CN106011089A - 串联hcv多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒及其制备方法和应用，属于分子生物学和细胞生物学领域。本发明方法采用将目的基因嵌合于HBV S的氨基端胞外区而不改变其穿膜结构域(TMD)的方式，将HCV中和抗原表位串联后嵌合于HBV S抗原氨基端，构建丙型肝炎病毒串联多中和抗原表位与乙型肝炎病毒S抗原嵌合基因真核表达质粒，观察其在293T细胞的表达，制备嵌合HCV串联多中和抗原表位的HBV S抗原的VLPs。该病毒样颗粒免疫血清对体外模拟HCV感染具有一定的保护作用，为设计HCV中和抗体疫苗提供了新的技术方法，也为设计双价疫苗提供了思路。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和细胞生物学领域，具体涉及一种串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
HCV感染导致的慢性肝病是全球性的公共卫生问题，全世界每年因HCV感染导致的死亡人数达到45万。由于长期缺乏合适的体外病毒培养系统、小动物模型和准确的中和抗体评价方法，使HCV预防疫苗的研制至今未能获得成功。研究表明，HCV包膜蛋白E1/E2区存在多个保守的中和性抗原表位，针对这些表位的单克隆抗体具有广谱的交叉中和活性，这也为设计诱导中和抗体的预防性表位疫苗提供了新的思路。
近年来报道较多的具交叉中和活性的单克隆抗体AP33，其抗原决定簇是E2的一个保守的线性中和表位(412-423)，该单克隆抗体能显著降低所有基因型HCVpp的感染性。从感染1b型HCV患者得到的单抗A8(523-535)，其对应表位是E2-CD81相互作用中起关键作用的表位。针对E1区的中和表位(313-327)的单抗能强烈中和1a,1b,4a,5a,和6a型HCV包膜糖蛋白制备的HCVpp。为克服HCV E2区高变异，可采用HVR1的模拟表位，其抗原性更强、更广谱。如报道的氨基酸序列为：ETYVSGGSAARNAYGLTSLFTVGPAQK的模拟表位，可与80％的HCV感染患者血清反应。将具有广谱作用的表位串联，制备多表位疫苗，可有效预防多种基因型和准种的病毒感染。
HBV小包膜蛋白S抗原(HBV S)长度为226个氨基酸，是目前商品化HBV疫苗的主要成分。S基因可在无核心蛋白和基因组参与下自我装配成病毒样颗粒，这种特殊的亚病毒颗粒，能产生大小为22nm的丝状或球状颗粒。在哺乳动物细胞中形成与野生型病毒相似的病毒颗粒，分泌到细胞培养上清中，所形成的病毒颗粒是非传染性的。用HBV S作为表达载体表达外源蛋白，具有易制备、易纯化等特点，而且外源抗原与之嵌合后，可增强外源蛋白的免疫原性。因此HBV S是一种较好的载体系统。HBV S抗原亲水区，可插入表位，嵌和表达病原体保守的表位，但研究发现，亲水区插入表位长度超过36个氨基酸就影响病毒颗粒的包装。而HBV S得氨基端可插入较大片段(如GFP)，可形成嵌合的病毒样颗粒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒及其制备方法和应用。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒，该病毒样颗粒是将串联的HCV多中和抗原表位嵌合于HBV S抗原氨基端构建得到真核表达载体，再经哺乳动物细胞体外装配制得；
其中，所述串联的HCV多中和抗原表位的核苷酸序列如SEQ.ID.NO：1所示。
所述串联的HCV多中和抗原表位是由氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4及SEQ.ID.NO.5所示的表位串联得到。
氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示的表位为HCV E1区线性中和表位；氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4所示的表位为HCV E2区线性中和表位；氨基酸序列如SEQ.ID.NO.5所示的表位为HCV E2高变区模拟表位。
串联的HCV多中和抗原表位的碱基序列全长255bp，各个表位间以AAY为间隔进行连接。
本发明还公开了一种串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1)利用DNA WORKS设计合成，并扩增得到串联的HCV多中和抗原表位基因序列；
2)设计引物扩增得到去除胞外区的HBV S基因；
3)将串联的HCV多中和抗原表位基因和去除胞外区的HBVS基因克隆入真核表达载体；
4)经哺乳动物细胞体外装配，制备得到串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒。
串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)，根据DNA WORKS设计合成表位基因序列Mix1～Mix6，以Mix1～Mix6混合物为模板，Mix1和Mix6为上下游引物，扩增得到串联多中和抗原表位序列MEp，克隆至T-easy载体，经Xho I、EcoR I双酶切鉴定正确后，命名为T-MEp；
步骤2)，以含有完整HBV S基因的质粒pBVHBs为模板，设计引物，扩增6-226位氨基酸的碱基序列，得到S，两端分别引入EcoR I和Not I酶切位点，克隆至T-easy载体，Eco RI和Not I双酶切鉴定正确后，命名为T-HBVS；
步骤3)，将T-HBVS用Eco R I/Not I双酶切，将T-MEp用Xho I/EcoR I双酶切后，与Xho I/Not I酶切的pCI-neo三片段连接，串联多中和抗原表位与截去胞外区的HBV S嵌合的重组真核表达载体pCI-MEpS，然后将该重组真核表达载体pCI-MEpS转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，提取pCI-MEpS质粒；
步骤4)，将pCI-MEpS质粒转染哺乳动物细胞，转染48h后收集培养上清，浓缩纯化后制得串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒。
本发明还公开了上述的串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒在制备用于预防HCV感染疫苗中的应用。
所述的疫苗为嵌合病毒样颗粒疫苗，用于HCV预防性疫苗的设计。由串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒免疫动物后产生保护性抗体，能够抑制HCVpp感染Huh7.5细胞。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明公开的串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒，采用将目的基因嵌合于HBV S的氨基端胞外区而不改变其穿膜结构域(TMD)的方式，将HCV中和抗原表位串联后嵌合于HBV S抗原氨基端，构建丙型肝炎病毒串联多中和抗原表位与乙型肝炎病毒S抗原嵌合基因真核表达质粒，在293T细胞表达，制备嵌合HCV串联多中和抗原表位的HBV S抗原的VLPs。该病毒样颗粒对体外模拟HCV感染具有一定的保护作用，可以为制备双价表位疫苗提供借鉴，为进一步设计中和抗体疫苗提供了新的技术方法。
本发明的串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒制备简单，易于浓缩纯化，制备的病毒样颗粒免疫新西兰兔后，免疫抗血清具有一定的保护作用。
附图说明
图1为HCV多表位抗原与HBV S抗原嵌合示意图；
图2为串联HCV多中和表位的合成扩增及HBV S基因的扩增结果；
图3为串联HCV多中和表位及HBV S基因胞基因T载体的酶切鉴定结果；
图4为串联HCV多中和表位及HBV S基因克隆入真核载体的酶切鉴定结果；
图5为重组真核表达载体在293T细胞中的表达分析；
图6为嵌合串联HCV多中和抗原表位在真核细胞中表达分析Western blot结果；
图7为纯化嵌合病毒样颗粒电镜分析结果；其中，A为分段测定HBsAg含量结果；B为乙肝疫苗作为阳性对照的HBsAg含量测定结果；C为电镜下观察病毒样颗粒；
图8病毒样颗粒免疫新西兰兔后血清抗体分析；其中，A为VLPs-MEpS组抗血清抗体水平与VLPs-HBS，Vaccine及佐剂对照组抗体的水平；B为检测HBV S抗原载体的免疫性；
图9免疫血清对HCVpp感染Huh7.5抑制作用分析；其中，A为各组中和率比较结果；B为免疫后42天和免疫前0天中和率比较结果。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
采用将目的基因嵌合于HBV S的氨基端胞外区而不改变其穿膜结构域(TMD)的方式，将HCV中和抗原表位串联后嵌合于HBV S抗原氨基端，构建丙型肝炎病毒串联多中和抗原表位与乙型肝炎病毒S抗原嵌合基因真核表达质粒，观察其在293T细胞的表达，制备嵌合HCV串联多中和抗原表位的HBV S抗原的VLPs。
1、串联丙型肝炎病毒多中和抗原表位基因选择及合成
1.1表位选择包括：
HCV E1区线性中和表位:ITGHRMAWDMMMNWS；
HCV E2区线性中和表位:QLINTNGSWHIN；
HCV E2区线性中和表位:GVPTYSWGENET；
HCV E2高变区(HVR)模拟表位：
ETYVSGGSAARNAYGLTSLFTVGPAQK。
具体参见下表1：
表1.表位选择及在HCV中的氨基酸位置
1.2DNA WORKS设计合成串联的多表位基因
表位间以AAY为间隔进行连接，表位碱基序列全长255bp，根据DNAWORKS设计合成表位基因序列Mix1-Mix6(参见表2)：
表2.DNA WORKS设计合成串联多表位基因MEp序列
以Mix1-6混合物为模板，Mix1和Mix6为上下游引物，扩增得到串联表位序列MEp，两端分别带有Xho I、EcoR I酶切位点和HIS，扩增后得到带有HIS标签的串联表位序列MEp，参见图2。克隆至T-easy载体，Xho I、EcoR I双酶切鉴定正确后，参见图3，送测序。测序正确后。命名为T-Mep。
2、HBV S基因胞外区扩增
以含有完整HBV S基因的质粒pBVHBs为模板，设计引物，扩增6-226位氨基酸的碱基序列，得到S，两端分别引入EcoR I和Not I酶切位点，参见图2。克隆至T-easy载体，Eco RI和Not I双酶切鉴定正确，参见图3，送测序，测序正确后，命名为T-HBVS。
从图2中可以看出，扩增出666bp和255bp大小的目的片段，与去除胞外区的HBV S基因和串联多表位基因(MEp)大小相符。从图3中可以看出，琼脂糖凝胶电泳分析，分别用EcoR I/Not I(截短HBV S)和XhoI/EcoRI(MEp)酶切得到大小分别为666bp、255bp的预期片段，测序结果表明所扩增序列正确。
3、将串联HCV多中和抗原表位基因和HBV S胞外区克隆入真核表达载体
将T-HBVS用Eco R I/Not I双酶切、T-MEp用Xho I/EcoR I双酶切后，与Xho I/Not I酶切的pCI-neo三片段连接，串联多中和抗原表位与截去胞外区的HBV S嵌合的重组真核表达载体pCI-MEpS，设计方式见图1。转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，提取质粒，用Xho I/Not I双酶切鉴定，结果参见图4，重组克隆质粒pCI-MEpS经Xho I/Not I双酶切后，琼脂糖凝胶电泳分析，可见921bp，大小与预期一致。不含Mep的真核表达载体为对照(pCI-HBS)。
4、串联HCV多中和抗原表位基因与HBV S嵌合基因表达分析
4.1嵌合基因真核表达载体在哺乳动物细胞293T中的表达分析(IFA)
将5×105HEK293T细胞接种放入盖玻片的6孔板中，培养24h。将7.5ulLipofectamine 2000用125ul稀释，放置5min，将2.5ug的pCI-MEpS质粒用125ul稀释，5min后将二者混合孵育20min，缓慢加入6孔板中。37℃，5％CO2孵育6h后，更换为完全DMEM培养基。细胞转染24h后，取出盖玻片，PBS洗2遍；加入500ul 4％多聚甲醛固定10min；PBS漂洗3次，3min/次；0.2％的PBST漂洗1次，10min；PBS漂洗3次，5min/次；3％的BSA封闭1h；1％BSA稀释的一抗(HIS单抗，1:1000；HbsAb阳性血清1:200)，37℃孵育1h；PBST漂洗3次，每次5min；1％BSA稀释的二抗(1:2000)，37℃避光封闭1h；PBS漂洗3次，每次5min，洗完后，中性树脂封片，荧光显微镜下观察，结果参见图5，重组真核表达载体在293T细胞中的表达分析。HIS单抗作为一抗：pCI-MEpS转染的293T细胞胞浆内可见较强的绿色荧光，而对照pCI-HBS、pCI-neo未见绿色荧光。HBV抗血清作为一抗：pCI-MEpS和pCI-HBS可见绿色荧光，pCI-neo未见绿色荧光。
4.2嵌合基因真核表达载体在哺乳动物细胞293T中的表达分析(Western)
将5×105HEK293T细胞接种6孔板中，培养24h。将7.5ul Lipofectamine2000用125ul稀释，放置5min，将2.5ug的pCI-MEpS质粒用125ul稀释，5min后将二者混合孵育20min，缓慢加入6孔板中。37℃,5％CO2孵育6h后，更换为完全DMEM培养基，继续培养24-48h。取部分转染24-48h的细胞，RIPA裂解，在冰上作用30-40min后，刮取裂解液，12000rpm离心10min留取上清。经SDS-PAGE分离蛋白，转移至硝酸纤维素膜；5％脱脂奶粉封闭1-2h；加入相应一抗(HIS单抗，1:2000；HBsAg单克隆抗体1:1000)4℃振荡孵育过夜；TBST洗3次，15min/次；加入HRP标记的羊抗人IgG(1:5000稀释)或羊抗鼠IgG(1:8000稀释)，室温振荡孵育1-2h；TBST洗3次，15min/次，ECL发光。以pCI-neo，pCI-HBVS作为对照，结果参见图6，从图中可以看出，HIS单抗作为一抗：检测结果显示pCI-MEpS转染的293T细胞在相对分子质量约38KD处可见蛋白条带，而pCI-HBS和空载体pCI-neo未见条带；HBsAg单抗作为一抗：pCI-MEpS和pCI-HBS转染的293T细胞在相对分子质量约27KD处可见蛋白条带，而pCI-neo未见条带。
5、病毒样颗粒的制备及纯化
5.1培养细胞
将1×107HEK293T细胞接种75ml培养瓶中，培养24h，待细胞长至95％密度时，按4中方法进行转染，脂质体和载体浓度按转染试剂说明书进行，48h后收集培养上清，上清中即含有自我装配的嵌合的病毒样颗粒VLPs-MEpS。罗氏E601电化学发光分析仪上对HBsAg进行定量，测定HBsAg含量。
5.2嵌合VLPs浓缩和纯化
将收集的各个细胞培养上清(约15ml),用Ultracell-15 100k离心过滤器4000g离心15min，浓缩的VLPs(约800μl)分别铺于60％-20％密度梯度的蔗糖上，Beckman超速离心机(rotor SW41)28000rpm超速离心16h；从管低依次收集不同片段(1ml/片段)，用商品化乙肝表面抗原测定试剂在罗氏E601电化学发光分析仪上对HBsAg进行定量，结果参见图7A，合并阳性片段进行透析(20mMTris-HCl)并用离心过滤器浓缩，得到约300μl纯化浓缩的VLPs，结果参见图7B。取20μl进行电镜分析，结果参见图7C，剩余-80℃冻存。纯化嵌合病毒样颗粒电镜分析结果。真核表达载体转染HEK293细胞48小时后，收集培养上清，浓缩离心，蔗糖滴度密度离心，分段检测HBsAg含量。结果第6和第7片段HBsAg含量最高(图7A)。取两片段混合透析，浓缩后测定HBsAg含量，结果pCI-MEpS转染组HBsAg含量可达3×103ng/ml，pCI-MEpS转染组HBsAg含量可达8×103ng/ml。乙肝疫苗作为阳性对照(图7B，HBsAg标准含量为20×103ng/ml)。取20ul浓缩的病毒样颗粒，1％钼酸铵负染电镜下观察，可见大量病毒样颗粒(图7C，放大倍数15万倍)。
6纯化病毒样颗粒免疫新西兰兔抗血清测定及保护力评价
6.1病毒样颗粒免疫新西兰兔方法
将15只新西兰兔分为5组，每组3只，分别命名为VLPs-MEpS、VLPs-HBS、Vaccine(乙肝疫苗)、佐剂组、PBS组。分别取10μg的纯化VLPs和10μg的Vaccine与同体积的MF59佐剂混合成油包水状后皮下多点免疫新西兰兔，佐剂组用PBS补齐。从第0天开始免疫，每隔两周免疫一次，共免疫三次；不同的时间点采集免疫兔静脉血，0、14、28、42、56和70天分别采血一次。离心留取血清，分装后-20℃保存备用。
6.2ELISA法检测免疫抗血清中抗体的水平
四种合成肽分别用0.3％戊二醛和BSA交联，包被交联肽(四种交联肽混合物)浓度为16μg/ml，以每孔100μl包被，4℃过夜；PBST重复清洗3次，每孔加入PBST配制2％BSA封闭液150μl,37℃1h；PBST重复清洗3次，加入免疫血清(1:200稀释)，每孔100μl，阴性对照不加一抗，37℃1h；PBST重复清洗3次，加入二抗(HRP标记的羊抗兔IgG，1:4000稀释)，37℃1h；PBST重复清洗3次，每孔加入TMB显色液100μl，37℃显色5-10min；加入终止液50μl；30分钟内酶标仪450nm测定OD值。同样方法用HBsAg阳性血清(1:500稀释)血清包被96孔板，测定免疫血清中HbsAb水平。抗体检测结果见图8，以收取血清的不同时间点为横坐标，ELISA检测结果OD值为纵坐标作图，分析不同组别中抗体的水平。图8A中可见VLPs-MEpS组抗血清抗体水平与VLPs-HBS，Vaccine及佐剂对照组相比OD值有明显增高，有统计学差异(P<0.01)。图8B是以HBV表面抗原强阳性血清包被抗原，检测HBVS抗原载体的免疫性，可见VLPs-MEpS，VLPs-HBS，Vaccine组均产生较高水平的HBsAb，与佐剂和PBS对照组相比有统计学差异(P<0.01)。
6.3免疫抗血清对HCVpp感染Huh7.5细胞的抑制性分析
2×105/孔的Huh7.5细胞接种于24孔板，37℃，5％CO2条件下过夜培养。将不同分组的免疫抗血清(预先56℃、30min灭活)从1:10开始进行倍比稀释，分别与含有2000TU(感染后非抑制对照组GFP阳性率达到50％左右)的HCVpp(1b型)等体积混合均匀，室温1h；DMEM清洗24孔板，将假病毒与抗血清混合物加到24孔板中，每孔约200μl。37℃吸附12h后，更换DMEM完全培养液；48～72h后流式细胞仪计数表达EGFP的阳性细胞的比率。PBS组为非抑制对照，计算免疫血清中和率。计算方法：计算中和抗体中和率(抑制率)，计算方法：中和率(％)＝(％GFP对照组-％GFP实验组)/％GFP对照组。
血清抗体中和作用见图9，实验结果显示，VLPs-MEpS组抗血清对1b型HCVpp感染Huh7.5的抑制作用，与对照组相比中和率明显增高，有统计学差异(P<0.01)，42天时最高中和率可达61.5％(图9A)；免疫后(42天)与免疫前(0天)比较VLPs-MEpS组中和率明显增高，有统计学差异(P<0.01)(图9B)。
Claims (8)
1.一种串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒，其特征在于，该病毒样颗粒是将串联的HCV多中和抗原表位嵌合于HBV S抗原氨基端构建得到真核表达载体，再经哺乳动物细胞体外装配制得；
其中，所述串联的HCV多中和抗原表位的核苷酸序列如SEQ.ID.NO：1所示。
2.如权利要求1所述的串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒，其特征在于，所述串联的HCV多中和抗原表位是由氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4及SEQ.ID.NO.5所示的表位串联得到。
3.如权利要求1所述的串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒，其特征在于，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示的表位为HCV E1区线性中和表位；氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4所示的表位为HCV E2区线性中和表位；氨基酸序列如SEQ.ID.NO.5所示的表位为HCV E2高变区模拟表位。
4.如权利要求1所述的串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒，其特征在于，串联的HCV多中和抗原表位的碱基序列全长255bp，各个表位间以AAY为间隔进行连接。
5.一种串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)利用DNA WORKS设计合成，并扩增得到串联的HCV多中和抗原表位基因序列；
2)设计引物扩增得到去除胞外区的HBV S基因；
3)将串联的HCV多中和抗原表位基因和去除胞外区的HBVS基因克隆入真核表达载体；
4)经哺乳动物细胞体外装配，制备得到串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒。
6.如权利要求5所述的串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)，根据DNA WORKS设计合成表位基因序列Mix1～Mix6，以Mix1～Mix6混合物为模板，Mix1和Mix6为上下游引物，扩增得到串联多中和抗原表位序列MEp，克隆至T-easy载体，测序和经Xho I、EcoR I双酶切鉴定正确后，命名为T-MEp；
步骤2)，以含有完整HBV S基因的质粒pBVHBs为模板，设计引物，扩增6-226位氨基酸的碱基序列，得到S，两端分别引入EcoR I和Not I酶切位点，克隆至T-easy载体，测序和经Eco RI和Not I双酶切鉴定正确后，命名为T-HBVS；
步骤3)，将T-HBVS用Eco R I/Not I双酶切，将T-MEp用Xho I/EcoR I双酶切后，与Xho I/Not I酶切的pCI-neo三片段连接，串联多中和抗原表位与截去胞外区的HBV S嵌合的重组真核表达载体pCI-MEpS，然后将该重组真核表达载体pCI-MEpS转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，提取pCI-MEpS质粒；
步骤4)，将pCI-MEpS质粒转染哺乳动物细胞，转染48h后收集培养上清，制得串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒。
7.权利要求1所述的串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒在制备用于预防HCV感染的疫苗中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为预防性疫苗，由串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒免疫动物后产生保护性抗体，能够抑制HCVpp感染Huh7.5细胞。
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| CN106636169A (zh) * | 2016-11-25 | 2017-05-10 | 中国人民解放军第四军医大学 | 重组hcv多表位减毒李斯特菌疫苗载体的构建方法 |
| CN107056947A (zh) * | 2016-12-23 | 2017-08-18 | 中国人民解放军第四军医大学 | 抗hbv复制的靶向融合蛋白及其构建方法 |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20161012 |