中细胞集合体的大小是1mm以上。
(12)(1)～(11)之任一项所述的方法，其中细胞集合体的形成是自律性的。
(13)(1)～(12)之任一项所述的方法，其中不使用支架材料，培养任意的种类的细胞及/或组织和间质细胞的混合物。
(14)(1)～(13)之任一项所述的方法，其中与间质细胞混合的细胞及/或组织来源于肝脏、胰腺、肠、肺、肾脏、心脏、脑或癌。
(15)(1)～(13)之任一项所述的方法，其中与间质细胞混合的细胞是多能性细胞。
(16)(1)～(13)之任一项所述的方法，其中与间质细胞混合的组织是自多能性细胞诱导的组织。
(17)(15)或(16)所述的方法，其中多能性细胞是自活体得到的多能性细胞、从重编程诱导得到的多能性细胞、或者它们的组合。
(18)细胞集合体，其由(1)～(17)之任一项所述的方法制作。
(19)三维组织结构的制作方法，其包括使由(1)～(17)之任一项所述的方法制作的细胞集合体自发组织，使附加高级结构的三维组织结构形成。
(20)凝胶状培养支持体，其中培养的侧截面是U或V字的形状。
(21)凝胶状培养支持体，其中中心部的硬度比周边部的硬度硬。
(22)凝胶状培养支持体，其中周边部的硬度比中心部的硬度硬。
(23)凝胶状培养支持体，其中有1个以上中心部的硬度比周边部的硬度硬的模式。
(24)凝胶状培养支持体，其中有1个以上周边部的硬度比中心部的硬度硬的模式。
(25)在体外制作细胞集合体的方法，其包括在(20)～(24)之任一项所述的凝胶状培养支持体上培养任意的种类的细胞及/或组织和间质细胞的混合物，使细胞集合体形成。
【发明效果】
由本发明通过将间质干细胞和支持体乃至用于在底面集合的基材组合，理论上使形成任何的复杂的组成的集合体变得可能。由本发明，无需使用支架材料(支架)构建组织－器官变得可能。
第一，期待更复杂的组织－器官的作为人为构成系统的活用。例如，在血管网以外，存在多种如尿管结构或胆管结构、气管结构等一样，有可制作附加进一步的高级结构的3维的的复杂的结构的可能性。再者，如肝脏等一样，为了其功能表达，不仅肝脏，胆管或胰腺管和的合流、向十二指肠的连接等其他器官的关联的再构成变得必须的器官。由本发明，通过制作再现与其他器官的相互作用的集合体，期待作为在体内存在的复杂的器官的自发组织诱导系统的活用。
第二，由于使用廉价且能比较容易地加工的支持体，旨在大量的组织创造的产业应用上的有用性高。通过组合支持体的多模式化等的方法，低成本、任意的形－尺寸－数的大量组织制作变得可能。
通过从自iPS细胞等的干细胞制成的细胞凝集体构建自发组织的立体的组织体，能评价至今难以达成的人功能细胞的创造、组织－器官移植、药物开发筛选、药剂的效果表达和支持组织(血管、神经、间质等)的关联性等的向新的解析系统等的应用。
本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本国专利申请、特愿2014-037341的说明书及/或附图中记载的内容。
【附图说明】
【图1】由间质细胞的收缩的细胞集合体的制作。(A)细胞集合体形成过程的经时变化。(绿色)iPSC-肝内胚层细胞、(薄红色)人血管内皮细胞、(无色)间质细胞。(B)自发组织的iPSC或iPS细胞来源肝芽的形成。(C)细胞集合体形成的时间发展动力学。(红色)集合体投影面积的平方根。可作为显示集合体外周部的位置的指标使用。约13h往后可以指数函数(黑色虚线)良好模拟。(蓝色)集合体的圆形度。集合体的投影面积自外周长计算。(D)细胞集合体形成的间质细胞的必要性。(E)使用各种化学物质的细胞集合体形成过程的抑制实验。(F)活化型肌球蛋白含有率的时间变化及其抑制。
【图2】细胞集合体形成中的硬度环境的最适化。(A、B)各种各样的硬度条件下中的细胞集合体形成实验。(A)是培养48小时后的肉眼观察照片。(B)显示利用共聚焦激光显微镜的细胞移动的时间变化。(C-G)细胞集合体中的MSCs的轨迹(C)、移动速度及运动取向性的时间依赖性(D、E)和基板硬度依赖性(F、G)。
【图3】使用各种各样的组织来源的细胞的自发组织用集合体形成实验。(A、B)使用胰腺β细胞的细胞集合体形成(A)和自发组织(B)(C、D)使用其他器官的细胞－组织的细胞集合体形成实验
【图4】来源于各种各样的组织的细胞集合体的体内自发组织和功能表达。(A)由移植在2-3天发生功能性的血管化。(B)与以往方法比较，血液灌流所要求的时间的比较。(C)小鼠血管和人血管的直接吻合。(D)自胎儿肾脏细胞形成的集合体形成的肾小球－肾小管。(E)自β细胞形成的集合体形成的胰岛样组织。(F)自β细胞形成的集合体的治疗效果判断模型。(G)移植由β细胞形成的集合体的糖尿病模型小鼠中的血糖值的经时变化。
【图5】各硬度条件中的细胞集合体中的MSCs的轨迹、移动速度及运动取向性的时间变化。
【图6】使用各种抑制物质的细胞集合体形成过程的经时观察。
【图7】使用成体肾组织的细胞集合体的体内自发组织。
【图8】使用胎儿肺组织的细胞集合体的体内自发组织。
【图9】使用β细胞的细胞集合体的体内血管导入过程的追踪。
【图10】使用β细胞的细胞集合体的与体内宿主血管的连接部位的观察。
【图11】自使用β细胞的细胞集合体形成的组织的组织学解析。
【图12】U底凝胶的截面图。
【图13】(A)不含血管内皮细胞的细胞集合体的形成。(B)使用人或小鼠间质细胞的细胞集合体的形成。
【图14】使用U底凝胶的细胞集合体的形成。
【图15】由在支持体上制作的肾脏原基移植的功能性的血管网的再构成。
【图16】进行移植的肾脏原基的成熟化。
【图17】移植后成熟的肾脏原基的结构学解析。
【图18】进行移植的肾脏原基的原尿生成功能的活体观察。
【图19】生物化学物质包被前后的支持体的硬度特性的测量。
【图20】有硬度的多模式的支持体的制作。
【图21】在有硬度的多模式的支持体上的细胞集合体的制作。
【图22】有复杂的多模式的支持体上的制作。
【实施方式】
以下，详细地说明本发明。
本发明提供在体外制作细胞集合体的方法，其包括培养任意的种类的细胞及/或组织和间质细胞的混合物，使细胞集合体形成。
间质细胞是主要存在于中胚层来源的结缔组织，且形成在组织中发挥功能的细胞的支持结构的结缔组织细胞，在本说明书中，“间质细胞”是也包括虽然决定了向间质细胞的分化命运，但尚未向未间质细胞分化的细胞的概念。在本发明中使用之间质细胞可为分化，也可为未分化，优选使用未分化间质细胞。某细胞是否是未分化间质细胞可通过研究标志物蛋白质、例如Stro-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD133、CD271、Nestin表达与否确认(上述标志物蛋白质之任一个或多个表达，则可判断为是未分化间质细胞。)。另外，不表达前项的任何标志物的间质细胞可判断为分化间质细胞。本领域技术人员间使用的用语之中，间质干细胞、间质祖细胞、间质细胞(R.Peters，et al.PLoS One.30；5(12)：e15689.(2010))等包括在间质细胞中。间质细胞主要使用人来源的，人以外的动物(例如，在实验动物、伴侣动物、使役动物、赛马、斗犬等中利用的动物、具体而言，也可使用小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、绵羊、鸡、鲨、鳐、银鲨、鲑、虾、蟹等)来源之间质细胞。
与间质细胞混合的任意的种类的细胞及/或组织不限种类或组合，可为任何的细胞及/或组织。另外，细胞及/或组织的来源不限，可为来源于肝脏、胰腺、肠、肺、肾脏、心脏、脑等任何器官或组织，或者另外也可为来源于癌。与间质细胞混合的细胞是构成器官或组织的功能细胞、或者也可为向功能细胞分化的未分化细胞或多能性细胞。另外，与间质细胞混合的组织可为从个体分离的组织，构成器官或组织的功能细胞、或者也可向功能细胞分化的未分化细胞或自多能性细胞诱导的组织。
作为未分化细胞，可举出例如，可为能分化为肾脏、心脏、肺、脾脏、食道、胃、甲状腺、副甲状腺、胸腺、生殖腺、脑、脊髓等的器官的细胞等，能分化为脑、脊髓、肾上腺髓质、表皮、毛发－爪·皮肤腺、感觉器、末梢神经、水晶体等之外胚层性器官的细胞、能分化为肾脏、尿管、心脏、血液、生殖腺、肾上腺皮质、肌肉、骨架、真皮、结缔组织、间皮等之中胚层性器官的细胞、能分化为肝脏、胰腺、肠道、肺、甲状腺、副甲状腺、尿路等之内胚层性器官的细胞等。某细胞是否是能分化为外胚层性器官、中胚层性器官或内胚层性器官的细胞可通过研究作为标志物的蛋白质的表达确认(标志物蛋白质之任一个或多个表达，则可判断为是能分化为内胚层性器官的细胞。)。例如，在能分化为肝脏的细胞中，HHEX、SO×2、HNF4A、AFP、ALB等成为标志物，在能分化为胰腺的细胞中，PD×1、SO×17、SO×9等成为标志物，在能分化为肠道的细胞中，CD×2、SO×9等成为标志物，在能分化为肾脏的细胞中，SI×2、SALL1、在能分化为心脏的细胞中，NK×2-5MYH6、ACTN2、MYL7、HPPA、在能分化为血液的细胞中，C-KIT、SCA1、TER119、HOXB4、在能分化为脑或脊髓的细胞中，HNK1、AP2、NESTIN等成为标志物。在本领域技术人员间使用的用语之中，成肝细胞、肝祖细胞、成胰腺细胞、肝前体细胞、胰腺祖细胞、胰腺祖细胞、胰腺前体细胞、内分泌前体细胞、肠祖细胞、肠前体细胞、中胚层、后肾间质前体细胞、多能性肾单位祖细胞、肾祖细胞、心脏中胚层、心血管祖细胞、心脏祖细胞、(JR.Spence，et al.Nature.；470(7332)：105-9.(2011)、Self，et al.EMBO J.；25(21)：5214-5228.(2006)、J.Zhang，et al.Circulation Research.；104：e30-e41(2009)、G.Lee，et al.Nature Biotechnology 25，1468-1475(2007))等也包括在本发明中的未分化细胞中。作为多能性细胞，可例示自活体得到的多能性细胞(例如，从ES细胞、重编程诱导而得到的多能性细胞(例如，iPS细胞、STAP细胞(Stimulus-triggered fate conversionof somatic cells into pluripotency.Nature，2014)、MUSE细胞(Multilineage-differentiating stress-enduring(Muse)cells are a primary source of inducedpluripotent stem cells in human fibroblasts.PNAS，2011)、iMPC细胞(inducedmultipotent progenitor cell；Mouse liver repopulation with hepatocytesgenerated from human fibroblasts.Nature，2014))、它们的组合等。未分化细胞可从人工多能性干细胞(iPS细胞)、胚胎干细胞(ES细胞)等的多能性干细胞根据公知的方法制作。例如，能分化为肝脏的细胞可根据K.Si-Taiyeb，et al.Hepatology，51(1)：297-305(2010)、T.Touboul，et al.Hepatology.51(5)：1754-65.(2010)制作，能分化为胰腺的细胞可根据D.Zhang，et al.Cell Res.；19(4)：429-38.(2009)制作，能分化为肠道的细胞可根据J.Cai，et al.J Mol Cell Biol.；2(1)：50-60(2010)、R.Spence，et al.Nature.；470(7332)：105-9.(2011)制作，能分化为心脏的细胞可根据J.Zhang，et al.CirculationResearch.；104：e30-e41(2009)制作，能分化为脑或脊髓的细胞可根据G.Lee，etal.Nature Biotechnology 25，1468-1475(2007)制作。作为构成器官或组织的功能细胞，可例示胰腺的内分泌细胞、胰腺的胰腺管上皮细胞、肝脏的肝细胞、肠道的上皮细胞、肾脏的肾小管上皮细胞、肾脏的肾小球上皮细胞、心脏的心肌细胞、血液的淋巴细胞或粒细胞、红细胞、脑的神经细胞或神经胶质细胞、脊髓的神经细胞或许旺细胞等。细胞主要使用人来源的，人以外的动物(例如，在实验动物、伴侣动物、使役动物、赛马、斗犬等中利用的动物、具体而言，也可使用小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、绵羊、鸡、鲨、鳐、银鲨、鲑、虾、蟹等)来源的细胞。
在想要为细胞集合体赋予血管系统时，向任意的种类的细胞及/或组织和间质细胞的混合物，再添加血管细胞即可。血管细胞可从血管组织分离，但不限于从血管组织分离的细胞，也可为从有iPS细胞或ES细胞等的全能性或多能性的细胞分化诱导的。作为血管细胞，优选为血管内皮细胞，在本说明书中，“血管内皮细胞”是指，构成血管内皮的细胞、或者能分化为那样的细胞的细胞(例如，血管内皮前体细胞、血管内皮干细胞等)。某细胞是否是血管内皮细胞可通过研究标志物蛋白质、例如TIE2、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、VE-cadherin、CD31表达与否确认(上述标志物蛋白质之任一个或多个表达，则可判断为是血管内皮细胞)。另外，作为血管内皮前体细胞的标志物，报告有c-kit、Sca-1等，由这些的标志物的表达，可确认血管内皮前体细胞(S Fang,et al.PLOS Biology.2012；10(10)：e1001407.)。本领域技术人员间使用的用语之中，内皮细胞、脐静脉内皮细胞、内皮祖细胞、内皮前体细胞、血管性祖细胞、成血管细胞(HJ.Joo，et al.Blood.25；118(8)：2094-104.(2011))等包括在本发明中的血管内皮细胞中。血管细胞主要使用人来源的，人以外的动物(例如，在实验动物、伴侣动物、使役动物、赛马、斗犬等中利用的动物、具体而言，也可使用小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、绵羊、鸡、鲨、鳐、银鲨、鲑、虾、蟹等)等的动物来源的血管细胞。血管细胞从脐带血、脐带血管、新生儿组织、肝脏、大动脉、脑、骨髓、脂肪组织等得到。
在本说明书中，“血管系统”是指由血管内皮细胞及其支持细胞组成的结构，血管系统不仅维持组织，在其成熟化过程中，也担负重要的作用。血管结构被认为，在移植后，将不仅有将对于组织生存必要的氧及营养素等送达到组织内部的作用，(即使在血液流入内部以前，)再现伴随血管的三维的的组织结构或细胞极性对于细胞的分化－增殖－维持重要。从而，无血管的组织不仅移植后不定着而内部坏死，伴随血管化的组织的成熟化不达成，难以发挥充分的功能。
在本说明书中，“赋予血管系统”及“血管化”是指由血管内皮细胞及支持细胞组成的血管系统与作为对象的组织直接联合，如果将赋予血管系统的生物学组织移植到活体，则观察到血管的成熟化，与宿主血管连接而开始血管灌流，向有血管网的功能性的组织－器官的诱导变得可能。
在本发明中，例如，培养总细胞数40万个以上(优选为，40万个～440万个、更优选为，200万个左右)的任意的种类的细胞及/或组织和4万个以上(优选为，5万～100万个、更优选为，10万～40万个)的间质细胞的混合物即可。由本发明的方法，细胞集合体自律性地形成，可形成各种的大小，例如，大小1mm以上(优选为，1～20mm、更优选为，1～8mm)的细胞集合体。任意的种类的细胞及/或组织和间质细胞的比只要是可形成期望的大小的细胞集合体的范围，就不特别限定，适宜的细胞的数比是任意的种类的细胞及/或组织:间质细胞＝10:0.5～3。
添加血管细胞时，向总细胞数40万个以上(优选为，40万个～440万个、更优选为，200万个左右)的任意的种类的细胞及/或组织和4万个以上(优选为，5万～100万个、更优选为，10万～40万个)的间质细胞添加4000个以上(优选为，2万～40万个、更优选为，4万～28万个)的血管细胞即可。任意的种类的细胞及/或组织和间质细胞和血管细胞的比只要是可形成期望的大小的细胞集合体的范围，就不特别限定，适宜的细胞的数比是任意的种类的细胞及/或组织:间质细胞:血管细胞＝10:1～3:0.1～7。
任意的种类的细胞及/或组织和间质细胞的混合物可通过二维培养形成细胞集合体。在培养时使用的培养基只要是形成细胞集合体的，可为任何培养基，但优选为促进目的组织的自发组织诱导的组成。例如，在由向活体内的移植诱导自发组织时，使用将血管内皮细胞用的培养基和作为目的的器官细胞的培养基以1:1混合的即可。作为血管内皮细胞用的培养基，优选使用EGM(注册商标)BulletKit(注册商标)(Lonza CC-4133)或EGM-2(注册商标)BulletKit(Lonza CC-3162)、EGM-2(注册商标)MV(Lonza CC-3156)等之任何，但不限于此。作为器官细胞用培养基的例，只要是成体的肾脏细胞，使用在RPMI1640(Wako)中加20％胎牛血清(BWT Lot.S-1560)、100μg/ml青霉素/链霉素(Gibco)、胰岛素-转铁蛋白-硒X(GIBCO)即可。只要是胎儿的肾脏细胞，优选使用D-MEM High-Glucose(Wako 043-30085)、10％胎牛血清(BWT Lot.S-1560)、100μg/ml青霉素/链霉素(Gibco)等。
任意的种类的细胞及/或组织和间质细胞的混合物在间质细胞能收缩的凝胶状支持体上培养即可。
间质细胞的收缩可通过(用显微镜、乃至肉眼)确认形态学上立体组织形成，或显示伴随由药匙等的回收而有组织的形状保持的强度等(Takebe et al.Nature 499(7459)，如481-484、2013))一样确认。
支持体是有适当的硬度(例如，杨氏模量200kPa以下(包被基质胶的形状平坦的凝胶的情况等)，但支持体的适当的硬度可随包被和形状变化)的凝胶状基材即可，作为这样的基材，可例示水凝胶(例如，丙烯酰胺凝胶、明胶、基质胶等)等，不限于它们。再者，根据作为目的的集合体的形－尺寸－量，支持体的硬度没心要均一，可为硬度设定空间－时间梯度(例如，后述的实施例6)或模式化(例如，后述的实施例7)。在支持体的硬度是均一的时，支持体的硬度优选为，100kPa以下，更优选是1～50kPa。凝胶状支持体可为平面，或者，凝胶状支持体的培养的侧截面是U或V字的形状即可。通过凝胶状支持体的培养的侧截面是U或V字的形状，细胞集合在支持体的培养面，由更少的数的细胞及/或组织形成细胞集合体，从而有利。另外，也可对支持体实施化学－物理修饰。作为修饰物质，可例示基质胶、层粘连蛋白、巢蛋白、胶原、纤连蛋白、玻连蛋白等。
为凝胶状培养支持体的硬度设定空间的的梯度的一例是中心部的硬度比周边部的硬度硬的凝胶状培养支持体(后述的实施例6、图20及21)。中心部的硬度是200kPa以下是适当的，周边部的硬度比中心部柔软即可，支持体的中心部和周边部的适当的硬度可随包被和形状变化。为凝胶状培养支持体的硬度设定空间的的梯度的别的一例是周边部的硬度比中心部的硬度硬的凝胶状培养支持体。
模式化的凝胶状培养支持体之一例是有1个以上中心部的硬度比周边部的硬度硬的模式的凝胶状培养支持体(后述的实施例7、图22左、阳性模式)。中心部的硬度是200kPa以下是适当的，周边部的硬度比中心部柔软即可，支持体的中心部和周边部的适当的硬度可随包被和形状变化。模式化的凝胶状培养支持体的别的一例是有1个以上周边部的硬度比中心部的硬度硬的模式的凝胶状培养支持体(后述的实施例7、图22右、阴性模式)。周边部的硬度是200kPa以下是适当的，中心部的硬度比周边部柔软即可，支持体的中心部和周边部的适当的硬度可随包被和形状变化。
培养时的温度不特别限定，优选设为30～40℃，更优选设为37℃。在组织大型化时，优选升高培养器内的氧供给量。氧供给量是4％～50％是适当的，优选为10％～30％，更优选为18％～25％。
培养期间不特别限定，优选设为12～144小时，例如，对于从自肝脏分离的细胞及/或组织形成0.4～10mm的大小的细胞集合体，优选设为12～48小时，对于从自胰腺分离的细胞及/或组织形成0.4～10mm的大小的细胞集合体，优选设为12～144小时，对于从自肠分离的细胞及/或组织形成0.4～3mm的大小的细胞集合体，优选设为12～96小时，对于从自肺分离的细胞及/或组织形成0.4～1mm的大小的细胞集合体，优选设为12～96小时，对于从自心脏分离的细胞及/或组织形成0.4～10mm的大小的细胞集合体，优选设为12～96小时，对于从自肾脏分离的细胞及/或组织形成0.4～5mm的大小的细胞集合体，优选设为12～144小时，对于从自脑分离的细胞及/或组织形成0.4～10mm的大小的细胞集合体，优选设为12～144小时，对于从自癌分离的细胞及/或组织形成0.4～10mm的大小的细胞集合体，优选设为12～144小时。另外，对于从iPS细胞等的多能性细胞形成0.4～10mm的大小的细胞集合体，优选设为48～144小时。
由本发明的方法制作的细胞集合体由于细胞间的相互作用紧密进行，再现胎内发生的生物学环境。由此认为，向器官前体细胞的初期分化诱导有效率地发生，所以其存在频度－数升高。另外，由本发明的方法制作的细胞集合体在细胞之间强地粘接，能非破坏性地回收。
本申请中记载的细胞集合体是包含器官芽或类器官(器官芽(WO2013/047639)、肝芽、肝盲囊、肝类器官、胰腺(背或腹)芽、胰腺盲囊、胰腺类器官、肠芽、肠盲囊、肠类器官(K.Matsumoto，et al.Science.19；294(5542)：559-63.(2001))等的概念，细胞集合体不限构成的细胞的种类或种类的数，器官芽与在器官发生初期形成相等，构成的细胞的种类是构成原则、器官或组织的功能细胞(或者向功能细胞分化的未分化细胞)、血管细胞及间质细胞的三种，类器官仅由构成上皮性组织的细胞成立，基本上是小型的(1mm以下)。
细胞集合体由自发组织，形成附加高级结构的三维组织结构，能由此实现前体细胞的终末分化诱导。自发组织也可在体内、体外之任何进行。例如，通过向活体内移植由本发明的方法调制的细胞集合体，血管网形成，血液灌流被诱导，发生向有复杂的结构的高级组织的自发组织，制作有与成体组织同等的高度成秩序的组织结构的组织或器官变得可能。在血管网以外，也有可形成尿管结构、胆管结构、气管结构等的附加进一步的高级结构的高级组织的可能性。再者，存在多种如肝脏等一样，为了其功能表达，不仅肝脏，胆管或胰腺管的合流、向十二指肠的连接等其他器官的关联的再构成变得必须的器官。通过由本发明制作再现与其他器官的相互作用的集合体，期待作为在体内存在的复杂的器官的自发组织诱导系统的活用。
本发明也提供由上述的方法制作的细胞集合体。
另外，本发明也提供三维组织结构的制作方法，其包括使由上述的方法制作的细胞集合体自发组织，形成附加高级结构的三维组织结构。
还另外，本发明提供培养的侧截面是U或V字的形状的凝胶状培养支持体。本发明的培养支持体通过凝胶状支持体的培养的侧截面是U或V字的形状，细胞集合在支持体的培养面，由更少的数的细胞及/或组织形成细胞集合体，从而有利。培养的侧截面是U或V字的形状的凝胶状培养支持体如上所述。
本发明也提供中心部的硬度比周边部的硬度硬的凝胶状培养支持体。其一实施方式示于后述的实施例6(图20及21)。中心部的硬度是200kPa以下是适当的，周边部的硬度比中心部柔软即可，支持体的中心部和周边部的适当的硬度可随包被和形状变化。
另外，本发明，相反，也提供周边部的硬度比中心部的硬度硬的凝胶状培养支持体。
本发明也提供有1个以上中心部的硬度比周边部的硬度硬的模式的凝胶状培养支持体。其一实施方式示于后述的实施例7(图22左、阳性模式)。中心部的硬度是200kPa以下是适当的，周边部的硬度比中心部柔软即可，支持体的中心部和周边部的适当的硬度可随包被和形状变化。
本发明也提供有1个以上周边部的硬度比中心部的硬度硬的模式的凝胶状培养支持体。其一实施方式示于后述的实施例7(图22右、阴性模式)。周边部的硬度是200kPa以下是适当的，中心部的硬度比周边部柔软即可，支持体的中心部和周边部的适当的硬度可随包被和形状变化。
再者，本发明也提供在体外制作细胞集合体的方法，其包括在上述的凝胶状培养支持体上培养任意的种类的细胞及/或组织和间质细胞的混合物，使细胞集合体形成。对于任意的种类的细胞及/或组织和间质细胞的混合物的培养如上所述。
【实施例】
以下，由实施例进一步详细地说明本发明。
〔实施例1〕
以往认为，细胞集合块形成是对于单离的未成熟的细胞经自发组织形成三维复杂的器官重要的原则。我们，通过再现在器官形成期发生的细胞间相互作用而发现，在体外，从单离的人肝前体细胞自律性地形成mm单位的肝原基。但是，这样的动力学三维组织化的背后的机制完全不明。我们得知，此立体组织形成从多种细胞单位的自身集合反应开始，在其进行中在间质干细胞中发生的肌球蛋白II的细胞骨架的收缩力的存在是必要的。此动态的细胞集合反应受基板基质的刚性(硬度)条件支配。在进一步优化的基板的条件下，成功制作从自包括肝脏、胰腺、肠、肺、心脏、肾脏、脑、再者癌的各种各样的器官分离的细胞/组织3维的器官原基。制作的3维原基通过掺入血管内皮细胞，移植时立即被血管化，再者，自律性地形成具有治疗效果的自发组织的三维组织结构。以将来的再生医疗的目标上，此原则关乎通过动态细胞集合及随后的自发组织，设立用于从干细胞再构建多个血管化的复杂的器官系统的广泛使用性高的平台。
在生理器官形成之间，得知肝脏是在人的妊娠第5～8周被称为肝芽的组织块集合而形成。间质干细胞、未分化的血管内皮细胞和前脏侧内胚层细胞的细胞间相互作用被称为前肠内的基本的肝脏的出芽(也称为肝芽)，对于肝再生的开始必要(1)。与器官形成中的这些的基本上的理解并行，再生医学最近的进步还证实，可通过在使用多能性干细胞(PSC)的培养中，再现器官形成期的细胞相互作用来模仿此动态三维(3-D)的转位。在固化的软质基质凝胶上接种，则单体的PSC-来源肝细胞通过与内皮细胞及间质细胞的共培养自律性地形成3维的集合体(2)。一旦集合体确立，则数天后，在完全的体外的条件下进行具有向与胎内存在的器官类似的结构的肝芽组织的自发组织(3)。在体外成长的器官的芽的移植在活体内进一步自发组织(成熟)，结果，成为血管化的具有功能的肝脏。此方法开辟了用于血管化的器官系统的人工的再构成的新的道路(4)。从这样的以前的观察最有魅力的是，即使在平坦的2维培养板之下的培养，在共培养的细胞上见到非常大的形态形成的变化。在自发组织的先前研究中，一般而言，在急凹的底的96孔板上生产微米规模的集合体，但此系统中，可成长至毫或厘米规模(5,6)。从而，本研究的主目的是，分析成为此令人惊讶的程度的动力学动态集合反应的中心的机制，明了用于再现现象不可或缺的要因。进而，在优化的条件之下，我们最终评价此方法向再构成其他器官系统的扩展性。
我们先由延时成像解析追踪类器官形成中的细胞的移动。将人诱导多能性干细胞(iPSC)来源的肝内胚层细胞、脐带来源的内皮细胞(HUVEC)及间质干细胞(MSC)用个别的荧光标记，在前述的凝固的基质凝胶上共培养。活细胞追踪确证，血管化的类器官的形成先于通过由如内皮一样的网络的形成(图1)显示的自发组织的空间的再构成，从迅速的细胞集合反应开始。即得知，在初期自身集合相中，细胞以组行为，也就是说作为多细胞集合单位行动，立即收敛到集合中心(图1)。为了更详细地解析这样的集合体形成动力学，由图像解析求出集合体外周部的位置(单元面积的平方根)和圆形度(Circularity)的时间发展(图1b)。结果，集合体至细胞接种后约7小时以10μm/h以下缓慢收缩，其后数小时以达最大～500μm/h程度加速后指数函数地减少收敛。另一方面，圆形度从细胞播种后大致单调性地减少，在10～13小时后显示约0.5的最小值。其后转至增加，在20小时后收敛到大致一定值(0.85)。
以上的结果提示，本研究中的集合体的形成不是由于细胞的游走，而是由于细胞组织的收缩。首先集合体外周部的最大速度在细胞接种后10～15小时达约500μm/h，这远超一般细胞游走速度。再者，移动速度最终以指数函数地减少，这暗示集合体根据以被称为Kelvin-Voigt模型的指数函数所示的力学模型收缩。实际上显示，至今，各种各样的细胞组织或应激纤维收缩可用Kelvin-Voigt模型模拟。另外，这样的集合体的大的收缩的开始要求约10小时，这被认为是作为进行细胞-细胞间的粘接或对于收缩必要的应激纤维的形成的时间在妥当的范围内。实际圆形度的结果显示，在初期的10小时集合体未达真圆，以歪形收缩。这被认为是提示，在集合体形成初期，其收缩力与细胞-外场(细胞ー基板间、细胞-容器壁面)间的粘接力同程度或更低。
为了在体外鉴定对于引发这样的动态且有指向性的细胞集合现象重要的细胞的种类，我们探讨在共培养中3系统的全部的可能的组合。结果确证，如果间质干细胞缺乏，则集合体不能形成(图中的，iPSC+EC，EC，iPSC)。一方面，在细胞集合体形成中，与MSC组合是充分条件，血管内皮细胞的存在不是必须的。例如，由iPSC来源的肝内胚层细胞和MSC的共培养(iPSC+MSC)、血管内皮细胞和MSC(EC+MSC)，细胞集合体形成也是可能的(图1)。由MSC单独也形成集合体，但在MSC非存在下的培养组，在EC单独、iPSC单独、iPSC+EC之任何中，都仅形成片状的脆组织，不能非破坏性地回收，从而不形成集合体。另外，在不在支持体上培养时(2-DiPSC+EC+MSC)、也确认不到集合体形成。为了明了由上述的观察提示的，'收缩结构'，我们其后，在分子水平评价对它们的基体和周围的细胞的MSC的收缩力的贡献。得知，在生理初期发生过程中的胚的原肠陷入中，有的细胞的组受收缩，由肌球蛋白II(MII)活性驱动的细胞-细胞间结合向急剧的内侧的变位导致在胚的原肠形成期细胞陷入。从而，我们通过由磷酸特异性抗体(7)和细胞内流式细胞术的肌丝的分解而测定在使MIIA失活的S1943(pS1943)的MIIA的磷酸化的时间经过依赖性的变化，评价MII的活性。基于用于推定MIIA活性的报告的式(8)，我们显示在集合体形成中的间质细胞内有活性的MIIA显著地上调而在6小时达到峰值，其对应于细胞以最大速度移动的时机(1)。另一方面得知，在iPSC来源肝细胞中活化MIIA通过集合体形成而大致一定。这提示由MSC的MIIA的活化担负此强固的3维转位的责任。再者，作为指示此活化MIIA减少的直接的证据的数据，我们显示，此集合体形成可由Blebbistatin(肌球蛋白II(MII)ATP酶抑制剂)完全地拮抗(9)。同样地，确证共培养中的ρ激酶抑制剂Y-27632的添加部分地使集合体形成(图1)延迟。一方面，由于作为最近的报告的，关于由在器官形成(图1)之间自律性地生成的趋化因子梯度的细胞集合机制，通过由AMD3100的添加的趋化因子受体途径的药理学抑制(10)无法妨碍细胞集合体的形成，被认为难以适应。从此结果得知，由肌动球蛋白细胞骨架的收缩力实现对于细胞集合的指向性和大幅的移动重要的作用。
在单一细胞水平提示，这样的培养中的细胞内骨架收缩由向基质锚的结合度调节(11)。即，在测定单一细胞的牽引力的最近的研究中显示，细胞骨架的张力由基板的生物化学及生物物理学参数调节(12)。从而我们假定，只要在细胞集合中的收缩机制中也可适应此过程，就可由基板条件的硬度调节使集合反应变化。在我们的先前研究中显示，水凝胶、胶原、层粘连蛋白、巢蛋白及它们的组合等在各种各样的生物化学条件下进行测试，基质胶等的基底膜复合物是最有效的基质。再者，为了明确重要的要因，我们在其中评价基板的生物物理学刚性状态的影响。具体而言，为了评价外部环境给细胞应答带来的影响，制作有能自如地调整生物化学－力学条件的特性的水凝胶(图2)(13)。在由本法制作的各种各样的硬度条件的基板上接种细胞时，得知在24小时左右的培养后确认明了的细胞集合行为差异。即，追踪集合体形成中的MSCs的运动，解析速度(velocity)和运动取向性(orderparameter)时，得知两参数均E＝17kPa之时显示极大。结果明确地表示，细胞外环境的硬度是集合体形成的重要参数之一。实际上得知，作为在本系统的集合体形成的关键细胞的MSCs，以分化或粘接为首在各种各样的过程显示机械应答。一般而言，在球形等的集合体的形成中，细胞-细胞间的相互作用高于细胞-外场间的相互作用是必要的，所以在本系统中也认为，E＝17kPa之外场硬度环境实现这样的条件。通过考虑MSC(图1)的必要性，我们得出对更柔软的基板的间质细胞的收缩有在共培养系统中引起这些集合反应的可能性的结论。
如果MSC来源的收缩力被认为是此自身集合行为的中心，则此原理被认为，与在以将来的再生医疗作为目的上的胚层的来源无关系，可向其他器官的自发组织系统扩展。就是在其中，胰腺由于得知根据与肝脏比较近的发生程序，为了验证此假说，我们先选择胰腺细胞而用于共培养用。当将单离的小鼠的胰腺β细胞(MIN6)与HUVEC和MSC共培养时，同样地确认细胞集合体的形成(图3)。为了使生成的类器官之内部结构可视化，共聚焦显微镜分析使用荧光标记的细胞进行。三维z堆栈投影图像显示，kusabira橙(KO)标记MIN6在移植后72小时为了形成胰岛样组织而自发组织。与此相比，绿色荧光蛋白质(EGFP)标记的HUVEC形成覆盖类器官内部的MIN6来源的胰岛的网络结构。以上显示，在肝脏中发现的动作原理在胰腺中也可扩展的可能性。
接下来，我们为了评价此方法的进一步的的广泛使用性，单离来自胚或成体小鼠(最大200μm的)多个细胞或组织片段。令人惊讶地，有细胞集团的指向性的自律性集合现象在胰腺、肝脏、肠、肺、心脏、肾脏、脑、再者含癌(图3)的测试的全部的细胞/组织类型中保持。延时成像显示，胚及成体的两方的细胞/组织良好地耐受含移植手术的追加的操作，自律性地形成单一的3D类器官(图3)。集合体设计为含培养内皮细胞(HUVEC)，则得知与有信赖性的以往的组织工程学方法(平均灌流时间、～192小时)比，在移植后显著更短的时间由受者的循环血液灌流(平均灌流时间；～72小时)。这提示，为了血管新生，无支架的自身集合方法优良(图4)。对于生成集合体而言不需要内皮细胞的存在，但无HUVEC，则移植后的结果非常地差。原因在于，在体内观察不到功能性的血管形成的迹象(图4)。
令人感兴趣的是，仅管保持功能性的血管新生，但成体器官来源的细胞几乎不再构成与移植时原来的组织近似的组织(图7)。但是，胚细胞来源的集合体有效率地由自发组织再构成功能性的组织单位。例如，胎儿肾脏来源的类器官的移植再构成有血液过滤的迹象的如肾小球一样的微组织(图4D)，但成体的肾脏或肺来源的类器官不能生成那样的组织(图7、8)。结果提起利用从PSC直接分化的细胞的成熟的细胞移植说不定对于治疗器官衰竭有效的优势的再生医学范例的疑问。原因在于，最终分化的细胞即使在良好血管新生的条件下，也在移植时缺乏再构建功能性的组织的能力。
进而，以胰腺细胞作为对象，实施详细的解析。3维胰腺类器官的移植引起迅速(～48小时)的再灌流和β细胞的植活，这些由活体成像解析确认。在第14天，移植片形成与受者的循环系统(图4,C)连接的、具有功能性微小血管网络的胰岛样结构(图4,E)。这样的血液灌流在移植不含血管内皮细胞的集合体时确认不到(图9)。再构成的胰岛与周边部的小鼠血管直接连接，由毛细血管的密的网络被高度血管化(图10)。得知，活体中的胰岛毛细血管网有比围绕外分泌组织的血管网高约5倍的密度，与这一致，显示由活体内的功能性的血管密度的定量化，在再构成的胰岛样组织中，毛细血管网远比正常组织(图4、图9)的周围致密(4.2倍)。从组织学的解析也认为，有与成体胰岛类似的结构，由自发组织再构成成熟组织(图11)。再者，为了评价治疗上的有效性，将体外来源的β细胞类器官移植到I型剧症糖尿病模型小鼠的肾脏被膜下。作为糖尿病模型，我们采用在胰岛素启动子上具有白喉毒素受体cDNA导入基因的、经毒素受体的细胞敲除(Track)-Tg小鼠。非移植组的小鼠经白喉毒素(DT)施用的糖尿病诱导后第6天死亡，与此相比，移植β细胞类器官的小鼠血糖值保持正常而存活(图4,G)。从以上，我们通过实验性地在体内再构成血管新生化及功能的三维组织，证实此原理也能适用于其他器官系统。
在1960年代，显示单离的胚细胞的集合体通过自发组织再构成有与原来的器官近似的结构的组织。一旦，成为必要的各种各样的少数的细胞集合至可密切相互作用，则每种细胞可在体外自发形成功能性组织(14)。对自发组织的此经典的知识可在设计作为此领域之一的本质的挑战的用于从PSC成长器官的原则的再生医学领域中带来技术革新。现在，此原则由包括从PSC来源细胞集合体至脑、眼杯、肾脏及肝脏的我们或其他研究者的观察而得到强化(15)。在此趋势中，我们在其中显示1个的有希望的原则。即，与如以往一样无论怎么做都只能形成小型的集合体的方法比较，通过从希望的多个多数的细胞/组织集合，可设计其自身组织下的类器官。集合体可在体外及体内的两方为研究其后的自发组织能力而使用。在此研究中，通过进行实验性地掺入内皮细胞，评价迅速的血管新生及随即的功能化，为了更正确的组织再构建，评价神经细胞等的未开拓的支援细胞的贡献，这是对于我们或其他组感兴趣的。为了确定用于成为目标的组织的自发组织的最适的条件，进一步的改良是必要的，我们认为，此培养原理不仅是用于研究使用多能性干细胞的人生物学及病理学的强力的工具，还可通过使用在体外成长的复杂的组织结构，使现在治疗不可能的患者的新世纪的再生医疗的实现成为可能。
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【材料和方法】
【·间质细胞(MC)的调制】
对于MC，使用自人骨髓分离的细胞、自人脐带间质(Walton鞘)分离的细胞、自人耳介分离的细胞、自小鼠骨髓分离的细胞、人成纤维细胞等之任何。在本实验中主要使用的，自人骨髓分离的间质干细胞(Mesenchymal Stem Cell：hMSC)使用在hMSC培养中调制的专用的培养基(MSCGMTM BulletKit(注册商标))(Lonza PT-3001)培养。
【·各种细胞的调制】
使用由二乙基醚(Wako)麻醉的C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)小鼠(日本SLC)，将妊娠第12-17天的腹部用70％乙醇消毒后，开腹，摘出胎儿。从胎儿摘出脑、心脏、肺、肝脏、后肾、或者肠道。另外，摘出6周龄以上的C57BL/6-BALB/c RFP多毛小鼠(自Anticancer Inc.购入)的脑、心脏、肺、肝脏、肾脏、或者肠道。在使用从摘出的组织单离的细胞时，放入0.05％胰蛋白酶-EDTA(GIBCO)200μL中，于37℃温育20分钟。其后，通过移液器吸吐崩解组织，加到4.8mL的培养基中。离心，加培养基而数细胞数之后，将酶处理至单一细胞的细胞在共培养中使用。另外，在将摘出的组织在小组织的状态下使用时，用夹切碎摘出的胎儿组织，放入0.05％胰蛋白酶-EDTA 10mL中，于37℃振荡20分钟。其后，加培养基而使通过100μm的细胞滤器，进行离心。离心后，加培养基，在细胞培养中使用。另外，将成体小鼠的脑、心脏、肺、肝脏用夹切碎，使用100μm的细胞滤器过滤，将流通物使用40μm的细胞滤器过滤，将在40μm的细胞滤器中残留的细胞块用培养基回收而在细胞的共培养中使用。另外，在成体小鼠的小肠中，将内容物用生理盐水清洗。将清洗的小肠纵切，切成4cm间隔，放入含2mM EDTA，0.5mMDTT的PBS中于37℃振荡20分钟。其后，使用100μm的细胞滤器过滤，加PBS。进行离心，吸上清后加PBS清洗。其后，进行离心，加培养基而在细胞培养中使用。
正常脐带静脉内皮细胞(Normal umbilical vein endothelial cells：HUVEC)是，将自取得说明和同意的妊产妇的分娩时得到提供的脐带分离的细胞、乃至购入的细胞使用EGM(注册商标)BulletKit(注册商标)(Lonza CC-4133)，由5次以内的继代次数培养。再者，全部细胞均可根据必要进行由反转录病毒载体的荧光标记。另外，HepG2在加10％FBS的DMEM中培养。各自的细胞在37℃、5％CO2的温育器内培养。
【·自发组织用细胞集合体的制作】
在使PA凝胶平面基板静置的，或者，进行基质胶包被(基质胶(BD)的原液、乃至将基质胶和培养基以1:1的比例混合的溶液每1孔各放入300μL，在37℃、5％CO2的温育器内静置10分钟以上而固定)的24孔板的1孔上使细胞数2×106细胞以上相当的任意的组合的种类的细胞(自胎儿－成体分离的组织或，KO-HepG2、HUVEC等)与2×105细胞的MSC混合，接种细胞。另外，为形成小型的细胞集合体，将4×103细胞以上相当的任意的组合的种类的细胞(自胎儿－成体分离的组织或，KO-HepG2、HUVEC)与5×103细胞以上的MSC混合，接种。其后，在37℃的温育器培养1天。接种后，实施使用实体显微镜或共聚焦显微镜的细胞共培养的经时观察。在任意的组合中无种类的限定，例如，即使使用将胰腺－肝脏－肠道－神经等的不同的组织来源的细胞混合，其后也可使用对于作为目的的器官的自发组织最适的组成。
还有，基于通过在使用静置进行细胞的图像解析的PA凝胶平面基板的板的实验中，接种2～4×106细胞的HUVEC、接种2～4×105细胞的hMSC这2种细胞得到的集合体形成过程的动画进行评价。
【·PA凝胶平面基板的制作(面内的硬度均一)】
作为凝胶的反应溶液，制作将丙烯酰胺水溶液(40％w/v，A4058，Sigma)、双丙烯酰胺水溶液(2％w/v，M1533，Sigma)、蒸馏水混合而制作的溶液10mL。此时，通过改变各自的溶液的混合比率，调节凝胶的杨氏模量。将此反应溶液使用真空室突沸之后，依次加100μL的APS(5g/DW50mL，01307-00，KANTO，0.20mm filtered)和10μL TEMED(T9281,Sigma)。其后，将本反应液25μL滴到用二甲基二氯硅烷(DCDMS,D0358,TCI)表面疏水化的载玻片(S2112,MATSUNAMI)上后，在上盖上烯丙基三氯硅烷(ATCS,107778-5g,Sigma)处理的圆型盖玻片( MATSUNAMI)而作为夹心结构，静置30分钟。其后，加蒸馏水，静置一晚后，从载玻片基板剥离，得到包被凝胶的盖玻片基板。其后，加磷酸缓冲液而静置一天，除去未反应的单体。表1显示代表性的反应溶液的配合比和凝胶的杨氏模量。凝胶的杨氏模量由原子间力显微镜(Nanowizard 3，JPK Instruments，Germany)的纳米压凹测定决定。
向PA凝胶表面的粘接分子(基质胶或层粘连蛋白)的包被以下列顺序进行。首先，将0.2mg/mL的N-磺基琥珀酰亚胺-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸盐(Sulfo-SANPAH,22589,Pierce)的20mM HEPES(pH8.5)溶液滴到PA凝胶基板上，用UV灯(Z169633-1EA，Sigma)照射20分钟。其后，滴下数mL的4.4mg/mL的基质胶溶液(将原液用20mM HEPES(pH8.5)溶液稀释227倍，354234，BD)、或者10.0mg/mL的层粘连蛋白溶液(将原液用20mMHEPES(pH8.5)溶液稀释227倍，354232，BD)，在37℃温育器中静置16小时。其后，将PA凝胶用磷酸缓冲液良好润洗，除去未交联的基质胶或层粘连蛋白。
【表1】
【表1：代表性的凝胶合成的溶液配合比和杨氏模量】
〔实施例2〕
在进行基质胶包被(每1孔各放入300μl基质胶(BD)的原液、乃至将基质胶与培养基以1:1的比例混合的溶液，在37℃、5％CO2的温育器内静置10分钟以上而固定)的24孔板的1孔，将细胞数2×106细胞的iPS细胞来源肝内胚层细胞乃至人成体肝细胞与5×105细胞的人或小鼠MSC混合，接种。其后，在37℃的温育器中培养1天。接种后，实施使用实体显微镜或共聚焦显微镜的细胞共培养的经时观察。如图13所示，即使无血管内皮细胞，只要有间质细胞，就显示形成细胞集合体。
〔实施例3〕
【·U底PA凝胶的调制】
作为凝胶的反应溶液，制作将丙烯酰胺溶液(40％w/v,A4058,Sigma)，双丙烯酰胺溶液(2％w/v,M1533,Sigma)，蒸馏水混合而制作的溶液10mL。此时，通过改变各自的溶液的混合比率，调节凝胶的杨氏模量。向24-孔组织培养板(353047，BD)加500μL反应溶液之后，依次加0.5μL TEMED(T9281,Sigma)和5μL的APS(5g/DW50mL，01307-00，KANTO，0.20mmfiltered)，立即充分混合。其后，在50℃的热板之上静置15分钟。其后，加磷酸缓冲液静置一天，除去未反应的单体。U底凝胶的截面图示于图12。
在使用本凝胶(深度3微米往后的硬度是约30kPa，是一定的。)的细胞集合体的形成实验中，在24孔板的1孔中将细胞数2×106细胞的iPS细胞来源肝内胚层细胞与7×105细胞的HUVEC、2×105细胞的人MSC混合，接种。其后，在37℃的温育器中培养1天。接种后，实施使用实体显微镜或共聚焦显微镜的细胞共培养的经时观察的结果，显示形成细胞集合体(图14)。
〔实施例4〕
【方法和结果】
使用由二乙基醚(Wako)麻醉的C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)小鼠(日本SLC)，将妊娠第12.5及13.5天的腹部用70％乙醇消毒后，开腹，摘出胎儿。从胎儿摘出后肾后，放入0.05％胰蛋白酶-EDTA(GIBCO)200μL中，于37℃温育20分钟。其后，通过移液器吸吐崩解组织，加到4.8mL的培养基中。离心，加培养基，数细胞数之后，将酶处理至单一细胞的细胞在共培养中使用。其后，将从人骨髓分离的间质干细胞(Mesenchymal Stem Cell：hMSC)和正常脐带静脉内皮细胞(Normal umbilical vein endothelial cells：HUVEC)混合，在固定了将基质胶(实施例2的基质胶(BD)的原液)和血管内皮细胞用培养基(EGM BulletKit(注册商标)、Lonza CC-4133)以1:1的比例混合的溶液的孔上进行接种。在24孔板的1孔相等的情况中，接种总细胞数约2×106细胞的任意的组合的种类的细胞。再者，胎儿肾脏细胞、MSC和HUVEC的比率依次设为10:2:0.1～1，不限于此。其后，在37℃的温育器中培养1天，自律性地形成3维组织。对于图16下段中记载的结果，使用进行沉淀培养的组织。对于沉淀组织的制作法，基于Christodoulos Xinaris，et al.(体内Maturation of Functional Renal OrganoidsFormed from Embryonic Cell Suspensions.J Am Soc Nephrol.2012Nov；23(11)：1857-1868.)中记载的方法，取将一齐回收的单离的细胞由离心力集合在管底面而形成移植用组织的方法。
将形成的肾脏原基移植到免疫缺陷小鼠胎内之后，实施肉眼观察的结果，在移植2-3天确认血液流入(图15之上段)。图15中的白虚线显示移植区域。分散的细胞在移植第8天，形成球状的肾小球组织(图15之下段)。图16左所示的荧光观察的结果，通过在支持体上进行培养而形成多个肾小球结构，与此相比，用以往方法(沉淀移植组)不形成。图16右所示的表达网罗的基因的解析的结果显示，移植第1个月的移植片是生后0～8周相等的成熟程度。由图17所示的左3列的结果，以移植第4周的组织作为对象的电子显微镜观察的结果，形成的组织形成由足细胞、裂孔膜、内皮细胞、近位肾小管、血管系膜细胞等组成的正常肾单位的结构。由图17右图显示，免疫染色的结果，足细胞或裂孔膜的存在。再者，显示在移植第3周施用低分子量荧光葡聚糖后荧光活体观察的结果(图18)。形成的组织，首先，流入血管内，在肾小球内部过滤，被近位肾小管回收，显示有肾脏的原尿生成功能(图18)。从以上，通过由本发明向活体内移植人为地制作的肾脏原基，成功诱导自律性的成熟，制成功能性的肾组织。
〔实施例5〕
【方法和结果】
在不同的硬度条件(Sample A,B,C)的支持体(PA凝胶平面基板的制作)的基质胶包被前(斜线)/后(全黑)的杨氏模量的变化。显示不管包被的有无，可严密控制硬度条件(图19)。本凝胶基板的制作使用实施例1中记载的方法进行。
〔实施例6〕
【方法和结果】
在一个基板上，成功制作不同的硬度条件混在的硬度的多模式凝胶(图20)。制作在模式1中中心部硬的凝胶，在模式2中中心部略硬的凝胶(图20左图)。图20右图显示以长轴方向测定硬度条件的结果，显示制作出作为目的的硬度条件。
有硬度的空间模式的凝胶基板的制作方法如下。作为凝胶的反应溶液，制作将丙烯酰胺水溶液(40％w/v,A4058,Sigma)、双丙烯酰胺水溶液(2％w/v，M1533，Sigma)、蒸馏水混合而制作的溶液10mL。其后，遮光加50mg的Irgacure2959(0.5％w/v，DY15444，Ciba)之后，在37℃的水浴中溶解，使用真空室突沸。其后，将本反应液10μL滴到用二甲基二氯硅烷(DCDMS,D0358,TCI)表面疏水化的载玻片(S2112,MATSUNAMI)上后，在上盖上烯丙基三氯硅烷(ATCS,107778-5g,Sigma)处理的圆型盖玻片( MATSUNAMI)而成为夹心结构。而且，置足罩，照射254nm的紫外光。使用在乙酰纤维素(G254B，Agar)上使用激光打印机(MC860，OKI)印刷的足罩。罩图案的设计利用Adobe Photoshop，制作外径12mm、内径2～4mm的圆形罩。在光照射中，光源用汞灯(C-HGFI，Nikon)，为向反应溶液均一地照射，使用光纤维和投光管。紫外线照射时间根据目的硬性以分钟精度调整。其后，加蒸馏水，从载玻片基板剥离，得到包被凝胶的盖玻片基板。其后，加磷酸缓冲液静置一天，除去未反应的单体。凝胶的杨氏模量由原子间力显微镜(Nanowizard 3，JPK Instruments，Germany)的纳米压凹测定决定。向PA凝胶表面的粘接分子(基质胶或层粘连蛋白)的包被以下列顺序进行。首先，将0.2mg/mL的N-磺基琥珀酰亚胺-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸盐(Sulfo-SANPAH,22589,Pierce)的20mM HEPES(pH8.5)溶液滴到PA凝胶基板上，用UV灯(Z169633-1EA，Sigma)照射20分钟。其后，滴下1mL的4.4mg/mL的基质胶溶液(将原液用20mM HEPES(pH8.5)溶液稀释227倍，354234，BD)、或者10.0mg/mL的层粘连蛋白溶液(将原液用20mMHEPES(pH8.5)溶液稀释227倍，354232，BD)，在37℃温育器内静置16小时。其后，将PA凝胶用磷酸缓冲液良好润洗，除去未交联的基质胶或层粘连蛋白。
接下来，使用制作的模式凝胶，将iPS来源肝脏内胚层细胞、HUVEC、MSC以10:7:2的比例混合，接种总细胞数约2×106细胞(图21)。结果，在模式1中，细胞接种后30小时之间细胞在中心的硬的区域集合，形成快速集合体。在模式2中，确认细胞集合体的形成，向中心的集合速度有略延迟的倾向。提示中心部是100kPa的条件是最适的。
〔实施例7〕
【方法和结果】
在阳性模式中，设计为各圆形部分坚固，其周边柔软(图22左)。在阴性模式中，设计为各圆形部分柔软，其周边变硬(图22右)。有这样的多种硬度模式的凝胶基板基于实施例6中记载的方法，由有4×4的圆形模式(圆的直径约2mm、圆的中心间距离约2.7mm)的足罩，对直径25mm的凝胶基板曝光而制作。认为通过使用这些模式化支持体，可在任意的场所形成任意的大小的集合体。
将本说明书中引用的全的刊物、专利及专利申请直接作为参考并入本说明书。
【工业实用性】
本发明能在新药的探索及药效的判断、再生医疗、疾病、病态的诊断、有用物质生产等中利用。
Claims (25)
1.在体外制作细胞集合体的方法，其包括培养任意的种类的细胞及/或组织和间质细胞的混合物，使细胞集合体形成。
2.权利要求1所述的方法，其中细胞集合体可由自发组织形成附加高级结构的三维组织结构。
3.权利要求1或2所述的方法，其中将任意的种类的细胞及/或组织和间质细胞的混合物在间质细胞能收缩的凝胶状支持体上培养。
4.权利要求3所述的方法，其中培养是二维培养。
5.权利要求3或4所述的方法，其中凝胶状支持体是平面，或者凝胶状支持体的培养的侧截面是U或V字的形状。
6.权利要求3～5之任一项所述的方法，其中凝胶状支持体的中心部的硬度比周边部的硬度硬。
7.权利要求3～5之任一项所述的方法，其中凝胶状支持体的周边部的硬度比中心部的硬度硬。
8.权利要求3～5之任一项所述的方法，其中凝胶状支持体经模式化，有1个以上中心部的硬度比周边部的硬度硬的模式。
9.权利要求3～5之任一项所述的方法，其中凝胶状支持体经模式化，有1个以上周边部的硬度比中心部的硬度硬的模式。
10.权利要求1～9之任一项所述的方法，其中任意的种类的细胞及/或组织是总细胞数40万个以上，间质细胞是10万～40万个。
11.权利要求1～10之任一项所述的方法，其中细胞集合体的大小是1mm以上。
12.权利要求1～11之任一项所述的方法，其中细胞集合体的形成是自律性的。
13.权利要求1～12之任一项所述的方法，其中不使用支架材料，培养任意的种类的细胞及/或组织和间质细胞的混合物。
14.权利要求1～13之任一项所述的方法，其中与间质细胞混合的细胞及/或组织来源于肝脏、胰腺、肠、肺、肾脏、心脏、脑或癌。
15.权利要求1～13之任一项所述的方法，其中与间质细胞混合的细胞是多能性细胞。
16.权利要求1～13之任一项所述的方法，其中与间质细胞混合的组织是自多能性细胞诱导的组织。
17.权利要求15或16所述的方法，其中多能性细胞是自活体得到的多能性细胞、由重编程诱导得到的多能性细胞、或者它们的组合。
18.细胞集合体，其由权利要求1～17之任一项所述的方法制作。
19.三维组织结构的制作方法，其包括使由权利要求1～17之任一项所述的方法制作的细胞集合体自发组织，使附加高级结构的三维组织结构形成。
20.凝胶状培养支持体，其中培养的侧截面是U或V字的形状。
21.凝胶状培养支持体，其中中心部的硬度比周边部的硬度硬。
22.凝胶状培养支持体，其中周边部的硬度比中心部的硬度硬。
23.凝胶状培养支持体，其中有1个以上中心部的硬度比周边部的硬度硬的模式。
24.凝胶状培养支持体，其中有1个以上周边部的硬度比中心部的硬度硬的模式。
25.在体外制作细胞集合体的方法，其包括在权利要求20～24之任一项所述的凝胶状培养支持体上培养任意的种类的细胞及/或组织和间质细胞的混合物，使细胞集合体形成。
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