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CN105934252B - Tm4sf1结合蛋白及其使用方法 - Google Patents

Tm4sf1结合蛋白及其使用方法 Download PDF

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CN105934252B
CN105934252B CN201480060319.1A CN201480060319A CN105934252B CN 105934252 B CN105934252 B CN 105934252B CN 201480060319 A CN201480060319 A CN 201480060319A CN 105934252 B CN105934252 B CN 105934252B
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cancer
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antibody
tm4sf1
seq
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S-C·贾米内特
H·F·德沃拉克
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Beth Israel Deaconess Medical Center Inc
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Abstract

本发明涉及在包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的表位特异性结合多肽的化合物(如TM4SF1结合蛋白，例如抗TM4SF1抗体)。特别是，本发明的化合物在结合包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的表位之后能够被内化入TM4SF1表达细胞(例如，肿瘤细胞或生成血管的脉管内皮细胞)。本发明还提供用本发明的化合物治疗患有与病理性血管生成相关的病症的受试者的方法。

Description

TM4SF1结合蛋白及其使用方法
关于联邦政府资助研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院(NIH)授予的批准号P01CA92644下部分由政府支持进行的。政府对本发明享有一定的权利。
发明背景
血管生成是其中血管内皮细胞(EC)增殖、减少(prune)和重组以从先前存在的血管网络形成新血管的重要的细胞事件。有令人信服的证据表明血管供给的发展对于正常和病理性增生过程是必不可少的。氧气和营养物的输送以及分解代谢产物的去除，代表了发生在多细胞生物体内的大多数生长过程中的限速步骤。因此，已普遍认为血管隔室不但对于胚胎生成期间器官的发育和分化是必要的，而且对于成人伤口的愈合和再生功能也是必要的。
血管生成还牵涉多种病症的发病机制，包括但不限于：癌症、肥胖症、增殖性视网膜病、年龄相关性黄斑变性、肿瘤、红斑痤疮、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎(RA)、细胞免疫和牛皮癣。血管生成是由蛋白酶释放后局部位置(local venue)的胞外基质的降解、毛细血管内皮细胞的增殖和毛细血管向血管生成刺激物的迁移组成的级联过程。鉴于血管生成的显著的生理和病理重要性，许多工作一直被致力于阐明能够调节该过程的因素。
于1986年发现了为“L6抗原”或“肿瘤细胞抗原”的跨膜-4L6家族成员-1(TM4SF1)(Hellstrom等Cancer Res.46：3917-3923，1986)，因为它在许多癌细胞上大量表达。出乎意料的是，还发现它在供应正常组织的血管的血管内皮细胞上有少量表达(DeNardo等Int JRad Appl Instrum B.18:621-631,1991；Wright等Protein Sci.9:1594-1600,2000；Richman等Cancer Res.5916s-5920s,1995；O’Donnell等Prostate.37:91-97,1998)。TM4SF1被内衬于供应几种人类癌症的血管的EC(Shih等Cancer Res.69:3272-3277,2009；Zukauskas等Angiogenesis.14:345-354,2011)、被发育视网膜脉管的EC(English等JBiomed Inform.42:287-295,2009)以及被由表达VEGF-A的腺病毒在小鼠中诱导的新生血管的EC(Shih等Cancer Res.69:3272-3277,2009)高度表达，但是并不被许多其它类型的细胞高度表达(Shih等Cancer Res.69:3272-3277,2009；Zukauskas等Angiogenesis.14:345-354,2011)。
尽管结果表明TM4SF1有潜力作为用于治疗与病理性血管生成相关的病症如癌症的血管靶标，但是对于靶向TM4SF1(例如，TM4SF1特异性结合多肽，如抗TM4SF1抗体，如抗人TM4SF1抗体)并用于商业和治疗目的规模化的化合物仍存在未满足的需要。
发明概述
本发明部分基于特异性结合TM4SF1(例如，在TM4SF1的ECL2结构域上的特定表位)的化合物(例如抗体)的鉴定，该化合物具有表明它们特别有利于治疗(例如，与病理性血管生成相关的病症如癌症的治疗)的性质。
在第一方面，本发明的特征在于一种化合物，其包含与多肽的表位特异性结合的结合结构域，其中所述表位包含氨基酸序列NYTFASTEGQYLLDTSTWSECTEPKHIVEWNVS(SEQ IDNO：1)。在一些实施方案中，多肽是跨膜-4L6家族成员-1(TM4SF1)。在一些实施方案中，TM4SF1是人TM4SF1。在一些实施方案中，人TM4SF1是糖基化(例如N-糖基化)的人TM4SF1。在一些实施方案中，糖基化的人TM4SF1在残基N129或残基N159处糖基化。在一些实施方案中，糖基化的人TM4SF1在残基N129和残基N159处糖基化。在一些实施方案中，化合物能够以10nM或更小(例如10nM、5nM、2nM、1nM、500pM、100pM、50pM、1pM或500fM或更小)的Kd值特异性结合糖基化的人TM4SF1。在一些实施方案中，化合物的结合结构域包括选自以下的至少一个氨基酸序列(例如1、2、3、4、5或6个氨基酸序列)：GFTFSSFAMS(SEQ ID NO：2)、TISSGSIYIYYTDGVKG(SEQ ID NO：3)、RGIYYGYDGYAMDY(SEQ ID NO：4)、RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO：5)、KVSNRFS(SEQ ID NO：6)和SQSTHVYT(SEQ ID NO：7)。在一些实施方案中，结合结构域包括选自以下的至少一个、至少两个或所有三个氨基酸序列：GFTFSSFAMS(SEQ IDNO：2)、TISSGSIYIYYTDGVKG(SEQ ID NO：3)和RGIYYGYDGYAMDY(SEQ ID NO：4)。在一些实施方案中，化合物包括包含选自以下的至少一个、至少两个或所有三个氨基酸序列的结合结构域：RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO：5)，KVSNRFS(SEQ ID NO：6)，和SQSTHVYT(序列ID NO：7)。在一些实施方案中，化合物包括含有以下六个氨基酸序列的结合结构域：GFTFSSFAMS(SEQ ID NO：2)、TISSGSIYIYYTDGVKG(SEQ ID NO：3)、RGIYYGYDGYAMDY(SEQ ID NO：4)、RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO：5)、KVSNRFS(SEQ ID NO：6)和SQSTHVYT(SEQ ID NO：7)。
在一些实施方案中，该化合物是抗体。在一些实施方案中，该抗体由杂交瘤小鼠细胞系8G4-5-13-13F(PTA-120523)产生。在一些实施方案中，抗体的重链包括与EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSFAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGSIYIYYTDGVKGRFTISRDNAKNTVHLQMSSLRSEDTAMYYCARRGIYYGYDGYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：8)具有至少60％、65％、70％、75％或80％的序列同一性(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体的轻链包括与AVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYMQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDLGIYFCSQSTHIPLAFGAGTKLELK(SEQ ID NO：9)具有至少60％、65％、70％、75％或80％的序列同一性(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体的重链包括与EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSFAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGSIYIYYTDGVKGRFTISRDNAKNTVHLQMSSLRSEDTAMYYCARRGIYYGYDGYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：8)具有至少60％、65％、70％、75％或80％的序列同一性(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性)的氨基酸序列，以及抗体的轻链包括与AVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYMQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDLGIYFCSQSTHIPLAFGAGTKLELK(SEQ ID NO：9)具有至少60％、65％、70％、75％或80％的序列同一性(例如、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体是单克隆的、人源化的、嵌合的或合成的。在一些实施方案中，抗体是抗体片段。在一些实施方案中，化合物(例如抗体)是裸露的(naked)、未偶联的和/或未修饰的。
在一些实施方案中，化合物还包含试剂。在一些实施方案中，试剂是治疗剂或诊断剂。在一些实施方案中，治疗剂是生物活性部分。在一些实施方案中，生物活性部分选自：细胞毒素剂、化疗剂、蛋白质、肽、抗体、生长抑制剂和抗激素剂。在一些实施方案中，细胞毒素剂选自：核糖体失活蛋白，组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂，微管蛋白抑制剂，烷化剂，抗生素，抗肿瘤剂，抗增殖剂，抗代谢物，I或II型拓扑异构酶抑制剂，激素激动剂或拮抗剂，免疫调节剂，DNA小沟结合剂，和放射性试剂。在某些实施方案中，核糖体失活蛋白是皂草素。在一些实施方案中，诊断剂是标记物。在一些实施方案中，标记物是荧光标记物、生色标记物或放射性标记物。在一些实施方案中，试剂直接偶联至化合物。在其它实施方案中，试剂任选地通过接头间接地偶联至化合物。
在第二方面，本发明的特征在于包括第一方面的化合物的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。在一些实施方案中，药物组合物被配制为用于治疗受试者中与病理性血管生成相关的病症。
在第三方面，本发明的特征在于编码第一方面的一种或多种多肽的多核苷酸。第三方面的一种或多种多核苷酸可以任选地包括在载体(例如，重组表达载体)中。
在第四方面，本发明的特征在于包括第三方面的一种或多种多核苷酸和/或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞(例如HUVEC、CHO、HeLa、3T3、BHK、COS、293和Jurkat细胞)。在其它实施方案中，宿主细胞是原核细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)细胞)。
在第五方面，本发明的特征在于生产第一方面的化合物的方法，其包括在培养基中培养第四方面的宿主细胞。在一些实施方案中，该方法还包括从宿主细胞或培养基回收多肽。在一些实施方案中，在体外或离体进行该方法。
在第六方面，本发明的特征在于治疗患有与病理性血管生成相关的病症(例如癌症)的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的第二方面的组合物，从而治疗受试者。在一些实施方案中，以约0.01mg/kg/4天至约10mg/kg/4天的剂量向受试者施用组合物。在一些实施方案中，以约0.1mg/kg/4天至约10mg/kg/4天的剂量向受试者施用组合物。在一些实施方案中，以每周约3mg/kg/至约10mg/kg的剂量向受试者施用组合物。
在第六方面的任何实施方案中，与病理性血管生成相关的病症可以是癌症。在一些实施方案中，癌症选自：乳腺癌、卵巢癌、肾癌、结肠直肠癌、肝癌、胃癌(gastriccancer)、胃癌(stomach cancer)、皮肤癌、食道癌、肾癌、脑癌、甲状腺癌、前列腺癌、胰腺癌和肺癌、睾丸癌、小肠癌、唾液腺癌和肾上腺癌。在其它实施方案中，与病理性血管生成相关的病症为肥胖症、黄斑变性、糖尿病性视网膜病、牛皮癣、类风湿性关节炎、细胞免疫、动脉粥样硬化或红斑痤疮。
在第六方面的任何实施方案中，该化合物在结合包含氨基酸序列NYTFASTEGQYLLDTSTWSECTEPKHIVEWNVS(SEQ ID NO：1)的表位之后能够被内化至TM4SF1表达细胞内。在一些实施方案中，化合物被内化至TM4SF1表达细胞的细胞质中。在一些实施方案中，化合物被内化至TM4SF1表达细胞的细胞核中。在一些实施方案中，TM4SF1表达细胞是肿瘤血管EC或肿瘤细胞。
在一些实施方案中，第二方面的组合物通过肌肉内、静脉内、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸腔内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、腹膜、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐带内、眼内、口服、局部、局部、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过直接局部灌注浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、在霜剂或脂质组合物中施用。在一些实施方案中，组合物可以通过局部药物递送施用。在一些实施方案中，局部药物递送系统导致组合物的缓慢释放。在一些实施方案中，向受试者施用至少一种剂量(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种剂量)的组合物或向受试者每天、每周、每月或每年施用至少一种剂量(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种剂量)。给药期间可以被定义(例如，1-4周、1-12个月、1-20年)或者可以是受试者的寿命期。在其它实施方案中，向受试者施用至少两种剂量(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种剂量)的组合物。在其它实施方案中，向受试者施用组合物每周一次至七次。当治疗与病理性血管生成相关的病症(例如癌症)时，在与病理性血管生成相关的病症(例如癌症)的症状发生或明确诊断之前或诊断或症状变得明显后可将本发明的第二方面的组合物施用至受试者。该组合物可以在例如诊断或临床确认症状后立即施用或症状诊断或检测后的2小时、4小时、6小时、10小时、15小时或24小时、2天、3天、5天或7天、2周、4周、6周或8周、或甚至3个月、4个月、6个月后施用。
在第七方面，本发明的特征在于检测生物样品中包含氨基酸序列NYTFASTEGQYLLDTSTWSECTEPKHIVEWNVS(SEQ ID NO：1)的多肽的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供生物样品和对照样品；(b)将生物样品和对照样品与第一方面的化合物或第二方面的药物组合物接触；和(c)确定生物样品中和对照样品中存在的化合物与多肽的络合物的量。在一些实施方案中，从疑似患有与病理性血管生成相关的病症(例如癌症)的受试者获得生物样品。
在最后一个方面，本发明的特征在于一种试剂盒，其包括：(a)本发明的第二方面的药物组合物；和(b)用于将药物组合物施用至受试者以治疗与病理性血管生成相关的病症(例如癌症)的说明书。
在本发明的所有方面的优选的实施方案中，受试者是哺乳动物，优选人。
附图简要说明
图1A是TM4SF1的示意图，示出被四个跨膜结构域(M1、M2、M3和M4)分隔的两个胞外环(ECL1和ECL2)、N端和C端以及胞内环(ICL)。ECL2包含两个N-糖基化位点，其表示为“n”。
图1B是TM4SF1蛋白结构域和每个结构域中氨基酸数目的表。
图2A是描绘使用8G4抗体用免疫细胞化学进行的初始筛选的一系列图像，其中鉴别出针对HUVEC((a)左图)和HDF(人真皮成纤维细胞)((b)，右图)呈阳性的15个克隆，中间的图为HDF对照)，其已被转导以过表达人TM4SF1(TM4SF1-OE)，但以非常低水平(约5mRNA拷贝/细胞)表达TM4SF1的天然HDF不染色。
图2B是表位作图实验中所用的TM4SF1野生型、突变体和小鼠-人TM4SF1嵌合构建体的图表。通过免疫细胞化学对被转导入不以可检测水平表达TM4SF1的HEMn(人类表皮黑素细胞，新生儿)细胞的各种TM4SF1构建体进行表位作图。从人类蛋白质参考数据库获得结构域信息。FL(全长)TM4SF1蛋白；ECL1，表达胞外环1的突变体；ECL2，表达胞外环2的突变体；N129/159G，两个用于在氨基酸位置129和159N-糖基化的天冬酰胺突变为甘氨酸。在N129/159G的情况下，制备两个单独的PCR片段，用DraIII限制性内切酶切割，然后用T4DNA连接酶连接。该鼠-人嵌合体(Mu-Hu-TM4SF1)含有从氨基酸117处开始的人TM4SF1序列，并通过集成的DNA技术(Coraville，IA)化学合成。每种构建体以每个细胞约500个mRNA拷贝表达。
图2C是示出8G4抗体以糖基化依赖性的方式特异性结合于ECL2上的表位的一系列图像。HEMn用以下转导：(i)空载体对照、(ii)FL-TM4SF1、(iii)ECL1、(iv)ECL2或(v)用于用8G4和鬼笔环肽染色的N129/159G。当ECL2缺乏(iii)或当两个N-糖基化区域发生突变(v)时染色丧失。
图2D是被转染以表达(i)空载体对照、(ii)鼠TM4SF1(Mu-TM4SF1)或(iii)Mu-HuTM4SF1嵌合体的HEK293细胞的8G4免疫染色的一系列图像。8G4识别Mu-Hu TM4SF1嵌合体而不识别天然鼠TM4SF1。
图2E是人、猴和小鼠TM4SF1ECL2结构域的氨基酸序列的比较序列比对。每个ECL2序列内的两个N-连接糖基化位点用下划线标出，并且划分出(demarcate)由8G4抗体识别的人TM4SF1上的表位。8G4表位包括跨越第一和第二糖基化位点(即，人TM4SF1的129-161氨基酸)的人TM4SF1 ECL2的氨基酸序列。
图3A是生长在玻璃圆盘上、用8G4、鬼笔环肽和DAPI免疫染色而不经Triton X-100提取的HUVEC的图像。8G4将TM4SF1定位至质膜和细胞质和细胞核位点(白色箭头)。比例尺，10微米。
图3B是图3A的框(i)的放大图像，示出F-肌动蛋白(鬼笔环肽染色，黄色箭头)仅延伸到nanopodia的最近端部分，nanopodia是从细胞表面的薄的、易碎的膜突起且在细胞运动和细胞间相互作用中起作用。
图3C是图3A的框(i)的放大图像，示出8G4将TM4SF1定位至nanopodia(粉红色箭头)。该图像还示出了图3B中描绘的F-肌动蛋白的鬼笔环肽染色(黄色箭头)。
图3D是生长在玻璃圆盘上、用8G4、鬼笔环肽和DAPI免疫染色并以指定浓度TritonX-100提取的HUVEC的一系列图像。由8G4识别的TM4SF1在很大程度上用0.05％(而不是0.01％)的Triton X-100提取，但是残留的核周和细胞核染色(白色箭头)需要0.1％的Triton X-100用于完全除去。比例尺，10微米。
图3E是用8G4抗体对TM4SF1染色的免疫印迹，示出用0.05％(而不是0.01％)Triton X-100提取的所有三个主要(28-，25-，和22-kD)TM4SF1条带；较长的暴露证明用0.1％Triton提取残留的28-kD的TM4SF1。
图3F是用8G4抗体对TM4SF1染色的免疫印迹，示出TM4SF1的亚细胞分布。
图4A是用8G4、CD144和DAPI免疫染色人胃癌相关的血管内皮细胞(EC)(粉红色箭头)的免疫荧光图像。人胃癌相关的血管EC表现出很强的8G4染色。右图是左侧框(i)的放大图像。L，内腔。比例尺，10μm。
图4B是与图4A中的胃癌相关的血管EC相邻的正常组织的免疫荧光图像，其表明CD144阳性血管(白色箭头)的弱染色性。L，内腔。比例尺，10μm。
图4C是免疫-纳米金-透射电子显微照片(TEM)的图像，示出内衬于肿瘤血管的EC的8G4染色。
图4D和4E是图4C的框(i)和(ii)的放大图像，示出间隔的金颗粒(粉红色箭头)以比(E)腔外质膜大得多的程度布置(D)管腔质膜。比例尺，100nm。
图4F是图4C的框(iii)的放大图像，蓝色箭头指示在核质中的金颗粒。比例尺，100nm。
图4G是另一肿瘤血管的EC的免疫-纳米金-TEM 8G4染色的图像，示出8G4标记的nanopodia(绿色箭头)和延伸至血管内腔内并形成经腔桥的基质填充的肠套叠状突起。
图4H是图4G的框(i)的放大图像，示出延伸至血管内腔内并形成经腔桥的基质填充的肠套叠状突起。比例尺，100nm。
图4I是胃中相邻的正常血管EC的免疫-纳米金-TEM 8G4染色的图像。
图4J是图4I的框(i)的放大图像，示出胃中的相邻的正常血管EC缺乏nanopodia并显示出低的多的管腔(粉红色箭头)和缺少的腔外8G4标记。比例尺，100nm。
图5A是于4℃在悬浮液中用8G4或对照小鼠IgG预温育1小时、用冷PBS洗涤3次并在指示的时间(0-24h)再涂板的胰蛋白酶化的HUVEC的一系列流式细胞仪直方图，示出通过流式细胞术测量的细胞表面8G4强度(104个细胞/测量)，在24小时的过程中从95.1％下降到4.9％。
图5B是示出在2、4或24小时再涂板并用8G4、鬼笔环肽和DAPI染色的HUVEC细胞的一系列免疫细胞化学图像。该图像表明在2小时时8G4的细胞质沉积，在4小时时沉积增加，以及在24小时时可忽略不计的染色。
图5C是共焦-3D Z-堆叠(22帧；从细胞表面到基质220nm/帧)图像，其定位8G4于GFP转导的HUVEC的核质(帧-6，白色箭头)以及在2小时时定位于核周细胞质(帧-15，黄色箭头)。
图5D是示出从0、4和24小时培养的8G4标记的HUVEC中制备的核提取物中8G4抗体的重链和轻链的免疫印迹。
图5E是8G4标记2小时后HUVEC的免疫-纳米金-TEM图像。如在培养2小时时8G4在细胞质、核孔(红色箭头)和核质(蓝色箭头)的显著沉积的出现所证明，8G4已被内吞。
图5F是图5E的框(i)的放大图像，示出8G4能够被内化入表达TM4SF1的HUVEC中。
图6A和6B是HUVEC的共焦-3D Z-堆叠图像(33帧；从细胞表面到基质220nm/帧)，HUVEC在24孔板中的玻璃圆盘上培养，培养4小时后，接着暴露于(A)200ng 8G4和对照(Ctl)ADC(皂草素偶联的山羊IgG Fab片段)或(B)200ng 8G4和实验(Exp)ADC(皂草素偶联的山羊抗-小鼠Fab片段)，随后免疫细胞化学前用(A)8G4/Ctl-ADC或(B)8G4/Exp-ADC继续培养72小时，示出相比(i)8G4/Ctl-ADC，HUVEC中的应力纤维高水平暴露于(ii)8G4/Exp-ADC。单个帧显示在细胞核(帧-12和-16；白色箭头)和核周细胞质(帧-20；黄色箭头)中的阳性Alexa-594信号。
图6C是在MTT测定第5天相比Ctl-ADC用8G4/Exp-ADC杀伤>80％HUVEC的曲线图(p，<0.0001，学生t-检验)(见下文实施例1)。抗体单独培养的HUVEC不受影响。
图7是示出8G4-皂草素络合物诱导的杀伤限于TM4SF1表达细胞的曲线图。以类似于HUVEC的水平表达TM4SF1的PC3肿瘤细胞，或不表达可检测的TM4SF1的HEK293细胞，分别在96孔板培养(5×103个细胞/孔)用于MTT测定。用200ng 8G4/Ctl-ADC或8G4/Exp-ADC培养细胞5天。MTT测定显示8G4的存在下用8G4/Exp-ADC而不是8G4/Ctl-ADC杀伤>50％的PC3细胞(p，<0.00001，学生t检验)。8G4/Exp-ADC在HEK293细胞中不诱导可检测的细胞毒性。
本发明的其它特征和优点将从下面的详细描述和权利要求书中显而易见。
本发明实施方案的详细描述
一、定义
如本文所用，术语“约”是指所引用的数值的+/-10％。
“跨膜-4L6家族成员-1(TM4SF1)”、“L6”、“L6抗原”、“M3S1”、“肿瘤相关抗原L6(TAAL6)”是指跨膜4超家族/四跨膜蛋白家族的多肽，其在肿瘤血管的内皮细胞(EC)、肿瘤细胞(TC)、发育视网膜血管的EC和新生血管上高度表达。TM4SF1包括，例如，人TM4SF1蛋白(NCBI RefSeq No.NP_055035.1)，其长度为202个氨基酸。
术语“抗体”和“免疫球蛋白(Ig)”在广义下可互换使用并包括单克隆抗体(例如，全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体，只要它们表现出期望的生物活性)，并且还可以包括某些抗体片段(如本文中更为详细地描述的)。抗体通常既包含“轻链”也包含“重链”。来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列可被归入两种完全不同的类型之一，被称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)。根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类别。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可被进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
“抗体片段”或“片段”只包含完整抗体的一部分，其中该部分优选保留当存在于完整抗体时通常与该部分相关联的至少一种、优选大多数或所有的功能。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段(例如，单链可变片段(scFv))；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生被称为“Fab”片段的两个相同的抗原结合片段，其每个片段都有一个抗原结合位点；和残余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原的F(ab')2片段。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，并因此保留了结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例如包含Fc区的抗体片段，保留当存在于完整抗体中时通常与Fc区相关联的至少一种生物学功能，如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC(抗体依赖性细胞毒作用)功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是具有与完整抗体基本上类似的体内半衰期的单价抗体。例如，这样的抗体片段可以包含连接至能够赋予该片段体内稳定性的Fc序列的抗原结合臂(binding arm)。
如本文所用，抗体或其片段的“可变区”是指抗体分子的轻链和重链的部分，其包括互补决定区(CDR；即CDR-1、CDR-2和CDR-3)和框架区(FR)的氨基酸序列。VH是指重链的可变结构域。VL是指轻链的可变结构域。根据本发明所用的方法，可以根据Kabat(Sequenceof Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda,Md.,1987和1991))来定义分配给CDR和FR的氨基酸位置。抗体或抗原结合片段的氨基酸编号也是根据Kabat的编号。
如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变结构域的氨基酸残基，它的存在对于抗原结合是必要的。每个可变结构域通常具有3个CDR区，确定为CDR-1、CDR-2和CDR-3。每个互补决定区可以包括来自根据Kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基(即在轻链可变结构域中的大约残基24-34(CDR-L1)、50-56(CDR-L2)和89-97(CDR-L3)，和在重链可变结构域中的31-35(CDR-H1)、50-65(CDR-H2)和95-102(CDR-H3)；Kabat,等Sequence ofProteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda MD.(1991))，和/或来自“高变环”的残基(即在轻链可变结构域中的大约残基26-32(CDR-L1)、50-52(CDR-L2)和91-96(CDR-L3)，和在重链可变结构域中的26-32(CDR-H1)、53-55(CDR-H2)和96-101(CDR-H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。在一些情况下，互补决定区可以包括来自根据Kabat定义的CDR区和高变环的氨基酸。
如本文所用，术语抗体的“恒定结构域”是指非可变结构域(例如CH1、CH2、CH3和CL结构域)的任何结构域。
“框架区”(下文称FR)是除CDR残基之外的那些可变结构域残基。每个可变结构域通常具有四个FR，被确定为FR1、FR2、FR3和FR4。如果根据Kabat定义CDR，轻链FR残基被定位在大约残基1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)和98-107(LCFR4)处，重链FR残基被定位在重链残基的大约残基1-30(HCFR1)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)和103-113(HCFR4)处。如果CDR包含来自高变环的氨基酸残基，轻链FR残基被定位在轻链中大约残基1-25(LCFR1)、33-49(LCFR2)、53-90(LCFR3)和97-107(LCFR4)处，重链FR残基被定位在重链残基的大约残基1-25(HCFR1)、33-52(HCFR2)、56-95(HCFR3)和102-113(HCFR4)处。在一些情况下，当CDR包含来自由Kabat定义的CDR的氨基酸和高变环的那些氨基酸时，FR残基会相应地调整。例如，当CDR-H1包含氨基酸H26-H35时，重链FR1残基处于位置1-25且FR2残基处于位置36-49。抗体或其功能性片段的可变区之间的共同结构特征是本领域公知的。编码特定抗体的DNA序列通常可通过下列公知方法找到，例如Kabat,等2987 Sequence of Proteinsof Immunological Interest，U.S.Department of Health and Human Services,Bethesda MD中描述的那些，其通过引用并入本文。此外，用于克隆来自抗体的功能可变区的一般方法可见于Chaudhary,V.K.,等,1990 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1066，其通过引用并入本文。
本文所用的术语“单克隆抗体”指从基本上同质性的抗体群获得的抗体，即包含该群的各个抗体除了可能的突变以外是相同的，例如可能以少量存在的天然发生的突变。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是不为独立抗体的混合物。在某些实施方案中，该单克隆抗体通常包括包含结合靶标的多肽序列的抗体，其中通过包括从多个多肽序列筛选单个靶标结合的多肽序列的方法获得靶标结合多肽序列。例如，筛选方法可以是从众多克隆如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的库筛选独特的克隆。应当理解，所选择的靶标结合序列可进一步改变，例如，以提高对靶标的亲和力、人源化靶标结合序列、提高其在细胞培养物中的生产、降低其体内免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶标结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除它们的特异性之外，单克隆抗体制剂由于它们通常不受到其它免疫球蛋白的污染而是有利的。
修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质性的抗体群获得，而不应被理解为要求通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本发明待使用的单克隆抗体可通过多种技术来制备，包括，例如：杂交瘤方法(如，Kohler and Milstein.,Nature 256:495-497(1975)；Hongo等,Hybridoma14(3):253-260(1995),Harlow等,Antibodies:A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第二版，1988)；Hammerling等,in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas563-681(Elsevier,N.Y.,1981))，重组DNA方法(参见例如U.S.专利号4,816,567),噬菌体展示技术(参见，例如Clackson等,Nature 352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,PNAS USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)，以及用于在动物中产生具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的人或类人型抗体的技术(参见，例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等,PNAS USA 90:2551(1993)；Jakobovits等,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等,Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks等,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)；以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。
“嵌合”抗体(免疫球蛋白)具有与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源的重链和/或轻链的一部分，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段(只要它们表现出期望的生物学活性)的对应序列相同或同源(美国专利号4,816,567；和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
非人类(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)的高变区的残基替换，非人物种如小鼠、大鼠、兔或具有所需特异性、亲和力和能力的非人灵长类。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。在一般情况下，人源化抗体会包含基本上至少一个、通常两个可变结构域，其中高变环的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的那些，和FR的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。更多细节参见Jones等Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等Nature 332:323-329(1988)；andPresta.Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还参见如下综述文章和其中引用的参考文献：Vaswani and Hamilton.Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris.Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle andGross.Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)。
“结合结构域”是指特异性结合靶表位、抗原、配体或受体的化合物或分子的一部分。结合结构域包括但不限于：抗体(例如单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体和嵌合抗体)、抗体片段(例如Fab片段、Fab'2、scFv抗体、SMIP、域抗体、双抗体、微抗体、scFv-Fc、亲和体(affibodies)、纳米抗体和域抗体)、受体、配体、适体和具有确定的结合伴侣的其它分子。
本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”指任何长度的核苷酸的聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物，或通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应可掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和它们的类似物。如果存在的话，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸的结构进行修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸成分中断。多核苷酸可以在合成后进一步修饰，如通过与标记物偶联。其它类型的修饰包括，例如，“加帽”，用类似物替代一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰诸如：具有不带电的连接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺、氨基甲酸酯等)和带电的连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些，含有侧基部分的那些，诸如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)，具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些，包含螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)，含有烷化剂的那些，具有修饰的键(例如，α异头核酸等)的那些，以及未修饰形式的多核苷酸。此外，通常存在于糖中的任何羟基基团可以被例如膦酸酯基团、磷酸酯基团取代，用标准保护基团保护，或活化以制备与额外的核苷酸的额外连接，或者可偶联至固体或半固体支撑物。5'和3'末端OH可以被磷酸化或被胺或1-20个碳原子的有机加帽基团部分取代。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸还可以包含本领域中通常已知的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如：2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-端基异构糖、差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、非环类似物和碱性核苷类似物如甲基核糖核苷。一个或多个磷酸二酯键可以被备选的连接基团取代。这些备选的连接基团包括，但不限于，其中磷酸酯被P(O)S(“硫酯”)、P(S)S(“二硫酯”)、“(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲缩醛”)替代的实施方案，其中每个R或R'独立地为H或取代的或未取代的烷基(1-20C)，其任选地含有醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并不是多核苷酸中的所有键都需要相同。前面的描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
本文中所用的术语“载体”意指能够转运已与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它是指环状双链DNA环，其中可以连接另外的DNA片段。某些载体能够在引入其的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制来源的细菌载体和附加体哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加体哺乳动物载体)可以在引入至宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而随宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称“重组载体”)。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。
根据本发明的“表位”是指是极大地有助于抗体的结合的靶多肽或抗原的氨基酸残基。靶多肽或抗原(例如，TM4SF1，或其片段或变体)与抗体(例如，抗TM4SF1抗体，例如8G4)的结合可以通过免疫细胞化学分析来确定。在一些实施方案中，靶多肽的极大地起作用的残基的任意一个的突变(例如通过丙氨酸或同系物突变或通过缺失或截短的野生型TM4SF1的突变)可以破坏抗体的结合，使得抗体的相对亲和力比(IC50突变体TM4SF1/IC50野生型TM4SF1)可以大于1(例如2、3、4、5、10、50、100、500、1000或更大)。
“结合”目的靶多肽或抗原的本发明化合物是指以足够亲和力结合靶多肽或抗原使得该化合物在靶向表达靶蛋白或抗原的细胞或组织中用作诊断和/或治疗剂，并且不显著地与其它蛋白质交叉反应。在该实施方案中，化合物与“非靶”蛋白的结合程度将小于该化合物与其特定靶蛋白结合的约10％，例如可通过荧光激活细胞分选(FACS)分析、免疫组织化学、放射免疫测定(RIA)、ELISA或本领域中已知的任何其它标准的定量或半定量技术确定。
关于本发明的化合物(例如抗TM4SF1抗体)与靶标分子(例如TM4SF1多肽)的结合，关于特定多肽靶标或特定多肽靶标上的的表位的术语“特异性结合”、“特异性结合于”和“特异于”是指可测量地不同于非特异性相互作用(例如，非特异性相互作用可以是结合牛血清白蛋白或酪蛋白)的结合。特异性结合可以通过例如确定相较于对照分子结合的分子的结合来测定。例如，特异性结合可通过与类似于靶标的对照分子竞争来确定，例如，过量的未标记靶标。在这种情况下，如果标记的靶标与探针的结合被过量的未标记靶标竞争性抑制，则指示为特异性结合。本文中所用的术语“特异性结合”或“特异性结合”或“特异于”特定多肽靶或特定多肽靶上的表位可表现为例如对靶标的Kd为约1微米至约1fM，或者约200nM至约1fM，或者约200nM至约1pM，或者约150nM至约1fM，或者约150nM至约1pM，或者约100nM至约1fM，或者约100nM至约1pM，或者约60nM至约1fM，或者约60nM至约1pM，或者约50nM至约1fM，或者约50nM至约1pM，或者约30nM至约1fM，或者约30nM至约1pM，或者约20nM至约1fM，或者约20nM至约1pM，或者约10nM至约1fM，或者约10nM至约1pM，或者约8nM至约1fM，或者约8nM至约1pM，或者约6nM至约1fM，或者约6nM至约1pM，或者约4nM至约1fM，或者约4nM至约1pM，或者约2nM至约1fM，或者约2nM至约500pM时，或者约1nM至约1fM，或者约1nM至约1pM。在一个实施方案中，术语“特异性结合”是指其中化合物结合特定多肽靶标或特定多肽靶标的表位而基本上不结合任何其它多肽或多肽表位靶标的结合。
“与病理性血管生成相关的病症”是指特征在于疾病状态下新血管的生长过度、不足或不适当(例如，正在从医学角度来看不希望的血管生成的位置、时间或开始)或以至于它会造成疾病状态的任何病症，这将受益于用本发明化合物或其药物组合物的治疗。本文中待治疗的病症的非限制性例子包括：癌症，如乳腺癌、卵巢癌、肾癌、结肠直肠癌、肝癌、胃癌和肺癌；肥胖症；黄斑变性；糖尿病性视网膜病变；银屑病；细胞免疫；类风湿性关节炎；和红斑痤疮。
术语“癌症”和“癌性的”指或描述哺乳动物中特征通常在于不受调控的细胞生长的生理病症。良性和恶性癌症以及休眠肿瘤或微转移包括在该定义中。癌症的例子包括但不限于：乳腺癌、卵巢癌、肾癌、结肠直肠癌、肝癌、胃癌、胃癌、皮肤癌、食道癌、肾癌、脑癌、甲状腺癌、前列腺癌、胰腺癌癌和肺癌。
本文所用的“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的或良性的，以及所有的癌前和癌性的细胞和组织。术语“癌症”、“癌性的”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中并不互相排斥。
“化疗剂”是用于癌症治疗的化学化合物。化疗剂的实例包括，例如紫杉醇或托泊替康或聚乙二醇化脂质体多柔比星(PLD)。化疗剂的其它实例包括：烷基化剂如塞替派和
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环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡和嗪消安；氮丙啶，如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌、美特多巴(meturedopa)和脲多巴(uredopa)；亚乙胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺和三甲基三聚氰胺；番荔枝内酯(尤其是泡番荔枝辛和泡番荔枝辛酮)；喜树碱；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新，卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；五加素；pancratistatin；sarcodictyin；软海绵素；氮芥类，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、氮芥氧化物盐酸盐、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、三芥环磷酰胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，如烯二炔类抗生素(如卡奇霉素，特别是卡奇霉素γ1和卡奇霉素ω1(见例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；达内霉素，包括达内霉素A；二膦酸盐如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素；以及新制癌菌素生色团和相关色素蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素、阿奇霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素D、辣椒素、缬氨霉素、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、
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多柔比星(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和脱氧多柔比星)、表阿霉素、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、丝裂霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；代谢拮抗剂，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤，三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧脲苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，如卡鲁睾酮、屈他雄酮丙酸、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；肾上腺拮抗剂，如鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；蒽双咪腙；edatraxate；defofamine；地美可辛；地亚醌；elformithine；依利醋胺(elliptinium)；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；lonidainine；美登素类，如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；mopidanmol；nitraerine；喷司他丁；苯来美特；吡柔比星；洛索蒽酮；足叶草酸；2-乙酰肼；甲基苄肼；
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多糖复合物(JHS天然产品，Eugene,Oreg.)；雷佐生；根霉素；sizofuran；螺环锗；菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢毒素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“阿糖胞苷”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类，如
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紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)，
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无聚氧乙烯蓖麻油，白蛋白工程化的纳米颗粒紫杉醇制剂(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Ill.)和
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多西他赛(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,法国)；苯丁酸氮芥；
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吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；
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长春瑞滨；诺肖林；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨喋呤；希罗达；伊班膦酸钠；伊立替康(依立替康，CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和亚叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，如视黄酸；卡培他滨；考布他汀；亚叶酸(LV)；奥沙利铂，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；拉帕替尼
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PKC-α，Raf，H-Ras，EGFR(例如，埃罗替尼
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)和降低细胞增殖的VEGF-A抑制剂，和上述任何的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
本文所用的术语“细胞毒素剂”指抑制或阻止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)，化疗剂，例如甲氨蝶呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、阿霉素、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其它嵌入剂、酶及其片段，诸如溶核酶、抗生素，和毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或其变体，和下文公开的各种抗肿瘤药或抗癌药。其它细胞毒素剂描述如下。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。
用于本文时“生长抑制剂”是指在体外或体内抑制细胞(例如，表达TM4SF1的细胞)的生长和/或增殖的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以显著降低TM4SF1表达细胞的百分比。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期进程(除了S期以外的位置)的试剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的试剂。传统的M期阻断剂包括：长春花(长春新碱和长春碱)、紫杉烷类和拓扑异构酶II抑制剂，如蒽环类抗生素多柔比星((8S-反)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脱氧-α-L-来苏-己吡喃基)氧基]-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-8-(羟乙酰)-1-甲氧基-5,12-并四苯二酮)、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博莱霉素。阻止G1的那些试剂也深入至S期停滞，例如DNA烷化剂，如他莫昔芬、强的松、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。更多信息可见于Murakami等的The Molecular Basis of Cancer,Mendelsohn和Israel，eds.，第一章，标题为“Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplasticdrugs”(WB Saunders:Philadelphia,1995)，特别是第13页。紫杉烷类(紫杉醇和多西他赛)是来自红豆杉树的抗癌药物。来自欧洲红豆杉的多西他赛
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Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(
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Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进来自微管蛋白二聚体的微管的装配并通过防止解聚稳定微管，这导致细胞中有丝分裂的抑制。
本文中所用的“抗激素剂”指的是调节、降低、阻断和/或抑制能促进癌症生长的激素的效果的化合物或组合物，而且往往为系统或全身治疗形式。它们可以是激素本身。实例包括抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括，例如：他莫昔芬(包括
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他莫昔芬)、
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雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫西芬、曲沃西芬、雷洛昔芬、LY117018、奥那司酮、和
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托瑞米芬；抗孕酮；雌激素受体下调剂(ERD)；发挥抑制或关闭卵巢作用的试剂，例如，黄体生成素释放激素(LHRH)激动剂，如
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和
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醋酸亮丙瑞林、醋酸戈舍瑞林、醋酸布舍瑞林和曲谱瑞林；其它抗雄激素，如氟他胺、尼鲁米特和比卡鲁胺；和抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，其调节肾上腺中生成的雌激素，例如，4(5)-咪唑、氨鲁米特、
Figure BDA0000980741080000241
醋酸甲地孕酮、
Figure BDA0000980741080000242
依西美坦、formestanie、法倔唑、
Figure BDA0000980741080000243
伏氯唑、
Figure BDA0000980741080000244
来曲唑、和
Figure BDA0000980741080000245
阿那曲唑。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐如氯膦酸盐(例如，
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或
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)、
Figure BDA0000980741080000248
依替膦酸、NE-58095、
Figure BDA0000980741080000249
唑来膦酸/唑来膦酸盐、
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阿仑膦酸盐、
Figure BDA00009807410800002411
帕米膦酸钠、
Figure BDA00009807410800002412
替鲁膦酸盐或
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利塞膦酸钠；以及曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制在牵涉异常细胞增殖的信号转导通路中的基因的表达的那些，例如，PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，如
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疫苗和基因治疗疫苗，例如，
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疫苗、
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疫苗和
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疫苗；
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拓扑异构酶1抑制剂；
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GnRH拮抗剂；拉帕替尼二甲苯磺酸酯(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016)；和上述任何的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
本文所用的术语“接头”是指化学连接剂(例如，同双功能和异双功能交联剂(偶联剂))，其可以包括柔性臂，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个碳原子，或一个或多个氨基酸，即通过肽键将一个分子(例如，本发明的化合物，例如抗TM4SF1抗体)共价连接到另一个分子(例如试剂，例如治疗剂如皂草素，或诊断剂如荧光或放射性标记物)。
术语“样品”和“生物样品”可互换使用，是指获自个体包括体液、体组织(例如肿瘤组织)、细胞或其它来源的任何生物样品。体液是例如淋巴、血清、全新鲜血液、外周血单核细胞、冷冻全血、血浆(包括新鲜或冷冻的)、尿液、唾液、精液、滑液和脊髓液。样品也包括乳房组织、肾组织、结肠组织、脑组织、肌肉组织、滑膜组织、皮肤、毛囊、骨髓和肿瘤组织。用于从哺乳动物获得组织切片和体液的方法是本领域众所周知的。
如本文所用，“治疗”(及其语法变化诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变被治疗的个体的自然进程的临床介入，并且可以是为了预防或在临床病理学过程中执行，可能导致受试者(例如人受试者)中疾病或病症的进展或严重程度(例如，与病理性血管生成相关的病症，例如癌症)、或疾病或病症的一种或多种症状的进展、严重性或频率的降低(例如，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或甚至100％)。治疗的期望效果包括但不限于：预防疾病的发生或复发，症状的减轻，疾病的任何直接或间接病理学后果的减轻，预防转移，减缓疾病进展的速率，改善或缓和疾病状态，及缓解或改善预后。
“药物组合物”是指含有本文所述的化合物的组合物，其与药学上可接受的载体一起配制，并经政府管理机构批准作为治疗哺乳动物中疾病的治疗方案的一部分制造或出售。药物组合物可被配制为例如以单位剂量形式(例如，片剂、胶囊、囊片、软胶囊或糖浆)用于口服给药；用于局部给药(例如作为乳膏、凝胶、洗剂或软膏)；用于静脉内施用(例如，作为无颗粒栓子的无菌溶液，和在适合于静脉内使用的溶剂体系中)；或本文所述的任何其它制剂。
“药学上可接受的载体”是指对被治疗的哺乳动物(例如人)生理学上可接受的载体，同时保留与其一起施用的化合物的治疗性质。示例性的药学上可接受的载体是生理盐水。其它生理上可接受的载体和它们的制剂是本领域技术人员已知的，并描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版，A.Gennaro,1990,MackPublishingCompany，Easton，PA)，其通过引用并入本文。
“序列同一性”或“序列相似性”是指两个或更多个氨基酸序列、或两个或更多个核苷酸序列之间的同一性或相似性，用序列之间的同一性或相似性来表示。序列同一性可以同一性百分比来衡量；百分比越高，序列相同的越多。序列相似性可以相似性百分比(其考虑保守氨基酸取代)来衡量；百分比越高，序列越相似。使用标准方法比对时核酸或氨基酸序列的同系物或同源物具有相对高的序列同一性/相似性。
用于比较的序列比对方法在本领域中是公知的。各种程序和比对算法描述于Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988；Higgins&Sharp,Gene,73:237-44,1988；Higgins&Sharp,CABIOS 5:151-3,1989；Corpet等,Nuc.Acids Res.16:10881-90,1988；Huang等Computer Appls.in the Biosciences 8,155-65,1992；和Pearson等,Meth.Mol.Bio.24:307-31,1994。Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-10,1990提出了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。
NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-10,1990)可从几个来源获得，包括国家生物信息中心(NCBI，国家医学图书馆，大厦38A，8N805室，Bethesda，MD 20894)和互联网上，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。这些软件程序通过对各种置换、缺失和其它修饰分配同源性程度来匹配相似的序列。保守取代通常包括下组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。更多信息可以在NCBI网址上找到。
BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。为了比较两个核酸序列，这些选项可以设置如下：-i设置为包含待比较的第一核酸序列的文件(如C：\seq1.txt)；-j设置为包含待比较的第二核酸序列的文件(如C：\seq2.txt)；-p设置为blastn；-o设置为任何希望的文件名(如C：\output.txt)；-q设定为-1；-r设定为2；所有其它选项保留默认设置。例如，下面的命令可用来生成包含两个序列之间的比较的输出文件：C:\Bl2seq–i c:\seq1.txt–jc:\seq2.txt–p blastn–o c:\output.txt–q–1–r 2。
为了比较两个氨基酸序列，Bl2seq的选项可以进行如下设置：-i设置为包含待比较的第一氨基酸序列的文件(如C：\seq1.txt)；-j设置为包含待比较的第二氨基酸序列的文件(如C：\seq2.txt)；-p设定为blastp；-o设置为任何希望的文件名(如C：\output.txt)；所有其它选项保留默认设置。例如，下面的命令可用来产生含有两个氨基酸序列之间的比较的输出文件：C:\Bl2seq–i c:\seq1.txt–jc:\seq2.txt–p blastp–o c:\output.txt。如果两个比较的序列具有同源性，那么指定的输出文件将呈现与比对序列同源的那些区域。如果两个比较的序列不具有同源性，那么指定的输出文件将不呈现比对序列。
一旦比对，即可通过对其中在两个序列中出现相同的氨基酸或核苷酸残基的位置的数目计数来确定匹配的数目。序列同一性百分比是通过将匹配的数目除以被鉴定的序列中所示的序列长度或者铰接长度(如鉴定的序列中所示的序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，随后将所得值乘以100来确定。在一些实例中，对于多肽，比较序列的长度一般为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75、90、100、125、150、200、250、300或350个连续的氨基酸。
术语“治疗有效量”是指在受试者中治疗疾病或病症，如与病理性血管生成相关的病症的本发明的化合物或组合物(例如，药物组合物)的量。在癌症的情况下，如癌性肿瘤，治疗有效量的化合物或组合物可减少癌细胞的数目；减少原发肿瘤大小；抑制(即，一定程度上减缓和优选停止)癌细胞渗入到外周器官中；抑制(即，一定程度上减缓和优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤的生长；和/或在一定程度上减轻与癌症相关的一种或多种症状。至化合物或组合物可以阻止存在的癌细胞的生长和/或杀伤存在的癌细胞的程度，该化合物或组合物可能是抑制细胞的和/或细胞毒性的。对于癌症治疗，体内功效可以例如通过评估存活持续时间、疾病进展时间(TTP)、响应速度(RR)、响应持续时间和/或生活质量来测量。
“减少或抑制”是指引起总体减少优选20％或更大、更优选50％或更大和最优选75％、85％、90％、95％或更大的能力。减少或抑制可以指所治疗的病症(例如，与病理性血管生成相关的病症，例如癌症)的症状、转移的存在或大小，原发肿瘤的大小或血管生成疾病中血管的大小或数量。
本文所用的“施用”是指给予受试者一定剂量的化合物或组合物(例如药物组合物)的方法。本文描述的方法中使用的组合物可以通过以下给药，例如：肌内、静脉内、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸腔内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、腹膜、皮下、结膜下、泡内、粘膜、心包内、脐带内、眼内、口服、外用、局部、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、直接通过局部灌注浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、以霜剂或脂质组合物。优选的给药方法可根据各种因素(例如，施用的化合物或组合物和所治疗的状况、疾病或病症的严重程度)而变化。
贯穿本说明书和权利要求书，词语“包含”或变形如“包括”或“包含”将被理解为暗示包括列出的整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。
“受试者”是指哺乳动物(例如人)。
II.跨膜-4L6家庭成员-1(TM4SF1)
于1986年发现了为“L6抗原”或“肿瘤细胞抗原”的跨膜-4L6家族成员-1(TM4SF1)(Hellstrom等Cancer Res.46：3917-3923，1986)，因为它在许多癌细胞上大量表达。出乎意料的是，发现它在供应正常组织的血管的内皮上有少量表达(DeNardo等Int J Rad ApplInstrum B.18:621-631,1991；Wright等Protein Sci.9:1594-1600,2000；Richman等Cancer Res.5916s-5920s,1995；O’Donnell等Prostate.37:91-97,1998)。
TM4SF1是具有四跨膜蛋白拓扑结构但不同源的小质膜糖蛋白(NCBI RefSeqNo.NP_055035.1)(Wright等Protein Sci.9:1594-1600,2000)。它在质膜上形成TM4SF1富集的结构域(TMED)，其中如真正的四跨膜蛋白，它作为分子促进剂募集功能上相关的膜和胞质分子(Shih等Cancer Res.69:3272-3277,2009；Zukauskas等,Angiogenesis.14:345-354,2011)，并在癌细胞生长(Hellstrom等Cancer Res.46:3917-3923,1986)、运动(Chang等Int J Cancer.116:243-252,2005)和转移(Richman等Cancer Res.5916s-5920s,1995)中发挥重要作用。
TM4SF1通过内衬于供应几种人类癌症的血管的EC(Shih等Cancer Res.69:3272-3277,2009；Zukauskas等Angiogenesis.14:345-354,2011)、通过发育视网膜的血管(English等J Biomed Inform.42:287-295,2009)以及通过小鼠中由表达VEGF-A的腺病毒诱导的新生血管(Shih等Cancer Res.69:3272-3277,2009)而高度表达，但是并不通过许多其它类型的细胞高度表达(Shih等Cancer Res.69:3272-3277,2009；Zukauskas等Angiogenesis.14:345-354,2011)。而且，TM4SF1通过培养的EC而高度表达，其中它被定位于质膜和薄的伸长的质膜突起nanopodia，其从细胞表面向上延伸多达50微米(Shih等Cancer Res.69:3272-3277,2009；Zukauskas等Angiogenesis.14:345-354,2011)。TM4SF1调节EC分化、增殖和定向迁移(Shih等Cancer Res.69:3272-3277,2009；Zukauskas等Angiogenesis.14:345-354,2011)。
总之，这些发现提示TM4SF1具有作为用于治疗癌症的血管靶标的潜力。在这里，我们报告了支持这种可能性的证据。我们制备了抗TM4SF1的一组鼠单克隆抗体。我们选择了这些抗体之一8G4用于进一步研究。8G4特异性结合胞外环2(ECL2)上的唯一表位(SEQ IDNO：1)。重要的和出人意料的是，在加入到培养基后，8G4被逐步内化入EC，当与治疗剂(例如皂草素)络合时，引起广泛的EC杀伤。因此，我们的结果有力地表明，在8G4抗体和与其共享TM4SF1的ECL2上的唯一的且新颖的结合表位的化合物，可用于诊断和治疗的疗法，例如治疗患有与病理性血管生成相关的病症(例如癌症)的受试者的方法。
III.本发明的化合物
因此，本发明的特征在于包括结合结构域的化合物，该结合结构域在包含氨基酸序列NYTFASTEGQYLLDTSTWSECTEPKHIVEWNVS(SEQ ID NO：1)的表位结合(例如，特异性结合)多肽。所述化合物可以包括在包含SEQ ID NO：1的表位特异性结合跨膜-4L6家族成员-1(TM4SF1)或其片段，如人TM4SF1(NCBI RefSeq No.NP_055035.1)或其片段的结合结构域。在一些情况下，人TM4SF1多肽被糖基化(例如，N-糖基化)，例如在残基N129或残基N159。在一些情况下，糖基化的人TM4SF1多肽在两个残基N129和N159都糖基化。该化合物可以10nM或更小的Kd值(例如10nM、5nM、2nM、1nM、500pM、100pM、50pM、1pM或500fM或更小)特异性结合糖基化的人TM4SF1。所述化合物可以包括包含选自下组的至少一个氨基酸序列(例如1、2、3、4、5或6个氨基酸的序列)的结合结构域：GFTFSSFAMS(SEQ ID NO：2)，TISSGSIYIYYTDGVKG(SEQ ID NO：3)，RGIYYGYDGYAMDY(SEQ ID NO：4)，RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO：5)，KVSNRFS(SEQ ID NO：6)，和SQSTHVYT(SEQ ID NO：7)。化合物例如可以包括包含选自下组的至少一个、至少两个或所有三个氨基酸序列的结合结构域：GFTFSSFAMS(SEQ ID NO：2)，TISSGSIYIYYTDGVKG(SEQ ID NO：3)，和RGIYYGYDGYAMDY(SEQ ID NO：4)。化合物例如可以包括包含选自下组的至少一个、至少两个或所有三个氨基酸序列的结合结构域：RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO：5)，KVSNRFS(SEQ ID NO：6)，和SQSTHVYT(SEQ ID NO：7)。化合物例如可以包括包含下列六个氨基酸序列的结合结构域：GFTFSSFAMS(SEQ ID NO：2)，TISSGSIYIYYTDGVKG(SEQ ID NO：3)，RGIYYGYDGYAMDY(SEQ ID NO：4)，RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQID NO：5)，KVSNRFS(SEQ ID NO：6)，和SQSTHVYT(SEQ ID NO：7)。
在一些实施方案中，本发明的化合物可以是抗体或其抗体片段。该抗体可以是单克隆的、人源化的、嵌合的或合成的。在一些情况下，该抗体通过杂交瘤小鼠细胞系8G4-5-13-13F(PTA-120523)(即8G4抗体)产生。在一些情况下，抗体的重链包括与EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSFAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGSIYIYYTDGVKGRFTISRDNAKNTVHLQMSSLRSEDTAMYYCARRGIYYGYDGYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：8)具有至少60％、65％、70％、75％或80％序列同一性(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，抗体的轻链包括与AVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYMQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDLGIYFCSQSTHIPLAFGAGTKLELK(SEQ ID NO：9)具有至少60％、65％、70％、75％或80％序列同一性(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，抗体的重链包括与EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSFAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGSIYIYYTDGVKGRFTISRDNAKNTVHLQMSSLRSEDTAMYYCARRGIYYGYDGYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：8)具有至少60％、65％、70％、75％或80％的序列同一性(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列，抗体的轻链包括与AVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYMQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDLGIYFCSQSTHIPLAFGAGTKLELK(SEQ ID NO：9)具有至少60％、65％、70％、75％或80％的序列同一性(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，化合物可以是裸露的、未偶联的或者未经修饰的化合物，诸如裸露的、未偶联的或未经修饰的抗体。
如上所述，本发明的特征在于化合物如本文所述的抗TM4SF1抗体，其与8G4抗体的重链和轻链的氨基酸序列具有小于100％的氨基酸序列同一性。虽然变体化合物具有较低程度的序列同一性(例如，小于100％的序列同一性，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)，但具有足够的相似性，以便由氨基酸序列执行本文所描述的多肽所执行的一个或多个相同功能。多肽的相似性由保守氨基酸的取代来确定。这种取代是由具有类似特性的另一氨基酸取代多肽中给定的氨基酸的那些。保守取代可能是表型沉默的。通常脂族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中的一个置换为另一个；羟基残基Ser和Thr的互换，酸性残基Asp和Glu的交换，酰胺残基Asn和Gln之间的取代，碱性残基Lys和Arg之间的交换，芳族残基Phe、Tyr和Trp中的替换被视为保守取代。关于哪些氨基酸的变化可能是表型沉默的指导见于Bowie等(Science.247:1306-1310,1990)和如下表1。
Figure BDA0000980741080000321
Figure BDA0000980741080000331
在一些实施方案中，本发明的化合物可以是偶联物(即，偶联的化合物)，其还包含一种或多种试剂(例如，1、2、3或4或更多种试剂)，如治疗剂，其与化合物加和或协同作用，例如在与病理性血管生成相关的病症例如癌症的治疗中杀伤或抑制肿瘤细胞(TC)和/或肿瘤血管的内皮细胞(EC)。治疗剂例如可以是生物活性部分，例如细胞毒素剂、化疗剂、蛋白质、肽、抗体、生长抑制剂和/或抗激素剂。
细胞毒素剂可以是例如核糖体失活蛋白(例如皂草素)、组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂、微管蛋白抑制剂、烷化剂、抗生素、抗肿瘤剂、抗增殖剂、抗代谢物、拓扑异构酶I或II抑制剂、激素激动剂或拮抗剂、免疫调节剂、DNA小沟结合剂和放射性试剂。可直接或间接与本发明化合物偶联的示例性微管蛋白抑制剂的实例包括但不限于下表2中列出的那些。
表2.示例性微管蛋白抑制剂
Figure BDA0000980741080000332
Figure BDA0000980741080000341
描述了用于偶联至本发明化合物的化疗剂。可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根A链、α-八叠球菌、油桐蛋白、石竹素蛋白，美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥阜草抑制剂、白树毒素，mitogellin、局限曲霉素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢菌素。参见例如1993年10月28日公开的WO 93/21232。多种放射性核素可用于制备本发明的放射性偶联化合物。例子包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。可替代地，本发明化合物可偶联至一种或多种小分子毒素，诸如卡奇霉素类、美登素生物碱类、海兔毒素类、aurostatins、单端孢霉烯族化合物和CC1065，并且这些毒素的具有毒素活性的衍生物在此也在本文中考虑。可偶联至本发明的化合物的其它治疗剂(特别是抗癌剂)包括BCNU、链脲霉素、长春新碱和5-氟尿嘧啶，已知在美国专利号5,053,394、5,770,710中描述的统称为LL-E33288络合物的试剂家族，以及埃斯波霉素(esperamicins)(美国专利号5,877,296)。
对于TC的选择性破坏，本发明的化合物可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射性偶联的化合物。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。放射性或其它标记可以已知的方式引入偶联物中。例如，本发明的放射性偶联化合物可生物合成，或者可以通过化学氨基酸合成使用适合的氨基酸前体来合成，包括例如氟-19代替氢。标记如tc99m或I123、Re186、Re188和In111可通过肽中的半胱氨酸残基连接。钇-90可以通过赖氨酸残基连接。IODOGEN方法(Fraker等Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57,1978)可用于引入碘-123。“MonoclonalAntibodies in Immunoscintigraphy”(Chatal,CRC Press 1989)详细记载了其它方法。
在一些实施方案中，本发明的化合物可以是偶联物(即，偶联的化合物)，其还包括一种或多种试剂(例如1、2、3、或4或更多种试剂)，如诊断剂。诊断剂例如可以是标记物，如荧光标记物、生色标记物或放射性标记物。因此，该标记物可用于检测目的，并且可以是荧光化合物、酶、辅基、荧光材料、生物发光材料或放射性材料。放射性标记物例如可以包含用于闪烁照相研究的放射性原子，例如Tc99m或I123，或用于核核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记物，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
在一些实施方案中，本发明的化合物可以是偶联物(即，偶联的化合物)，它包括一种以上的试剂(例如2、3或4或更多种试剂)，其中至少一种试剂是治疗剂，至少一种试剂是诊断剂，如如上所述的治疗剂和诊断剂。
一种或多种试剂(例如，治疗剂和/或诊断剂)可直接偶联至本发明的化合物(例如，通过直接的共价或非共价相互作用的方式)，以使得该试剂立即偶联至化合物。试剂可直接偶联至本发明的化合物，例如通过直接的肽键。在其它情况下，直接偶联是通过直接非共价相互作用的方式，如本发明的化合物和特异性结合所述化合物(例如抗体试剂)的试剂之间的相互作用。
一种或多种试剂(例如，治疗剂和/或诊断剂)可以间接地偶联至本发明的化合物(例如，通过具有直接共价或非共价相互作用的接头的方式)。接头可以是化学连接剂，如同双功能和异双功能交联剂，其可从许多商业来源获得。用于交联的区域可以在本发明的化合物(例如，抗TM4SF1抗体)中找到。接头可包括柔性臂，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个碳原子。示例性接头包括BS3([双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸盐]；BS3是靶向可进入的伯胺的同双功能N-羟基琥珀酰亚胺酯)，NHS/EDC(N-羟基琥珀酰亚胺和N-乙基-(二甲氨基丙基)碳二亚胺；NHS/EDC允许伯胺基团与羧基偶联)，磺基-EMCS([N-e-马来酰亚胺基己酸]酰肼；磺基-EMCS是对巯基和氨基具有反应性的异双功能反应基团(马来酰亚胺和NHS-酯))，酰肼(大多数蛋白含有暴露的碳水化合物且酰肼是用于连接羧基至伯胺的有用试剂)，和SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯；SATA对胺有反应性并增加了受保护的巯基基团)。
为了形成共价键，可以使用多种活性羧基(例如酯)作为化学反应基团，其中羟基部分在修饰肽所需要的水平是生理上可接受的。具体的试剂包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基-硫代琥珀酰亚胺(硫代-NHS)、马来酰亚胺-苯甲酰基-琥珀酰亚胺(MBS)、γ-马来酰亚胺-丁酰氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS)、马来酰亚胺基丙酸(MPA)、马来酰亚胺己酸(MHA)和马来酰亚胺基十一烷酸(MUA)。
伯胺是NHS酯的主要靶标。可进入的α-氨基酸存在于蛋白质的N-末端上，且赖氨酸的ε-胺与NHS酯反应。当NHS酯与伯胺偶联反应释放N-羟基琥珀酰亚胺时，形成酰胺键。含有反应基团的这些琥珀酰亚胺在本文中被称为琥珀酰亚胺基团。在本发明的某些实施方案中，蛋白质上的官能团将是硫醇基，化学反应基团将是含马来酰亚胺的基团，如γ-马来酰亚胺-丁酰胺(GMBA或MPA)。这种含马来酰亚胺的基团在本文中称为马来酰亚胺(maleido)基团。
当反应混合物的pH为6.5-7.4时，马来酰亚胺基团对肽上的巯基基团最有选择性。在pH 7.0时，具有巯基(例如，蛋白质(如血清白蛋白或IgG)上的硫醇基团)的马来酰亚胺基团的反应速率比胺快1000倍。因此，在马来酰亚胺基和巯基之间可以形成稳定的硫醚键。
在其它实施方案中，接头包括至少一个氨基酸(例如至少2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、40或50个氨基酸的肽)。在某些实施方案中，接头是单个氨基酸(例如，任何天然存在的氨基酸如Cys)。在其它实施方案中，可以使用富含甘氨酸的肽，如在美国专利号7,271,149所述的肽。在其它实施方案中，可以使用富含丝氨酸的肽接头，如美国专利号5,525,491所述。在一些情况下，接头可以是单个氨基酸(例如，任何氨基酸，如Gly或Cys)。
适合的接头的实例是琥珀酸、Lys、Glu和Asp，或诸如Gly-Lys的二肽。当接头是琥珀酸时，其的一个羧基可与氨基酸残基的氨基形成酰胺键，而其另一个羧基可以例如与肽或取代基的氨基形成酰胺键。当接头是Lys、Glu或Asp时，其羧基可与氨基酸残基的氨基形成酰胺键，而其氨基可例如与取代基的羧基形成酰胺键。当将Lys用作接头时，另一接头可以在Lys的ε-氨基和取代基之间插入另一个接头。在一个具体的实施方案中，另一接头是琥珀酸，其例如与Lys的ε-氨基和取代基中存在的氨基形成酰胺键。在一个实施方案中，另一接头是Glu或Asp(例如，其与Lys的ε-氨基形成酰胺键，与存在于取代基的羧基形成另一酰胺键)，即取代基是Nε-酰化赖氨酸残基。
IV.多核苷酸、载体、宿主细胞和重组方法
i.多核苷酸
本发明的特征在于编码本发明的一种或多种(例如1、2、3或4种或更多种)化合物(例如抗TM4SF1抗体，如8G4)或其片段或部分的多核苷酸。可使用标准的重组技术获得编码本发明的一种或多种化合物的多核苷酸序列。例如，可以通过聚合酶链式反应(PCR)来制备包括结合结构域的化合物的cDNA，该结合结构域在包含氨基酸序列SEQ ID NO：1或其部分的表位特异性结合多肽(例如8G4)且其包括一个或多个(例如1、2、3或4个或更多个)克隆位点(例如EcoRV克隆位点)。
ii.载体
本发明的特征在于包括本发明的一种或多种(例如1、2、3或4种或更多种)化合物的载体。例如，可以分离本发明的多核苷酸并将其插入到用于进一步克隆(扩增DNA)或用于表达编码的多肽化合物的可复制的载体中。例如，在化合物是抗TM4SF1抗体的情况下，可以将多核苷酸克隆到pBluescript质粒中和将DNA亚克隆入Fc-编码质粒如pFUSE-hIgG1-Fc1(InvivoGen)之前检查的序列中。许多载体是可用的。载体的选择部分取决于要使用的宿主细胞。每个载体含有多种成分，这取决于其功能(扩增或表达异源多核苷酸，或二者兼之)及其与它驻留的具体宿主细胞的相容性。载体成分通常包括但不限于：复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入和转录终止序列。
在一般情况下，含有来自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主结合使用。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，大肠杆菌通常使用来自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化。pBR322含有编码抗氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)的基因，由此提供用于识别转化细胞的轻松手段。pBR322、其衍生物或其它微生物质粒或噬菌体还可包含或经修饰而包含可被微生物使用用于表达内源蛋白的启动子。用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例详细描述于Carter等(美国专利号5,648,237)。
另外，含有复制子和与宿主微生物相容的控制序列的噬菌体载体可用作与这些宿主有关的转化载体。例如，噬菌体如λGEM-11TM可用于制备重组载体，其可用于转化易感宿主细胞如大肠杆菌LE392。
本发明的表达载体可包含两个或更多个编码每种多肽成分的启动子-顺反子对。启动子是非翻译调控序列，其位于调节其表达的顺反子的上游(5')。原核启动子通常分成两类，即诱导型的和组成型。诱导型启动子是这样的启动子，即响应培养条件的变化在其控制下启动顺反子转录水平的增加，培养条件的变化例如存在或不存在营养物或温度变化。
被多种潜在宿主细胞识别的大量启动子是众所周知的。通过经由限制性酶切从源DNA中除去启动子并将分离的启动子序列插入本发明的载体，选择的启动子可以可操作地连接编码轻链或重链的顺反子DNA。天然启动子序列和许多异源启动子均可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在一些实施方案中，利用异源启动子，因为相比于天然靶多肽启动子，它们通常容许更大的转录和更高产量的被表达的靶基因。
适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、β-galactamase和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而，在细菌中发挥功能的其它启动子(如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也是适合的。它们的核苷酸序列已经公开，由此使得本领域技术人员使用接头或者适配子将其连接到编码靶轻链和重链的顺反子(Siebenlist等,Cell 20:269,1980)，以提供任何所需的限制性位点。
iii.宿主细胞
本发明的特征在于包括本发明的一种或多种载体的宿主细胞，例如原核来源(例如，大肠杆菌细胞)或真核来源(通常是哺乳动物(例如人脐静脉EC(HUVEC))的宿主细胞，还包括真菌(如酵母)、昆虫(例如果蝇S2细胞)、植物以及来自其它多细胞生物体的有核细胞)。在一些实施方案中，可以使用常规的筛选方法例如Zeocin筛选制备稳定的克隆。
a.原核宿主细胞
适用于表达本发明的化合物(例如抗TM4SF1抗体)的原核宿主细胞包括古细菌和真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物。有用的细菌的实例包括：埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌(E.coli))、芽孢杆菌属(Bacilli)(例如，枯草杆菌(B.subtilis))、肠杆菌(Enterobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas species)(例如绿脓杆菌(P.aeruginosa))、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、志贺氏菌属(Shigella)、根瘤菌(Rhizobia)、透明颤菌(Vitreoscilla)或副球菌属(Paracoccus)。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，大肠杆菌细胞作为本发明的宿主使用。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110(Bachmann,Cellular and Molecular Biology,第2卷(Washington,D.C.:American Society for Microbiology,1987),第1190-1219页；ATCC保藏号27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110ΔfhuA(ΔtonA)ptr3lac lq lacL8ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41kanR的菌株33D3(美国专利号5,639,635)。其它菌株及其衍生物，诸如大肠杆菌294(ATCC 31,446)，大肠杆菌B，大肠杆菌λ1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)也是合适的。这些实例是说明性的而不是限制性的。用于构建具有限定基因型的任何上述细菌的衍生物的方法在本领域中是已知的，并且描述于例如Bass等,Proteins 8：309-314(1990)。一般需要考虑在细菌细胞中复制子的可复制性来选择适当的细菌。例如，当公知的质粒如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410用于提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属(Serratia)或沙门氏菌属物种可适于作为宿主使用。通常，宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶，可以期望地将额外的蛋白酶抑制剂掺入在细胞培养中。
b.真核宿主细胞
载体成分通常包括但不限于一种或多种下列物质：信号序列、复制起点、一种或多种标记物基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
用于真核宿主细胞中的本发明的载体可含有信号序列或在成熟蛋白或目的多肽的N-末端具有特定切割位点的其它多肽。选择的异源信号序列可以是被宿主细胞识别并加工(即通过信号肽酶切除)的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列例如单纯疱疹病毒gD信号是可用的。这种前体区的DNA在读码框中被连接到编码多肽的DNA。
通常，哺乳动物表达载体不需要复制元件的起点。例如，通常可使用SV40起点，但仅仅是因为它含有早期启动子。
表达和克隆载体可包含选择基因，也被称为可选择的标记物。典型的选择基因编码以下的蛋白：(a)赋予抗生素或其它毒素例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素以抗性，(b)相关的情况下，补足营养缺陷，或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物。
筛选方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞产生赋予药物抗性的蛋白，因而幸免于筛选方案。此类显性选择的实例使用新霉素、霉酚酸和潮霉素药物。
用于哺乳动物细胞的适合的选择标记物的另一个例子是能够鉴定有能力摄取编码本发明的化合物(例如抗TM4SF1抗体，如8G4)的核酸的那些，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II，优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，用DHFR选择基因转化的细胞首先通过将所有转化子在含有DHFR的竞争性拮抗剂即甲氨蝶呤(Mtx)的培养基中培养来鉴定。采用野生型DHFR时，适当的宿主细胞是缺乏DHFR活性(例如，ATCC CRL-9096)的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
可选地，用编码本发明化合物、野生型DHFR蛋白和另一可选择的标记物如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)可通过在含有针对可选择的标记物的选择试剂的培养基中的细胞生长来选择，可选择的标记物如氨基糖苷抗生素，例如卡那霉素、新霉素或G418。参见例如美国专利号4,965,199。
编码化合物(例如抗TM4SF1抗体，如8G4)的高等真核生物的DNA的转录可通过将增强子序列插入载体来提高。现已知晓来自哺乳动物基因(例如，珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素基因)的许多增强子序列。此外，人们可以使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括在复制起点最近侧的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点的最近侧的多瘤增强子，和腺病毒增强子。可以将增强子在化合物的编码序列的位置5'或3'处接合到载体，只要实现增强，但通常位于从启动子的位点5'。
表达和克隆载体通常包含被宿主生物体识别并可操作地连接到编码化合物(例如抗TM4SF1抗体，如8G4)的核酸序列的启动子。真核生物的启动子序列是已知的。几乎所有的真核基因具有位于从转录起始位点的约25至30个碱基上游的富AT区域。发现从许多基因的转录起始的70至80个碱基上游的另一个序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。大多数真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是聚A尾添加到编码序列的3’端的信号。所有这些序列都适合插入真核表达载体中。
编码化合物(如抗TM4SF1抗体，如8G4)的载体在哺乳动物宿主细胞中的转录受到例如从病毒基因组获得的启动子、来自异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子、或来自热激启动子的控制，病毒例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和猿猴病毒40(SV40)，条件是此类启动子与宿主细胞系统相容。
SV40病毒的早期和晚期启动子作为还包含SV40病毒复制起点的SV40限制性片段可方便地得到。人巨细胞病毒的极早期启动子作为HindIII E限制性片段方便地获得。在哺乳动物宿主中使用牛乳头瘤病毒作为载体表达DNA的系统在美国专利号4,419,446中公开。在美国专利号4,601,978中描述了该系统的修改。可替代地，劳氏肉瘤病毒长末端重复序列可被用作启动子。
在真核宿主细胞中使用的表达载体通常还含有对于终止转录和稳定mRNA所需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5'和偶尔的3'、非翻译区获得。这些区域包含在编码TSP-1多肽的mRNA非翻译部分中转录为聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组件是牛生长激素聚腺苷酸化区(参见例如WO 94/11026和本文公开的表达载体)。
在本文描述的在载体中克隆或表达DNA的适合的宿主细胞包括本文描述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养基(组织培养基)中的繁殖已经成为常规流程。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚肾系(293或293细胞亚克隆用于在悬浮培养中生长，Graham等,J.Gen.Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))，例如CHO-K1细胞；小鼠睾丸支持细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCCCCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤系(Hep G2)。
iv.重组方法
本发明的特征还在于生产本发明的一种或多种化合物(例如抗TM4SF1抗体，如8G4)的方法，由此可以在培养基中培养宿主细胞，以及可以从宿主细胞或培养基(例如使用蛋白A琼脂糖的无血清条件培养基)中回收(例如，纯化)本发明的化合物(例如抗TM4SF1抗体，如8G4)。
用于生产本发明的化合物(例如抗TM4SF1抗体，如8G4)的宿主细胞可以在多种培养基中培养。市售的培养基适于培养宿主细胞，诸如Ham’s F10(Sigma)、最小必需培养基((MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco’s改良Eagle’s培养基((DMEM)，Sigma)。此外，Ham等,Meth.Enz.58:44(1979)、Barnes等,Anal.Biochem.102:255(1980)、美国专利号4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655或5,122,469、WO 90/03430、WO 87/00195或美国专利Re.30,985中描述的任何培养基可以用作宿主细胞的培养基。任何这些培养基可以根据需要补充有激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以终浓度在微摩尔范围存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能源。也可以包括本领域技术人员已知的适当浓度的任何其它必需补充。培养条件如温度、pH等是与预先选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些，这对普通技术人员将是显而易见的。
可以采用本领域中已知的标准的蛋白质纯化方法。以下程序是示例性的适合的纯化程序：免疫亲和分馏或离子交换柱，乙醇沉淀，反相HPLC，硅胶或阳离子交换树脂如DEAE层析，聚焦层析，SDS-PAGE，疏水相互作用柱(HIC)，硫酸铵沉淀，和使用例如葡聚糖G-75的凝胶过滤。
在一个实施方案中，当化合物是抗体时，蛋白A可固定在固相上并用于本发明的抗体(例如8G4)的免疫亲和纯化。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的41-kDa细胞壁蛋白，它以高亲和力结合抗体的Fc区(Lindmark等J.Immunol.Meth.62:1-13,1983)。固定蛋白A的固相优选为含有玻璃或石英表面的柱，更优选可控孔玻璃柱或硅酸柱。在一些应用中，柱已涂覆有试剂如甘油，以试图防止污染物的非特异性粘附。
作为纯化的第一步，将源自上述的细胞培养物的制剂施加到固定蛋白A的固相，以允许将目的抗TM4SF1抗体特异性结合至蛋白A。然后洗涤固相以除去非特异性结合于该固相的污染物。通过洗脱可以将目的抗TM4SF1抗体从固相回收到含有离液剂或中性洗涤剂的溶液中。示例性离液剂包括但不限于：脲、盐酸胍、高氯酸锂、组氨酸和精氨酸。示例性温和洗涤剂包括但不限于：吐温(例如吐温20)、Triton(例如Triton X-100)、NP-40(壬基苯氧基聚乙氧基乙醇)、诺乃洗涤剂P-40(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)和十二烷基硫酸钠(SDS)。从柱(例如mAbSure柱)洗脱后将抗TM4SF1抗体稀释为含有离液剂或中性洗涤剂的溶液维持抗TM4SF1抗体洗脱后的稳定性。
在其它实施方案中，本发明的经表达的多组氨酸标记化合物(例如抗TM4SF1抗体)可以被纯化，例如通过如下的Ni2+螯合亲和层析。可以从Rupert等(Nature.362:175-179,1993)所述的重组病毒感染的S2细胞制备提取物。简言之，将S2细胞洗涤，再悬浮在超声处理缓冲液(25mL HEPES pH值7.9；12.5mM氯化镁；0.1mM EDTA；10％甘油；0.1％NP-40；0.4MKCl)中，并在冰上超声处理两次，20秒。通过离心澄清超声处理物，将上清液在加样缓冲液(50mM磷酸盐；300mM NaCl；10％甘油pH 7.8)中稀释50倍，并通过0.45μm的过滤器过滤。将Ni2+-NTA琼脂糖柱(可购自Qiagen)用5mL的床体积制备，用25mL水洗涤，并用25mL加样缓冲液平衡。将过滤的细胞提取物以每分钟0.5mL加载至柱上。用加样缓冲液洗涤柱至基线A280，在该点开始级分收集。接着，将柱用次级洗涤缓冲液(50mM磷酸盐；300mM NaCl；10％甘油pH6.0)洗涤，其洗脱非特异性结合的蛋白质。再次到达A280基线后，将柱用次级洗涤缓冲液中的0-500mM咪唑梯度显影。将一毫升级分(One mL fractions)收集并通过SDS-PAGE和银染色或用Ni2+-NTA-偶联碱性磷酸酶(Qiagen)的Western印迹进行分析。将含有本发明的洗脱的多组氨酸标记的化合物的级分汇集并针对加样缓冲液进行透析。
也可以用已知的层析技术包括例如蛋白A或蛋白G柱层析进行本发明的化合物(例如抗TM4SF1抗体，如8G4)的纯化。本发明的化合物(例如，抗TM4SF1抗体，例如8G4)可以通过洗脱从该柱的固相回收到含有离液剂或中性洗涤剂的溶液。示例性离液剂和中性洗涤剂包括但不限于：盐酸胍、脲、高氯酸锂、精氨酸、组氨酸、SDS(十二烷基硫酸钠)、吐温、Triton和NP-40，所有这些都是市售的。蛋白质印迹(例如，使用化合物的多克隆抗体或偶联剂，例如标签)可用于确认产生了正确分子量的蛋白。
v.本发明的组合物
本发明的任何化合物(例如抗TM4SF1抗体，如8G4)或编码本发明的化合物的多核苷酸，如上所述的那些，可以包含在组合物(例如药物组合物)中。本发明的药物组合物还可以包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
如本文所述，任何一种药物组合物可被配制用于治疗患有与病理性血管生成相关的病症(例如癌症，如乳腺癌、卵巢癌、肾癌、结肠直肠癌、肝癌、胃癌和肺癌；肥胖症；黄斑变性；糖尿病性视网膜病；银屑病；类风湿性关节炎；细胞免疫；和红斑痤疮)的受试者(例如，人)。
vi.本发明的治疗方法
在包含氨基酸序列NYTFASTEGQYLLDTSTWSECTEPKHIVEWNVS(SEQ ID NO：1)的表位处包括结合(例如特异性结合)多肽(例如TM4SF1)的结合域的本发明化合物(例如抗TM4SF1抗体，如8G4)可用于治疗性应用。因此，本发明的特征在于治疗患有与病理性血管生成相关的病症(例如癌症，如乳腺癌、卵巢癌、肾癌、结肠直肠癌、肝癌、胃癌和肺癌；肥胖症；黄斑变性；糖尿病性视网膜病；银屑病；类风湿性关节炎；细胞免疫；和红斑痤疮)的受试者的方法，包括施用治疗有效量的本发明化合物或其药物组合物以治疗所述受试者。化合物或药物组合物将以与优良医学实践一致的方式被配制、给药和施用。根据本发明的治疗可以单独或与另一治疗联合进行，并且可以在家里、医生办公室、诊所、医院的门诊部或医院提供。治疗任选在医院开始，以便医生可以密切观察治疗的效果并进行所需的任何调整，或者它可以开始于门诊基础上。该疗法的持续时间取决于所治疗的疾病或病症的类型、患者的年龄和身体状况、患者的疾病的阶段和类型以及患者对治疗的反应。此外，具有产生增殖或致病性疾病的更大风险的人可接收治疗，以抑制或延缓症状的发作。
在上述的方法中，本发明的化合物或其药物组合物可以在结合包含氨基酸序列NYTFASTEGQYLLDTSTWSECTEPKHIVEWNVS(SEQ ID NO：1)的表位之后，被内化(例如内吞)入TM4SF1表达细胞(例如，肿瘤血管的内皮细胞或肿瘤细胞)。在一些实施方案中，化合物或其药物组合物可以被内化至TM4SF1表达细胞的细胞质中，并可能被内化至TM4SF1表达细胞的细胞核中。因此，治疗有效量的化合物或其药物组合物可以导致病症的症状的减轻、减少、治疗和/或停止，如在原发肿瘤尺寸的减小(例如，施用本发明的化合物或药物组合物后受试者的原发肿瘤大小相比对照处理减小了5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或以上)；TM4SF1表达细胞(例如肿瘤血管的内皮细胞或肿瘤细胞)的数目减少(例如，施用本发明的化合物或药物组合物后受试者中的TM4SF1表达细胞的数目相比对照处理减少了5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或以上)；和/或TM4SF1表达细胞(例如肿瘤血管的内皮细胞或肿瘤细胞)的细胞凋亡的增加(例如，施用本发明的化合物或药物组合物后受试者中TM4SF1表达细胞的细胞凋亡相比对照处理诱导了5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或以上)。这些症状和/或与病理性血管生成相关的病症的其它症状和治疗过程中它们的治愈可通过例如物理检查期间的医师或本领域已知的其它测试和方法来测定。在一些实施方案中，使用本发明的一种或多种化合物或药物组合物的治疗会导致受试者中病症进展的缺乏。在其它实施方案中，使用本发明一种或多种化合物或其药物组合物的治疗相对于常见或常规疗法(例如手术、放疗、化疗、免疫疗法或激素治疗)会导致受试者中病症的进展减缓。
i.施用方法
根据本文所述的本发明的化合物和组合物(例如药物组合物)可以配制为施用后(例如，靶向递送)立即释放，或使用控释或缓释制剂施用后在任何预定的时间段释放。以控释或缓释制剂施用化合物或组合物是有利的，其中单独或组合施用的化合物或组合物具有以下优点：(i)窄的治疗指数(例如，导致有害副作用或毒性反应的血浆浓度和导致治疗效果的血浆浓度之间的差异小；一般来说，治疗指数TI被定义为中值致死剂量(LD50)与中值有效剂量(ED50)之间的比例；(ii)在释放部位(例如胃肠道)的窄吸收窗；或(iii)短的生物半衰期，因此需要在一天内频繁给药以维持治疗水平。
可以采取许多策略以获得控释或缓释，其中释放速率超过了药物组合物的代谢速率。例如，可以通过制剂参数和成分的适当选择可以获得控释，包括例如适合的控释组合物和包衣。适合的制剂是本领域技术人员已知的。实例包括单个或多个单位片剂或胶囊组合物、油溶液、混悬剂、乳剂、微囊剂、微球、纳米颗粒、贴剂和脂质体。
任选地，组合物可以配制为例如用于通过局部药物递送(例如，局部缓慢释放或持续释放的药物递送系统)施用。缓释制剂的适合例子包括含有本发明化合物的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质是成形制品形式，例如薄膜或微胶囊。微胶囊可以例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备，例如分别在胶状药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能够释放分子超过100天，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当包封的本发明的化合物(例如抗TM4SF1抗体)留在体内较长时间时，由于暴露于37℃的水分它们可能会变性或聚集，导致生物活性丧失和免疫原性可能的改变。根据所涉及的机制可以设计用于稳定的理性策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换而形成分子间S-S键，那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制水分、采用适当添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。
任选地，该组合物可配制为例如用于通过病毒载体(例如腺病毒载体或痘病毒载体)施用。重组腺病毒用作例如本发明的一种或多种化合物(例如抗TM4SF1抗体)的表达的载体提供了几个显著优点。病毒可制备为高滴度，可以感染非复制细胞，在接触靶细胞群之后可以赋予来自体内的靶细胞的高效转导。此外，腺病毒不把它们的DNA整合到宿主基因组中。因此，它们作为表达载体使用具有降低诱导自发增殖性疾病的风险。在动物模型中，已普遍发现腺病毒载体介导高水平表达大约一周。转基因表达(本发明的核酸分子的表达)的持续时间可以通过使用细胞或组织特异性启动子来延长。腺病毒载体本身的分子工程学的其它改进已产生更持久的转基因表达和较少的炎症。这可从在附加的早期腺病毒基因中含有特定突变的所谓的“第二代”载体中和其中利用Cre-Lox策略删除几乎所有的病毒基因的“裸”载体中看出(Engelhardt等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:6196(1994)and Kochanek等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:5731(1996)，均通过引用并入本文)。
在国际专利申请公布WO 2006/040330和WO 2007/104792(均通过引用并入本文)公开的腺病毒载体作为本发明的载体是特别有用的。这些腺病毒载体可以编码和/或递送本发明的一种或多种化合物(例如抗TM4SF1抗体)以治疗患有与血管生成相关的病理性病症(例如癌症)的受试者。在一些实施方案中，一种或多种重组腺病毒载体可以施用给受试者以表达多于一种类型的本发明化合物。除腺病毒载体外，可用于促进受试者(例如人)中本发明的一种或多种化合物的递送和/或表达的其它病毒载体和技术是本领域中已知的。这些病毒包括痘病毒(例如，牛痘病毒和改良型痘苗病毒Ankara(MVA)；参见例如美国专利号4,603,112和5,762,938，每个均通过引用并入本文)、疱疹病毒、披膜病毒(例如，委内瑞拉马脑炎病毒；参见例如美国专利号5,643,576，其通过引用并入本文)、小核糖核酸病毒(例如脊髓灰质炎病毒；参见例如美国专利号5,639,649，其通过引用并入本文)、杆状病毒，和由Wattanapitayakul和Bauer(Biomed.Pharmacother.54:487(2000)，其通过引用并入本文)描述的其它病毒。
本文所述的方法中使用的化合物和/或组合物可被配制为例如用于以下方式的施用：肌肉内、静脉内、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸腔内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、腹膜、皮下、结膜下、泡内、粘膜、心包内、脐带内、眼内、口服、外用、局部、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过直接局部灌注浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗或以霜剂或脂质组合物。
优选的施用方法可根据各种因素(例如，被施用的组合物的组分和所治疗的病症的严重程度，例如癌症的具体阶段)而变化。适合于口服或鼻给药的制剂可以由液体溶液(例如溶解在稀释剂(例如，水、盐水或PEG-400)中的有效量的组合物)、胶囊剂、小袋剂、片剂或凝胶剂组成，各含有预定量的该组合物或编码本发明的组合物的多核苷酸。该药物组合物还可以是用于吸入到例如支气管通道的气雾剂制剂。气雾剂制剂可以与加压的药学上可接受的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、丙烷或氮)混合。特别是，通过吸入施用可以通过使用例如含有山梨糖醇三油酸酯或油酸的气雾剂，例如与三氯氟甲烷、二氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或任何其它生物相容的推进剂气体一起完成。
受试者已被诊断为患有与病理性血管生成相关的病症(例如癌症)后，可施用本发明的组合物。该组合物可以施用于受试者，例如诊断后15-30分钟，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、20、24、48或72小时，2、3、5或7天，2、4、6或8周，3、4、6或9个月，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20年或更长的时间。可以向受试者施用单剂量(或，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个剂量)的组合物，或可以向受试者每天、每周、每月或每年施用至少一种剂量(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个剂量)。可以定义给药期间(例如，1-4周，1-12个月，1-20年)，或者可以是用于受试者的寿命期。
当治疗与病理性血管生成相关的病症(例如癌症)时，可在症状发生或确切诊断之前或诊断后或症状变得明显后将本发明的组合物施用给受试者。因此，例如可以在诊断或临床确认症状后立即或诊断或症状检测后2、4、6、10、15或24小时，2、3、5、或7天，2、4、6或8周，或甚至3、4或6个月后施用组合物。
该组合物可通过常规的灭菌技术灭菌，或可以无菌过滤。所得的水溶液可按原样包装使用或冻干，冻干的制剂可以粉末形式施用或在施用前与无菌水性载体联合施用。制剂的pH通常为3-11，更优选5-9或6-8，最优选在7-8，如7-7.5。固体形式的所得组合物可以多个单剂量单位包装，各含有固定量的化合物和/或编码一种或多种化合物的一种或多种核酸，如果需要的话，如在片剂或胶囊的密封包装中，或在能够施用一个或多个剂量的适合的干粉吸入器(DPI)中。
ii.剂量
施用的剂量取决于待治疗的受试者(例如，被治疗受试者的年龄、体重、免疫系统的能力以及一般健康状况)、施用形式(例如，作为固体或液体)、施用方式(例如，通过注射、吸入、干粉推进剂)以及潜在地靶向的TM4SF1表达细胞(例如TC或EC，如新生血管的那些)。此外，有关具体患者的药物基因组学(基因型对药代动力学、药效学或治疗的效能的影响)信息可能影响使用的剂量。该组合物优选以这样的量施用，即提供足够水平的化合物(例如抗TM4SF1抗体，如8G4)以在受试者中产生治疗效果，而没有由治疗引起的过度不良生理作用。
基于受试者中与病理性血管生成相关的病症(例如癌症)的严重程度、发生或进展(例如，基于病症的一种或多种症状的严重程度)，本发明的组合物(例如，包括本发明的一种或多种化合物的组合物)的剂量或使用本发明的组合物的治疗次数可以增加或者降低。
本发明的化合物或药物组合物可以约0.01mg/kg至约10mg/kg，如约0.1mg/kg至约10mg/kg，如约3mg/kg至约10mg/kg的剂量施用至受试者。在一个实例中，向受试者施用化合物或药物组合物的至少一个剂量(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个剂量)。化合物或组合物可被施用例如每周一次至七次(例如，每周1、2、3、4、5、6或7次)。优选地，当将高剂量(例如，约10mg/kg)的化合物或药物组合物施用给受试者时，总共提供单个剂量(即，一个剂量)。优选地，当将低剂量(例如，约3mg/kg)的化合物或药物组合物施用给受试者时，总共提供多于一个剂量(例如2、3、4或5或更多个剂量)，如4个剂量。
此外，可向受试者施用(诊断前或后)本发明的组合物单次或多次(例如，施用一次或施用两次或更多次)。例如，特别易患与病理性血管生成相关的病症如癌症或具有该病症家族史的受试者可能需要多次治疗来建立和/或维持治疗效果。对于患有与病理性血管生成相关的病症的受试者的治疗，通过本文描述的药物组合物提供的治疗的功效可通过例如监测和/或测量原发肿瘤的大小、TM4SF1表达细胞数目和/或TM4SF1表达细胞(例如，肿瘤血管的内皮细胞或肿瘤细胞)的细胞凋亡来监测，由此原发肿瘤的大小和/或TM4SF1表达细胞数目的减小或降低和/或EOC细胞凋亡的诱导或增加指示有效的治疗。随后根据需要调整或重复剂量以触发响应的期望水平。
本发明的单剂量的一种或多种组合物可以实现预诊断的治疗效果。此外，诊断后单剂量施用可以发挥本发明的治疗作用。
本发明的单剂量的一种或多种组合物也可用来实现治疗具有与病理性血管生成相关的病症(例如癌症)的受试者的治疗。必要时，也可将多剂量(例如2、3、4、5或更多种剂量)施用于这些受试者。
iii.载体、赋形剂、稀释剂
可使用本领域已知的标准方法通过将具有所需纯度的活性成分与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备本发明的组合物的治疗制剂(Remington’sPharmaceutical Sciences，第20版),ed.A.Gennaro,2000,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA)。可接受的载体包括盐水，或缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐的抗衡离子如钠；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或PEG。
任选地，但优选地制剂含有药学上可接受的盐，优选氯化钠，优选以约生理浓度。任选地，本发明的制剂可以含有药学上可接受的防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂浓度范围在0.1-2.0％，通常单位为v/v。适合的防腐剂包括制药领域公知的那些。苄醇、苯酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯是优选的防腐剂。任选地，本发明的制剂可以包括浓度为0.005-0.02％的药学上可接受的表面活性剂。
VII.试剂盒
本发明提供了包括本发明的组合物(例如药物组合物)(例如，包括本发明的化合物，如抗TM4SF1抗体，如8G4的组合物)的试剂盒。该试剂盒包括说明书，以允许临床医生(例如，医生或护士)将其中包含的组合物施用于受试者以治疗与病理性血管生成相关的病症(例如癌症)的说明书。
优选地，试剂盒包括含有有效量的本发明的多肽或多核苷酸的单剂量药物组合物的多个包装。任选地，施用药物组合物所需的工具或设备可以包括在试剂盒中。例如，本发明的试剂盒可以提供一个或多个预填充注射器，其含有有效量的疫苗、载体、稳定的三聚体或本发明的优化的病毒多肽。此外，该试剂盒还可以包括附加的组件，例如关于对具有与病理性血管生成相关的病症(例如癌症)的受试者使用含有本发明的化合物或多核苷酸的药物组合物的施用方案的说明书。
在不背离本发明的精神或范围的情况下，可以对本发明的组合物、方法和试剂盒作出各种修改和变化，这对本领域技术人员将是显而易见的。因此，预期本发明涵盖本发明的这些修改和变型，只要它们落在所附权利要求及其等同的范围之内。
实施例
提供以下实施例用于说明，但不限制本发明要求保护的范围。
实施例1.材料和方法
抗TM4SF1的单克隆抗体的制备
将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在EGM2-MV完全培养基(Lonza，Walkersville，MD)中培养并在3-6通道使用。转导HUVEC以在约400个mRNA拷贝/细胞的水平(即天然HUVEC的约4倍)过表达(OE)人TM4SF1(Shih等Cancer Res.69:3272-3277,2009；Zukauskas等Angiogenesis.14:345-354,2011)。将107个TM4SF1 OE细胞以2周的间隔向雌性六周龄的Balb-c小鼠腹膜内注射5次。TM4SF1结构如图1所述。如下和图2示出杂交瘤细胞的筛选步骤和表位作图策略。得到十五个稳定克隆。这些中，基于它们与TM4SF1的突变体形式的反应性，十三个识别的表位在胞外环2(ECL2)中，两个表位在胞内结构域中(图2B-2E)。针对人ECL2的克隆均未与小鼠TM4SF1反应，可能是因为小鼠和人TM4SF1之间显著的结构差异(图2E)。
免疫染色
先前描述了实验程序(Shih等Cancer Res.69:3272-3277,2009；Zukauskas等Angiogenesis.14:345-354,2011)。简言之，用4％多聚甲醛在25℃将细胞和组织切片固定20分钟，在PBS中洗涤3次，并在用一级抗体(来自Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA的8G4或山羊抗人CD144)随后用二级驴抗小鼠的Alexa Fluor-488或-594标记抗体和鬼笔环肽(Life Technologies,Carlsbad,CA)进行免疫细胞化学之前，用PBS/2％FBS封阻。对于免疫-纳米金-透射电子显微镜(TEM)，山羊抗小鼠的Alexa Fluor-488/纳米金Fab片段(Nanoprobes,Yaphank,NY)用作二级抗体。HRP标记的山羊抗小鼠抗体(Cell Signaling,Danvers,MA)用于免疫印迹。亚细胞分离试剂盒购自Thermo Scientific(Logan,UT)。
MTT测定
皂草素偶联的非特异性山羊Fab(对照ADC)和皂草素偶联的山羊抗小鼠IgG Fab(实验ADC)来自高级定位系统(San Diego,CA)，并按照制造商的说明进行实验。简言之，在25℃分别用在10μl EGM2-MV完全培养基(Lonza,Walkersville,MD)中的200ng对照或实验ADC预温育200ng 8G4或对照小鼠IgG(mIgG)1小时。将该混合物加入到在96孔平板上(1×103细胞/孔在200μl EGM2-MV；每组4个孔)涂板4小时的HUVEC。第5天进行MTT测定(LifeTechnologies)。所有实验至少重复3次。计算活细胞％如下：活细胞(％)＝(OD570ADC-OD750ADC)/(OD570实验对照-OD750实验对照)×100。
实施例2.抗TM4SF1抗体8G4
图2描述了杂交瘤的筛选和表位作图策略。在针对ECL2上的表位的抗体(图1A和1B)中，8G4由于其高亲和力(Kd～1nM)被选定用于详细的研究。
通过其生产杂交瘤，杂交瘤小鼠细胞系8G4-5-13-13F的方式，将8G4抗体保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture
Figure BDA0000980741080000561
邮政信箱1549,Manassas,VA,20108,USA
Figure BDA0000980741080000562
细胞系
Figure BDA0000980741080000563
登记号 保存日期
杂交瘤小鼠
细胞系8G4-5-13-13F PTA-120523 2013年7月31日
保藏按照国际承认用于专利程序的微生物保存的布达佩斯条约的规定及其细则进行。这确保从保藏之日起维持存活保藏30年。该细胞系将按照布达佩斯条约的条款由ATCC提供，并且受贝斯以色列女执事医疗中心(Beth Israel Deaconess Medical Center,Inc.)和ATCC之间的协议的约束，其保证一旦相关的美国专利授权或任何美国或外国专利申请特公开于公众后，即向公众永久和无限制地提供细胞系，以先到者为准，并保证细胞系对于按照35USC§122和与此相关的委员条例(包括37 CFR§1.14，特别提及886 OG 638)授权此项事宜的美国专利和商标委员确定的公众的可用性。
本申请的受让人已同意，如果适合的条件下培养的保藏的细胞系丢失或损坏，则在收到通知后将及时更换为相同细胞系的样品。保藏的细胞系的可用性不应被解释为根据其专利法许可实施违背任何政府权力下授予的权利的本发明的实践。
实施例3.8G4和HUVEC中TM4SF1的亚细胞分布
用8G4染色HUVEC中的TM4SF1(图3A-3C)和间歇的培养的其它内皮细胞(EC)，质膜和nanopodia上的TM4SF1富集结构域(TMED)，以及核周和核沉积物。免疫细胞化学证实，TM4SF1通过Triton-X100提取；膜相关染色比核周和核沉积物受到更大影响(图3D)。TM4SF1被认为是由具有用于起始蛋白翻译的潜在可选位点的2个转录变体产生的，生成了28-、25-和22-kD的亚型(Zukauskas等Angiogenesis.14:345-354,2011)。免疫印迹表明，所有三个带主要是通过0.05％的Triton X-100提取而不是0.01％的Triton X-100(图3E)。用0.1％Triton的附加提取洗脱了残留的28-kD带。28-kD带(黑色箭头)在可溶性核级分中是主要的，并且只出现在细胞骨架和核染色质级分中(图3F)。8G4并不与缺乏TM4SF1表达的细胞相互作用(图2C和2D)。
HUVEC的亚细胞分离(图3F)表明所有三个主要TM4SF1带几乎等于在膜级分的量；所有三种亚型也存在于可溶性细胞核级分。在细胞骨架和核染色质级分中仅发现28-kD的TM4SF1。在可溶性细胞质级分未检测到TM4SF1。
实施例4.人胃腺癌血管EC中TM4SF1的分布
先前的免疫组化研究已表明TM4SF1通过内衬于数种不同的人癌症血管的EC而高度表达(Chang等Int J Cancer.116:243-252,2005)。用8G4的免疫荧光染色证实了这些结果，并将其扩展到另外的人癌症，胃腺癌(图4A和4B)。透射电子显微镜(TEM)与免疫-纳米金染色表明质膜上间歇的TMED灶(图4C-4F)。管腔染色始终强于腔外染色(图4D和4E)。癌症血管EC还用TMED染色模式将瘦长的nanopodia扩展进入血管管腔高达30微米的距离(图4G)。这些扩展中的一些比典型的nanopodia更厚，含有胶原基质，并形成将血管管腔分割成更小沟道的桥(图4H)。类似的nanopodia状突起已描述于小鼠癌症血管中(Nagy等,CancerRes.55:360-368,1995)和表达VEGF-A164的腺病毒诱导的小鼠中的血管中(Shih等,CancerRes.69:3272-3277,2009)。据我们所知，这是在人类癌症EC中对这种突起的首次描述并具有重要意义，因为它们为抗血管靶向提供了显著增加的表面积。这类突起并未在内衬于相邻正常血管的EC中发现，并且用8G4的标记在这种血管中也弱得多(图4I和4J)。
实施例5.HUVEC中8G4的内化
为了确定8G4是否内化入表达TM4SF1的细胞中，在培养物中随时间追踪用8G4预标记的HUVEC。流动细胞术显示细胞表面信号的渐进性丧失：在2、4和24小时分别为20.8％、52.2％和95％(图5A)，这表明8G4被逐步内吞进入HUVEC。虽然一些这种丧失可以反映从细胞表面的脱落，共焦-3D Z-堆叠显微镜证实8G4信号实质和渐进摄取到细胞质隔室(图5B)和细胞核(图5C，帧6，白箭头)。免疫印迹表明至4小时的核提取物中的8G4重链和轻链，这些在24小时持续处于较低的水平(图5D)。免疫-纳米金-EM提供了8G4内吞作用的进一步证据，即鉴定核周细胞质、核孔和核本身内的纳米金簇(图5E和5F)。8G4内化在以非常低的水平表达TM4SF1的细胞(例如成纤维细胞)中是检测不到的。
负责8G4抗体内化的路径仍不清楚，但网格蛋白介导的机制是不可能的。TMED内化的动力学比报道的网格蛋白依赖的内吞作用慢；从HUVEC表面损失50％的TM4SF1需要至少4小时(图5A和5B)，而网格蛋白依赖的内吞作用通常只需要几分钟(McNiven.Trends CellBiol.16:487-492,2006)。此外，网格蛋白抑制剂如PitStop不阻断TM4SF1的摄取，TM4SF1胞内结构域不包含网格蛋白基序(Kelly and Owen.Curr Opin Cell Biol.23:404-412,2011)。最后，内化的8G4沉积物(直径100-300nm)过大，以至于不能被网格蛋白依赖的囊泡(约80nm直径)容纳，并且在任何情况下，它们不与膜结合。这些最近的观察还排除小窝摄取8G4。8G4进入HUVEC核(图5A-5F)是预料之外的。TM4SF1没有传统的核定位序列(Wright等Protein Sci.9:1594-1600,2000)。因此，很可能TM4SF-1相互作用蛋白如肌动蛋白和肌球蛋白(Shih等Cancer Res.69:3272-3277,2009；Zukauskas等Angiogenesis.14:345-354,2011)可以负责(Spencer.Communicative&Integrative Biology.4:511-512,2011；Dzijak等PLoS ONE.7:e30529,2012；Weber等Nature.431:325-329,2004)。
实施例6.用抗体-药物偶联物(ADC)靶向TM4SF1
因为推测与TM4SF1络合的8G4被HUVEC有效地摄取，我们测试抗体-药物偶联物(ADC)途径是否会诱发EC杀伤。最近的研究表明ADC作为癌症治疗的方法的效用(Kuroda等Prostate.70:1286-1294,2010)。成功所需要的是靶分子在细胞表面上高度表达和该抗体连接的毒素被有效内吞。TM4SF1和本发明的化合物如8G4抗TM4SF1抗体满足这些标准。首先，TM4SF1不仅在许多癌细胞表面上高度表达，而且在肿瘤血管EC的质膜上高度表达，预期肿瘤血管EC的杀伤会中断血流和分解血管屏障，从而提高ADC到肿瘤细胞的进入。其次，针对TM4SF1的8G4抗体被EC和表达大量TM4SF1的其它细胞容易地内吞，为连接的毒素进入细胞质和细胞核提供所得的细胞杀伤。总之，这些发现表明TM4SF1可以是用于ADC癌症疗法的适合的血管和肿瘤细胞靶标，如使用本发明化合物的ADC癌症治疗，该化合物特异性结合包含氨基酸序列NYTFASTEGQYLLDTSTWSECTEPKHIVEWNVS(SEQ ID NO：1)的表位，并且优选能够以与观察到的8G4抗体相似或相同的方式被内化入细胞中。
为了检验这一假设，皂草素，阻止蛋白质合成的单体RNA N-糖苷酶(Polito等IntJ Biochem Cell Biol.41:1055-1061,2009)用作产生8G4 ADC的毒素。HUVEC摄取8G4/Exp-ADC(皂草素偶联的山羊抗小鼠Fab)，至第3天生长明显的应力纤维(图6B)，至第5天大量的细胞被杀伤(图6C)。仅暴露于8G4或小鼠IgG的HUVEC或暴露于对照-ADC(皂草素偶联的山羊Fab)(图6A)的HUVEC并没有表现出可检测的细胞毒性(图6C)。类似的结果用高水平表达TM4SF1的PC3前列腺癌细胞获得，而不表达可检测的TM4SF1的HEK293对8G4-皂草素络合物有抗性(图7)。
其它实施方案
虽然已经结合其具体实施方案描述了本发明，但应理解能够进行进一步修改，并且本申请旨在覆盖遵循本发明的一般原理的本发明的任何变化、使用或改编，包括与本发明的这种背离，即其落入本发明所属领域的已知或常规实践中并且可以应用于上文所述的基本特征。
所有出版物、专利和专利申请都通过引用以其每一单独的出版物、专利或专利申请特别或单独地通过引用全文并入本文的相同程度全部并入本文。这些专利申请特别包括本申请要求受益的于2013年10月10日提交的美国临时专利申请第61/88934号。
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Claims (23)

1.一种药物组合物，其包含与跨膜-4L6家族成员-1(TM4SF1)中的多肽序列特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述多肽序列包含氨基酸序列NYTFASTEGQYLLDTSTWSECTEPKHIVEWNVS(SEQ ID NO：1)，其中所述抗体或其抗原结合片段偶联至治疗剂，并且其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含三个互补决定区(CDR)SEQ ID NO：2-4，所述轻链可变区分别包含第一CDR SEQ ID NO:5和第二CDR SEQ IDNO:6以及第三CDR，所述第三CDR为包含在SEQ ID NO:9中的CDR3。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段能够以10nM或更小的Kd值特异性结合糖基化的人TM4SF1中的多肽序列。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述Kd值为2nM或更小。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述Kd值为500pM或更小。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段的重链包括氨基酸序列SEQ ID NO：8。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段的轻链包括氨基酸序列SEQ ID NO：9。
7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段的重链包括氨基酸序列SEQ ID NO：8，且
其中所述抗体或其抗原结合片段的轻链包括氨基酸序列SEQ ID NO：9。
8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆的、人源化的、嵌合的或合成的。
9.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv双抗体或scFv-Fc。
10.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段以糖基化依赖性的方式特异性结合人TM4SF1中的多肽序列，并且其中所述糖基化位点对应于人TM4SF1的残基N129和N159。
11.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述治疗剂选自：细胞毒素剂、蛋白质、肽和生长抑制剂。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述蛋白质是抗体。
13.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述细胞毒素剂选自：核糖体失活蛋白、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、微管蛋白抑制剂、烷化剂、抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶I或II抑制剂、激素激动剂或拮抗剂、免疫调节剂、DNA小沟结合剂、和放射性试剂。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述核糖体失活蛋白是皂草素。
15.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述细胞毒素剂是抗肿瘤剂。
16.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述细胞毒素剂是抗增殖剂。
17.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述治疗剂是化疗剂。
18.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述治疗剂是抗激素剂。
19.根据权利要求1所述的药物组合物，其还包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
20.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制为用于治疗受试者中与肿瘤血管生成相关的病症。
21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述与肿瘤血管生成相关的病症是癌症。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述癌症选自：乳腺癌、卵巢癌、肾癌、结肠直肠癌、肝癌、胃癌、皮肤癌、食道癌、脑癌、甲状腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌，睾丸癌、小肠癌、和唾液腺癌。
23.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述癌症是肾上腺癌。
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