CN105974014A - 知母的一测多评检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种知母的一测多评检测方法，包括如下步骤：(1)取知母制备成供试品溶液；(2)取芒果苷配制成对照品溶液；(3)分别吸取所述供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测试，获取所述供试品溶液中芒果苷的保留时间和/或含量；(4)根据所述芒果苷的保留时间和/或含量，对所述供试品溶液中其余成分进行定性分析和/或定量分析。本发明以芒果苷作为对照品，构建了知母的一测多评检测方法，由此可以更好更全面的控制知母的质量，同时规避由多成含量测定带来的成本和操作问题，方法简单便于操作，且测定结果准确，方法重复性，耐用性好。

Description

知母的一测多评检测方法

技术领域

本发明涉及药物检测领域，特别是涉及一种知母的一测多评检测方法。

背景技术

如何有效地评价中药质量是中药现代研究面临的关键问题之一。中药多成分、多功效的作用特点决定着单一成分是难以表达中药质量的，多成分多指标的控制方式应运而生，而这种质量控制方式却带来了另一个问题——高昂的检测费用和繁琐检测操作。针对这一矛盾，很多专家学者提出了新的思路，其中一测多评的方法得到了广泛的认同，并已成功运用于常见中药中多种成分的含量测定。

知母为百合科知母属植物知母Anemarrhenaasphodeloides Bunge的干燥根茎，具有清热泻火、生津润燥等功效。黄酮类成分是知母主要的药效物质之一，知母中所含的黄酮类成分主要为双苯吡酮类，如芒果苷、新芒果苷、异芒果苷等。中国药典在对知母质量控制时主要采用的是对芒果苷的测定，控制手段相对简单，无法全面的控制知母的质量。

发明内容

基于此，有必要提供一种知母的一测多评检测方法。

一种知母的一测多评检测方法，包括如下步骤：

(1)取知母制备成供试品溶液；

(2)取芒果苷配制成对照品溶液；

(3)分别吸取所述供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测试，获取所述供试品溶液中芒果苷的保留时间和/或含量；

(4)根据所述芒果苷的保留时间对所述供试品溶液中其余成分进行定性分析，和/或，根据所述芒果苷的含量对所述供试品溶液中其余成分进行定量分析。

在其中一个实施例中，所述高效液相色谱仪的采用的流动相为：以乙腈为流动相A，体积浓度0.1-0.3％的冰乙酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱方式：0-8min，流动相A的体积百分数保持为9％；8-20min，流动相A的体积百分数由9％变化至20％；20-21min，流动相A的体积百分数由20％变化至9％；21-31min，流动相A的体积百分数保持9％。

在其中一个实施例中，所述冰乙酸水溶液的体积浓度为0.2％。

在其中一个实施例中，所述高效液相色谱仪的条件为：色谱柱为C18色谱柱；所述流动相的流速为0.8-1.2mL/min；柱温25-35℃；检测波长256-260nm。

在其中一个实施例中，所述高效液相色谱仪的条件为：色谱柱为WatersC18色谱柱；所述流动相的流速为1.0mL/min；柱温30℃；检测波长258nm。

在其中一个实施例中，所述其余组分为新芒果苷和异芒果苷。

在其中一个实施例中，步骤(4)为根据所述芒果苷的保留时间和含量，对所述供试品溶液中新芒果苷和异芒果苷进行定性分析和定量分析：

所述定性分析的方法为：所述新芒果苷和异芒果苷相对于所述芒果苷的相对保留时间依次为0.45-0.46和1.08-1.09；

所述新芒果苷或异芒果苷的保留时间通过公式(I)计算：

$T_m=\frac{T_k}{R_t}---\left(I\right)$

其中，T_k为芒果苷的保留时间，R_t为新芒果苷或异芒果苷相对于所述芒果苷的相对保留时间；

所述定量分析的方法为：所述新芒果苷和异芒果苷相对于所述芒果苷的相对校正因子依次为0.57-0.58和0.9-1.0；

所述新芒果苷或异芒果苷的含量通过公式(II)计算：

$W_m=\frac{W_k\×A_m}{f_{km}\×A_k}---\left(II\right)$

其中，A_k为芒果苷的峰面积，W_k为芒果苷的含量，A_m为新芒果苷或异芒果苷的峰面积，f_km为新芒果苷或异芒果苷相对于所述芒果苷的相对校正因子。

在其中一个实施例中，所述新芒果苷和异芒果苷相对于所述芒果苷的相对保留时间依次为0.46和1.09；

所述新芒果苷和异芒果苷相对于所述芒果苷的相对校正因子依次为0.574和0.929。

在其中一个实施例中，步骤(1)所述供试品溶液的制备方法为：

精密称定知母粉末，每0.1g所述知母粉末精密加入稀乙醇20-30mL，超声处理20-40min后，以0.22-0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

在其中一个实施例中，步骤(2)所述对照品溶液的制备方法为：

精密称取芒果苷，精密加入稀乙醇溶解配制成0.01-0.1mg·mL^-1的溶液，即得。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明以芒果苷作为对照品，构建了知母的一测多评检测方法，由此可以更好更全面的控制知母的质量，同时规避由多成含量测定带来的成本和操作问题，方法简单便于操作，且测定结果准确，方法重复性，耐用性好。

附图说明

图1为空白溶剂(A)HPLC图；

图2为混合对照品(B)HPLC图；

图3为知母样品(C)HPLC图；

图4为芒果苷、新芒果苷、异芒果苷的最大吸收光谱图；

图5为不同波长条件下样品分离的HPLC图；

图6为不同色谱柱条件下样品分离的HPLC图；

图7为不同流动相pH条件下样品分离的HPLC图；

图8为不同柱温条件下样品分离的HPLC图；

图9为不同流速条件下样品分离的HPLC图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的知母的一测多评检测方法作进一步详细的说明。

1仪器与试药

DIONEX Ultimate 3000高效液相色谱系统；Agilent1200系列高效液相色谱系统；Waters 2695高效液相色谱系统；色谱柱WatersC₁₈(5μm，250×4.6mm)；色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈(5μm，250×4.6mm)；色谱柱phenomenexNX-C18(5μm，250×4.6mm)；XS204型电子天平(d＝0.1mg，Mettler Toledo)；MX5型电子天平(d＝0.001mg，Mettler Toledo)；RHP-100型高速多功能粉碎机(浙江永康市荣浩工贸有限公司)；DHG-9245A型电热鼓风干燥箱(上海市一恒科学仪器有限公司)；KQ-500DA型数控超声波清洗仪(40KHz&500W，昆山市超声仪器有限公司)。

芒果苷(111607-200402，中国食品药品检定研究院)，新芒果苷(成都瑞芬思生物科技有限公司，经面积归一化法测定，纯度大于98％)、异芒果苷(成都曼思特生物科技有限公司，经面积归一化法测定，纯度99.81％)；乙腈(色谱纯，Merck)，冰乙酸(HPLC级，阿拉丁)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

知母为采自安徽亳州和河北安国的知母，经连林生高级工程师鉴定均为百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)的干燥根茎。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱Waters XBridge C₁₈(250×4.6mm，5μm)；流动相乙腈(A)和0.2％冰乙酸(B)，按表1中的规定进行梯度洗脱，流速1.0mL·min^-1，柱温为30℃，检测波长为258nm，进样量为5μL。在该色谱条件下，各待测成分分离度良好，空白溶剂、混合对照品与知母样品色谱图见图1-3。

表1梯度洗脱条件表

2.2对照品混合储备液的制备：

分别取新芒果苷、芒果苷、异芒果苷对照品适量，精密称定，加稀乙醇(《中国药典一部》附录XVB试液，20℃时体积浓度为49.5-50.5％)溶解，配制成含新芒果苷0.2mg·mL^-1、芒果苷0.1mg·mL^-1、异芒果苷0.025mg·mL^-1的混合对照品储备液，即得。

芒果苷对照品溶液的制备：取芒果苷对照品适量，精密称定，加稀乙醇溶解，配置成0.05mg·mL^-1的单标溶液，即得。

2.3供试品溶液的制备：

取知母粉末(过三号筛)约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25mL，称定重量，超声处理(功率400W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀。用0.22μm的微孔滤滤过，取续滤液，即得。

2.4系统适应性试验

分别精密吸取空白溶剂、混合对照品溶液、供试品溶液各5μL，进样分析，结果见图1。新芒果苷、芒果苷、异芒果苷与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，拖尾因子新芒果苷1.00～1.02，芒果苷1.05～1.10，异芒果苷1.03～1.07，理论塔板数以芒果苷色谱峰计在50000以上。

2.5线性范围

取“2.2”项下的混合对照品储备液，准确稀释1、2、4、5、10、20倍，配制成系列的混合对照品溶液，每个浓度分别进样5μL，以各对照品的进样量对峰面积进行回归处理，得新芒果苷、芒果苷和异芒果苷的回归方程及相关系数r，结果表明，各对照品的进样量与峰面积均呈良好的线性关系(表2)。

表2线性范围考察结果

2.6校正因子和相对保留时间计算

取“2.5”项下配制的系列浓度的混合对照品溶液，每个浓度分别进样5μL。以芒果苷为内标，按公式(A_k为参照物峰面积，W_k为参照物浓度，A_m为其他组分m峰面积，W_m为其他组分m浓度)和(T_k为参照物保留时间，T_m为其他组分m保留时间)，分别计算芒果苷对新芒果苷和异芒果苷的校正因子和相对保留时间，取平均值，结果表明，以芒果苷为参照物，新芒果苷和异芒果苷的响应因子分别为0.574和0.929，相对保留时间分别为0.46和1.09，RSD均小于2％(表3)。

表3校正因子和相对保留时间

2.7精密度试验

精密吸取同一混合对照品溶液5μL，连续进样6次，记录峰面积。精密度考察结果显示，新芒果苷峰面积RSD为0.60％，芒果苷峰面积RSD为0.26％，异芒果苷峰面积RSD为1.2％，RSD均小于2.0％，说明仪器精密度良好(表4)。

表4精密度考察试验

2.8稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于放置0、2、4、6、8、12、24、48h时进样分析，测定各待测物峰面积，计算含量。稳定性考察结果显示，0～24h内，新芒果苷含量RSD为0.45％，芒果苷含量RSD为1.3％，异芒果苷含量RSD为0.83％，RSD均小于2.0％，说明处理后的样品溶液中的新芒果苷、芒果苷、异芒果苷在24h内较稳定(表5)。

表5稳定性考察试验

2.9重复性试验

取同一批知母，按“2.3”项下方法制备供试品溶液6份，测得新芒果苷、芒果苷、异芒果苷的平均含量分别为1.25％、1.10％、0.098％，RSD分别为0.82％、0.73％、1.3％，RSD均小于2.0％，说明方法重复性良好(表6)。

表6重复性考察试验

2.10加样回收率试验

精密称取适量已知含量的知母粉末(过3号筛)6份，分别加入一定量的对照品，按“2.3”项下供试品溶液制备方法制备样品，测定含量，计算加样回收率。结果新芒果苷、芒果苷、异芒果苷的加样回收率分别为95.5％、100.6％、102.1％，RSD分别为1.9％、1.1％、2.5％，均符合加样回收率实验呢的要求(表7)。

表7加样回收率考察试验

2.11色谱条件考察

按照“2.3”项下供试品的制备方法制备供试品，取“2.5”项下配制的系列浓度的混合对照品溶液，进样体积均为5μL。分别考察了3根不同厂家的色谱柱(WatersC₁₈、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈、phenomenexNX-C₁₈)，柱温变化±5℃，检测波长变化±2nm，流速变化±20％，以及不同流动相pH值，进行测定时的仪器色谱行为变化。比较同一批知母中新芒果苷(Neo)、芒果苷(M)、异芒果苷(Iso)3个成分的测定含量，并比较其分离度、拖尾因子、理论塔板数。

(1)波长选择

采用DAD全波长扫描对照品溶液，分别测定新芒果苷、芒果苷和异芒果苷的最大吸收波长。紫外光谱图显示，新芒果苷在256.5nm处有最大吸收波长，芒果苷在257.8nm处有最大吸收波长，异芒果苷在255.9nm处有最大吸收波长。同时比较了256nm、258nm、260nm处三个成分的含量，无明显差异，因此检测波长最终设定为258nm(表8、图4、图5)。

表8不同波长实验结果(n＝6)

(2)色谱柱考察

考察WatersC₁₈、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈、phenomenexNX-C₁₈三种不同品牌的色谱柱对样品分离的影响。结果表明，三根色谱柱均能够对目标化合物获得良好分离，满足分析要求，考虑到WatersC₁₈的峰形较好，拖尾因子较其它两个品牌的色谱柱小，最终选择WatersC₁₈进行试验(表9和图6)。

表9不同色谱柱及高效液相色谱仪考察(n＝6)

(3)流动相pH值考察

考察不同pH流动相体系(水、0.1％冰乙酸、0.2％冰乙酸、0.3％冰乙酸)对样品分离情况的影响。结果表明，流动相里面添加冰乙酸能够明显改善色谱峰的峰形，而比较0.1％冰乙酸、0.2％冰乙酸和0.3％冰乙酸的体系，则峰形无明显差异，但是不同pH值的芒果苷含量差异较大，考虑到酸对目标成分的色谱行为具有较强的影响，为达到较为稳定的分析效果，最终选用0.2％冰乙酸体系进行试验(表10和图7)。

表10不同流动相pH值实验结果(n＝6)

(4)柱温考察

考察不同柱温(25℃、30℃、35℃)对样品分离的影响。结果表明，三个温度下的分离度无明显差异，均能达到良好的分离效果，柱温较低时，理论塔板数较高，但是峰形较差，30℃下的理论塔板数较35℃高，综合考虑方法的实用性，选择30℃柱温进行试验(表11和图8)。

表11不同柱温实验结果(n＝6)

(5)流速考察

考察不同流速(0.8mL·min^-1、1.0mL·min^-1、2.0mL·min^-1)对样品分离的影响。结果表明，三个流速下分离度无明显差异，低流速下的理论塔板数较高，而对比三者的对称因子，1.0mL·min^-1具有更优越的峰形，最终选择1.0mL·min^-1进行试验(表12和图9)。

表12不同流速实验结果(n＝6)

2.12耐用性试验

按照“2.3”项下供试品的制备方法制备供试品，取“2.5”项下配制的系列浓度的混合对照品溶液，进样体积均为5μL。以芒果苷为内标，分别计算新芒果苷和异芒果苷的相对校正因子，取平均值。分别考察了柱温变化±5℃，检测波长变化±2nm，流速变化±20％，流动相pH值变化，以及采用3根不同厂家的色谱柱(WatersC₁₈、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈、phenomenexNX-C₁₈)、3台不同品牌的色谱系统(Waters 2695、Agilent1200、DIONEX Ultimate 3000)进行测定时的校正因子的变化。同时，为了在仅采用芒果苷为对照品时，能够确认新芒果苷和异芒果苷色谱峰的位置，比较不同条件下的其他2个待测成分色谱峰与芒果苷色谱峰间的相对保留时间。

(1)检测器波长

考察不同波长256nm、258nm、260nm对标准溶液测定的影响，计算校正因子和相对保留时间，并结合色谱条件考察中相应的系统适应性参数，结果表明，波长变化对相对保留时间和系统适应性参数无明显影响，但是校正因子大于2.0％，波长对于该校正因子影响较大，需要控制波长(表13)。

表13不同检测器波长考察(n＝6)

(2)色谱柱及高效液相色谱系统

考察不同色谱柱和色谱仪对校正因子和相对保留时间的影响，结果表明，各成分的校正因子的RSD在1.4％～4.0％之间，相对保留时间的RSD在1.4％～4.6％之间，表明该方法耐用性较好(表14)。

表14不同色谱柱及高效液相色谱系统考察(n＝6)

(3)流动相pH值

考察三个不同流动相pH值的体系(0.1％冰乙酸水溶液、0.2％冰乙酸水溶液、0.3％冰乙酸水溶液)对标准溶液测定的影响，计算校正因子和相对保留时间，并结合色谱条件考察中相应的系统适应性参数，结果表明，流动相pH值对新芒果苷的校正因子有一定影响，为了保证结果的可靠性应适度控制范围(表15)。

表15不同流动相pH值耐用性考察(n＝6)

(4)柱温

考察不同柱温(25℃、30℃、35℃)对标准溶液测定的影响，计算校正因子和相对保留时间，并结合色谱条件考察中相应的系统适应性参数，结果表明，柱温对各成分的校正因子、相对保留时间等影响较小，通常情况下可以选择30℃进行实验(表16)。

表16不同柱温耐用性实验结果(n＝6)

(5)流速

考察不同的流速(0.8mL·min^-1、1.0mL·min^-1、2.0mL·min^-1)对标准溶液测定的影响，计算校正因子和相对保留时间，并结合色谱条件考察中相应的系统适应性参数，结果表明，流速对各成分的校正因子和相对保留时间影响较小，RSD小于2％，耐用性良好(表17)。

表17不同流速耐用性考察(n＝6)

2.13样品测定

分别精密吸取供试品、系列浓度的混合对照品、芒果苷单标溶液各5μL注入高效液相色谱仪，测定。分别采用一测多评法和外标法计算知母中新芒果苷、芒果苷、异芒果苷的含量，其中采用一测多评法的计算公式为：(A_k为参照物峰面积，W_k为参照物浓度，A_m为其他组分m峰面积，W_m为其他组分m浓度)。结果表明，一测多评法和外标法所测得的新芒果苷、芒果苷、异芒果苷的含量无明显差异，一测多评法可以用来测定知母3成分的含量(表18)。

表18不同来源知母中3种黄酮类成分的含量(一测多评法和外标法)

2.15与药典方法(芒果苷含量)的测定的结果比较

本发明的供试品处理方法与2015版《中国药典》项下的知母芒果苷测定的供试品处理方法一致，按“2.3”项下供试品处理方法制备低、中、高三个浓度，共6份知母供试品溶液，分别按照本发明中的测定条件和《中国药典》的测定条件测定芒果苷的含量，比较本发明建立的测定芒果苷的方法与药典测定结果的差异。结果表明，按照本发明建立的测定方法测定的芒果苷的含量与按照药典测定的结果无明显差异(表19)。

表19与药典方法(芒果苷含量)的测定的结果比较

综上可知，本发明采用HPLC法，以芒果苷为对照品，用外标法测定了其在知母中的含量，同时测定新芒果苷、异芒果苷的相对校正因子，然后用获得的相对校正因子计算新芒果苷、异芒果苷的含量，实现了一测多评。又用外标法测定了知母中新芒果苷、异芒果苷的含量，比较了其与采用相对校正因子计算值之间的差异。结果表明各成分采用相对校正因子计算的含量值与外标法测定值之间无显著性差异。一测多评法的适用性和可行性在知母3种黄酮类成分的含量测定中得到了验证。同时，本发明还对比了药典的测定方法(仅芒果苷的含量测定)，结果表明与药典检测结果一致，即该法在兼顾药典指标的同时还能同时兼顾其他成分的质量控制，基本不增加成本的同时，实现了知母质量控制的提升。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种知母的一测多评检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取知母制备成供试品溶液；

(2)取芒果苷配制成对照品溶液；

(3)分别吸取所述供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测试，获取所述供试品溶液中芒果苷的保留时间和/或含量；

(4)根据所述芒果苷的保留时间对所述供试品溶液中其余成分进行定性分析，和/或，根据所述芒果苷的含量对所述供试品溶液中其余成分进行定量分析。

2.根据权利要求1所述的知母的一测多评检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪的采用的流动相为：以乙腈为流动相A，体积浓度0.1-0.3％的冰乙酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱方式：0-8min，流动相A的体积百分数保持为9％；8-20min，流动相A的体积百分数由9％变化至20％；20-21min，流动相A的体积百分数由20％变化至9％；21-31min，流动相A的体积百分数保持9％。

3.根据权利要求2所述的知母的一测多评检测方法，其特征在于，所述冰乙酸水溶液的体积浓度为0.2％。

4.根据权利要求1所述的知母的一测多评检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪的条件为：色谱柱为C18色谱柱；所述流动相的流速为0.8-1.2mL/min；柱温25-35℃；检测波长256-260nm。

5.根据权利要求4所述的知母的一测多评检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪的条件为：色谱柱为WatersC18色谱柱；所述流动相的流速为1.0mL/min；柱温30℃；检测波长258nm。

6.根据权利要求1所述的知母的一测多评检测方法，其特征在于，所述其余组分为新芒果苷和异芒果苷。

7.根据权利要6所述的知母的一测多评检测方法，其特征在于，步骤(4)为根据所述芒果苷的保留时间和含量，对所述供试品溶液中新芒果苷和异芒果苷进行定性分析和/或定量分析：

所述定性分析的方法为：所述新芒果苷和异芒果苷相对于所述芒果苷的相对保留时间依次为0.45-0.46和1.08-1.09；

所述新芒果苷或异芒果苷的保留时间通过公式(I)计算：

$T_m=\frac{T_k}{R_t}---\left(I\right)$

其中，T_k为芒果苷的保留时间，R_t为新芒果苷或异芒果苷相对于所述芒果苷的相对保留时间；

所述定量分析的方法为：所述新芒果苷和异芒果苷相对于所述芒果苷的相对校正因子依次为0.57-0.58和0.9-1.0；

所述新芒果苷或异芒果苷的含量通过公式(II)计算：

$W_m=\frac{W_k\×A_m}{f_{km}\×A_k}---\left(II\right)$

其中，A_k为芒果苷的峰面积，W_k为芒果苷的含量，A_m为新芒果苷或异芒果苷的峰面积，f_km为新芒果苷或异芒果苷相对于所述芒果苷的相对校正因子。

8.根据权利要7所述的知母的一测多评检测方法，其特征在于，所述新芒果苷和异芒果苷相对于所述芒果苷的相对保留时间依次为0.46和1.09；

所述新芒果苷和异芒果苷相对于所述芒果苷的相对校正因子依次为0.574和0.929。

9.根据权利要求1-8任一项所述的知母的一测多评检测方法，其特征在于，步骤(1)所述供试品溶液的制备方法为：

精密称定知母粉末，每0.1g所述知母粉末精密加入稀乙醇20-30mL，超声处理20-40min后，以0.22-0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

10.根据权利要求1-8任一项所述的知母的一测多评检测方法，其特征在于，步骤(2)所述对照品溶液的制备方法为：

精密称取芒果苷，精密加入稀乙醇溶解配制成0.01-0.1mg·mL^-1的溶液，即得。