CN105980554B - 通过减少糖化得到的稳定酶 - Google Patents

Abstract

本教导内容提供了具有由减少的糖化引起的提高的稳定性的酶。糖化减少可以通过多种方式实现，所述方式包括蛋白质工程、加热以除去背景淀粉水解活性、渗滤和多种配制方案，所述配制方案包括不包含问题性糖和包含抗性淀粉。

Description

通过减少糖化得到的稳定酶

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年11月14日提交的美国临时专利申请号USSN61/904,378和2013年12月19日提交的美国临时专利申请号USSN61/918,396优先权权益，上述专利的内容全文以引用方式并入本文中。

发明领域

本公开涉及改进的酶和酶制剂。

发明背景

活性剂(诸如酶)在洗涤剂、食品和动物饲料中的应用已经变成一项常见的实践。在这些工业中持续需要在遭受苛刻条件以后保持活性的稳定酶颗粒。

避免在工业过程中不可逆地灭活酶或降低酶活性的问题的方法包括，鉴定酶的新来源(例如鉴定极端嗜热微生物中的已知酶)，或鉴定使已知酶稳定的方式。Klibanov,1983(Stabilization of Enzymes against Thermal Inactivation,Advances in AppliedMicrobiology，第29卷，第1-28页)公开了存在三种用于使酶稳定的基本方式：(1)固定化，(2)化学修饰，和(3)包含添加剂。尽管以前的制剂方法已经在该领域中取得了一些进步(参见例如WO9854980、WO9739116、WO2007044968和EP1996028)，本教导内容通过认识到对于某些酶而言减少的糖化可以提高酶稳定性，在克服这些问题中的一些问题的方面做出了一个额外进步。

为了易于参考，我们已经在一个或多个标题下面描述了本教导内容的要素。应当指出，在每个标题下面的教导也适用于在其它标题下面的教导。例如，每个阐述的关于本教导内容的应用的实施方案和方面同样是关于本教导内容的方法或本教导内容的组合物的一个实施方案或方面。同样地，每个阐述的关于本教导内容的方法或应用的实施方案和方面同样是关于本教导内容的组合物的一个实施方案或方面。

在本文中引用的所有专利、专利申请、出版物、文件和文章都全文以引用方式并入本文中。

发明内容

本教导内容提供了改进的酶、配制的酶和制备它们的方法。

附图简述

图1A-B示出了根据本教导内容的示例性数据。

图2A-D示出了根据本教导内容的示例性数据。

图3示出了根据本教导内容的示例性数据。

图4示出了根据本教导内容的示例性数据。

图5示出了根据本教导内容的示例性数据。

图6示出了根据本教导内容的示例性数据。

图7A-B示出了根据本教导内容的示例性数据。

图8示出了根据本教导内容的示例性数据。

图9示出了根据本教导内容的示例性数据。

图10示出了根据本教导内容的示例性数据。

图11示出了根据本教导内容的示例性数据。

图12示出了根据本教导内容的示例性数据。

图13示出了根据本教导内容的示例性数据。

图14示出了根据本教导内容的示例性数据。

图15A-B示出了根据本教导内容的示例性数据。

图16A-B示出了根据本教导内容的示例性数据。

图17示出了根据本教导内容的示例性数据。

图18A-C示出了根据本教导内容的示例性数据。

图19示出了根据本教导内容的示例性数据。

图20示出了根据本教导内容的示例性数据。

详细描述

除非另有说明，否则本教导内容的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和动物饲料造粒的常规技术，它们是在本领域的技能内。此类技术在文献中进行了充分解释，例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版(Sambrook等人，1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑，1984；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑，1994)；PCR:ThePolymerase ChainReaction(Mullis等人编辑，1994)；Gene Transfer and Expression:A LaboratoryManual(Kriegler,1990)和Fairfield,D.1994.第10章，Pelleting CostCenter.In Feed Manufacturing Technology IV.(McEllhiney编辑)，American FeedIndustry Association,Arlington,Va.，第110-139页。

除非在本文中另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有本教导内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton，等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，第2版，John Wiley and Sons,New York(1994)，以及Hale和Markham,The Harper Collins Dictionary of Biology,Harper Perennial,NY(1991)给技术人员提供了在本发明中使用的许多术语的一般词典。与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可以用于实践或试验本教导内容。

本文提供的数字范围包括限定所述范围的数字。

定义

如本文所用，术语“颗粒”是指含有芯、活性剂和至少一个包衣层的颗粒。

如本文所用，术语“芯”表示颗粒的内核。本教导内容的芯可以通过多种制造技术来生产，所述技术包括：旋转雾化、湿法制粒、干法制粒、喷雾干燥、圆盘制粒、挤出、锅包衣、滚圆、转鼓制粒、流化床凝聚、高剪切制粒、流化床喷雾涂布、结晶、沉淀、乳液胶凝、旋转圆盘雾化和其它浇铸方法，以及造粒方法。此类方法是本领域已知的，并描述于美国专利4689297和美国专利5324649(流化床加工)；EP656058B1和美国专利454332(挤出方法)；美国专利6248706(高剪切制粒)；和EP804532B1和美国专利6534466(利用流化床芯和混合器包衣的联合方法)。

芯可包含酶，所述酶可以包被在种子周围或可以不包被在种子周围。适用于本教导内容的芯优选地为可水合的或多孔的材料(即，可分散或可溶解于水的材料)，所述材料是饲料级材料。芯材料可以分散于水中(当水合时分解)或通过进入真正的水性溶液而溶解于水中。粘土(例如，页硅酸盐膨润土、高岭土、蒙脱石、锂蒙脱石、皂石、贝得石、绿坡缕石和硅镁石)、硅酸盐诸如砂(硅酸钠)、nonpareils和附聚的马铃薯淀粉或面粉、或其它淀粉颗粒源(诸如小麦和玉米轴)被认为是可分散的。(Nonpareils是由晶种制成的球形颗粒，通过在旋转球形容器中使粉末和溶质的层结合至所述晶种，所述晶种已经构建并且滚圆成球形形状。Nonpareils通常由糖(诸如蔗糖)和粉末(诸如玉米淀粉)的组合制成)。在本教导内容的一个实施方案中，所述芯包含氯化钠或硫酸钠晶体，也被称作种子，或其它无机盐晶体。在本教导内容的另一个实施方案中，所述芯包含蔗糖晶种。由无机盐和/或糖和/或小有机分子组成的颗粒可以用作本教导内容的芯。适于掺入芯中的水溶性成分包括：无机盐诸如氯化钠、硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、硫酸锌；或脲、柠檬酸、糖诸如蔗糖、乳糖等。本教导内容的芯还可以包含以下中的一种或多种：附加的活性剂、饲料或食品级的聚合物、填料、增塑剂、纤维材料、增量剂和已知用于芯中的其它化合物。合适的聚合物包括聚乙烯醇(PVA)(包括部分水解的和完全水解的PVA)、聚乙二醇、聚氧化乙烯、聚乙烯基吡咯烷和碳水化合物聚合物(诸如淀粉、直链淀粉、支链淀粉、α和β-葡聚糖、果胶、糖原)，包括它们的混合物和衍生物。可用于芯中的合适填料包括用于增加体积和降低成本的惰性材料，或用于调节最终颗粒中的预期酶活性的目的的惰性材料。此类填料的示例包括但不限于，水溶性试剂诸如盐、糖、和水分散性试剂诸如粘土、滑石粉、硅酸盐、纤维素和淀粉，以及纤维素和淀粉的衍生物。可用于本教导内容的芯中的合适增塑剂是低分子量有机化合物，并且对被塑化的聚合物是高度特异性的。示例包括但不限于，糖(诸如，葡萄糖、果糖和蔗糖)，糖醇(诸如，山梨醇、木糖醇和麦芽糖醇和其它二醇类)，极性低分子量有机化合物诸如脲，或其它已知的增塑剂诸如水或饲料级增塑剂。可用于本教导内容的芯中的合适纤维材料包括但不限于，纤维素，和纤维素衍生物诸如HPMC(羟基-丙基-甲基纤维素)，CMC(羧基-甲基纤维素)，HEC(羟基-乙基纤维素)。在另一个特别适用于家庭清洁应用的实施方案中，所述芯包含水溶性的或水分散性的糖或盐晶体或nonpareil。本领域技术人员将认识到，对于饲料和食品应用而言，所述芯(以及任何聚合物、填料、增塑剂、纤维材料和增量剂)是食品和/或饲料应用可接受的。对于家庭清洁应用而言，不需要施加这样的限制。

如本领域技术人员容易判定的，根据本教导内容可以使用易受问题性糖化影响的任何酶，并且酶的非限制性列表可以包括植酸酶、木聚糖酶、α-葡聚糖酶、磷酸酶、蛋白酶、淀粉酶(α或β或葡糖淀粉酶)、纤维素酶、脂肪酶、角质酶、氧化酶、转移酶、还原酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、酯酶、异构酶、果胶酶、乳糖酶、过氧化物酶、漆酶、其它氧化还原酶及其混合物。特别优选的酶可以包括来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的木聚糖酶和来自里氏木霉的变体木聚糖酶，二者均可得自DuPont Industrial Biosciences，或在EP1222256B1中描述的固有地热稳定的木聚糖酶，以及来自以下微生物的其它木聚糖酶：黑曲霉(Aspergillus niger)、白曲霉(Aspergillus kawachii)、塔宾曲霉(Aspergillustubigensis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、浅青紫链霉菌(Neocallimastix patriciarum)、青霉属(Penicillium)种、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、热紫链霉菌(Streptomycesthermoviolaceus)、褐色高温单孢菌(Thermomonospora fusca)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、绿色木霉(Trichoderma viride)。另外的酶可以包括植酸酶，诸如例如

一种来自曲霉菌属种(Aspergillus sp.)的植酸酶，可得自AB Enzymes(Darmstadt,Germany)；Phyzyme^TMXP，一种来自大肠杆菌的植酸酶，可得自DuPont Nutrition and Health，以及来自例如以下生物体的其它植酸酶：木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、镰孢菌属(Fusarium)、布丘氏菌属(Buttiauxella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、青霉属(Penicillium)、腐质霉属(Humicola)、芽孢杆菌属(Bacillus)和隔孢伏革菌属(Peniophora)，以及均在2012年2月12日提交的美国专利申请61/595,923和61/595,941中描述的那些植酸酶。潜在纤维素酶的一个示例是

BGL，一种可得自DuPont IndustrialBiosciences的纤维素酶(β葡聚糖酶)，以及来自诸如以下物种的其它纤维素酶：曲霉菌属(Aspergillus)、木霉属、青霉属、腐质霉属、芽孢杆菌属、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、青霉属、高温单孢菌属(Thermomonospora)、梭菌属(Clostridium)和肉座菌属(Hypocrea)。也可以使用US20060193897A1中描述的纤维素酶和内切葡聚糖酶。用于本发明的可商购获得的纤维素酶包括但不限于，

(Novozymes)和KAC-500(B)^TM(KaoCorporation)。淀粉酶可以例如来自诸如以下物种：曲霉菌属、木霉属、青霉属、芽孢杆菌属例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。可能合适的真菌淀粉酶来源于曲霉菌属，诸如米曲霉(A.oryzae)和黑曲霉(A.niger)。可用于本发明的可商购获得的淀粉酶包括但不限于，

STAINZYME

STAINZYME

和BAN^TM(Novozymes)、以及POWERASE^TM、

和

P(Genencor)。蛋白酶可以来自解淀粉芽孢杆菌(amyloliquefaciens)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，以及曲霉菌属和木霉属种。植酸酶、木聚糖酶、磷酸酶、蛋白酶、淀粉酶、酯酶、氧化还原酶、脂肪酶、转移酶、纤维素酶和β-葡聚糖酶是经常用于包含在动物饲料中的酶，且可以应用在本教导内容中。合适的蛋白酶可以包括动物、植物或微生物来源的那些。在一些实施方案中，可以使用微生物蛋白酶。在一些实施方案中，可以包括化学或遗传修饰的突变体。在一些实施方案中，所述蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶-样蛋白酶。碱性蛋白酶的示例可以包括枯草杆菌蛋白酶，特别是来源于芽孢杆菌属的那些(例如，枯草杆菌蛋白酶、lentus、amyloliquefaciens、枯草菌溶素、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168)。其它示例可以包括在美国专利RE 34,606、5,955,340、5,700,676、6,312,936和6,482,628(这些专利均以引用方式并入本文)中描述的那些突变体蛋白酶。另外的蛋白酶示例可以包括但不限于，胰蛋白酶(例如，猪或牛来源)，和在WO 89/06270中描述的镰孢菌属蛋白酶。在一些实施方案中，可以用于本发明的可商购获得的蛋白酶包括但不限于，

MAXACAL^TM、MAXAPEM^TM、

OXP、PURAMAX^TM、EXCELLASE^TM和PURAFAST^TM(Genencor)；

DURAZYM^TM、

(Novozymes)；BLAP^TM和BLAP^TM变体(Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien,Duesseldorf,Germany)和KAP(B.alkalophilus subtilisin；Kao Corp.,Tokyo,Japan)。各种蛋白酶描述于WO95/23221、WO 92/21760、WO 09/149200、WO 09/149144、WO 09/149145、WO 11/072099、WO 10/056640、WO 10/056653、WO 11/140364、WO 12/151534、美国专利公开2008/0090747和美国专利5,801,039、5,340,735、5,500,364、5,855,625、US RE 34,606、5,955,340、5,700,676、6,312,936和6,482,628以及多篇其它专利中。在一些其它的实施方案中，金属蛋白酶可以用于本发明，包括但不限于在WO 07/044993中描述的中性金属蛋白酶。适合用于包含在家庭护理应用所用的洗涤剂中的潜在酶是类似的，具体地是蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、半纤维素酶、氧化还原酶、过氧化物酶、甘露聚糖酶、果胶酶、聚酯酶、转移酶和纤维素酶。在本教导内容的某些方面，所述酶可以选自植酸酶、木聚糖酶、β葡聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、酯酶、以及它们的混合物。在本发明的一个实施方案中，在颗粒中提供两种酶：木聚糖酶和β-葡聚糖酶。所述酶可以混合在一起，或分别施用于颗粒。在另一个实施方案中，在颗粒中提供三种酶，即β-葡聚糖酶、木聚糖酶和植酸酶。在一些实施方案中，所述颗粒可以与其它颗粒、助洗剂、表面活性剂和其它材料组合。上面的酶列表仅仅是示例，且无意成为排他性的。在本发明中可以使用易受问题性糖化影响的任何酶，包括细菌、真菌、酵母、植物、昆虫和动物来源的野生型、重组体和变体酶，以及酸性、中性或碱性酶。

如本文所用，术语“酶基质”是指由发酵产生的回收的酶，且可以包括另外的组分作为加工助剂，包括例如粘结剂(例如PVA)、消泡剂、表面活性剂(例如lutensol)、淀粉和糖。

术语“包衣层”和“层”在本文中可互换使用。第一包衣层通常包裹芯以便形成基本上连续的层，使得芯表面具有几个未包被的区域或没有未包被的区域。随后的包衣层可以包裹生长中的颗粒以形成一个或多个另外的基本上连续的层。因此，如本文所用，“另外的层”是指施加于颗粒的一个或多个包衣，且可以含有本领域的普通技术人员容易得到的多种材料中的任一种，包括在“芯”下面描述的那些材料，以及可以在相关技术中找到，所述相关技术包括美国专利7,018,821、美国专利8,076,113、美国专利4,106,991、美国专利4,689,297和美国专利4,740,469。

如本文所用，术语“抗性淀粉”是指这样的淀粉：其已经经过改性以减少当用葡糖淀粉酶处理时葡萄糖的产生。具体地，如果当将2％w/w的目标淀粉与里氏木霉野生型葡糖淀粉酶一起在50mM NaOAC(pH 4.5)中在25℃温育40分钟时产生小于0.2mM葡萄糖(通过使用葡萄糖校正曲线用BCA方法测量总还原端)，本文中使用的淀粉将被视为“抗性淀粉”。

如本文所用，术语“易受问题性糖化影响的酶”是指当进行下述测定时显示出相对于对照的至少20％活性下降的酶。得到酶溶液，向它加入1％w/w葡萄糖，将所得的混合物冻干，并将所得的干燥的固体暴露于50℃/70％RH保持5天，再溶解，并测量该样品的活性并且与暴露于50℃/70％RH、但是没有添加葡萄糖的对照样品进行对比。如果添加了葡萄糖的酶与对照相比丧失了超过20％活性，则它是“易受问题性糖化影响的”。在一些实施方案中，产生至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％下降。

如本文所用，术语“问题性糖”通常是指葡萄糖、果糖和蔗糖。

如本文所用，术语“可糖化的氨基酸残基”是指蛋白中易于经历糖的共价添加的氨基酸。示例包括赖氨酸和精氨酸，但是应当理解，其它非天然存在的氨基酸(如果存在于蛋白中且易于经历糖的共价添加)将落入本教导内容的范围内。

如本文所用，术语“一个渗透体积(diavolume)”等于与在连续渗滤或透析过程中在添加淡水或缓冲液的同时保持在恒定体积的等体积的渗余物相比回收的滤液的量。

如本文所用，术语“序列同一性百分比”是指，当使用具有默认参数的CLUSTAL W算法比对时，至少具有特定百分比的与目标蛋白相同的氨基酸残基的变体。参见Thompson等人(1994)Nucleic Acids Res.22:4673-4680。CLUSTAL W算法的默认参数是：

将缺失计数为与参照序列相比不相同的残基。包括发生在任一个末端处的缺失。例如，具有成熟多肽612个残基分子的C-端的6个氨基酸缺失的变体相对于成熟多肽具有99％(606/612相同残基×100，四舍五入至最接近的整数)的序列同一性百分比。这样的变体将被与目标蛋白具有“至少99％序列同一性”的变体包括。

示例性实施方案

在本教导内容的一个示例性实施方案中，鉴定出了易受问题性糖化影响的酶。此后，制备所述酶从而确保糖化与在没有这样的保证下制备的酶相比减少，从而提高与其相比的酶稳定性。可以采取多种方案从而确保糖化减少，如在本发明的实施例中提供的和在包含的权利要求中讨论的，且包括渗滤、工程除去问题性氨基酸残基、加热以灭活从发酵剩下的问题性酶、在没有问题性糖存在下配制、使用抗性淀粉配制和它们的组合。

在一些实施方案中，本教导内容提供了一种提高酶稳定性的方法，所述方法包括：在发酵中制备酶，其中所述发酵包含含有问题性糖和可水解淀粉的发酵介质，并且其中所述酶包含至少一个可糖化的氨基酸残基且是易受问题性糖化影响的酶；回收所述酶；以及，除去足够量的问题性糖以与缺乏所述除去的类似地发酵的酶相比提高酶稳定性。

在一些实施方案中，所述除去包括渗滤超滤液浓缩物以除去问题性糖从而形成酶浓缩物。在一些实施方案中，所述渗滤包括至少两个、至少三个或至少四个渗透体积，使得所述酶浓缩物的糖含量降低至小于0.1％w/w。在一些实施方案中，所述除去包括在50℃发酵以后将所述酶加热至少1、2、4、8或12小时以灭活任何存在的淀粉水解酶。在一些实施方案中，所述除去包括先前的遗传操作，其中从所述多肽除去至少一个活性部位赖氨酸残基。在一些实施方案中，所述活性赖氨酸残基是K131和/或K26，且所述酶是野生型布丘氏菌属(Buttauxella sp.)植酸酶，或与其90％、95％、97％、98％或99％相同的分子。在一些实施方案中，所述活性赖氨酸残基是K131和/或K26，且所述酶是BP17。

在一些实施方案中，本教导内容提供了一种酶颗粒，其包含小于0.1％、0.08％、0.06％、0.04％、或0.01％w/w的问题性糖。在一些实施方案中，所述酶存在于层中。在一些实施方案中，所述酶遍布于颗粒中。

在一些实施方案中，本教导内容提供了一种经工程改造的植酸酶，其中相对于野生型布丘氏菌属植酸酶在位置131和/或26处的氨基酸残基为非赖氨酸。在一些实施方案中，所述位置131残基是精氨酸。

在一些实施方案中，本教导内容提供了一种提高酶的稳定性的方法，所述方法包括：确定至少一个可糖化的氨基酸残基在酶中的存在；确定所述酶是否是易受问题性糖化影响；制备所述酶从而确保糖化与在没有这样的保证下制备的酶相比减少，从而与其相比提高酶稳定性。在一些实施方案中，所述确保包括突变至少一个赖氨酸残基。在一些实施方案中，所述确保包括用热处理所述酶。在一些实施方案中，所述确保包括将所述酶配制在包含抗性淀粉的颗粒中。在一些实施方案中，所述确保包括渗滤所述酶。在一些实施方案中，所述确保包括组合多个方案，例如，突变和热处理，或者，突变和与抗性淀粉一起配制，或者，突变和渗滤，或者，热处理和渗滤，或者，突变和渗滤，或者，突变和热处理和渗滤，或者，以实践常规组合逻辑的本领域普通技术人员将明白的其它组合。

在一些实施方案中，本教导内容提供了一种酶颗粒，其包含易受问题性糖化影响的酶和抗性淀粉。在一些实施方案中，所述酶颗粒包含：a)硫酸钠种子，b)酶层，其包含易受问题性糖化影响的酶、抗性淀粉、植酸钠和油菜籽油，c)硫酸钠层，和，d)外层，其包含PVA和滑石。在一些实施方案中，存在于酶颗粒中的酶是植酸酶。在一些实施方案中，所述酶是野生型布丘氏菌属(Buttauxella sp.)。在一些实施方案中，所述酶是BP17，或与其90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述酶是纤维素酶。在一些实施方案中，所述酶是本文中举例说明的纤维素酶，或与其90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列。

本教导内容的酶和组合物将用于多个领域中的任一个，所述领域包括谷物和淀粉加工(例如-淀粉酶和葡糖淀粉酶)、织物和家庭护理(例如-蛋白酶)、生物质加工(例如-纤维素酶)、动物饲料(例如-植酸酶)。这些和其它应用领域和蛋白是本领域技术人员将会明白的，且通常不是本教导内容的限制。

本教导内容的酶可以配制为固体(例如-酶颗粒)或液体(例如-含有合适量的例如山梨醇和盐的液体)，或实际上呈本领域技术人员会认识到它们的适用性的任何形式。

通过参考以下实施例可以进一步理解本发明，所述实施例作为例证而提供，且无意成为限制性的。

实施例1

活性丧失数据

为了探究时间对植酸酶稳定性的影响，将BP17植酸酶表达和纯化以形成UFC。

BP17是布丘氏菌属(Buttauxella sp.)植酸酶的酶变体。BP17(不包括信号肽)的序列如下，且描述在PCT/US2013/0244415中。

SEQ ID NO:1

NDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGGFYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSIYVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPSLALMNTTLNFSKSPWCQKHSADKSCDLGLSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWALLLKLHNVYFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLNMRWTLPGQPDNTPPGGALVFERLADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ

在WO2004035070A1和US7713725B2中描述了包括BP17植酸酶在内的蛋白的发酵。发酵以后，使发酵物穿过旋转桶真空过滤单元(其可以用硅藻土预涂布)以从所述发酵物除去细胞。接着，如下浓缩无细胞的发酵物：使它穿过10,000分子量截止超滤膜从而除去足够的渗透物，直到最终的活性是在介于30,000FTU/g和80,000FTU/g之间。

回收的发酵浓缩物被称作“超滤的浓缩物”或UFC，且含有植酸酶蛋白以及在发酵过程中作为副产物产生的其它蛋白、肽、多糖和糖。将UFC与充当防腐剂的0.3％山梨酸钾和0.3％苯甲酸钠组合，然后将所述材料造粒。为了制备2000克批量的Axtra Phytase

将380g具有74,250单位/g的活性和25.6％的固体含量的植酸酶UFC与190g水、70.6g蔗糖、152.9g玉米淀粉、17.6g油菜籽油和11.8g植酸钠组合，并将该混合物喷雾到已经装入Vector VFC-1流化床制粒机中的722g硫酸钠种子上。对于该第一次喷雾涂布，入口温度是60℃，出口温度是40℃，喷雾速度是11g/min，雾化气压是38psi，且流态化空气速度是75cfm。接着，使用以下条件将870g硫酸钠溶解在2475g水中的溶液喷雾到颗粒上：入口温度是68℃，出口温度是47℃，喷雾速度是25g/min，雾化气压是38psi，且流态化空气速度是75cfm。通过在90℃将70.59g聚乙烯醇(Mowial

)与141g滑石一起溶解在965g水中保持30分钟，制备最终的包衣。使该溶液冷却回室温以后，使用以下条件将它喷雾到颗粒上：入口温度是70℃，出口温度是51℃，喷雾速度是11g/min，雾化气压是40psi，且流态化空气速度是75cfm。然后，将20克Axtra Phytase

酶颗粒样品置于200ml封闭的聚乙烯容器中在4℃、25℃和40℃保存12个月。在规律的时间间隔，在用0.25M乙酸钠缓冲液pH 5.5溶解以后通过磷酸对硝基苯酯(pNPP)测定和钒酸钼(Mo-V)测定确定植酸酶活性。在pNPP测定中，采用合成的底物磷酸对硝基苯酯。在用植酸酶去磷酸化和将反应混合物碱化以后，形成对硝基苯醚(para-nitrophenylate)阴离子，其在405nm吸收。在Mo-V测定中，使用植酸钠作为底物。植酸盐去磷酸化与在用酸性钒酸钼混合液处理后在415nm的吸光度相关。pNPP测定是一种通用磷酸酶测定，而Mo-V测定是对植酸酶特异性的。

pNPP测定可以如下在自动化的

机器人上执行。将所有样品在0.25M乙酸盐缓冲液pH 5.5(将30.02g三水合乙酸钠(或18.10g无水乙酸钠)、1.76g浓乙酸(＝1.677ml)和0.147g二水合物氯化钙稀释在900ml Milli-Q水中。用4M乙酸(22.9ml浓乙酸在100ml Milli-Q水中)或100％乙酸调至pH 5.5。加入1ml TWEEN 20，并用Milli-Q水将体积调至1000ml)。一旦将稀释的样品加载进Konelab中，将7μl样品与84μl pNPP底物溶液(磷酸-4-硝基苯酯(Npp)二(-三)盐(FW 461.4)(Sigma N-3254)，称量0.09228g磷酸-4-硝基苯酯并溶解在10mL测定缓冲液中)合并，并在30℃温育5分钟。接着，将105μl 200mM硼酸盐停止溶液(将6.183g硼酸溶解在400mL MilliQ水中。用1N NaOH调节pH至10.2。用适量MilliQ水补至500mL)加入样品和底物中以淬灭反应2分钟。读出在405nm的吸光度，并通过使用含有0、2.5、13.0和27.0FTU/g的植酸酶标准品的校正曲线转化成FTU/g的活性单位。

在图1A和1B中的图总结了TPT植酸酶在保存过程中遭受的活性损失。在25℃，颗粒在12个月中遭受30-70％Mo-V活性(植酸钠底物)损失。相同样品在相同时间段内在pNPP测定(合成底物)中没有损失活性。在40℃，TPT植酸酶在6个月中损失它的Mo-V活性的95-100％，且相同样品在6个月中仅损失它的pNPP活性的20-40％。

假定pNPP和Mo-V测定之间的差别活性损失是由于在植酸酶活性部位附近的赖氨酸残基的糖化，所述糖化会使底物特异性朝向较大的天然植酸底物改变，而不是朝向较小的合成的磷酸对硝基苯酯(pNPP)底物。

实施例2

美拉德反应和褐变

为了试验糖化的作用，如下视觉地监测美拉德褐变反应：将BP17 ETD植酸酶UFC的溶液沉积到一圈滤纸上，干燥所述酶，然后将所述酶置于50℃和70％相对湿度的环境室中保持5至12天。

图2A显示了对于两个不同批的酶UFC，在50℃和70％相对湿度保存5天的干燥的植酸酶喷雾1(由32％酶固体、41％玉米淀粉、19％蔗糖、3％植酸钠和5％油菜籽油组成)的黑变。图2B显示了一批具有不同水平的添加的葡萄糖的植酸酶UFC，其在25℃/40％RH和50℃/70％RH保存12天。可以看出，增加的葡萄糖水平会导致增加的褐变水平。

使用10K分子量截止膜过滤掉UFC的渗透物(其含有所有小于10K道尔顿的物质)，执行BP17ETD UFC的渗滤。在Amicon搅拌池(Amicon Model#8400)上执行渗滤，所述Amicon搅拌池配有在10K道尔顿分子量截止再生纤维素膜(Millipore目录号PLGC07610)的上面的10K道尔顿分子量截止聚醚砜膜(Sartorius No.14639—76-----D)。通过执行渗滤以产生渗透物中的起始UFC的原始体积的3倍(3个渗透体积)，从UFC除去所有还原糖(包括葡萄糖)的大约96％，从而极大地减小该UFC发生糖化或美拉德反应的趋势。在渗滤过程中除去的可渗透分子的百分比可以由下述公式描述：

{1-[e^(V*T)]^-1}×100

其中V是渗滤的渗透体积的数目，且T是穿过膜的传递系数。当我们假定T＝1(100％传递)且V＝3(3个渗透体积)时，那么渗滤的可渗透分子的百分比是1-e^-3)×100或95％。

图2C显示了在50℃和70％相对湿度保存7天以后渗滤BP17 ETD UFC对褐变反应的影响。可以看出，在穿过10K膜渗滤酶UFC 3个渗透体积以后，UFC几乎没有显示褐变。图2D显示了在50℃和70％相对湿度保存7天以后渗滤第二批BP17 ETD UFC对褐变反应的影响。可以看出，在穿过10K膜渗滤酶UFC 3个渗透体积以后，UFC几乎没有显示褐变。

实施例3

内荧光

随着蛋白经历美拉德反应，它们将形成糖化产物，所述产物经历进一步化学反应以形成荧光杂环产物。通过测量它们的荧光发射信号的强度，可以监测这些高级糖化产物的形成。称量大约0.15g颗粒，并与1.5ml稀释缓冲液(100mM NaOAc,pH 5.5)混合，并允许在室温溶解20min。所述颗粒包含大约37％的200-300μm芯(硫酸钠的种子)，所述芯被由以下物质组成的酶层包被：(A)2％聚乙烯醇(

5-88)、0.50％植酸钠和大约4％植酸酶固体，或者，(B)3％蔗糖、6.5％玉米淀粉、0.50％植酸钠和大约4％植酸酶固体。在酶层的顶部是40％的硫酸钠层，然后是由3％聚乙烯醇和6％滑石组成的最终包衣层。将样品在3000rpm离心10min，并穿过0.45um过滤器过滤。将Zeba脱盐旋转柱(10ml柱)用4×5ml 20mM硼酸钠缓冲液pH 8.5平衡。将1毫升样品与0.2ml硼酸盐缓冲液一起加入每个柱以辅助离心洗脱。然后将洗脱的样品加入微孔滴定板中，并使用335nm激发波长监测荧光波谱。

图3显示了从在4℃、25℃和37℃保存12个月的TPT颗粒提取的植酸酶在335nm的激发引起的荧光发射光谱。荧光的增加反映了保存温度。因为较高的保存温度加速糖化的速率，并且较高的糖化水平将导致较高的高级糖化终产物(AGE)水平，并且因为这些AGE的百分比负责内荧光，结论是，较高的内荧光水平也与植酸酶活性的损失相关，因为较高的植酸酶糖化水平与植酸酶活性损失直接相关。

实施例4

荧光胺测定

将在内荧光测量中使用的类似地处理的样品用在荧光胺测定中。将荧光胺直接用于测量植酸酶中的糖化的赖氨酸基团的水平。荧光胺与未修饰的(未糖化的)赖氨酸基团反应并在反应以后变得发荧光。

将荧光胺(8mg)与DMSO(50ml)混合以制备终浓度为0.16mg/ml的溶液。在96孔微孔滴定板上制备脱盐的样品的9个2倍系列稀释物。将75ul的样品量一式两份地转移至黑色荧光平板。将一组与18ul DMSO/荧光胺溶液组合，将另一组与18ul单独的DMSO组合。允许溶液在具有盖的振荡器平板上在室温下反应5分钟。在390nm激发样品，并在475nm监测发射。将没有荧光胺的荧光发射值从有荧光胺的荧光发射值减去，并绘图。图4表明，荧光发射强度随着植酸酶浓度而增加，但是随着温度升高而下降。后者提示糖化的赖氨酸基团随着保存温度升高而增加。

图5总结了温育温度对内荧光强度和荧光胺衍生的荧光强度的影响。在415nm的内荧光强度与美拉德产物的形成对应。在475nm的荧光胺衍生的荧光强度是由于游离氨基基团与荧光胺的反应，且因此代表美拉德产物的缺失。从上述实验得到数据，并绘制在同一个图上以说明美拉德产物如何随着温育温度(内荧光)增加，而游离赖氨酸减少(反映为减少的荧光胺衍生的信号)。图6示出了在不同温度温育的相同样品的测量活性。用孔雀石绿试剂执行活性测定，其将在620nm的吸光度与从植酸盐底物释放的磷酸盐相关联。图6所示的活性在高温下的减弱反映了图5所示的美拉德产物的增加。

实施例5

通过质谱法进行糖化分析

植酸酶的糖化的质谱法证据显示在图7A-B中。这些数据得自Asp-N内蛋白酶/糜蛋白酶和胰蛋白酶消化，针对赖氨酸残基上的己糖(即糖化)修饰进行数据库检索。对于Asp-N/糜蛋白酶消化，通过得到糖化肽相对于非糖化肽的比率，建立定量。重要的是注意到，定量数目仅仅是近似值，因为预期赖氨酸残基的糖化会降低它的电离效率。在时间0的AspN/糜蛋白酶消化中，植酸酶上的介于19％和54％之间的赖氨酸基团被糖化。在40℃保存6个月以后，所有赖氨酸的糖化百分比增加至介于67％和81％之间。还执行了胰蛋白酶消化，但是由于该酶在赖氨酸和精氨酸残基处切割的事实不能以相同方式定量。因此，通过标准化至内部标准肽，确定就胰蛋白酶消化而言相对于t＝0的修饰的增加倍数。在胰蛋白酶消化中，在几个赖氨酸上观察到的糖化增加最高达约110倍。

在图8中，突出显示了位置最靠近植酸酶的活性部位的两个赖氨酸K131和K270。不受理论的约束，假定正是在活性部位附近的一个、两个或其它赖氨酸的糖化负责植酸酶朝向它的天然底物植酸盐的活性的下降，同时保留几乎所有的它针对小得多的合成底物磷酸对硝基苯酯(pNPP)的活性。

实施例6

纯化的BP17ETD的冻干样品中的诱导糖化

通过高离子交换色谱法纯化2mg/ml的BP17ETD植酸酶，并与0-0.0625M葡萄糖或果糖溶液组合。将这些溶液冻干以产生干燥的固体，并将该冻干的物质在50℃和70％相对湿度温育6天以诱导植酸酶与添加的还原糖的糖化或美拉德反应。

图9显示了将0.0625M糖与植酸酶一起在50℃和70％相对湿度温育6天以后来自葡萄糖和果糖的诱导的糖化的影响。可以看出，对于葡萄糖而言，pNPP活性从5500FTU/ml下降至4500FTU/ml，而通过MG测定测量的对植酸盐的活性从4000FTU/ml下降至0FTU/ml。同样，对于果糖而言，活性从5200FTU/ml下降至2700FTU/ml(朝向pNPP)，和从4100FTU/ml下降至0FTU/ml(对于果糖)。如预期的，与非还原糖蔗糖一起的温育没有导致pNPP或植酸酶活性的任何显著损失。对于来自UFC的植酸酶，得到了类似的结果。

实施例7

热处理BP17ETD植酸酶UFC以除去背景活性

进行BP17ETD植酸酶UFC的热处理以除去背景蔗糖酶和葡糖淀粉酶活性，它们分别可以在保存期间从制剂中的蔗糖和淀粉产生葡萄糖。图10显示了热处理过程的一个实施例和测量的背景活性随着加热时间的对应下降。将植酸酶UFC在pH 4.0加热至50℃保持4-20小时，这会造成介于90％至95％的葡糖淀粉酶活性下降和约65％的蔗糖酶活性下降。蛋白酶活性也下降了90-95％，但是不认为该活性负责葡萄糖产生或植酸酶的糖化。

实施例8

加速的保存稳定性

图11显示了渗滤和热处理(50℃保持16小时)对冻干的UFC的保留活性的影响。用3kg植酸酶UFC进行渗滤。起始UFC具有4.0的pH和约2.7S/cm的电导率。将具有10kDa聚醚砜(PES)Millipore膜的Millipore单元用于该实验。将UFC以分批模式在10-15℃的温度渗滤3个渗透体积的生产用水。分批模式在这里是指这样的技术：其中将1个渗透体积的水加入在UFC的上前方，随后收集1个渗透体积的UF渗透物。将该过程重复3次，以便达到3个渗透体积的渗滤。在渗滤结束时，如果UFC的pH已经漂移>4.5，则使用20％乙酸将pH下调至4.0。

可以看出，渗滤和热处理都会提高干燥的植酸酶对它的天然底物植酸盐的保存稳定性(MG测定)，而仅热处理提高干燥的植酸酶对它的合成的pNPP底物的保存稳定性。这最可能是因为，渗滤主要除去葡萄糖和其它还原糖并因此阻止植酸酶的糖化。相反，热处理主要灭活背景酶蛋白酶、葡糖淀粉酶和蔗糖酶，且由于没有蔗糖或淀粉存在于这些UFC中，热处理主要阻止蛋白酶解，所述蛋白酶解影响对合成的和真实的底物的活性。

图12显示了在50℃和70％相对湿度保存的具有四种不同酶基质组成的颗粒的植酸酶活性剩余。所述颗粒在组成上类似于在实施例3中描述的那些。对于由酶基质中的3％蔗糖和6.5％玉米淀粉与未处理的酶浓缩物制成的颗粒，可以看出，在保存350小时以后仅剩余3％活性。当用2％PVA替换酶基质中的蔗糖和玉米淀粉、从而去掉葡萄糖产生的所有内部来源时，可以看出，保存350小时以后的活性现在增加至37％。类似地，当用热处理过的酶制备基于蔗糖/淀粉酶基质的颗粒、从而灭活酶基质中负责葡萄糖形成的酶时，350小时以后保留活性也增加，这次达到42％。最后，如果用酶基质中的2％PVA和热处理过的酶浓缩物制备颗粒，保存350小时以后的最终保留活性是82％。认为这是由于在热处理过程中发生的蛋白酶的灭活以及形成葡萄糖的蔗糖和淀粉底物的除去。

实施例9

DXST

图13显示了随着葡萄糖浓度而变化的各种冻干的纤维素酶UFC在50℃和70％RH的稳定性。在里氏木霉中表达DXST，它的序列提供在下面。

SEQ ID NO:2

MRSSPVLRTALAAALPLAALAADGKSTRYWDCCKPSCSWPGKASVNQPVFACSANFQRISDPNVKSGCDGGSAYACADQTPWAVNDNFSYGFAATSISGGNEASWCCGCYELTFTSGPVAGKTMVVQSTSTGGDLGTNHFDLAMPGGGVGIFDGCSPQFGGLAGDRYGGVSSRSQCDSFPAALKPGCYWRFDWFKNADNPTFTFRQVQCPSELVARTGCRRNDDGNFPVFTPPSGGQSSSSSSSSSAKPTSTSTSTTSTKATSTTSTASSQTSSSTGGGCAAQRWAQCGGIGFSGCTTCVSGTTCNKQNDWYSQCL

纤维素酶是一种来自Staphylotrichum coccosporumgi|197267671(短名称STCE1)的内-β-D-1,4-葡聚糖酶。可以看出，含有约0.01mg/ml的葡萄糖的初始UFC在431小时中显示出约30％的活性损失，而冻干的UFC在相同时间段内没有显示出活性损失。将葡萄糖加回冻干的UFC造成纤维素酶再次变得不稳定，从而造成在1mg/ml和更高的葡萄糖浓度在450小时中多达80％的活性损失。令人感兴趣的是，将0.01mg/ml的葡萄糖加回渗滤的UFC不会造成像含有0.01mg/ml的葡萄糖的初始UFC那样多的活性损失。这可以通过以下假设来解释：葡萄糖不可能是存在于初始UFC中的唯一还原糖。

图14显示了在50℃和70％RH保存431小时以后多种冻干的纤维素酶UFC(来自图13的类似地处理的样品)的内荧光。可以看出，初始纤维素酶UFC显示出内荧光的300％增加，而冻干的纤维素酶仅显示20％增加。添加了葡萄糖的渗滤的纤维素酶UFC显示出逐渐更大的内荧光水平，从而表明在添加的葡萄糖的最高水平下多达150％的内荧光增加。

不受理论的约束，假定在活性部位附近的赖氨酸(包括K25、K34、K42和K65)中的至少一个可能负责该损失。

实施例10-蛋白质工程研究

为了探究促成糖化和蛋白稳定性的特定赖氨酸氨基酸的作用，做出了蛋白质工程努力。使用WT和变体K131R和K26R执行该研究。基于以下来选择这些赖氨酸残基：(1)在其它植酸酶序列中，在这些位置是保守的(图15A)，(2)靠近底物结合位点，和(3)来自以前研究的植酸酶BP17的质谱分析的结果。

在图15A中考虑的蛋白的序列如下。

>HiPhos

SEQ ID NO:3

MSTFIIRLLFFSLLCGSFSIHAEEQNGMKLERVVIVSRHGVRAPTKFTPIMKNVTPDQWPQWDVPLGWLT

PRGGELVSELGQYQRLWFTSKGLLNNQTCPSPGQVAVIADTDQRTRKTGEAFLAGLAPKCQIQVHYQKDEEKNDPLFNPVKMGKCSFNTLQVKNAILERAGGNIELYTQRYQSSFRTLENVLNFSQSETCKTTEKSTKCTLPEALPSELKVTPDNVSLPGAWSLSSTLTEIFLLQEAQGMPQVAWGRITGEKEWRDLLSLHNAQFDLLQRTPEVARSRATPLLDMIDTALLTNGTTENRYGIKLPVSLLFIAGHDTNLANLSGALDLNWSLPGQPDNTPPGGELVFEKWKRTSDNTDWVQVSFVYQTLRDMRDIQPLSLEKPAGKVDLKLIACEEKNSQGMCSLKSFSRLIKEIRVPECAVTE

>Phyzyme

SEQ ID NO:4

QSEPELKLESVVIVSRHGVRAPTKATQLMQDVTPDAWPTWPVKLGWLTPRGGELIAYLGHYQRQRLVADGLLAKKGCPQSGQVAIIADVDERTRKTGEAFAAGLAPDCAITVHTQADTSSPDPLFNPLKTGVCQLDNANVTDAILSRAGGSIADFTGHRQTAFRELERVLNFPQSNLCLKREKQDESCSLTQALPSELKVSADNVSLTGAVSLASMLTEIFLLQQAQGMPEPGWGRITDSHQWNTLLSLHNAQFYLLQRTPEVARSRATPLLDLIMAALTPHPPQKQAYGVTLPTSVLFIAGHDTNLANLGGALELNWTLPGQPDNTPPGGELVFERWRRLSDNSQWIQVSLVFQTLQQMRDKTPLSLNTPPGEVKLTLAGCEERNAQGMCSLAGFTQIVNEARIPACSLRSHHHHHH

>BP17ETD

SEQ ID NO:5

MQTFGAFLVSFLAASGLAAANDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGGFYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSIYVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPSLALMNTTLNFSKSPWCQKHSADKSCDLGLSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWALLLKLHNVYFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLNMRWTLPGQPDNTPPGGALVFERLADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ

使用下述材料：在里氏木霉宿主中生产布丘氏菌属(Buttauxella sp.)植酸酶变体，并使用离子交换色谱法纯化；BP17/BP111Konelab Standard(22000FTU/g；密度＝1.07)；402.4mM葡萄糖水溶液；Zeba 7kDa截止脱盐板；磷酸对硝基苯酯；和，植酸盐/孔雀石绿试剂。

为了诱导美拉德反应，在几个浓度制备葡萄糖储备溶液：0、8、20和40mM。通过在PCR条中将50uL植酸酶变体(2mg/mL)与50uL葡萄糖溶液混合，开始反应。为4个时间点中的每一个准备PCR条。将样品冷冻，冻干，并置于40℃和70％相对湿度(RH)的培养箱中。将样品在0、58、100和237小时取出并在研究结束之前在-20℃保存。此后，将样品用100uL水再悬浮，并使用Zeba 7kDa截止脱盐板处理以除去多余的葡萄糖。

使用pNPP和IP6底物以及BP17酶标准品测定酶活性。pNPP测定依赖于在405nm吸收的对硝基苯醚离子的形成。IP6测定依赖于在620nm吸收的钼酸盐-磷酸盐复合物的孔雀石绿(MG)染色。

这些数据指示，贯穿在40℃和70％RH的应力试验的持续期间，未用葡萄糖处理的样品保留对IP6(图16A)和pNPP(未显示)底物的完整活性。

此外，对pNPP的活性的保留和对IP6的活性的损失指示由美拉德反应引起的赖氨酸糖化的程度。尽管在葡萄糖应力过程中保留了对pNPP的活性，除了K131R和在更低程度上的K26R以外，对IP6的活性在最初的时间点(甚至在时间零点)减少(图16B)。pNPP/MG比率的增加与葡萄糖的浓度有关(图17)。

并且，在时间100h，对于WT注意到内荧光的葡萄糖依赖性的增加，但是对于K131R和K26R却没有(图18A-C)。这种在415nm的荧光增加指示WT植酸酶中的AGE形成。WT植酸酶和它的变体的内荧光波谱显示在图18A、K131R(图18B)和K26R(图18C)中，在40℃和70％RH保存100h以后取样。在约420nm的荧光信号的葡萄糖依赖性的增加是美拉德反应的标记(Journal of Dairy Science 94:5375-5380)。

这些结果提示，K131和K26是在葡萄糖应力后改变IP6底物特异性的关键赖氨酸。K131R和K26R变体对葡萄糖应力具有抗性而野生型丧失对IP6的活性的事实提示，这些残基经历美拉德反应。

认为会受益于本教导内容的另外的目标序列显示在图15B中，且包括SEQ ID NO:6gi|161898386|gb|ABX80238.1|植酸酶[布丘氏菌属]

SEQ ID NO:7GC21]；>gi|42795098|gb|AAS45884.1|植酸酶[布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)]；

SEQ ID NO:8>gi|40748277|gb|AAR89622.1|植酸酶[弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)]；和，

SEQ ID NO:9>gi|364569314|gb|EHM46937.1|组氨酸酸性磷酸酶[蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)ATCC 51873]

实施例11

加速应力试验：

将根据上面关于实施例1描述的方法制备的植酸酶颗粒(2g)称量在各个样本杯中。每个样品准备7个杯，每个杯代表一个时间点。将敞开的杯子置于设定至40℃和70％相对湿度(RH)、或50℃和70％RH的培养箱中。在0、125、305和335h从培养箱收集含有样品的杯子。允许样品与环境温度和湿度平衡20分钟，盖上盖子，并在-20℃保存直到收集所有样品。

植酸酶剩余活性：

在15mL锥形管中用约9.9g测定缓冲液提取颗粒(0.1g)。允许样品在室温在58RPM旋转下溶解20min。将样品在3000RPM离心3min，将含有植酸酶的上清液手工过滤。假定所有提取的样品的植酸酶活性为约120FTU/mL，并用MG测定缓冲液稀释至15FTU/mL(对于pNPP测定)和0.010FTU/mL(对于IP6/孔雀石绿测定)。

完整颗粒中的葡萄糖水平：

将颗粒用研钵碾磨直到得到细粉末。在通风柜中执行碾磨过程以避免酶暴露。将碾磨的样品(2g)称量在15mL锥形管中，并将3mL 2％TFA加入干粉中。将样品混合，并允许在约25RPM恒定旋转下在室温溶解15min。将样品(500uL)用500uL Tris(pH 7.6)中和，混合，在15000RPM离心2min，并使用Konelab葡萄糖氧化酶测定分析上清液的葡萄糖。

结果示出在图19中。在这里显示了在酶基质中有淀粉/蔗糖(对照)或PVA存在下用渗滤的UFC制备的Phyzyme、Hiphos和不同的含有BP17的TPT颗粒随时间产生的葡萄糖/颗粒的浓度(W/W％)。值是在40℃和70％RH执行的加速应力试验以后在0、125、305和335h收集的样品的值。

实施例12-抗性淀粉作为TPT制剂组分以减小美拉德反应

固体制剂中的还原糖可以是制剂成分的组成部分(例如，右旋糖)，或由于背景葡糖淀粉酶和转化酶随时间从其它组分(诸如淀粉和蔗糖)非故意地产生。尽管葡糖淀粉酶从淀粉底物产生葡萄糖，转化酶从非还原糖蔗糖产生葡萄糖和果糖。葡糖淀粉酶和转化酶与目标酶一起在生产菌株里氏木霉中无所不在地产生。因而，仅在目标酶可以支持高水平的还原糖且没有丧失酶活性的情况下，使用固体制剂中的淀粉和蔗糖应当是可接受的。

为了试验抗水解的淀粉的作用，当采用Hylon VII时，测量了葡萄糖产量。HylonVII是一种来自玉米杂种的抗性淀粉，其含有70％直链淀粉和30％支链淀粉。预期通过Hylon VII的使用会减少通常由于存在于渗滤的BP17 ETD UFC中的背景葡糖淀粉酶引起的葡萄糖。在15℃进行测量。将从Hylon VII释放的总葡萄糖与从小麦淀粉释放的总葡萄糖进行对比，所述小麦淀粉是预期发生葡糖淀粉酶的水解的更常规的制剂成分。

材料：

1.来自Beloit的Axtra PHY/BP17ETD UFC(C14068；批次1681970737)(pH 4.9)

2.250mM乙酸钠(pH 4.9)

3.Hylon VII淀粉

4.来自Hanko的小麦淀粉

5.三氟乙酸(TFA)

6.500mM Tris,pH 7.6

7.葡萄糖氧化酶测定(Konelab)

葡萄糖产量：

用3个渗透体积渗滤Axtra PHY/BP17ETD。在开始反应之前，将UFC和缓冲液在冰上预冷却。将样品转移至设定在15℃的冷藏培养箱，并用自动旋转器混合。将小麦淀粉和Hylon VII(3.7g)独立地悬浮于冷的16.3g渗滤的UFC或250mM乙酸钠(pH 4.9)中。使用的淀粉浓度与在TPT制剂中存在的浓度相同。取约4h的时间点，并通过使用TFA进行酸淬灭来停止葡萄糖产生。考虑到淬灭时间，收集下述时间点：

Hylon VII UFC：3.5、32.7、73.87、126、231.35min

Hylon VII缓冲液：3.45、35.18、76.65、133.35、231.18min

小麦淀粉UFC：3.28、33.9、74.6、129.51、230.26min

小麦淀粉缓冲液：2.93、36.27、70.4、126.82、224.67min

如下在室温执行淬灭操作。将反应混合物(1mL)在15000RPM旋转2min。收集上清液(0.49mL)，并加入含有10ul TFA的eppendorf试管中。将溶液涡旋以确保适当混合，并在15000RPM离心2min以除去沉淀物。将上清液(400ul)加入新试管中的500ul 500mM Tris(pH7.6)，作为在葡萄糖测量之前中和溶液的方式。在酸淬灭步骤之后不久且在葡萄糖分析之前，将样品在-80℃冷冻。

为了测量葡萄糖，将样品在室温融化20-30min，并按照Konelab葡萄糖氧化酶测定程序测定葡萄糖浓度。尽管所有的UFC样品是在测定范围内，缓冲液中的样品是在检测限度以下。

我们观察到，在15℃和pH 4.9保持231min以后，存在于BP17ETD UFC中的背景葡糖淀粉酶从Hylon VII淀粉产生12mM葡萄糖。237min以后从小麦淀粉产生的浓度是从HylonVII产生的该葡萄糖浓度约7.7倍。

结果显示在图20中。在这里，显示了在15℃来自Hylon VII玉米淀粉和小麦淀粉的葡萄糖产量之间的对比。通常认为产生的葡萄糖通过存在于BP17 ETD UFC中的背景葡糖淀粉酶的作用而产生。通过将淀粉加入已经预平衡至15℃的UFC或缓冲液(pH 4.9)，开始葡萄糖产生。时间点是酸淬灭，随后中和。使用葡萄糖氧化酶测定，测量在淬灭的样品中产生的葡萄糖。

Claims (14)

1.一种提高酶稳定性的方法，所述方法包括：

在发酵中制备酶，其中所述发酵包含含有问题性糖和可水解淀粉的发酵介质，其中所述问题性糖是葡萄糖、果糖和/或蔗糖，并且其中所述酶包含至少一个可糖化的氨基酸残基且是易受问题性糖化影响的酶，其中所述酶是植酸酶SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少99％相同的氨基酸序列；回收所述酶；以及，

除去足够量的所述问题性糖以与缺乏所述除去的类似地发酵的酶相比提高酶稳定性，

其中所述除去包括将超滤液的浓缩物进行渗滤以除去所述问题性糖从而形成酶浓缩物，其中通过渗滤所述超滤液的浓缩物，所述植酸酶对其天然植酸底物的稳定性得到改善。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述渗滤包括至少两个、至少三个或至少四个渗透体积，使得所述酶浓缩物的糖含量降低至小于0.1％w/w。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述除去还包括发酵以后在50℃将所述酶加热至少1、2、4、8或12小时以灭活任何存在的淀粉水解酶。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述除去还包括先前的遗传操作，其中从多肽除去至少一个活性部位赖氨酸残基。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述活性位点赖氨酸残基是K131和/或K26。

6.权利要求1的方法，还包括将所述酶配制为酶颗粒，所述酶颗粒包含小于0.1％、0.08％、0.06％、0.04％或0.01％w/w的问题性糖。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述酶存在于颗粒的层中。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述酶遍布于颗粒中。

9.根据权利要求1的方法，其中所述植酸酶是经工程改造的植酸酶，其中相对于野生型布丘氏菌属植酸酶在位置131和/或26处的氨基酸残基为非赖氨酸。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述位置131残基是精氨酸。

11.根据权利要求6所述的方法，其中将所述酶配制在包含抗性淀粉的颗粒中。

12.根据权利要求11所述的方法，所述酶颗粒包含：

a)硫酸钠种核，

b)酶层，所述酶层包含易受问题性糖化影响的所述植酸酶、抗性淀粉、植酸钠和油菜籽油，

c)硫酸钠层，和，

d)外层，所述外层包含PVA和滑石。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述酶是野生型布丘氏菌属(Buttauxella sp.)植酸酶。

14.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述酶是SEQ ID NO:1。

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