CN106008374B - 吡嗪类化合物及其在医药上的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一类荧光标记β‑淀粉样斑块和神经纤维缠结的吡嗪类化合物，所述化合物的结构通式如式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示：

Description

吡嗪类化合物及其在医药上的用途

技术领域

本发明涉及特异性分子识别诊断试剂领域，更具体地说，涉及一类与β-淀粉样斑块和神经纤维缠结具有高亲和力的新型小分子荧光化合物，以及该类化合物在制备用于检测或显像β-淀粉样蛋白沉积疾病或神经纤维缠结疾病的显像剂中的应用。

背景技术

阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD）是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病。目前我国已提前进入老龄化社会，大约有600万人患AD，数量居世界各国之首，且患病人数以每年30万以上的速度递增。我国65岁以上人群患病率达7.2%，且AD患者正在向年轻化趋势发展。AD已成为仅次于心脏病、癌症、中风的导致老人死亡的第四大杀手。AD不但严重影响中老年人的生活质量，而且给患者家庭和社会带来沉重的经济负担。由于AD病因复杂，确切的发病机理目前仍不清楚，临床上主要通过评价患者的认知功能损伤来诊断，确诊患者多已进入病程的中晚期而延误治疗。缺乏有效的检测手段，已成为AD早期诊断与治疗的重大障碍。

在AD患者脑内，以β-淀粉样蛋白（Aβ）为主要成分的β-淀粉样斑块（Aβ斑块）和以过度磷酸化Tau蛋白为主要成分的神经纤维缠结是AD最为显著的两大神经病理学特征。研究表明，脑内Aβ斑块或神经纤维缠结的沉积均不同程度地早于AD的临床发病期，故开发以Aβ斑块或神经纤维缠结为靶标的检测试剂，将对AD的早期诊断、病程监测以及治疗药物的研究等提供重要的分析手段。

过去数年间，多个用于正电子发射断层扫描成像技术（PET）的Aβ斑块示踪剂进入临床试验阶段，其中C-11标记的[¹¹C]PIB（Klunk WE,et al. Ann. Neurol. 2004, 55(3),306-319）是目前全球应用最为广泛的Aβ斑块PET显像剂； [¹⁸F]AV-45 （Wong DF, et al.J. Nucl. Med.2010, 51(6), 913-920）、 [¹⁸F]GE-067（Koole M, et al. J. Nucl. Med.2009，50 (5), 818-822）以及[¹⁸F]BAY-94-9172（Rowe CC, et al.Lancet. Neurol. 2008,7(2), 129-135）等三个F-18标记的Aβ显像剂已被美国FDA和欧洲EMA批准用于人体脑内Aβ斑块的PET显像（Villemagne VL. Ageing. Res. Rev. 2016, pii: S1568-1637(16)30005-8）。用于脑内神经纤维缠结PET显像的小分子探针也有数个进入人体临床试验，具体包括：[¹⁸F]AV-1451、[¹⁸F]THK-5117、[¹⁸F]THK-5351、[¹¹C]PBB3以及 [¹⁸F]RO6958948等（Okamura N, et al. Ageing. Res. Rev. 2016, pii: S1568-1637(15)30045-3）。但是放射性显像剂的应用也受一些因素限制，比如放射性显像剂所发出的射线对人体具有一定的辐射损伤、需要医疗机构配套有生产放射性核素的回旋加速器、放射性显像剂须专业技术人员标记配制、显像时间长且图像处理费时等。

相较之下，光学成像具有安全无放射性、数据采集时间短以及成本低廉等诸多优势，近年在医学诊断等中的应用受到广泛重视；尤其是新兴的近红外荧光成像技术，在其光谱范围内，生物组织的自发荧光干扰较小，组织背景荧光信号很低，且穿透组织距离可高达数厘米。此外，光声成像技术（photoacoustic imaging，PAI）通过光声信号的转换，可实现三维扫描成像。因此，研发与Aβ斑块和神经纤维缠结具有高亲和力的靶向光学探针，并直接应用于制备检测或显像β-淀粉样蛋白沉积疾病或神经纤维缠结疾病的显像剂，将具有非常重要的科学意义和实际价值。然而，目前国内外有关靶向Aβ斑块或神经纤维缠结的荧光化合物的研究报道较少，还处于起步阶段。基于上述技术背景，研发性能优异的新型小分子荧光化合物，符合我国社会民生的迫切需求和老龄化社会国情，具有重大的应用前景和科学意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，现有显像探针常需外接荧光团，且荧光团具有较大的分子结构并带有电荷，因而不适合应用于制备须通过血脑屏障的脑内Aβ斑块或神经纤维缠结的显像剂，且非特异结合的荧光团发光对成像易产生干扰信号。本发明提供一类不带电荷的小分子荧光化合物，其结构中的推电子基团和拉电子基团，形成推-拉电子作用的共轭结构，并通过碳碳双键增加π-π*跃迁的共轭体系，使化合物分子产生的荧光向长波方向移动（减少生物自发荧光干扰），同时其结构整体又满足了与Aβ斑块或神经纤维缠结的亲和力。化合物与Aβ斑块或神经纤维缠结结合后发射波长蓝移或红移，且荧光强度显著提高，从而有效排除非特异结合的化合物发光对成像可能产生的干扰，因此该类化合物可直接做为检测或显像β-淀粉样蛋白沉积疾病或神经纤维缠结疾病的药物或药物有效成分。

本发明的目的在于提供与Aβ斑块和神经纤维缠结具有高亲和力的小分子荧光化合物。

本发明的另一目的是提供所述化合物的制备方法及应用。

为了实现本发明目的，本发明的一类与Aβ斑块和神经纤维缠结具有高亲和力的化合物，其特征在于，所述化合物结构如式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示：

其中，n为1、2或3。

本发明还提供前述式（Ⅰ）所示化合物的制备方法。具体如下：通过Knoevenagel缩合反应合成目标化合物：取2-甲基吡嗪3 mmol及对应醛1 mmol溶于20-40 mL干燥四氢呋喃后，加入叔丁醇钾 4 mmol，80℃加热回流2小时，旋蒸除去溶剂；加入20 mL水析出固体，抽滤后将所得固体进行柱层析分离得到如式（Ⅰ）所示的化合物。

本发明也提供前述式（Ⅱ）所示化合物的制备方法。具体如下：通过Knoevenagel缩合反应合成目标化合物：取2-甲基喹喔啉2 mmol及对应醛1 mmol溶于10-30 mL 氢氧化钠溶液（5mol/L），加入Aliquat 336（0.1 mmol），100℃加热回流8-15小时，冷却，过滤，将所得固体进行柱层析分离得到如式（Ⅱ）所示的化合物。

本发明进一步提供一种药物组合物，所述组合物包括式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示的化合物与药学上可接受的盐、前药或载体组成的制剂。“药学上可接受的载体”包括各种赋形剂和稀释剂。本发明所述的在组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、生理盐水、甘油和乙醇等。

本发明式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示的化合物可有效荧光标记转基因小鼠和人脑中的Aβ斑块和神经纤维缠结，且该类化合物与Aβ斑块结合后发射波长蓝移、与神经纤维缠结结合后发射波长红移，因此通过单个化合物的多光谱成像即可实现β-淀粉样斑块和神经纤维缠结的同步实时检测。

本发明进一步提供式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示的化合物在制备检测或显像动物或人体组织内的β-淀粉样斑块或神经纤维缠结的药物或其药物有效成分中的应用。在应用过程中，将可检测量的式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示的化合物通过本领域技术人员公知的方法给药至动物或人体组织内。在本发明的优选实施方案中，以可检测量的式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示的化合物引入动物或人体内并且在足以使化合物与β-淀粉样斑块或神经纤维缠结结合的时间之后，非创伤性地检测化合物。在本发明的另一实施方案中，将式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示的化合物引入动物或人体内，经足量的时间以使化合物与β-淀粉样斑块或神经纤维缠结结合，取组织样品，并脱离动物或人体检测组织中的化合物。在本发明的第三个实施方案中，自动物或人体取组织样品并且将式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示的化合物引入该组织样品。在足以使该化合物结合至β-淀粉样斑块或神经纤维缠结的时间之后，检测化合物。

本发明所述的显像手段为光学显像或光声显像，包括但不限于荧光显微技术、激光共聚焦显微技术、多光子显微技术、光学投影断层扫描技术（OPT）、光片照明显微技术（SPIM）、荧光成像系统、介观荧光断层扫描技术、荧光分子断层扫描成像技术（FMT）、多模态成像系统（荧光成像结合X射线/CT/MRI）、光声成像系统、多光谱光声断层成像（MSOT）等。

本发明所述淀粉样蛋白沉积疾病或神经纤维缠结疾病包括但不限于阿尔茨海默病、淀粉样脑血管病、淀粉样蛋白多发性神经病、全身性老年淀粉样蛋白病、淀粉样蛋白心肌病、具有淀粉样变的遗传性脑出血、克雅氏病、Ⅱ型糖尿病胰岛瘤、额颞叶痴呆、匹克氏病、缠结为主型痴呆、进行性核上麻痹（PSP）、皮质综合征（CBS）、慢性创伤性脑病变（CTE）、神经节神经胶质瘤等。

本发明提供了一类基于推拉电子结构的与Aβ斑块和神经纤维缠结具有高亲和力的荧光化合物。体外荧光染色实验表明，该类化合物能够清楚地与转基因小鼠脑切片和患病人脑组织切片的Aβ斑块和神经纤维缠结结合，发射波长移动且荧光强度显著增强；正常小鼠体内分布实验结果显示该类化合物具有良好的入脑能力并能从脑内快速清除。因此，该类化合物具有成为阿尔茨海默病等β-淀粉样蛋白沉积疾病或神经纤维缠结疾病的新型显像剂和诊断药物的巨大潜力。

附图说明

图1为本发明式（Ⅰ）及式（Ⅱ）化合物合成过程示意图

图2为PB-1和QB-1分别对APP/PS1转基因小鼠脑切片荧光染色标记结果。其中右图为硫磺素S（ThS）对相邻鼠脑切片的染色结果。

图3为PB-1对AD患者脑切片荧光染色标记结果。其中图A、B、C分别为PB-1染色后同一位置在紫光、绿光、红光波段下的染色结果：Arrow head所指处为PB-1荧光标记的神经纤维缠结，arrow所指处为PB-1荧光标记的Aβ斑块；图D为同一位置的免疫染色结果。

图4为PB-1与Aβ_1-42聚集体混合前后的荧光发射光谱。

具体实施方式

以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于所述实施例。常见的且对本领域技术人员而言显而易见的各种条件和参数的其他适当的修饰和改变处于本发明的精神和范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟识的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例一：式（Ⅰ）所示的化合物的合成

本发明式（Ⅰ）所示的化合物的合成路径如图1所示。

合成PB-1

将2-甲基吡嗪 （282.3 mg， 3 mmol）与4-N，N二甲氨基肉桂醛（175.4 mg，1 mmol）溶于20 mL干燥四氢呋喃，加入叔丁醇钾 （448.8 mg，4 mmol），80℃加热回流2小时，旋蒸除去溶剂；加入20 mL水析出固体，抽滤后将所得固体进行柱层析分离，得到105.8 mg PB-1，产率42.1%。结构如下: ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃)：δ 8.50 (s, 1H), 8.47 (s, 1H), 8.30(s, 1H), 7.51 (dt, J = 36.4, 18.2 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.83 (d,J = 7.0 Hz, 1H),6.81 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 6.70 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 6.61 (s,1H), 6.58 (s, 1H), 3.00 (s, 6H)。

实施例二：式（Ⅱ）所示的化合物的合成

本发明式（Ⅱ）所示的化合物的合成路径如图1所示。

合成QB-1

取2-甲基喹喔啉（288 mg， 2 mmol）及4-N，N二甲氨基肉桂醛（175.4 mg，1 mmol）溶于15 mL 氢氧化钠溶液（5mol/L），加入Aliquat 336（43 mg，0.1 mmol），100℃加热回流10小时，冷却，过滤，将所得固体进行柱层析分离得到91.0 mg QB-1，产率30.2%。结构如下:¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃)：δ 8.90 (s, 1H), 8.03-7.99 (m, 1H), 7.73-7.63 (m, 4H),7.40 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.89 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 6.81 (d, 1H, J = 15.6Hz), 6.70 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 3.02 (s, 6H)。

实施例三：光学参数的测定

1.最大吸收波长与摩尔吸收系数的测定

以二氯甲烷为溶剂，分别配制一定浓度梯度的化合物，如1、5、10、20、25 μM的溶液，用紫外-可见分光光度计扫描紫外吸收光谱，记录最大吸收波长（λ_abs）和吸光度，并计算摩尔吸收系数ε（M^-1 cm^-1）。本发明实施例中的部分化合物的最大吸收波长与摩尔吸收系数见表1。

2.荧光激发波长与荧光发射波长的测定

本发明中的化合物具有良好的荧光性质。为了考察本发明中的化合物的荧光性质，具体实施步骤为：精密称取本发明中的化合物适量，溶于二氯甲烷，并用二氯甲烷稀释至1 μmol·L^-1。应用荧光分光光度计进行荧光检测。固定激发/发射波长并400-750 nm连续扫描发射/激发波长，绘制波行图像。本发明实施例中的部分化合物的最大激发波长（λ_ex）与最大发射波长（λ_em）见表1。

表1 实施例中的部分化合物的光学性质

实施例四：体外荧光染色实验

1.小鼠脑切片的荧光染色

本发明中的化合物能够清晰染色转基因小鼠脑切片上的Aβ斑块，并有效地荧光标记Aβ斑块。为了考察对Aβ斑块的标记能力，具体实施步骤为：配制浓度为1μmol·L^-1的本发明中的化合物，分别滴加覆盖APP/PS1转基因小鼠(26月龄)脑切片(10μm)，室温培育10分钟；切片按40％乙醇(2分钟)、40％乙醇(2分钟)、纯水(30秒)的顺序进行漂洗，风干后应用荧光显微镜观察。邻接切片用硫磺素染色以确认Aβ斑块位置。本发明中的化合物染色荧光斑点与邻接切片的荧光斑点位置一致，能够选择性结合Aβ斑块，并有效地荧光标记Aβ斑块。其中，本发明实施例中的部分化合物的染色结果如图2。

2.AD患者脑切片的荧光染色

本发明中的化合物能够清晰有效地荧光标记AD患者脑切片上的神经纤维缠结。具体实施步骤为：配制浓度为1 μmol·L^-1的本发明中的化合物，分别滴加覆盖AD患者脑切片（5 μm），室温培育15分钟；切片按40%乙醇（1分钟）、40%乙醇（1分钟）、纯水（30 秒）的顺序进行漂洗，风干后应用荧光显微镜观察。同一切片用磷酸化Tau蛋白特异抗体（AT-8）和DAB染色剂通过免疫染色确认神经纤维缠结。本发明实施例中的部分化合物的染色结果如图3。本发明中的化合物PB-1在红光波段能够清晰有效地荧光标记神经纤维缠结（arrow head）而不显示Aβ斑块荧光，在紫光波段能够清晰有效地荧光标记Aβ斑块（arrow）而不显示神经纤维缠结荧光；因此通过PB-1在不同波段的多光谱显像，可实现同时特异性区分检测神经纤维缠结和Aβ斑块。

实施例五：Aβ_1-42聚集体混合后的化合物荧光光谱

本发明中的化合物与Aβ聚集体结合后具有荧光增强的性质。为了考察本发明中的化合物与Aβ混合后的荧光光谱行为的变化，具体实施步骤为：精密称取本发明中的化合物适量，溶于乙醇，并用PBS稀释至1 μmol·L^-1。应用荧光分光光度计进行荧光检测。固定激发/发射波长并400-750 nm连续扫描发射/激发波长，绘制波行图像。选用Aβ_1-42蛋白在37℃水浴中培育Aβ聚集体，用于模拟人脑内的Aβ聚集体。将化合物（1 μmol·L^-1）与Aβ_1-42聚集体（2.75 μmol·L^-1）混合，应用荧光分光光度计进行荧光检测。固定激发/发射波长并400-750nm连续扫描发射/激发波长，绘制波行图像。本发明中的化合物与Aβ聚集体结合后具有荧光增强的性质。其中，本发明实施例中的化合物与Aβ_1-42聚集体混合前后的荧光光谱行为见图4。化合物PB-1与Aβ_1-42聚集体混合后的荧光强度显著增强，为化合物自身荧光强度的76倍。

实施例六：正常小鼠脑内摄取与清除实验

本发明中的化合物能够快速有效地穿过血脑屏障入脑，并具有良好的初始摄取量和清除速率。具体实施步骤为：取本发明中的化合物（2.0 mg/kg，含20%二甲亚砜和80%丙二醇），经尾静脉注射入正常小鼠（n = 5）体内，分别于注射后2、10、30以及60 min时断头取脑。脑组织称重、匀浆，并用乙腈1 mL×3次提取，低温高速离心（10000 r，4℃）5 min，取上层清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，注入HPLC仪分析并计算% injected dose per gram (%ID/g)。本发明实施例中的部分化合物的HPLC分析条件见表2。本发明实施例中的部分化合物的分析结果见表3。本发明中的化合物能够快速穿过血脑屏障进入脑内（注射后2 min即已入脑），且具有良好的脑初始摄取量和清除速率。

表2 HPLC分析条件

表3 HPLC分析结果

Claims (10)

1.一种荧光标记β-淀粉样斑块和神经纤维缠结的化合物，其特征在于，所述化合物结构如式(Ⅰ)所示：

其中，n为1、2或3。

2.根据权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，通过Knoevenagel缩合反应合成目标化合物：取2-甲基吡嗪3mmol及对应醛1mmol溶于20-40mL干燥四氢呋喃后，加入叔丁醇钾4mmol，80℃加热回流2小时，旋蒸除去溶剂；加入20mL水析出固体，抽滤后将所得固体进行柱层析分离得到如式(Ⅰ)所示的化合物。

3.一种药物组合物，其特征在于，由权利要求1中所述如式(Ⅰ)所示的化合物及其药学上可接受的盐与载体组成的制剂。

4.权利要求1所述的化合物在制备检测或显像动物或人体组织内的β-淀粉样斑块或神经纤维缠结的药物或其药物有效成分中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的药物为光学显像技术或光声显像技术药物。

6.一种荧光标记β-淀粉样斑块和神经纤维缠结的化合物，其结构如式(Ⅱ)所示：

其中，n为1、2或3。

7.根据权利要求6所述化合物的制备方法，其特征在于，通过Knoevenagel缩合反应合成目标化合物：取2-甲基喹喔啉2mmol及对应醛1mmol溶于10-30mL、5mol/L氢氧化钠溶液，加入0.1mmol甲基三辛基氯化铵，100℃加热回流8-15小时，冷却，过滤，将所得固体进行柱层析分离得到如式(Ⅱ)所示的化合物。

8.一种药物组合物，其特征在于，由权利要求6中所述如式(Ⅱ)所示的化合物及其药学上可接受的盐与载体组成的制剂。

9.权利要求6所述的化合物在制备检测或显像动物或人体组织内的β-淀粉样斑块或神经纤维缠结的药物或其药物有效成分中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的药物为光学显像技术或光声显像技术药物。