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CN105979971A - 抗体-药物缀合物和免疫毒素 - Google Patents

抗体-药物缀合物和免疫毒素 Download PDF

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CN105979971A CN201580006995.5A CN201580006995A CN105979971A CN 105979971 A CN105979971 A CN 105979971A CN 201580006995 A CN201580006995 A CN 201580006995A CN 105979971 A CN105979971 A CN 105979971A
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Abstract

本发明涉及具有式(I)的缀合物：A‑(L‑D)p或其药学上可接受的盐或溶剂化物，特别是抗体‑药物缀合物和免疫毒素，其中A是选择性结合FAP的抗体；L是接头；D是包括溶细胞素或黑杆菌素‑b A链的药物；且p是1至10，并且涉及所述缀合物治疗性治疗肿瘤的用途。公开产生所述缀合物的方法和用于所述方法中的组分。

Description

抗体-药物缀合物和免疫毒素
发明领域
本发明涉及靶向纤维母细胞活化蛋白α(FAP)的抗体-药物缀合物(ADC)和免疫毒素以及它们在医学中，例如在治疗某些癌症方面的用途。
发明背景
恶性上皮肿瘤是人类死亡的主要癌症相关病因。这些实体肿瘤常常展现显著间质反应，诸如所谓“促结缔组织增生性间质”或“反应性间质”，其占总体肿瘤质量的20-60％，并且特征在于存在大量间质细胞和致密细胞外基质(ECM)。新近研究已指示间质细胞的促肿瘤作用，如由血管细胞、免疫细胞、纤维母细胞、肌纤维母细胞、脂肪细胞和骨髓源性祖细胞所例示(1-6)。具体来说，常在包括乳腺癌、肺癌、结肠癌和胰腺癌的各种人类癌症的肿瘤相关间质内观察到可观数目的癌症相关纤维母细胞(CAF)(14,15)。在与间质的不同组分协调相互作用的情况下，CAF能够促进新血管生成和肿瘤生长；也已显示在癌症进展期间CAF对侵袭性肿瘤的发展和肿瘤侵袭性至关重要(16-25)；CAF促进肿瘤细胞在远端器官中扩散和浸润，由此造成转移的形成。重要的是，也已指示间质细胞与全身性药物向肿瘤递送失败和出现抗药性的相关性(7-11)。
对消除间质-肿瘤细胞相互作用并由此减弱肿瘤发生的细胞靶标和分子靶标的鉴定当前是转化肿瘤学中一个最重要的主题。实际上，靶向肿瘤周围间质是一种治疗代表超过90％的癌症患者死亡率的转移性肿瘤的相当新颖策略：迄今仅少许产品已获得治疗批准，它们中的大多数是抗血管生成药物(26)。然后鉴定和靶向肿瘤微环境内的其它新型分子为增加与基于间质的治疗方法组合的常规疗法的功效所必需，并且代表一种用于癌症和转移治疗的有效方法(12,13)。
基于单克隆抗体(MAb)的药物代表在对抗癌症方面的极大希望。这是因为它们允许治疗以精确和特异性方式针对分子水平。这些优势连同它们的商业吸引力(开发时间短暂、竞争力受局限以及一旦它们已被批准即可易于向其它癌症类型输出)一起已推动许多药物公司在开发新型基于抗体的分子方面，以及在从生物技术公司获得新型分子或技术的引入式授权方面大量投资。
然而，尽管治疗性抗体取得了临床成功，但靶向细胞表面肿瘤抗原的裸露MAb很少独自提供足够功效。为使MAb的低活性增加，新策略集中于使它们结合于毒性分子。植物和细菌毒素以及小化学治疗分子可为良好候选物，因为它们在极小量的情况下非常有效和有活性。
由于在过去数年期间进行的技术进步，用于治疗癌症的免疫毒素(IT)和抗体-药物缀合物(ADC)的领域近来已经历一场由药物公司进行的日益增长的开发活动，旨在解决它们最初呈现的关于免疫原性、不合需要的毒性、产量、半衰期和抗性的问题。
免疫缀合物由共价连接于细胞毒性药物的人、人源化或嵌合重组抗体制得。此类结构的主要目标是将小细胞毒性剂(300至1000Da)的效力和肿瘤相关抗原靶向(TAA)的MAb的高特异性结合。
Ab对于到达其表达必须局限在正常细胞中的抗原必须极具选择性。Ab也必须被高效内化至癌性细胞中。
选作效应物部分的细胞毒性剂必须仅在内化并向细胞质中释放之后杀灭细胞。最通常用于ADC中的有效载荷是DNA损害性药物，诸如卡奇霉素(calicheamicin)、倍癌霉素(duocarmicin)或微管靶向化合物，如奥莉斯汀(auristatin)和美登木素(maitansinoid)。
Ab-细胞毒性剂接头被设计以达成全身稳定，并且在靶细胞内释放细胞毒性剂。
TAA常常是在患病组织中过度表达或至少充分表达以促进内化活化的细胞毒性的细胞膜蛋白质。理想的是，抗原在正常组织中呈现受局限表达，而在重要器官中表达较低或不存在表达。除此之外，肿瘤抗原必须由Ab以选择性方式以及以高亲和力识别。
在许多类型的人类癌症中，纤维母细胞响应的特征在于诱导细胞表面蛋白，即纤维母细胞活化蛋白α(FAPα)，其是一种其表达高度局限于发育器官、伤口愈合和组织重塑的95kDa丝氨酸蛋白酶。
FAP呈现以下特征：
●具有SER蛋白酶活性的II型膜糖蛋白(胶原酶+DPP)
●89％人-鼠蛋白质同源性
●肿瘤间质在>90％癌(乳腺癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌和结肠癌)中中表达
●在伤口愈合期间的正常成人组织以及发育器官中短暂和高度局限表达。
●FAP(+)纤维母细胞接近于肿瘤血管结构定位
●表达极具局灶性
●内化
●牵涉于细胞外基质重塑、肿瘤生长和转移中。
FAP表达近来已见于胰腺肿瘤细胞以及肿瘤相关间质纤维母细胞中。FAP表达与患者存活期较短和预后更糟糕相关联，从而表明在这个类型的肿瘤中可能存在基于FAP的自分泌/旁分泌环路(32)。
在过去10年期间，Kontermann和Pfizenmaier(IZI,University of Stuttgart,Germany)已开发针对人蛋白质与鼠蛋白质两者的抗FAP MAb衍生物(27,28)。他们已在体外显示抗FAP scFv免疫脂质体特异性结合FAP+细胞并被内化(29)。在新近研究中，他们证明了用脂质和抗FAP scFv覆盖，并且用TNFα上样的纳米粒子的抗肿瘤作用(30)。
在胰腺和肺癌异种移植物模型中，用鼠MAb FAP5-DM1免疫毒素治疗诱导对肿瘤生长的长效抑制和完全消退，而无任何不耐受性相关效应(31)。
尽管取得这些进步，但仍然对用于治疗包括上皮肿瘤的肿瘤的其它治疗策略，以及对于用于此类治疗策略中的组分存在未满足的需要。本发明解决这些和其它需要。
发明简述
广泛来说，本发明涉及抗FAP抗体、其缀合物和用于抗体缀合物策略中的优化有效载荷。具体来说，本发明者已发现如本文所述的抗FAP抗体展现高度特异性结合以及快速和高效内化。此外，本发明者已发现可分离并在细菌宿主细胞中产生黑杆菌素(Nigrin)b的A链，其在缺少黑杆菌素-b B链下仍然保留体外核糖体失活活性，并且仅只要缀合于抗体，即展现易位至细胞中的能力与在无黑杆菌素-b B链下的所得细胞毒性活性两者。
本文所述的黑杆菌素-b A链和/或溶细胞素(cytolysin)衍生物被有利地缀合于抗FAP抗体以用于治疗肿瘤。
因此，在第一方面，本发明提供一种具有式I的缀合物：
A-(L-D)p (I)
或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中：
A是选择性结合FAP的抗体；
L是接头；
D是包括溶细胞素或黑杆菌素-b A链的药物；并且
p是1至10。
在根据本发明的这个和其它方面的一些情况下，A是选择性结合人FAP的细胞外区域的单克隆抗体或其结合片段。在某一情况下，A可与人FAP和鼠FAP两者交叉反应。在特定情况下，A可包含具有以下氨基酸序列的重链互补决定区1-3(CDRH1-3)和轻链互补决定区1-3(CDRL1-3)：
(i)CDRH1：SEQ ID NO:7或其相较于SEQ ID NO:7的序列具有多达1或2个氨基酸取代的变体；
(ii)CDRH2：SEQ ID NO:8或其相较于SEQ ID NO:8的序列具有多达1或2个氨基酸取代的变体；
(iii)CDRH3：SEQ ID NO:9或其相较于SEQ ID NO:9的序列具有多达1或2个氨基酸取代的变体；
(iv)CDRL1：SEQ ID NO:10或其相较于SEQ ID NO:10的序列具有多达1或2个氨基酸取代的变体；
(v)CDRL2：SEQ ID NO:11或其相较于SEQ ID NO:11的序列具有多达1或2个氨基酸取代的变体；和
(vi)CDRL3：SEQ ID NO:12或其相较于SEQ ID NO:12的序列具有多达1或2个氨基酸取代的变体。
在某些情况下，CDRH1-3分别包含SEQ ID NO:7-9的氨基酸序列，并且CDRL1-3分别包含SEQ ID NO:10-12的氨基酸序列。
在某些情况下，A包含含与SEQ ID NO:5的全长序列具有至少90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)。
在某些情况下，A包含含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区(VH)。
在某些情况下，A包含含与SEQ ID NO:6的全长序列具有至少90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。具体来说，A可包含含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在某些情况下，A包含氨与SEQ ID NO:3的全长序列具有至少90％、95％或99％序列同一性的基酸序列的重链。具体来说，A可包含含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链。
在某些情况下，A包含与SEQ ID NO:4的全长序列具有至少90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链。具体来说，A可包含含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链。
在某些情况下，A可为在结构上不同于本文例示的抗FAP抗体分子的竞争性结合抗FAP抗体。举例来说，A可为与在本文中标识为“hu36”的抗FAP IgG1抗体竞争结合固定的重组人FAP的抗FAP抗体分子。hu36具有SEQ ID NO:3的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:4的轻链氨基酸序列。在某一情况下，抗FAP抗体可与hu36结合相同表位。用于测定抗体结合竞争以及用于表位定位的方法在本领域中是熟知的，参见例如“Epitope Mapping byCompetition Assay”Ed Harlow和David Lane,Cold Spring Harb Protoc；2006；doi:10.1101/pdb.prot4277。
根据本发明的这个和其它方面，D可为溶细胞素。在一些情况下，溶细胞素可为WO2008/138561A1中公开的化合物，所述专利的整个内容以引用的方式明确并入本文(其中公开的化合物也被称为微管溶素(Tubulysine)衍生物)。可如WO 2008/138561中所述合成溶细胞素。在某些情况下，溶细胞素可如WO 2008/138561A1的式I或式IV中所定义。在某些情况下，溶细胞素可具有式IV：
其中：
R2(i)直接或间接连接于接头L或(ii)是H或是C1-C4烷基；
R6是C1-C6烷基；
R7是C1-C6烷基、CH2OR19或CH2OCOR20，其中R19是烷基，R20是C2-C6-烯基、苯基或CH2-苯基；
R9是C1-C6烷基；
R10是H、OH、O-烷基或O-乙酰基；
f是1或2；
R11具有以下结构：
其中
R21是H、OH、卤素、NH2、烷基氧基、苯基、烷基氨基或二烷基氨基；
R16是H或C1-C6-烷基基团；
R17(i)直接或间接连接于接头L或(ii)是CO2H、CO2R18、CONHNH2、OH、NH2、SH或任选取代的烷基、环烷基、杂烷基或杂环烷基基团，其中R18是任选取代的烷基、杂烷基或杂环烷基基团；并且
q是0、1、2或3；
并且其中术语“任选取代的”涉及其中一个或若干个H原子可被F、Cl、Br或I或OH、SH、NH2或NO2置换的基团；术语“任选取代的”进一步涉及可仅仅或另外被未取代的C1-C6烷基、C2C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C10环烷基、C2-C9杂环烷基、C6-C10芳基、C1-C9杂芳基、C7-C12芳烷基或C2-C11杂芳烷基基团取代的基团。
在一些情况下，R2是至接头L的键。
在一些情况下，R17是C(O)X、CONHNHX、OX、NHX或SX，其中X是至接头L的键。
在一些情况下，接头L可进一步包含间隔基。
在一些情况下，间隔基具有2至30个原子的链长度。
在一些情况下，间隔基包含以下或由以下组成：亚烷基(即二价烷基)或亚杂烷基(即二价杂烷基)基团。
在一些情况下，间隔基包含以下或由以下组成：亚烷基或氧基亚烷基基团。
在一些情况下，间隔基包含以下或由以下组成：基团-(CH2)n-或-(OCH2CH2)n-，其中n≥1。
在一些情况下，间隔基包含以下或由以下组成：基团-(OCH2CH2)n-，其中n≥1。具体来说，n可为1至15、1至10、1至6、或2至5。举例来说，n可为3或4。
在一些情况下，间隔基包含一个与六个之间的乙二醇单元，例如三乙二醇。
在一些情况下，间隔基可直接连接于基团R17，或可经由桥连基团连接于基团R17。
在一些情况下，间隔基经由-C(O)X桥连基团连接于基团R17，其中X是与R17的键。
在一些情况下，R17是CONHNHX，并且间隔基经由-C(O)X桥连基团连接于基团R17，其中X代表间隔基与R17之间的键。
在一些情况下，R17是CONHNHX，并且间隔基是经由-C(O)X桥连基团连接于R17的-(OCH2CH2)n-，其中n＝2、3或4。
在一些情况下，D包括具有以下结构的溶细胞素：
在一些情况下，D包括具有以下结构的溶细胞素：
在某些情况下，L包含用于连接于A和蛋白酶可裂解部分的连接基团。举例来说，L可包含缬氨酸-瓜氨酸单元。具体来说，L可包括马来酰亚胺基己酰-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲基氨基甲酸酯。
在一些情况下，使马来酰亚胺的双键与抗体A的半胱氨酸残基的硫醇基团反应以形成硫-碳键来实现接头L连接于抗体A。
在一些情况下，–L-D具有选自由以下组成的组的结构：
在某些情况下，–L-D可具有以下结构：
在某些情况下，–L-D可具有以下结构：
根据本发明的这个和其它方面，在一些情况下，p可处于1至5，例如1至4，或1至3的范围内。在特定情况下，p可为1或2。在特定情况下，p可为3或4。
根据本发明的这个和其它方面，D可为黑杆菌素-b A链。优选地黑杆菌素-b A链缺少黑杆菌素-b B链。黑杆菌素-b A链可包含以下或由以下组成：序列SEQ ID NO:13。
在某些情况下，黑杆菌素-b A链可或可已例如在细菌宿主细胞中重组产生。本发明者已惊人地发现尽管天然糖基化丧失或改变，诸如当在细菌宿主细胞中重组产生黑杆菌素-b A链时的情况，但黑杆菌素-b A链保留它的活性(例如细胞毒性和/或核糖体抑制活性)。
当本发明的缀合物包含黑杆菌素-b A链作为毒性有效载荷(即D)时，L可仅为在A上硫原子与D上硫原子之间的二硫键。因此，L可包括二硫键或由二硫键组成。
在第二方面，本发明提供一种用于医学中的如根据本发明的第一方面定义的缀合物。
在第三方面，本发明提供一种用于治疗哺乳动物受试者的肿瘤的方法中的如根据本发明的第一方面定义的缀合物。
在一些情况下，缀合物用于与一种或多种其它抗肿瘤药物同时、依序或分开施用。一种或多种其它抗肿瘤药物包括细胞毒性化学治疗剂或抗血管生成剂或免疫治疗剂。在一些情况下，一种或多种其它抗肿瘤药物包括吉西他滨(Gemcitabine)、凯素贝伐单抗(Abraxane bevacizumab)、伊曲康唑(itraconazole)、羧基酰胺基三唑、抗PD-1分子或抗PD-L1分子(例如尼鲁单抗(nivolumab)或派姆单抗(pembrolizumab))。
在某些情况下，缀合物用于治疗实体肿瘤。具体来说，缀合物可用于治疗胰腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、头颈癌、卵巢癌、膀胱癌或结肠癌。
在第四方面，本发明提供一种治疗哺乳动物受试者的肿瘤的方法，其包括向有需要的所述受试者施用治疗有效量的如根据本发明的第一方面定义的缀合物。在一些情况下，方法可用于治疗实体肿瘤。具体来说，方法可用于治疗胰腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、头颈癌、卵巢癌、膀胱癌或结肠癌。
在第五方面，本发明提供溶细胞素制备抗体-药物缀合物的用途，其中所述抗体是FAP特异性抗体，例如根据本发明的第八方面的FAP特异性抗体。在某一情况下，用途可为溶细胞素制备如根据本发明的第一方面定义的抗体-药物缀合物。
在第六方面，本发明提供一种本发明的第一方面的缀合物，其用于治疗炎性疾患(例如类风湿性关节炎)。
在第七方面，本发明提供一种治疗哺乳动物受试者的炎性疾患(例如类风湿性关节炎)的方法，其包括向有需要的所述受试者施用治疗有效量的本发明的第一方面的缀合物。
在第八方面，本发明提供一种缺少黑杆菌素-b B链的分离的黑杆菌素-b A链。黑杆菌素-b A链的氨基酸序列可包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:13的序列。
在第九方面，本发明提供根据本发明的第八方面的分离的黑杆菌素-b A链制备免疫毒素的用途。在一些情况下，免疫毒素包含缀合和/或结合于所述分离的黑杆菌素-b A链(缺少黑杆菌素-b B链)的单克隆抗体。在一些情况下，免疫毒素包含选择性结合FAP的抗体，诸如单克隆抗体，例如人单克隆抗体。在一些情况下，免疫毒素包含根据本发明的第十方面的抗体。
在第十方面，本发明提供一种选择性结合FAP，并且包含含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链的单克隆抗体，例如人单克隆抗体。
在第十一方面，本发明提供用于医学中的本发明的第十方面的抗体。抗体可用于治疗炎性疾患(例如类风湿性关节炎)。
在第十二方面，本发明提供根据本发明的第十方面的单克隆抗体制备抗体-药物缀合物或免疫毒素的用途。
在第十三方面，本发明提供一种包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码至少一种具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的多肽的多核苷酸：SEQ ID NO:1-6和13。在一些情况下，多核苷酸可包含SEQ ID NO:14的核酸序列。
在第十四方面，本发明提供一种用于产生根据本发明的第一方面的缀合物的方法，其包括：
(a)使选择性结合FAP的抗体衍生以引入至少一个巯基基团；以及
(b)使衍生化抗体与黑杆菌素-b A链(缺少黑杆菌素-b B链)上适当残基(例如半胱氨酸氨基酸)在允许在所述抗体与所述黑杆菌素-b A链之间形成二硫键连接，由此产生所述缀合物的条件下反应。方法可进一步包括纯化和/或分离缀合物的步骤(c)。
在一些情况下，步骤(a)可包括使抗体与4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯(SMPT)、3-(2-吡啶基-二硫代丙酸N-琥珀酰亚胺酯)(SPDP)或4-巯基丁酰亚胺酸甲酯反应。
在第十五方面，本发明提供一种用于产生根据本发明的第一方面的缀合物的方法，其包括：
(a)使选择性结合FAP的抗体通过硫醇基团连接于接头；以及
(b)使溶细胞素通过溶细胞素分子上适当基团连接于接头。在一些情况下，使溶细胞素通过位置R2或位置R17连接于接头。可以任一顺序进行步骤(a)和(b)。在任选进一步骤(c)中，方法可包括纯化和/或分离缀合物。
本发明包括所述方面和优选特征的组合，例外之处是当这种组合是明确不允许的或被陈述应明确避免时。以下进一步详细并且参照随附实施例和附图来描述本发明的这些和其它方面和实施方案。
附图简述
图1显示对人源化scFv hu33和hu36的表征。A)对纯化scFv片段的SDS-PAGE分析。考马斯(Coomassie)染色。R-还原性，NR–非还原性。B)对hu36(人源化)和mo36(嵌合)与HT1080-huFAP细胞的结合的流式细胞计量术分析。用抗His标签抗体检测结合的抗体(n＝2)。C)对hu36scFv和mo36scFv与固定的重组人FAP(在100ng/ml下涂布)的结合的ELISA。用HRP缀合的抗Myc标签抗体检测结合的抗体。
图2显示A)用于结合重组人FAP(rhFAP)的抗FAP mo36-IgG1(圆圈)和hu36-IgG1(方块)或对照蛋白质(BSA)(分别是三角和倒三角)的ELISA。每孔涂布50ng蛋白质。用HRP缀合的抗人IgG-Fc检测结合的抗体。B)对用于结合HT1080-FAP的抗FAP mo36-IgG1(三角和星形)和hu36-IgG1(方块和圆圈)的流式细胞计量术分析。用PE标记的抗hu IgG-Fc抗体检测结合的蛋白质。
图3显示对hu36-IgG1与稳定转染以表达A)人FAP(HT1080-huFAP)和B)小鼠FAP(HT1080-moFAP)的HT1080的结合的流式细胞计量术分析。用PE标记的抗人Fc抗体检测结合的抗体。
图4显示对HT1080-FAP细胞的共焦显微术，所述细胞与hu36-IgG1一起孵育各种时间(0、30和60分钟)，并且用FITC标记的抗IgG抗体、WGA-TRed(膜染色)和DAPI(核)染色。右手图版显示三种染色的合并图像。
图5显示通过辨别显示仅膜染色(PM；空心棒条)、PM和细胞内染色(阴影化棒条)、或仅细胞内染色(实心棒条)的细胞(n＝10-30)来对hu36-IgG1内化的分析。证实明确时间依赖性内化。
图6显示重组黑杆菌素-b A链的MALDI-Tof概况。观察质量(Da)：28546.55；预期质量(Da)：28546.09；质量偏差：0.5；质量准确度：16ppm。
图7显示相对于天然(WT)黑杆菌素-b，在兔网织红细胞无细胞裂解物(RRL)中测试的重组黑杆菌素-b A链(recNgA)的核糖体失活蛋白(RIP)活性。(3a、3b、6c、9c)代表不同recNgA制剂。
图8显示通过结晶紫存活力测定关于HT1080-FAP细胞系测试的recNgA细胞毒性(天然黑杆菌素–菱形；重组黑杆菌素-b A链–方块)。
图9显示相较于天然(WT)黑杆菌素(三角)和重组黑杆菌素-b A链(recNgA；方块)，抗FAP hu36-IgG1-recNgbA免疫毒素缀合物(HSP131-001；十字号)在RRL测定中的RIP活性。
图10显示抗FAP hu36-IgG1-recNgbA免疫毒素缀合物(HSP131-001；三角)、未缀合(裸露)抗FAP hu36-IgG1(方块)和重组黑杆菌素-b A链(recNgA；菱形)对A)HT1080-WT细胞系；和B)HT1080-FAP细胞系的细胞毒性活性。相对于抗体/免疫毒素浓度绘制增殖倍数变化。
图11显示通过vcPABA接头获得的溶细胞素缀合抗体的一般性抗体缀合物结构。溶细胞素可通过R1或R4(用箭头标识)连接。
图12显示对患者源性异种移植物(PDX)小鼠(胰腺肿瘤)的抗FAP hu36肿瘤切片的免疫检测。在来自胰腺癌的PDX小鼠模型(Panc185)的皮下肿瘤中观察到对间质的特异性剂量-和时间-依赖性染色-在PDX小鼠Panc-185中腹膜内施用单次剂量(1和5mg/kg)的抗hu/moFAP hu36IgG1；用抗人IgG1二级抗体进行免疫检测-显示20x标度图片。对照-48小时：用媒介物施用小鼠，并且在48小时之后切除肿瘤。
图13显示在用抗FAP:recNgA免疫毒素在一周一次施用的不同剂量(2.5、1、0.5、0.25、0.1mg/kg)下治疗之后监测的动物重量。在组1和2(分别是2.5和1mg/kg)中观察到显著重量减轻和毒性，此类似于用5mg/kg治疗(未显示)；0.5mg/kg是用作单一药剂时的最高耐受剂量。
图14显示(A)相对体重和(B)肿瘤体积，由未治疗(媒介物；10ml/kg/天；一周一次)，用吉西他滨(GEM；150mg/kg；一周一次)或抗FAP:recNgA免疫毒素(OMTX505；0.5/0.25mg/kg；一周一次)或两者(OMTX505(0.25mg/kg):GEM(150mg/kg))治疗4周(治疗日1、8、15、22、29)的患者源性异种移植物小鼠(PAXF 736)所测量。
图15显示对ADC471结合FAP靶标的ELISA和FACS分析。(A)相较于裸露的抗hu/moFAP hu36抗体，对ADC-471结合huFAP融合蛋白的ELISA检测；指示DAR＝3.48的HPS124-3ADC-471分子的EC50值；(B)和(C)：对HPS131-143-1(ADC-471；DAR4)、HPS131-124-1(ADC-467；DAR 1.2)和HPS131-124-3(ADC-471；DAR 3.48)ADC在HT1080-huFAP、HT1080-wt和HEK293细胞上的结合的FACS分析。对于这个后述(B)，指示EC50值。
图16显示对抗FAP hu36:溶细胞素ADC(ADC-471；HPS131-124-3)关于HT1080-FAP活细胞的内化能力的延时免疫荧光分析。左侧图版：与裸露的抗hu/moFAP hu36(FITC-AB；绿色)一起孵育；右侧图版：与ADC-471(FITC-ADC；绿色)一起孵育。时间0、30、60、90分钟(上部图版)：HT1080-FAP细胞。时间30分钟(下部图版)：HT1080野生型细胞。
图17显示抗hu/moFAP hu36:溶细胞素ADC对(A)HT1080-wt和(B)FAP(+)细胞的体外细胞毒性作用。通过在10-6至10-12M的浓度范围下孵育各化合物72小时之后进行结晶紫染色来证实细胞增殖阻滞。亲本TAM334溶细胞素用作不特异性细胞毒性的阳性对照。
图18显示抗hu/moFAP hu36:溶细胞素ADC候选物的肿瘤生长抑制作用。(A)ADC471相对于ADC551；(B)ADC471和ADC553(OMTX705-553)相对于ADC558(OMTX705-558)。媒介物和GEM(吉西他滨)：阴性和阳性对照组。
发明详述
在描述本发明时，以下术语将被采用，并且意图如以下指示所定义。
FAP
如本文所用，“纤维母细胞活化蛋白(Fibroblast activation protein/fibroblast activating protein)”、“FAP”和“FAPα”可互换使用。FAP可为任何哺乳动物物种的FAP。在一些情况下，FAP是人FAP(也称为分离酶(Seprase)、170kDa黑素瘤膜结合明胶酶、纤维母细胞活化蛋白α或整合性膜丝氨酸蛋白酶)，其氨基酸序列以UniProt登记号Q12884(140版，日期是2013年12月11日)(SEQ ID NO:15)加以公开。在一些情况下，结合FAP的分子(例如抗体分子或其缀合物)可结合FAP的细胞外结构域的区域。人FAP的细胞外结构域包含全长人FAP蛋白的残基26-760。在一些情况下，FAP是鼠FAP(也称为纤维母细胞活化蛋白α或整合性膜丝氨酸蛋白酶)，其氨基酸序列以UniProt登记号P97321(117版，日期是2013年12月11日)(SEQ ID NO:16)加以公开。鼠FAP的细胞外结构域包含全长鼠FAP蛋白的残基26-761。
缀合物
如本文所用，“缀合物”包括通过连接各分子形成的所得结构，并且明确包括抗体-药物缀合物(ADC)和免疫毒素(IT)。
选择性结合
术语选择性结合(selectively binds/selective binding)是指抗体或其结合片段以特异性方式结合预定分子(例如抗原)。举例来说，抗体或其结合片段可以至少约1x107M-1的亲和力结合FAP，例如其细胞外部分，并且结合预定分子的亲和力可比它结合除预定分子以外的分子的亲和力大至少两倍(例如大五倍或十倍)。
抗体分子
如本文关于本发明的所有方面所用，术语“抗体”或“抗体分子”包括天然或部分或完全合成产生的任何免疫球蛋白。术语“抗体”或“抗体分子”包括单克隆抗体(mAb)和多克隆抗体(包括多克隆抗血清)。抗体可为完整的，或源于完全抗体的片段(参见下文)。抗体可为人抗体、人源化抗体或非人来源的抗体。“单克隆抗体”是针对靶标分子的单一抗原位点或“决定簇”的均质高度特异性抗体群体。“多克隆抗体”包括针对靶标分子的不同抗原决定簇的异质抗体群体。术语“抗血清”是指从免疫的动物获得的含有抗体的血清。
已显示完整抗体的片段可执行结合抗原的功能。因此，在本文中提及抗体以及提及本发明的方法、阵列和试剂盒涵盖完全抗体，并且也涵盖包含抗体结合片段的任何多肽或蛋白质。结合片段的实例是(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH结构域组成的dAb片段；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，即包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域由允许两个结构域缔合以形成抗原结合位点的肽接头连接；(viii)双特异性单链Fv二聚体(WO 93/11161)和(ix)“微型双功能抗体”，即通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；58)。可通过并入连接VH结构域和VL结构域的二硫桥来使Fv、scFv或微型双功能抗体分子稳定。也可制备包含接合于CH3结构域的scFv的微型抗体。
关于抗体分子，术语“选择性结合”可在本文中用于指代其中特异性结合对的一个成员将不显示与除它的特异性结合配偶体以外的分子的任何显著结合的情况。当例如抗原结合位点对由许多抗原携带的特定表位具有特异性时，所述术语也是可适用的，在所述情况下，携带抗原结合位点的特异性结合成员将能够结合携带所述表位的各种抗原。
在根据本发明的一些情况下，抗体可为完全人抗体。
细胞毒性化学治疗剂
在根据本发明的任何方面的一些情况下，本发明的缀合物可与或用于与一种或多种其它抗肿瘤药物一起施用(同时、依序或分开)，所述抗肿瘤药物包括但不限于细胞毒性化学治疗剂或抗血管生成剂或免疫治疗剂。
细胞毒性化学治疗剂在本领域中是熟知的，并且包括抗癌剂，诸如：
烷基化剂，包括氮芥，诸如二氯甲基二乙胺(HN2)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)(L-溶肉瘤素(L-sarcolysin))和苯丁酸氮芥；10亚乙基亚胺和甲基三聚氰胺，诸如六甲基三聚氰胺、噻替派(thiotepa)；alkylsulphonates，诸如白消安(busulfan)；亚硝基脲，诸如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNLJ)、司莫司汀(semustine)(甲基-CCN-U)和链脲佐菌素(streptozoein/streptozotocin)；和三氮烯，诸如达卡巴嗪(decarbazine)(DTIC；二甲基三氮烯基咪唑甲酰胺)；
抗代谢剂，包括叶酸类似物，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)(氨甲蝶呤(amethopterin))；嘧啶类似物，诸如氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶；5-FU)、氟尿苷(氟脱氧尿苷；FUdR)和阿糖胞苷(cytarabine)(胞嘧啶阿拉伯糖苷)；和嘌呤类似物和相关抑制剂，诸如巯基嘌呤(6-巯基嘌呤；6-MP)、硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤；TG)和喷司他汀(pentostatin)(2'-脱氧柯福霉素(2'-deoxycofonnycin))。天然产物，包括长春花生物碱，诸如长春花碱(vinblastine，VLB)和长春新碱(vincristine)；表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)，诸如依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)；抗生素，诸如放线菌素D(dactinomycin/actinomycin D)、柔红霉素(daunorabicin)(道诺霉素(daunomycin)；红比霉素(rubidomycin))、多柔比星(doxorubicin)、博莱霉素(bleomycin)、光神霉素(plicamycin)(米拉霉素(mithramycin))和丝裂霉素(mitomycin)(丝裂霉素Q)；酶，诸如L-天冬酰胺酶；和生物响应调节剂，诸如干扰素alphenome。杂项药剂，包括铂配位络合物，诸如顺铂(cisplatin)(顺式DDP)和卡铂(carboplatin)；蒽二酮，诸如米托蒽醌(mitoxantrone)和蒽环霉素(antbracycline)；取代的脲，诸如羟基脲；甲基肼衍生物，诸如丙卡巴肼(procarbazine)(N-甲基肼，MIH)；和肾上腺皮质抑制剂，诸如米托坦(mitotane)(o,p'-DDD)和胺鲁米特(aminoglutethimide)；泰素(taxol)和类似物/衍生物；以及激素激动剂/拮抗剂，诸如氟他胺(flutamide)和他莫昔芬(tamoxifen)。另一优选细胞毒性剂是吉西他滨(Gemcitabine)另一优选细胞毒性剂是结合于人血清白蛋白的太平洋紫杉醇(Paclitaxel)
抗血管生成剂在本领域中是熟知的，并且包括抗癌剂，诸如贝伐单抗(bevacizumab)、伊曲康唑(itraconazole)和羧基酰胺基三唑。
免疫治疗剂在本领域中是已知的，并且包括例如抗程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)抗体和抗程序化死亡配体1(PD-L1)抗体，包括尼鲁单抗(Nivolumab)(MDX1106)和派姆单抗(Pembrolizumab)(MK-3475)。
药物组合物
本发明的缀合物可与药学上可接受的赋形剂一起包含在药物组合物中。
药学上可接受的赋形剂可为进入药物组合物中，不激起次级反应，并且允许例如促进施用缀合物，增加它在体内的寿命和/或功效，或增加它在溶液中的溶解性的化合物或化合物的组合。这些药学上可接受的媒介物是熟知的，并且将由本领域技术人员随缀合物的施用模式而变加以改适。
在一些实施方案中，本发明的缀合物可以用于在施用之前复原的冻干形式提供。举例来说，冻干缀合物可在向个体施用之前于无菌水中复原，并且与盐水混合。
本发明的缀合物将通常以除缀合物之外，也可包含至少一种组分的药物组合物形式施用。因此，除缀合物之外，药物组合物也可包含为本领域技术人员所熟知的药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其它物质。所述物质应无毒，并且不应干扰缀合物的功效。载体或其它物质的确切性质将取决于可为如下讨论的团注、输注、注射或任何其它适合途径的施用途径。
对于例如通过注射达成的静脉内施用，包含缀合物的药物组合物可呈无热原并具有适合pH、等张性和稳定性的胃肠外可接受的水溶液形式。本领域相关技术人员完全能够使用例如等张媒介物制备适合溶液，诸如氯化钠注射液，林格氏注射液(Ringer'sInjection)、乳酸林格氏注射液。可根据需要采用防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，诸如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六羟季铵；氯化苯甲烃铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷酯，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3’-戊醇；和间甲酚)；低分子量多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐相对离子，诸如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
受试者
受试者可为人、伴侣动物(例如狗或猫)、实验室动物(例如小鼠、大鼠、兔、猪或非人灵长类动物)、家养或农场动物(例如猪、母牛、马或绵羊)。优选地，受试者是人。在一些情况下，受试者可为被诊断有例如上皮肿瘤的癌症或分类为处于显现例如上皮肿瘤的癌症的风险下的人。在某些情况下，受试者可为实验室动物，例如患有癌症的小鼠模型。在某些情况下，受试者可为已被诊断有诸如类风湿性关节炎(RA)的炎性疾患或分类为处于显现诸如类风湿性关节炎(RA)的炎性疾患的风险下的哺乳动物(例如人)。具体来说，受试者可为患有RA的人。
癌症
本文所述的抗FAP缀合物适用于治疗哺乳动物受试者的肿瘤。肿瘤可为实体肿瘤。具体来说，肿瘤可为胰腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、头颈癌、卵巢癌、膀胱癌或结肠癌。
炎性疾患
在根据本发明的一些情况下，抗FAP抗体或抗体药物缀合物可用于治疗炎性疾患。已报道FAP在类风湿性关节炎(RA)患者中的纤维母细胞样滑膜细胞(FLS)中表达(参见例如Bauer等,Arthritis Res.Therp.(2006):8(6)；R171)。本发明者相信本文所述的抗FAP抗体和/或本文所述的其缀合物能够改善RA和/或RA的症状。
以下是通过举例方式呈现，并且不应解释为是对权利要求的范围的限制。
实施例
实施例1–产生抗FAP抗体
先前(28)已描述通过噬菌体展示从免疫的FAP-/-敲除小鼠选择的抗FAP scFv。使两个对于人和鼠FAP具有交叉反应性的scFv，即“MO36”和“MO33”(28)转变成全长IgG，以用于随后表征研究和产生免疫毒素和ADC。这些scFv(scFv33和scFv36)用于产生嵌合抗体，从而使重链和轻链恒定结构域分别融合至VH和VL。此外，两者均通过CDR移植加以人源化，并且相较于亲本scFv来测试所述两者与FAP表达性细胞和重组FAP的结合。根据这个比较，最佳结合剂用于产生全长IgG。所有scFv都在大肠杆菌(E.coli)中产生，并且通过IMAC纯化，使用开发用于抗体产生的Lonza GS表达载体pEE6.4和pEE14.4在哺乳动物细胞(CHO)中产生IgG。scFv的特征概述于表1中。
表1：抗体、特异性、子类和用作原料的载体
所有scFv都在大肠杆菌TG1中通过细菌产生，并且通过IMAC从1L培养物的周质提取物纯化。两种人源化抗体(scFv hu33和hu36)均以约0.6mg/L培养物的产率以可溶性形式纯化。在SDS-PAGE中，蛋白质以约30kDa的预期大小迁移(图1A)。纯度被估计为>90％。在使用表达人FAP的HT1080细胞(稳定转染子)进行的流式细胞计量术实验中，观察到scFv hu36和也在细菌中产生的mo36scFv具有类似结合(未显示)。EC50值处于低纳摩尔范围内。在较高浓度下观察到一些差异(图1B)。在这些实验中，scFv hu33不显示结合或仅显示临界结合。因此，进一步开发集中于hu36。通过ELISA也观察到hu36scFv与重组人FAP(细胞外区域aa26-760；R&D systems)的结合，尽管结合稍微弱于对于mo36scFv观察的结合(图1C)。
产生对应于全长IgG1抗体的质粒，并且将其转染至CHO细胞中以在Lonza的CHO表达系统中以约1mg/L细胞培养物的产率产生抗体(实验室规模)。通过蛋白A色谱法来从细胞培养上清液纯化抗体。通过SDS-PAGE和尺寸排阻色谱法表征纯化蛋白质。通过使用重组FAP以及用HRP缀合的抗人IgG抗体检测结合的抗体进行ELISA来分析生物活性。通过使用HT1080-FAP细胞系进行流式细胞计量术来分析细胞结合。
结果：
产生(并且测序)的质粒：
mo36IgG1：pEE14.4mo36-IgG1OCMTX001p(嵌合抗FAP IgG1)
hu36IgG1：pEE14.4hu36-IgG1OCMTX002p(人源化抗FAP IgG1)
实施例2–表征抗FAP抗体
以下分别显示人源化抗FAP IgG1hu36(hu36-IgG1)重链(HC)和轻链(LC)的氨基酸序列：
抗FAP hu36-IgG1-HC：
导致ADCC和CDC缺乏的突变以粗斜体显示(也参见WO99/58572)
信号序列被加框显示
VH结构域被加下划线；CDRH1-H3以粗体显示并加弯曲下划线。
抗FAP hu36-IgG1-LC：
aa 218
加工的HC的分子量 23,919
理论pI 7.77
信号序列被加框
VL结构域被加下划线；CDRL1-L3以粗体显示并加弯曲下划线。
hu36-IgG1-HC–无信号序列：
hu36-IgG1-LC–无信号序列：
hu36-CDRH1：
ENIIH(SEQ ID NO：7)
hu36-CDRH2：
WFHPGSGSIKYNEKFKD(SEQ ID NO：8)
hu36-CDRH3：
HGGTGRGAMDY(SEQ ID NO：9)
hu36-CDRL1：
RASKSVSTSAYSYMH(SEQ ID NO：10)
hu36-CDRL2：
LASNLES(SEQ ID NO：11)
hu36-CDRL3：
QHSRELPYT(SEQ ID NO：12)
完全hu36-IgG的参数如下：
在ELISA中分析纯化嵌合和人抗FAP抗体mo36和hu36与重组FAP的结合。两种抗FAP抗体均显示以类似EC50值(约5nM)特异性以及强烈结合至重组FAP(图2A)。此外，两种抗体均显示结合至在它们的细胞表面上表达人FAP的HTP1080-FAP(图2B)。人源化IgG相较于嵌合IgG产生更强烈信号，然而，EC50值类似。人源化hu36抗FAP抗体能够与人FAP和鼠FAP两者交叉反应，如通过FACS分析所示(图3A和3B)。Hu36-IgG1以浓度依赖性方式以次纳摩尔EC50值(0.33和0.25nM)结合两种细胞系。
对于按比例扩大，将抗体构建体克隆于GS双重载体(pEE14.4)中。将DNA质粒转化、扩增并短暂转染至CHOK1SV细胞中以在200ml的体积下进行表达评估。在第二步骤中，在5-10L大规模培养物中短暂表达抗体。使用一步蛋白A色谱法纯化澄清的培养物上清液。使用浓度是1mg/ml的纯化物质，以及内部人抗体作为对照样品，通过SE-HPLC、SDS-PAGE和LAL进行产物质量分析。
纯化蛋白质样品经0.2μm过滤器过滤，并且通过SE-HPLC色谱图加以分析。抗体被纯化至>98.8％。内毒素水平是<0.5EU/mg。
所有纯化蛋白质都通过SDS-PAGE在还原性和非还原性条件下分析(数据未显示)。
通过SDS-PAGE和尺寸排阻色谱法来表征纯化蛋白质hu36-IgG和mu36-IgG。通过使用重组FAP以及用HRP缀合的抗人IgG抗体检测结合的抗体进行ELISA来分析生物活性。通过使用HT1080-FAP细胞系进行流式细胞计量术来分析细胞结合。使用zetasizer nano，通过动态光散射来测定熔点。使用Attana A100，通过QCM来测定亲和力。通过间接免疫荧光共焦显微术来对可透化的细胞进行内化研究，用FITC标记的二级抗体检测结合和内化的抗体。
以实验室规模与更大规模均成功生产全长IgG1纯化的抗体以用于产生免疫缀合物。抗体性质的概述显示于表2中。抗体保留它们的特异性，如通过ELISA和流式细胞计量术实验所示。抗体以次纳摩尔EC50值结合FAP表达细胞。如通过QCM测定的亲和力与亲本抗体的亲和力相当。QCM测量结果指示亲合力效应有助于高亲和力结合。在不同IgG之间存在热稳定性差异(77-80℃)。
显示hu36-IgG1(人源化抗FAP抗体)对HT1080-FAP细胞的快速内化(参见图4和5)。
表2：抗体性质的概述
γ1*＝ADCC和CDC缺陷(参见Amour等,1999；Richter等,2013)。
抗FAP IgG1体内结合。
以1和5mg/kg的单剂量向胰腺癌的患者源性异种移植物小鼠腹膜内施用抗FAPIgG1hu36。在12、24和48小时施用之后切除肿瘤，用福尔马林固定并用石蜡包埋。用抗人IgG二级抗体对抗FAP hu36进行免疫检测。图12显示对仅在来自治疗小鼠的肿瘤样品中的间质的特异性剂量和时间依赖性染色。
实施例3-黑杆菌素-b A链
为避免可被释放在血流中的游离毒素的副作用以及为降低RIP毒素的潜在免疫原性(如以篦麻毒素广泛描述)，克隆并在细菌中表达黑杆菌素b的酶结构域即A链。本发明者假设如果在细菌中产生的A链能够保留它的活性，那么它将不能够进入细胞，除非缀合于诸如抗体的载体分子。
产生
在考虑细菌表达的密码子优化的情况下合成黑杆菌素-bA链，并且将合成的基因克隆于两种不同载体黑杆菌素_pET30b-3和黑杆菌素_pET33b-1(+/-His标签)中以在两种不同大肠杆菌菌株，即大肠杆菌BLR(DE3)和大肠杆菌HMS174(DE3)中表达。不同培养基用于检查不同表达条件。使用Capto Q色谱法和高效SP琼脂糖建立纯化方法。在5mg/ml下，在1XPBS(pH7.4)、0.5mM DTT、10％甘油中配制纯化的重组黑杆菌素-b A链(recNgA)。内毒素水平是＜1EU/mg黑杆菌素，并且呈单体形式的纯度＞99％。
Eldman N末端测序揭示recNgA的N末端对应于预期序列。
重组黑杆菌素-bA链氨基酸序列：
MIDYPSVSFNLDGAKSATYRDFLSNLRKTVVATGTYEVNGLPVLRRESEVQVKSRFVLVPLTNYNGNTVTLAVDVTNLYVVAFSGNANSYFFKDATEVQKSNLFVGTKQNTLSFTGNYDNLETAANTRRESIELGPSPLDGAITSLYHGDSVARSLLVVIQMVSEAARFRYIEQEVRRSLQQATSFTPNALMLSMENNWSSMSLEIQQAGNNVSPFFGTVQLLNYDHTHRLVDNFEEIYKITGIAIILFRCSSPSND(SEQ ID NO：13)
重组黑杆菌素-bA链具有以下特征：
氨基酸的数目：256
分子量：28546.0
理论pI：5.45
编码重组黑杆菌素-b A链的核苷酸序列如下：
材料
-黑杆菌素_pET30b-3遗传构建体。
-大肠杆菌(Migula)Castellani和Palmers BLR(DE3)
-培养基：自诱导培养基(AIM)
-提取培养物缓冲液：甘氨酸/NaOH 10mM、亮抑酶肽(Leupeptine)1μg/ml、胃酶抑素(Pepstatine)1μg/ml，pH 9.5。
-提取上清液缓冲液：Tris-HCl 50mM、NaCl 200mM、MgCl2 2mM、亮抑酶肽1μg ml-1、胃酶抑素1μg ml-1、溶菌酶0.1mg ml-1，pH8.0。
-透析溶液：柠檬酸/NaOH 25mM，pH 5.0。-Capto Q FPLC：平衡缓冲液A：甘氨酸/NaOH 50mM pH 9.5。洗脱缓冲液B：甘氨酸/NaOH 50mM(pH 9.5)、NaCl 1M。
-从Capto Q步骤汇集的级分(+80ml提取液)。
-SP琼脂糖HP FPLC：平衡缓冲液A：柠檬酸25mM，pH 4.0。洗脱缓冲液B：柠檬酸25mM(pH 4.0)、NaCl 1M。
方法
在1L形式的具有30μg ml-1卡那霉素的自诱导培养基(AIM)中培养持有表达黑杆菌素_pET30b-3的大肠杆菌BLR(DE3)。在生长约3-4小时之后，通过乳糖活化和葡萄糖消耗来触发蛋白质表达。接着，使温度降低至20℃，持续过夜。
对于提取，初始将各细胞沉淀再混悬于80ml提取缓冲液/培养物l中，并且在8℃下在振荡下孵育30分钟之后进行3个在1100-110巴下崩解7分钟的循环。接着提取物经受在15,900g、8℃下离心60分钟。上清液是纯化的原料。
Capto Q FPLC：将从81培养物提取的160ml产物上样至160ml Capto Q中，并且使用4CV平衡缓冲液平衡并用15CV平衡缓冲液洗涤。分三步进行洗脱：在1.5mS/cm下15CV(7.6％B)；在23.8mS/cm下20CV(18.9％B)；20CV 100％B。
在以下条件下进行透析：于25mM柠檬酸/NaOH(pH 5.0)中的4x5L浴内来透析650ml产物，截断值6-8000Da。透析因子约3500，<24小时。在透析之后，在20,500g和8℃下离心30分钟使得可溶性级分与不溶性级分分离。在透析前和透析后均对总级分和可溶性级分进行SDS-PAGE(10μl上样于SDS-PAGE上)。将洗脱液透析至PBS(pH 7.4)中，并且使用2x20cm2EKV过滤器进行过滤。
SP琼脂糖HP：将610ml在25mM柠檬酸(pH 5.0)中透析的Capto Q汇集物上样至采用4CV平衡缓冲液的240ml高效SP琼脂糖中，并且用15CV平衡缓冲液洗涤并以25Cv梯度至20％B；4CV 100％B步骤洗脱。
在PBS(pH 7.4)、0.5mM DTT中透析从SP琼脂糖HP步骤汇集的级分(5x4L浴，汇集级分是950mL，在0.97mg/ml下)。截断值是6-8000Da，透析因子是约3130，时间>24小时。之后，在20,55g和8℃下离心30分钟使得可溶性级分与不溶性级分分离。之后添加10％甘油。
最后，将洗脱液透析至PBS(pH 7.4)(5次浴，约3100)中并进行过滤，接着将recNg b A批料快速冷冻在-80℃下。稍后以半制备性S200Superdex进行SEC。
尺寸排阻色谱法和质谱测定法分析证明所得重组黑杆菌素-b A链(recNgA)的单体和纯化状态(图6)。
进行稳定性研究以评估pH和温度对黑杆菌素-b A链蛋白自身和它活性的影响。recNgA在5至9范围内的pH下，以及在存在或不存在甘油(10至45％)下是稳定的(数据未显示)。
活性
测试重组黑杆菌素-b A链在兔网织红细胞无细胞裂解物中的核糖体失活蛋白(RIP)活性：所得IC50值类似于天然黑杆菌素-b，并且在2.5至25pM范围内(参见图7)。因此，来自黑杆菌素-b，在细菌中以重组蛋白形式表达的A链维持它的酶活性，从而支持糖基化不为黑杆菌素-b A链的RIP活性所需。
如果在(-80℃)下冷冻储存以及低于3个冷冻-融化循环，那么RecNgA在兔网织红细胞无细胞裂解物中保留它的活性(未显示)。
通过基于结晶紫的存活力测定来测试recNgA对细胞培养物的细胞毒性活性。缺乏用以在细胞内易位的B链的recNgA呈现的毒性活性比天然黑杆菌素-b小100至1000倍，如图8中所示。天然黑杆菌素b显示IC50≈2x10-8M(类似于先前公布的数据；参见33)，而recNgA显示IC50≈2x10-6M。
先前公布的研究显示在RRL测定中，天然黑杆菌素b呈现的RIP活性高于篦麻毒素，而它在细胞中或在体内的毒性小得多(约30-10,000倍)(参见表3中的IC50和LD50值)。
在移除B链后，篦麻毒素A链在RRL测定与细胞毒性测定两者中均丧失活性。出乎意料的是，本发明中首次产生的黑杆菌素b A链仅在细胞细胞毒性测定中丧失活性，而它相对于天然黑杆菌素b在RRL测定中甚至增加。这些数据表明在篦麻毒素的情况下，移除B链不仅影响A链的结合和易位，而且也影响它的RIP活性，而对于黑杆菌素b A链来说，情况不是这样，所述黑杆菌素b A链相对于它的天然对应物保留乃至增加它的RRL活性。因此，在RRL中，黑杆菌素b A链的活性比篦麻毒素A链大50倍。
因此，在缀合后，黑杆菌素b A链缀合物比篦麻毒素A链缀合物(nM范围)呈现更高细胞毒性活性(IC50在pM范围内)(数据未显示)。
表3：篦麻毒素和黑杆菌素(天然和A链)的体外和体内活性数据。
(本发明者的自有数据–黑杆菌素b A链；也参见Ferreras J.M.等,Toxins,3:420,2011；Svinth M.等,BBRC,249:637,1998)
实施例4–使黑杆菌素-b A链缀合于抗FAP抗体
对于含有RIP以展现最大细胞毒性的免疫缀合物，RIP必须以完全活性形式从靶向性载体释放，此需要避免空间位阻(34)。二硫键是符合这个准则的唯一连接类型(35,36)。这个键允许使用用于引入游离巯基基团的试剂进行缀合，所述试剂诸如3-(2-吡啶基-二硫代丙酸N-琥珀酰亚胺酯)(SPDP)和4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯(SMPT)。由通过位阻化二硫化物接头共价结合于毒素的mAb组成的免疫毒素，常被标注为第二代免疫毒素的免疫毒素，是稳定的，长寿的，并且显示对靶细胞的有效细胞毒性(37)。
SPDP已用于制备含有黑杆菌素b的免疫毒素(IT)(38,39)。此外，SMPT保护二硫键免遭由硫醇盐阴离子攻击，从而改善连接的体内稳定性(40,41)。
材料
-重组黑杆菌素b A链于PBS(pH 7.4)、10％甘油、0,5mM DTT、4.92gl-1中，储存在5℃下。
-5,5'-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸)
-GE PD MiniTrap G-10脱盐柱。
-0.2μm 28mm无菌Minisart过滤器。
-Sciclone ALH 3000工作站。
-Sarstedt 96孔平底微型测试板，参考号82.1581。
方法
二硫苏糖醇(DTT，克莱兰氏试剂(Cleland′s reagent))是一种将用于使蛋白质样品中存在的硫醇基团游离的氧化还原剂。一旦所述基团已被游离并且因此可用于反应，即将添加5,5'-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸)(埃尔曼试剂(Ellman reagent))。埃尔曼试剂二硫桥将被裂解，并且2个所得硫基-硝基苯甲酸盐分子(TNB)将在硫醇基团位点处连接于蛋白质。为滴定TNB，将在λ＝412nm(即DTT不被吸收，从而赋予硫醇基团浓度所处的波长)下获取吸光度值。这些值与由蛋白质在λ＝280下的吸光度获取的蛋白质浓度的比例将产生每个蛋白质分子的游离硫醇基团的数目。
如下进行直接硫醇滴定：
将204μl recNg b A溶解于796μl 20mM磷酸盐、250mM NaCl、1mM EDTA(pH 7.0)(测定缓冲液)中(1.0033gl-1＝最终浓度)。将埃尔曼试剂在3gl-1下溶解于0.2M磷酸盐中。对于两种缓冲液，均以1.61比1质量比例添加磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。在室温下调整PH，并且过滤缓冲液。制备100ml埃尔曼缓冲液和500ml测定缓冲液。将Ellman试剂完全再混悬而非称重。
在室温下在4.8mM DTT存在下孵育recNgA样品30分钟。接着在柱中纯化recNgbA样品，并且等分前10ml洗脱液(V＝0.5ml)。获取等分试样的A280，并且混合两个最浓等分试样。再次获取A280。添加10μl 3gl-1DTNB，并且在2分钟之后测量A412(n＝1)，使用在测定缓冲液中以相同浓度稀释的埃尔曼试剂作为空白(nb＝3)。读数属于0.1-3AU线性范围。在涡旋之后，将蛋白质溶液吸移恰好处于弯月面下方。每孔吸移100μl。
这个研究的结果显示属于recNgA的单一半胱氨酸残基的硫醇基团是游离的，并且可用于反应，而非由它的三级结构阻断。这将允许recNgbA使用需要位阻化链间二硫键的接头加以缀合。
明确确定的是含有核糖体失活蛋白的免疫缀合物仅在毒素分子以完全活性形式从靶向性载体释放时展现最大细胞毒性。RIP分子从载体分离为避免空间位阻以及允许毒素有效易位至细胞质中所需(34)。目前，二硫键是似乎符合这些准则的唯一连接类型(36)。
两个不同蛋白质大分子的导致异二聚体形成的偶联要求各蛋白质在混合它们以进行反应之前被修饰。在2型RIP的A链的情况下，修饰限于还原性裂解连接分子的活性(A)链和结合(B)链的天然半胱氨酸残基。
对于IgG分子，这是不可能的，因为半胱氨酸残基参与维持蛋白质的三级和/或四级结构，以致不可能使它们还原而不损失特定蛋白质功能。此外，推测一些半胱氨酸残基并非在空间上可及，如由每个免疫球蛋白必须产生10个硫醇基团以达成最优缀合于活化的RIP所证明(42)。
出于这些原因，在大多数IgG分子中，使用异双官能试剂化学插入硫醇基团，并且已开发若干方法来产生异缀合物，从而避免形成同聚物或使同聚物的形成降至最少。在大多数情况下，用于引入硫醇基团的试剂与氨基基团反应，从而形成酰胺键或脒键。氨基基团是反应性的，充足的，并且以有限方式对于大多数蛋白质来说是可消耗的。也就是说，有限数目的氨基基团可被修饰而不减弱蛋白质的生物活性(36)。
最通常使用的引入游离巯基基团的试剂是3-(2-吡啶基-二硫代丙酸N-琥珀酰亚胺酯)(SPDP)和4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯(SMPT)，其通过与氨基基团反应以形成中性酰胺来将2-吡啶基二硫化物基团引入蛋白质中；以及4-巯基丁酰亚胺酸甲酯(2-亚氨基硫杂环戊烷，特劳特氏试剂(Traut’s reagent))，其引入巯基丁酰亚胺基基团，反应以形成带电荷的脒，由此保持衍生化氨基酸的正电荷(36,41)。
SPDP和SMPT引入位阻化二硫键，而2-亚氨基硫杂环戊烷–SH必须通过使它与5,5’-二硫代双-2-硝基苯甲酸(埃尔曼氏试剂)反应加以保护。
与埃尔曼氏试剂的反应也用于快速测量蛋白质巯基基团(43,44)。
SMPT具有连接于与二硫键邻近的碳原子的甲基基团和苯环，其保护二硫键免遭由硫醇盐阴离子攻击，由此改进连接的体内稳定性(40,41)。
基于这些数据，IgG蛋白可用SMPT修饰，此不显著影响分子在以下条件下的抗原结合性质，即使它们改变蛋白质在反应位点中的电荷。
在本研究中，本发明者研究遵循缀合方案(36)，在使用SMPT:mAb摩尔比6进行衍生化之后，使用2种不同recNgA:mAb摩尔比2.5和3.5使人源化抗FAP-IgG1与recNgA缀合。通过尺寸排阻色谱法在Sephacryl S200上进行纯化(37)。
在所述条件下，免疫毒素主要是连接于一个或两个毒素分子的抗体的混合物，其中存在高分子量组分(连接于若干RIP蛋白的IgG)以及游离和聚合物RIP(在recNgA的情况下是二聚体)和游离抗体。因此，仔细纯化被认为获得纯产物是所需的。
生物化学表征
如下产生并表征抗FAP hu36-IgG1-recNgA免疫毒素缀合物：
缀合物HPS131-001-1
浓度0.277mg/ml
药物:抗体比率(DAR)：1.8
PM：182kDa
纯度：87％(13％游离mAb)
体外活性测试
通过评估RIP在兔网织红细胞无细胞裂解物(RRL)测定中的活性(图9)以及对细胞培养物的细胞毒性作用(图10A和10B)来对如上所述制备的缀合物进行活性测试。
RRL测定结果显示抗FAP hu36-IgG1-recNgA缀合物(HPS131-001-1)与天然黑杆菌素-b或recNgA呈现类似IC50值，并且在3pM范围内，从而显示了抗体缀合不减弱recNgA的酶活性(参见图9)。
细胞细胞毒性结果显示在HT1080野生型细胞上，缀合抗体HPS131-001-1仅显示略微毒性(如果有的话)并且仅在最高浓度下显示，裸露的抗FAP hu36-IgG1不具有任何作用，并且recNgA仅在10-6M下以及在72小时孵育之后显示细胞毒性作用(参见图10A)。
然而，在FAP表达性细胞(HT1080-FAP)上，仅HPS131-001-1缀合的抗FAP抗体在皮摩尔浓度范围内以5pM的IC50值强烈降低HT-1080-FAP细胞存活力(参见图10B)。
这些结果显示：1)抗FAP:recNgA免疫毒素在体外具有高度活性，在皮摩尔范围内具有细胞毒性；2)活性对于FAP表达是高度特异性的，因为未观察到在HT1080-WT中的显著作用；3)抗FAP hu36-IgG1对它的靶标的特异性不受与recNgA缀合影响，recNgA的酶RIP活性也不受与recNgA缀合影响；4)活性为缀合的抗FAP hu36-IgG1所特有，因为在裸露的IgG1的情况下未观察到作用；5)抗FAP:recNgA免疫毒素被内化，因为非缀合的recNgA(缺乏膜结合结构域)显示几乎无细胞毒性作用(IC50>1μM)(参见图8)。
总之，抗FAP:recNgA免疫毒素在体外能够特异性识别靶标(FAP)，在胞质液内内化，并且释放recNgA效应物部分以主动抑制核糖体，从而产生在皮摩尔范围内的细胞毒性IC50值。
体内评估抗肿瘤作用
已在胰腺癌的细胞源性异种移植物小鼠模型与患者源性异种移植物小鼠模型两者中体内测试免疫毒素抗FAP:recNgA。首先进行剂量范围研究以限定在正常小鼠以及这些模型中的各个中的最大耐受剂量：在3周期间一周一次腹膜内施用5至0.1mg/kg的剂量，并且每2天监测动物重量以检测由于免疫毒素的毒性作用导致的可能重量减轻。结果呈现于图13中。
高剂量(>0.5mg/kg)在正常小鼠中诱导肝毒性，而在对其中已描述低FAP表达的子宫和骨骼肌的病理性分析之后未观察到FAP依赖性毒性(Dolznig H.等,Cancer Immun.,5:10,2005；Roberts E.W.等,J.Exp.Med.,210:1137,2013)，也未在心脏和肾中观察到FAP依赖性毒性。在胰腺癌的细胞系源性原位(图13)和患者源性皮下(图14A)异种移植物鼠模型中，低于0.5mg/kg的剂量不诱导任何可检测的非特异性毒性。
在接着在0.5至0.1mg/kg的无毒剂量下进行的功效研究中，以单一药剂形式或与吉西他滨(240mg/kg)组合施加的抗FAP:recNgA免疫毒素已显示在FAP(-)细胞系源性原位异种移植物鼠模型中无体内抗肿瘤功效(未显示)，而在胰腺癌的FAP(+)患者源性皮下异种移植物鼠模型中，在0.5mg/kg的剂量下证实高体内抗肿瘤功效(图14B)。当与吉西他滨(150mg/kg)组合时，它甚至显示100％肿瘤生长抑制和肿瘤消退。
实施例5–溶细胞素和它们与抗FAP抗体的缀合
微管溶素是近来发现的从粘细菌(Myxobacteria)分离的天然化合物，能够使微管蛋白骨骼去稳定，从而以极高活性诱导凋亡。
由于导致快速不可逆和极大的细胞形态变化，微管溶素和它们的合成四肽类似物溶细胞素是高度有效的细胞杀灭剂(nM至pM活性)。微管溶素A以0.75-1μM的IC50在体外抑制微管蛋白聚合，由此阻断有丝分裂纺锤体的形成以及诱导细胞周期阻滞在G2/M期。微管溶素通过结合在微管蛋白的长春花碱结合位点上来与长春花碱激烈竞争。此外，它们在富含溶酶体的细胞级分中是稳定的(45-48)。
经缀合检验，许多不同微管溶素/溶细胞素衍生物可通过以足以用于临床前和临床开发的量进行全合成来获得；它们的结构中的官能团可适应于若干不同接头技术。
用于缀合研究的溶细胞素选自以上显示的一般结构(式IV)。这些结构展现针对不同癌细胞系的活性(nM至pM范围)。
各种接头系统可被使用并连接于分子的R2位或R17位。
包括vcPABA接头和抗FAP抗体的溶细胞素缀合物的一般性概述显示于图11中(在图11中描绘的结构中，溶细胞素与vcPABA接头的连接位点在R1位或R4位处–图11中使用的R1和R4编号系统不同于例如在权利要求中使用的R基团编号系统；图11的R1意在对应于权利要求中的R2，并且图11的R4对应于权利要求的R17)。
vcPABA(缬氨酸-瓜氨酸-PABC)蛋白酶可裂解接头先前已用于ADC分子布妥昔单抗维多汀(Brentuximab Vedotine)中，所述ADC分子由Seattle Genetics和Takeda开发，并且近来由FDA和EMEA以批准(分别是2011年，和2012年11月)。在这个ADC中，vcPABA已在它的游离NH2处偶联于马来酰亚胺己酰基以用于基于硫醇而缀合在mAb(cAC10抗CD30抗体)上。在另一侧，vcPABA已通过它的COOH缀合于来自Seattle Genetics的奥莉斯汀细胞毒性药物(MMAE)。(参见49)
本发明者已使用这个接头(马来酰亚胺己酰基-vcPABA)通过基于硫醇的与马来酰亚胺己酰基的反应来缀合抗FAP抗体，并且在另一端，使溶细胞素细胞毒性分子通过它的环状哌啶与vcPABA缀合(溶细胞素的R1位或R4位显示于图11中)。
合成马来酰亚胺基-val-cit-PABOCO-微管溶素/溶细胞素-TAM461：
将TAM461和TAM465在干燥条件下溶解于无水DMF中，并且用HOBt和DIPEA处理所得溶液。在室温下搅拌反应物18小时。浓缩反应混合物，并且所得油状物通过使用2-6％甲醇:DCM进行柱色谱法加以纯化以产生35mg(64％)呈白色固体状的TAM467。ESI-MS:m/z＝1371[M+H]。
合成马来酰亚胺基-val-cit-PABOCO-微管溶素/溶细胞素-TAM470：
将TAM470和TAM466在干燥条件下溶解于无水DMF中，并且用HOBt和DIPEA处理所得溶液。在室温下搅拌反应物18小时，接着用TLC分析，指示反应完成。浓缩反应混合物，并且所得油状物用使用4-12％甲醇:DCM的柱色谱法纯化以产生56mg TAM471(产率：62％)。ESI-MS：1384.6[M+1]。
进行体外活性测试。将通过微管抑制测定评估功能活性，而通过结晶紫存活力测定来测定细胞毒性活性。
产生溶细胞素-接头衍生物
根据图11中呈现的一般结构合成不同溶细胞素-接头衍生物，其中vcPABA接头单独或与乙二醇间隔基(EG；n＝1至3)一起添加在R1位(TAM467、TAM551)或R4位(TAM471、TAM553、TAM558)中或被乙二醇基团(n＝3)取代(TAM552)。相应化学结构呈现于表4中。
表4–溶细胞素-接头衍生物的化学结构
通过微管蛋白聚合抑制测定(TPI；微管蛋白聚合测定试剂盒；Cytoskeleton，目录号BK011P)以及在HT1080细胞上的细胞增殖阻滞(CPA；结晶紫)来评估各新型衍生物的微管抑制活性和细胞毒性活性。计算IC50，并且结果呈现于表5中。
表5：溶细胞素-接头衍生物的微管抑制活性和细胞细胞毒性活性。(ND：未测出)
亲本溶细胞素TAM334的体外活性与当前用于产生抗体-药物缀合物(诸如奥莉斯汀(MMAE)或美登木素(DM1-DM4))的其它有效载荷的相同范围内。如对于来自微管溶素A家族的其它化合物所预期以及先前所述，在添加接头后，相对于亲本化合物TAM334，溶细胞素的细胞细胞毒性活性降低。此外，在两种测定中，TAM467衍生物均呈现显著最低活性。所有衍生物都在缀合中用于产生ADC分子。
ADC的缀合和化学表征
遵循非位点特异性缀合方法，使各新产生的衍生物缀合于半胱氨酸残基上的抗FAP hu36。为了这个目的，使一批抗体还原并与各衍生物反应。测试不同TCEP比率以达到3-4的最优DAR，小于10％的游离抗体和药物。最优缀合条件如下：TCEP＝2.5和3.57硫醇水平埃尔曼氏试剂。接着在G25Sephadex上纯化缀合物，并且通过尺寸排阻色谱法(SEC)分析以测定它们的纯度，以及通过疏水性相互作用色谱法(HIC)和聚合液体反相色谱法(PLRP)以测定DAR、游离抗体的含量和不同ADC物质的分布概况(0-8药物/mAb)。通过紫外检测方法在280nm下评估游离药物的含量。确定每种ADC和游离抗体的化学分析结果(SEC、HIC和PRLP概况)(数据未显示)。ADC的生物化学特征显示于表6中。
表6：不同ADC分子的化学特征的概述
各种药物产生不同聚集水平。具体来说，ADC HPS157-039-002(TAM551)已在DAR＝3.08下显示最高聚集水平，留有22.4％未缀合抗体。与TAM467的初步缀合也显示高聚集水平：在DAR 3.27下，SEC纯度已仅为67％，有16％游离药物(数据未显示)。这些数据表明在这些条件下，对于这个类型的溶细胞素分子，vcPABA接头在R1位中明显不太理想。
缀合物的靶标结合
通过ELISA分析抗FAP hu36:TAM471ADC与huFAP融合蛋白的结合，以及通过FACS分析抗FAP hu36:TAM471ADC与HT1080-FAP细胞的结合(图15)。对于FACS分析，在连续稀释度下(图15B)或在一种稀释度下(图15C；10nM)孵育化合物，并且用抗人IgG-PE(γ链特异性)检测。
在两种测定中获得的EC50值显示对于裸露的抗hu/moFAP hu36抗体无显著差异(图15A和15B)。未观察到诸如HT1080-wt和HEK293细胞的FAP(-)细胞中的结合(图15C)。
图16显示ADC-471(图16B)特异性结合并在90分钟之后被完全内化于HT1080-FAP细胞中，此类似于裸露的抗FAP抗体(图16A)。这些结果证实缀合不影响抗FAP hu36IgG1的靶标特异性和亲和力或内化能力。
实施例6–评估体外细胞毒性活性和体内抗肿瘤作用
通过增殖阻滞测定(结晶紫染色)来在体外评估抗FAP:溶细胞素ADC候选物。结果呈现于图17中，并且IC50值呈现于表7中。在胰腺癌的患者源性异种移植物(PDX)小鼠模型(PAXF-736)中评估各ADC候选物的抗肿瘤作用。先前选择这个模型来获得FAP表达水平和间质扩增。一周一次在2.5mg/kg下腹膜内施用ADC化合物。一周两次测量肿瘤体积和体重。媒介物治疗的和吉西他滨治疗(150mg/kg)的PDX小鼠分别用作阴性和阳性对照组。结果显示于图18中。
单独vcPABA接头定位于R1位中(ADC-551)产生的缀合物相较于利用R4位的缀合物(ADC-471)具有小得多的体外细胞毒性活性(图17；表7)，并且无体内抗肿瘤活性(图18)。
向R4位中的vcPABA接头中增加作为间隔基的乙二醇基团的数目(ADC-471(n＝0)相对于ADC-553(n＝1)和ADC-558(n＝3))显示使体外FAP特异性细胞毒性活性(图17)和体内抗肿瘤作用(图18)增加。发现具有3个乙二醇间隔基，但接头中不存在vcPABA的TAM552缀合物(ADC-552)展现最小或不展现体内抗肿瘤活性(数据未显示)。尽管ADC-471和ADC-553显示较低和不显示FAP特异性细胞毒性活性(分别是10nM和100nM IC50范围)，其中既在HT1080-WT与FAP细胞之间无差异，也在体内抗肿瘤作用方面也无差异，但ADC-558呈现1nM范围FAP特异性细胞毒性活性，其中在FAP(+)与FAP(-)HT1080细胞之间的特异性比率是500，并且在胰腺癌的PDX小鼠模型中，在2.5mg/kg剂量下呈现40％肿瘤生长抑制作用。在这个剂量下，对于候选物都既未观察到重量减轻，也未观察到毒性作用(未显示)。
表7：在增殖阻滞测定中获得的IC50值(nM)
化合物 HT1080-WT HT1080-FAP
TAM334 1.04 0.77
ADC-471(HPS-157-039-001) 5.6 10.33
ADC-551(HPS-157-039-002) 964 552
ADC-553(HPS-157-039-004) 90 108
ADC-558(HPS-157-039-005) 555 0.96
使用ADC-558进行进一步研究。在正常小鼠中进行最大耐受剂量(MTD)，并且发现ADC-558在2.5至25mg/kg剂量范围内持续3周进行每周治疗的情况下是无毒的。接着持续4周每周向具有高FAP表达水平和间质扩增的PDX小鼠模型(Panc185)施用20、10和5mg/kg的剂量以确认ADC-558缀合物的肿瘤生长抑制和完全消退功效。
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本文所述的特定实施方案是通过举例方式，而非通过限制方式提供。本文任何副标题皆仅为了方便起见而包括，并且不应解释为以任何方式限制本公开。
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Claims (80)

1.一种具有式I的缀合物：
A-(L-D)p (I)
或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中：
A是选择性结合FAP的抗体；
L是接头；
D是包括溶细胞素或黑杆菌素-b A链的药物；并且
p是1至10。
2.如权利要求1所述的缀合物，其中A是选择性结合至人FAP和/或鼠FAP的细胞外区域的单克隆抗体或其结合片段。
3.如权利要求2所述的缀合物，其中A包含具有以下氨基酸序列的重链互补决定区1-3(CDRH1-3)和轻链互补决定区1-3(CDRL1-3)：
(i)CDRH1：SEQ ID NO:7或其相较于SEQ ID NO:7的序列具有多达1或2个氨基酸取代的变体；
(ii)CDRH2：SEQ ID NO:8或其相较于SEQ ID NO:8的序列具有多达1或2个氨基酸取代的变体；
(iii)CDRH3：SEQ ID NO:9或其相较于SEQ ID NO:9的序列具有多达1或2个氨基酸取代的变体；
(iv)CDRL1：SEQ ID NO:10或其相较于SEQ ID NO:10的序列具有多达1或2个氨基酸取代的变体；
(v)CDRL2：SEQ ID NO:11或其相较于SEQ ID NO:11的序列具有多达1或2个氨基酸取代的变体；和
(vi)CDRL3：SEQ ID NO:12或其相较于SEQ ID NO:12的序列具有多达1或2个氨基酸取代的变体。
4.如权利要求3所述的缀合物，其中CDRH1-3分别包含SEQ ID NO:7-9的氨基酸序列，并且其中CDRL1-3分别包含SEQ ID NO:10-12的氨基酸序列。
5.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中A包含含与SEQ ID NO:5的全长序列具有至少90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)。
6.如权利要求5所述的缀合物，其中A包含含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区(VH)。
7.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中A包含含与SEQ ID NO:6的全长序列具有至少90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
8.如权利要求7所述的缀合物，其中A包含含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
9.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中A包含含与SEQ ID NO:3的全长序列具有至少90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链。
10.如权利要求9所述的缀合物，其中A包含含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链。
11.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中A包含含与SEQ ID NO:4的全长序列具有至少90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
12.如权利要求11所述的缀合物，其中A包含含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链。
13.如权利要求1或权利要求2所述的缀合物，其中A与具有SEQ ID NO:3的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:4的轻链氨基酸序列的抗FAP IgG1抗体竞争结合固定的重组人和/或鼠FAP。
14.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中D是式IV溶细胞素：
其中：
R2(i)直接或间接连接于接头L或(ii)是H或C1-C4烷基；
R6是C1-C6烷基；
R7是C1-C6烷基、CH2OR19或CH2OCOR20，其中R19是烷基，R20是C2-C6-烯基、苯基或CH2-苯基；
R9是C1-C6烷基；
R10是H、OH、O-烷基或O-乙酰基；
f是1或2；
R11具有以下结构：
其中
R21是H、OH、卤素、NH2、烷基氧基、苯基、烷基氨基或二烷基氨基；
R16是H或C1-C6-烷基基团；
R17(i)直接或间接连接于接头L或(ii)是CO2H、CO2R18、CONHNH2、OH、NH2、SH或任选取代的烷基、环烷基、杂烷基或杂环烷基基团，其中R18是任选取代的烷基、杂烷基或杂环烷基基团；并且
q是0、1、2或3；
并且其中术语“任选取代的”涉及其中一个或若干个H原子可被F、Cl、Br或I或OH、SH、NH2或NO2置换的基团；术语“任选取代的”进一步涉及可仅仅或另外被未取代的C1-C6烷基、C2C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C10环烷基、C2-C9杂环烷基、C6-C10芳基、C1-C9杂芳基、C7-C12芳烷基或C2-C11杂芳烷基基团取代的基团。
15.如权利要求14所述的缀合物，其中R2是至接头L的键。
16.如权利要求14所述的缀合物，其中R17是C(O)X、CONHNHX、OX、NHX或SX，其中X是至接头L的键。
17.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中接头L进一步包含间隔基。
18.如权利要求17所述的缀合物，其中所述间隔基具有2至30个原子的链长度。
19.如权利要求17或权利要求18所述的缀合物，其中所述间隔基包含以下或由以下组成：亚烷基(即二价烷基)或亚杂烷基(即二价杂烷基)基团。
20.如权利要求17至19中任一项所述的缀合物，其中所述间隔基包含以下或由以下组成：亚烷基或氧基亚烷基基团。
21.如权利要求20所述的缀合物，其中所述间隔基包含以下或由以下组成：基团-(CH2)n-或-(OCH2CH2)n-，其中n≥1。
22.如权利要求21所述的缀合物，其中所述间隔基包含以下或由以下组成：基团-(OCH2CH2)n-，其中n≥1。
23.如权利要求21或权利要求22所述的缀合物，其中n＝1至15、1至10、1至6或2至5。
24.如权利要求23所述的缀合物，其中n＝3或4。
25.如权利要求17至24中任一项所述的缀合物，其中所述间隔基直接连接于基团R17，或经由桥连基团连接于基团R17。
26.如权利要求25所述的缀合物，其中所述间隔基经由-C(O)X桥连基团连接于基团R17，其中X是至R17的键。
27.如权利要求26所述的缀合物，其中R17是CONHNHX，并且所述间隔基经由-C(O)X桥连基团连接于基团R17，其中X代表所述间隔基与R17之间的键。
28.如权利要求27所述的缀合物，其中R17是CONHNHX，并且所述间隔基是经由-C(O)X桥连基团连接于R17的-(OCH2CH2)n-，其中n＝2、3或4。
29.如权利要求14所述的缀合物，其中D包括具有以下结构的溶细胞素：
30.如权利要求14所述的缀合物，其中D包括具有以下结构的溶细胞素：
31.如权利要求14至30中任一项所述的缀合物，其中L包含用于连接于A的连接基团和蛋白酶可裂解部分。
32.如权利要求31所述的缀合物，其中L包含缬氨酸-瓜氨酸单元。
33.如权利要求32所述的缀合物，其中L包括马来酰亚胺基己酰-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲基氨基甲酸酯。
34.如权利要求33所述的缀合物，其中使马来酰亚胺的双键与所述抗体A的半胱氨酸残基的硫醇基团反应以形成硫-碳键来实现所述接头L连接于所述抗体A。
35.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中–L-D具有选自由以下组成的组的结构：
36.如权利要求35所述的缀合物，其中–L-D具有以下结构：
37.如权利要求14所述的缀合物，其中–L-D具有以下结构：
38.如权利要求14所述的缀合物，其中–L-D具有以下结构：
39.如权利要求1所述的缀合物，其中所述缀合物是在本文中描述为ADC-558的缀合物。
40.如前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中p是1、2、3、4或5。
41.如权利要求1至13中任一项所述的缀合物，其中D是缺少黑杆菌素-b B链的黑杆菌素-b A链。
42.如权利要求41所述的缀合物，其中所述黑杆菌素-b A链的氨基酸序列包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:13的序列。
43.如权利要求41或权利要求42所述的缀合物，其中所述黑杆菌素-b A链是在细菌宿主细胞中重组产生。
44.如权利要求41至43中任一项所述的缀合物，其中L包含或是二硫键。
45.如权利要求41至44中任一项所述的缀合物，其中p是1至5。
46.如前述权利要求中任一项所定义的缀合物，其用于医学中。
47.如前述权利要求中任一项所定义的缀合物，其用于治疗哺乳动物受试者的肿瘤的方法中。
48.根据权利要求47所述的供使用的缀合物，其中所述缀合物用于与一种或多种其它抗肿瘤药物同时、依序或分开施用。
49.根据权利要求48所述的供使用的缀合物，其中所述一种或多种其它抗肿瘤药物包括细胞毒性化学治疗剂或抗血管生成剂或免疫治疗剂。
50.根据权利要求49所述的供使用的缀合物，其中所述一种或多种其它抗肿瘤药物包括吉西他滨、凯素贝伐单抗、伊曲康唑、羧基酰胺基三唑、抗PD-1分子或抗PD-L1分子。
51.根据权利要求50所述的供使用的缀合物，其中所述抗PD-1分子或抗PD-L1分子包括尼鲁单抗或派姆单抗。
52.根据权利要求47至51中任一项所述的供使用的缀合物，其中所述肿瘤是实体肿瘤。
53.根据权利要求52所述的供使用的缀合物，其中所述治疗是关于胰腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、头颈癌、卵巢癌、膀胱癌或结肠癌。
54.一种治疗哺乳动物受试者的肿瘤的方法，其包括向有需要的所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1至45中任一项所定义的缀合物。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述缀合物与一种或多种其它抗肿瘤药物同时、依序或分开施用。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述一种或多种其它抗肿瘤药物包括细胞毒性化学治疗剂或抗血管生成剂或免疫治疗剂。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述一种或多种其它抗肿瘤药物包括吉西他滨、凯素、贝伐单抗、伊曲康唑或羧基酰胺基三唑、抗PD-1分子或抗PD-L1分子。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述抗PD-1分子或抗PD-L1分子包括尼鲁单抗或派姆单抗。
59.如权利要求54至58中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是实体肿瘤。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述肿瘤是关于胰腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、头颈癌、卵巢癌、膀胱癌或结肠癌。
61.如权利要求14至18中任一项所定义的溶细胞素的用途，其用于制备包含FAP特异性抗体的抗体-药物缀合物。
62.根据权利要求61所述的用途，其中所述FAP特异性抗体如权利要求2至13中任一项所定义。
63.如权利要求1至45中任一项所定义的缀合物，其用于治疗炎性疾患。
64.一种治疗哺乳动物受试者的炎性疾患的方法，其包括向有需要的所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1至45中任一项所定义的缀合物。
65.根据权利要求63所述的供使用的缀合物或根据权利要求64所述的方法，其中所述炎性疾患是类风湿性关节炎。
66.一种分离的黑杆菌素-b A链，其缺少黑杆菌素-b B链。
67.如权利要求66所述的分离的黑杆菌素-b A链，其中所述黑杆菌素-b A链的氨基酸序列包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:13的序列。
68.根据权利要求66或权利要求67所述的分离的黑杆菌素-b A链的用途，其用于制备免疫毒素。
69.根据权利要求68所述的用途，其中所述免疫毒素包含FAP特异性抗体。
70.根据权利要求69所述的用途，其中所述FAP特异性抗体如权利要求2至13中任一项所定义。
71.一种人单克隆抗体，其选择性结合FAP，并且包含含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链。
72.如权利要求71所述的抗体，其用于医学中。
73.如权利要求71所述的抗体，其用于治疗炎性疾患的方法中。
74.根据权利要求73所述的供使用的抗体，其中所述炎性疾患包括类风湿性关节炎。
75.如权利要求71所定义的单克隆抗体的用途，其用于制备抗体-药物缀合物或免疫毒素。
76.一种包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码至少一种具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的多肽的多核苷酸：SEQ ID NO:1-6和13。
77.如权利要求76所述的宿主细胞，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:14的核酸序列。
78.一种用于产生如权利要求41至45中任一项所定义的缀合物的方法，其包括：
(a)使选择性结合FAP的所述抗体衍生以引入至少一个巯基基团；以及
(b)使衍生化抗体和黑杆菌素-b A链在允许在所述抗体与所述黑杆菌素-b A链之间形成二硫键连接、由此产生所述缀合物的条件下反应；以及
(c)任选地，纯化和/或分离所述缀合物。
79.如权利要求78所述的方法，其中步骤(a)包括使所述抗体与4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯(SMPT)、3-(2-吡啶基-二硫代丙酸N-琥珀酰亚胺酯)(SPDP)或4-巯基丁酰亚胺酸甲酯反应。
80.一种用于产生如权利要求14至40中任一项所定义的缀合物的方法，其包括：
(a)使选择性结合FAP的所述抗体经由硫醇基团连接于所述接头；
(b)使所述溶细胞素连接于所述接头；以及
(c)任选地，纯化和/或分离所述缀合物，其中步骤(a)和(b)可以任何顺序进行。
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Legal Events

Date Code Title Description
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PB01 Publication
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GR01 Patent grant
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Application publication date: 20160928

Assignee: Yingshi Biotechnology (Nanjing) Co., Ltd

Assignor: Oncomatryx Biopharma, S.L.

Contract record no.: X2021990000175

Denomination of invention: Antibody drug conjugates and immunotoxins

Granted publication date: 20191011

License type: Exclusive License

Record date: 20210323

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