CN105873601A - TNFR:Fc融合多肽的替代配方 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类水中稳定的制药组合物，可以实现肿瘤坏死因子受体(TNFR)的FC融合多肽的储存。

Description

TNFR:Fc融合多肽的替代配方

技术领域

本发明涉及一类水中稳定的制药组合物，可以在无需某些特定氨基酸的状态下实现肿瘤坏死因子受体(TNFR)的FC融合多肽的储存。

背景技术

多肽制剂在使用前通常需储存。然而，液态多肽在长时间储存时会很不稳定，特别是在没有精氨酸等稳定剂存在的时候。液态储存的一种替代方法是将多肽制备成冻干形式。然而，冻干多肽的复原常常导致凝聚或变性，而凝聚会让多肽产生免疫原性，这是不希望看到的。

依那西普(商品名)是一种市售可溶性、融合有FC结构域的肿瘤坏死因子(TNF)受体。作为TNF抑制剂，依那西普有可以干扰TNF的作用。它是一种二聚体融合多肽，由人的75kDa(P75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的细胞外配体结合部分与人类IgG1的Fc部分融合而成，目前，该二聚体融合多肽的生产中采用L-精氨酸和/或L-半胱氨酸作为凝聚抑制剂，以防止多肽的凝聚(参见EP1478394B1)。

然而，精氨酸在某些人身上可能会引发严重的副作用。注射精氨酸后，会引发一种叫I型超敏反应的严重过敏反应，以及恶心、胃痉挛等胃部不适症状或大便次数增加。其他潜在的副作用包括低血压，以及血液中大量化学物质和电解质发生紊乱，如出现高钾、高氯、低钠、低磷酸盐、高血尿素氮和高肌酸酐等。理论上，精氨酸可能会增加出血风险，抬高血糖、血钾水平，并可能使镰状红细胞贫血症患者的症状恶化。

半胱氨酸是一个非必需氨基酸，与胱氨酸密切相关，因为胱氨酸由两个半胱氨酸分子结合而成。半胱氨酸不稳定，很容易转化为胱氨酸。而过多胱氨酸在体内积聚可引起一种罕见的疾病——胱氨酸贮积症，从而在身体内产生胱氨酸结晶，形成膀胱结石或肾结石。此外，半胱氨酸补充剂可增加糖尿病和胱氨酸尿症患者并发症也是众所周知的。

专利WO2013/006454公开了一类不含精氨酸的多肽组合物，其配方与专利EP1478394B1所公开的配方相似，但用盐取代了后项专利所使用的精氨酸。根据该专利所提供的实例，这种盐的浓度是140mM(参见实施例1)。该专利未对多肽组合物高温下的稳定性做出说明，不过实际上，专利中公开的组合物是以2-8℃的液态或冰冻状态储存的。

本发明通过提供一种新型稳定的溶液配方解决了上述问题。该配方可实现TNFR：Fc多肽的液态存储。并且，发明人意外地观察到，本专利所公开的稳定的水溶液配方完全不需要精氨酸和半胱氨酸就能够制备出来，并且高温下仍然稳定。

发明内容

发明的第一部分

本发明的第一部分内容是基于以下发现：存在于分离的多肽(亦即由人的75kDa肿瘤坏死因子受体的细胞外配体结合部分与人类IgG1的Fc部分融合组成的多肽)溶液中一定量的盐，可以增加蛋白质在5℃以上高温下的稳定性。此外，选择的盐浓度与生理盐水浓度接近。

因此，本发明涉及一种水溶液组合物，包括：

一种分离的多肽，是由人的p75肿瘤坏死因子受体的细胞外配体结合部分与人类IgG1的Fc部分融合而成；

一种盐，其浓度为80-130mM；

一种赋形剂，选自海藻糖和蔗糖或它们的组合；

该水溶液组合物的特征在于，在其组份中既不含精氨酸也不含半胱氨酸。

附图说明

图1为各样品在330-310nm处的荧光比条件下的带有误差线的相对展开温度(T_onset/℃)的柱状图。

图2A和2B为各种配方初始时pH值和渗透压的柱状图。

图3A显示在所有时间(0至14天)及相关条件(-20℃、25℃、50℃、3次冷冻/解冻(-20℃/25℃条件下)和搅动3天)下测量出的蛋白质浓度(280nm处的吸光度)。

图3B显示配方F3在6个月(0、1、3和6个月)时间内及相关条件下(-20℃、2-8℃、25℃、1、2、4次冷冻/解冻(-20℃/25℃条件下))测量出的蛋白质浓度(280nm处的吸光度)。

图4A显示在所有时间(0至14天)及相关条件下(-20℃、25℃、50℃条件下、3次冷冻/解冻(-20℃/25℃条件下)及搅动3天)测量出的浊度值(330nm处的吸光度)。

图4B(1)显示配方F3在6个月(0、1、3和6个月)时间内及相关条件下(-20℃、2-8℃、25℃、1、2、4次冷冻/解冻循环(-20℃/25℃条件下))测量出的浊度值(330nm处的吸光度)。

图4B(2)显示配方F1、F5、F6和F8在3个月(分别是0、1和3个月)时间内、在-20℃、2-8℃、25℃条件下进行1、2和4次冷冻/解冻(-20℃/25℃条件下)操作测量出的浊度值(330nm处的吸光度)，并与创新组(在25℃下放置0和3个月)进行比较。

图5A显示了HIAC仪器的亚可见粒子分析，使用标准杜克计数仪测定配方F1、F2、F3和F4在所有条件下(-20℃、25℃、50℃、3次冷冻/解冻(-20℃/25℃条件下)及搅动3天)。

图5B显示了HIAC仪器的亚可见粒子分析，使用标准杜克计数仪测定配方F3在0、1和3个月，以及-20℃、2-8℃和25℃、1、2次冷冻/解冻(1x、2xFzTh，在-20℃/25℃条件下)。

图5C(1)显示了HIAC的亚可见粒子分析，使用标准杜克计数仪测定配方F1、F3、F5、F6、F8在0、1和3个月(F3加做6个月)，以及-20℃和2-8℃条件下。

图5C(2)显示了HIAC的亚可见粒子分析，对配方F1、F3、F5、F6、F8在25℃条件下，在0、1和3个月(F3加做6个月)，以及在-20℃/25℃条件下冷冻/解冻(1×、2×、4×(1、2、4))。

图6A显示了配方F1(A)、F2(B)、F3(C)、F4(D)在所有条件下(0至14天内，-20℃、25℃、50℃、3次冷冻/解冻(-20℃/25℃条件下)及搅动3天)用考马斯染色法处理后的SDS-PAGE凝胶。

图6B(1)显示了配方F3在-20℃、2-8℃和25℃以及进行2次冷冻/解冻(-20℃/25℃条件下)条件下孵化3个月后用考马斯染色法处理后的SDS-PAGE凝胶。

图6B(2)显示了配方F3在-20℃、2-8℃和25℃以及进行2次冷冻/解冻(-20℃/25℃条件下)条件下孵化6个月后用考马斯染色法处理后的SDS-PAGE凝胶。

图6C显示了配方F5、F6和F7以及创新组(对照组)在0个月和在-20℃/25℃条件下1次冷冻/解冻后用考马斯染色法处理后的SDS-PAGE凝胶。

图6D显示了配方F8、F9和F1以及创新组(对照组)在0个月和在-20℃/25℃条件下1次冷冻/解冻循环后用考马斯染色法处理后的SDS-PAGE凝胶。

图6E(1)显示了配方F1、F5在1个月和在-20℃、2-8℃和25℃条件下以及在-20℃/25℃的条件下进行2次冷冻/解冻循环后用考马斯染色法处理后的SDS-PAGE凝胶。

图6E(2)显示了配方F1、F5在3个月和在-20℃、2-8℃和25℃条件下以及在-20℃/25℃的条件下进行4次冷冻/解冻循环后用考马斯染色法处理后的SDS-PAGE凝胶。

图6F(1)显示了配方F6、F8在1个月和在-20℃、2-8℃和25℃条件下以及在-20℃/25℃的条件下进行2次冷冻/解冻循环后用考马斯染色法处理后的SDS-PAGE凝胶。

图6F(2)显示了配方F6、F8在3个月和在-20℃、2-8℃和25℃条件下以及在-20℃/25℃的条件下进行4次冷冻/解冻循环后用考马斯染色法处理后的SDS-PAGE凝胶。

图7A-7D显示了所有配方在所有条件下(在-20℃(7A)、25℃(7B)、50℃(7C)、3次冷冻/解冻及搅动3天(7D)条件下的所有时间点)分子排阻(凝胶过滤)HPLC色谱图；测量的波峰百分数如表所示。

图7E(1)显示在-20℃、2-8℃和25℃以及进行2次冷冻/解冻(-20℃/25℃条件下2xFzTh)条件下3个月时配方F3的分子排阻(凝胶过滤)HPLC色谱图。

图7E(2)显示在-20℃、2-8℃和25℃以及进行4次冷冻/解冻(-20℃/25℃条件下2xFzTh)条件下6个月时配方F3的分子排阻HPLC色谱图。

图7F显示了在25℃条件下，配方F3在0、1、3、6个月和创新组(对照)在3个月时的分子排阻HPLC(凝胶过滤)色谱图。

图7G(1)显示了在25℃条件下，配方F3在0、3个月时的分子排阻(凝胶过滤)HPLC色谱图以及与创新组(对照)在0个月时的对比。

图7G(2)显示了在25℃条件下，创新组(对照)在0、3个月时的分子排阻(凝胶过滤)HPLC色谱图。

图7H显示了用分子排阻HPLC色谱长时间研究配方F3在条件-20℃、2-8℃和25℃以及进行1次和2次冷冻/解冻(1x及2xFzTh，-20℃/25℃条件下)条件下孵化0、1、3个月时的表格结果图。

图7I显示在0个月时，配方F1、F5、F6、F7、F8、F9和创新组(对照)的分子排阻HPLC色谱图。

图7J显示在-20℃/25℃条件下1次冷冻/解冻后，配方F1、F5、F6、F7、F8、F9和创新组(对照组)的分子排阻HPLC色谱图。

图7K(1)显示了在-20℃条件下，1个月时配方F1、F5、F6、F8的分子排阻(凝胶过滤)HPLC色谱图。

图7K(2)显示在3个月和-20℃下，配方F1、F3、F5、F6、F8的分子排阻(凝胶过滤)HPLC色谱图。

图7L(1)显示在1个月和2-8℃下，配方F1、F5、F6、F8的分子排阻(凝胶过滤)HPLC色谱图。

图7L(2)显示在3个月和2-8℃下，配方F1、F3、F5、F6、F8的分子排阻(凝胶过滤)HPLC色谱图。

图7M(1)显示在1个月和25℃下，配方F1、F5、F6、F8的分子排阻(凝胶过滤)HPLC色谱图。

图7M(2)显示在3个月和25℃下，配方F1、F3、F5、F6、F8和创新组(对照)的分子排阻HPLC色谱图。

图7N(1)显示在1个月和25℃下，配方F1、F5、F8的分子排阻(凝胶过滤)HPLC色谱图。

图7N(2)显示在3个月和25℃下，配方F1、F3、F5、F8和创新组(对照组)的分子排阻(凝胶过滤)HPLC色谱图。

图7O显示在1个月和25℃下，配方F1、F3、F5、F8的分子排阻(凝胶过滤)HPLC色谱图。

图7P显示在-20℃/25℃经历2次冷冻/解冻过程后，配方F1、F5、F6、F8的分子排阻(凝胶过滤)HPLC色谱图。

图7Q、7R、7S显示了配方F1、F3、F5、F6、F8在以下条件的分子排阻HPLC色谱图集：-20℃(图7Q)、2-8℃(7R)和25℃(7S)；时间上对配方F3是6个月，对配方F1、F5、F6和F8是3个月。测量了波峰百分数并加以标示(％峰前值，％主峰值和％峰后值)。

图7T显示了配方F1、F3、F5、F6、F8在0个月，-20℃/25℃的条件下经历1和2次冷冻/解冻循环(1x和2x FzTh)后的分子排阻(凝胶过滤)HPLC色谱图集。测量了波峰的百分数并加以标示(％峰前值，％主峰值和％峰后值)。柱状图按以下配方顺序列出：每个条件(即0个月，1xFzTh或2x FzTh)下的顺序为F1、F3、F5、F6和F8。

图7U显示了配方F3在-20℃、2-8℃和25℃条件下储存0、1、3、6个月后的分子排阻(凝胶过滤)HPLC色谱图集。

图8A-8D显示了所有配方在所有条件下(在-20℃(8A)、25℃(8B)、50℃(8C)、3次冷冻/解冻及搅动3天(8D)条件下的所有时间点)基于细胞的效价测定分析(相对效价％，相比于参考标准的效力)。

图8E显示了配方F3在在6个月(分别是0、1、3和6个月)时间内、在-20℃、2-8℃、25℃条件下进行1x、2x和4x冷冻/解冻(-20℃/25℃条件下)后基于细胞的效价测定分析图(相对效价％，相比于参考标准的效力)，在随图附表中也有显示。

图8F显示了配方F1、F3、F5、F6和F8在25℃下3个月后(F3还经过6个月后)基于细胞的效价测定分析(相对效价％，相比于参考标准的效力)，并与25℃下3个月后的创新组作对比。此处25℃条件下相应结果，包括-20℃、2-8℃下以-20℃/25℃％经历4次冻融循环的相对效价值，在随图附表中也有显示。

具体实施方式

本发明涉及一种水溶液组合物，包括：

一种分离的多肽，是由人的p75肿瘤坏死因子受体的细胞外配体结合部分与人类IgG1的Fc部分融合而成；

一种盐，其浓度为80-130mM；

一种赋形剂，选自海藻糖和蔗糖，或是它们的组合；

该水溶液组合物的特征在于，其组份中既不含精氨酸也不含半胱氨酸。

该水溶液组合物的进一步特征在于，其组份中不含有游离氨基酸。例如，所述组合物既不包含精氨酸，也不含半胱氨酸，也不含脯氨酸，也不含甘氨酸，也不含蛋氨酸，也不含组氨酸，也不含丝氨酸，也不含缬氨酸，也不含赖氨酸，也不含谷氨酸。

本文所提到的术语“组合物”可以指包含适用于以注射和/或其它给药方式用于所需人群的某种或某类多肽配方。“组合物”也可以被称做“制药组合物”。在某些实施方案中，本文提供的组合物基本上是无菌的，不含有对接受者有毒性或感染性的成分。此外，本文所提到的溶液或水溶液组合物可以指含有一种或多种溶解在适宜溶剂里(如，水和/或其他溶剂，例如，有机溶剂)或互溶性的溶剂里的化学物质。此外，本文提到的术语“大约”是指所标示的值的±5％范围内，最好就是标示值本身(±0％)。

注意，按照本发明的内容，尽管组合物组份中不包含精氨酸或半胱氨酸(或任何其他的氨基酸，例如脯氨酸，甘氨酸，甲硫氨酸，组氨酸，丝氨酸，缬氨酸，赖氨酸，谷氨酸)或它们的组合，但是多肽本身在其链中可能含有精氨酸或半胱氨酸(或任何其它氨基酸如脯氨酸，甘氨酸，甲硫氨酸，组氨酸，丝氨酸，缬氨酸，赖氨酸，谷氨酸)的氨基酸残基。

在某些实施方案中，含有多肽的Fc结构域通过标准方法进行纯化。当含有多肽的Fc结构域在细胞内产生时，颗粒碎片可以通过离心或超滤的方式进行移除。当多肽被分泌到培养基中，这种表达系统的上清液可以事先使用标准的多肽浓缩过滤器进行浓缩。也可通过加入蛋白酶抑制剂抑制蛋白水解以及加入抗生素抑制微生物的生长。在一些实施方案中，包含Fc结构域的多肽可以使用以下方式进行纯化，例如，羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析，以及任何已知或尚待发明的纯化技术的组合。例如，若含FC结构域的多肽是基于人体伽玛1、伽玛2或伽玛4重链构建，则可用蛋白A进行纯化(Lindmark等人，1983，《免疫学方法杂志》62：1-13)。

根据具体需要，其它多肽纯化技术如离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀法、反相HPLC法、硅胶色谱法、肝素SEPHAROSET^TM层析色谱法、阴离子或阳离子交换树脂(例如，使用聚天冬氨酸柱)法、层析聚焦SDS-PAGE法和硫酸铵沉淀法均可加以运用。另外，其它未及的多肽纯化技术均可使用。

在一个优选实施方案中，盐的浓度为80至130mM，优选为90至130mM，例如可以是105至130mM，例如也可以是90mM、100mM或125mM。优选地，盐的浓度(优选NaCl)浓度为90mM。无论盐浓度如何，盐的种类优选NaCl，虽然其他的盐类也可以使用，例如氯化钾、柠檬酸钠、硫酸镁、氯化钙、次氯酸钠、硝酸钠、硫化汞、铬酸钠和二氧化镁。这个特定的盐浓度的范围可保障本发明在高温(甚至高达50℃)下仍可获得稳定组合物。此外，相比于现有技术所提到的数值(例如140mM)，本发明所确定的这个浓度值范围更接近人体生理渗透压，因而可以配制更多适用于诸如皮下给药的组合物。

在另一个优选的实施方案中，分离的多肽是依那西普。依那西普的Fc组分包含恒重2(CH 2)结构域，恒重3(CH 3)结构域和铰链区，但是并非人源性IgG1恒重1(CH1)结构域。依那西普可以通过DNA重组技术在中国仓鼠(黑线仓鼠)卵巢(CHO)的哺乳动物细胞表达系统内生产。它由934个氨基酸组成，表观分子量为150千道尔顿(《医师案头参考》(Physicians′Desk Reference)2002年，医学经济公司(MedicalEconomics Company Inc))。

分离的多肽，其浓度优选为10至100mg/mL，在20至60mg/mL之间更好，在大约25mg/mL或约50mg/mL时最好。优选浓度为约50mg/mL。

在一个优选实施方案中，赋形剂是海藻糖，其浓度是10至80mg/mL，优选为30至65mg/mL，最好的浓度是60mg/mL，优选的海藻糖最好为海藻糖二水合物。在另一个优选的实施方案中，赋形剂为蔗糖，其浓度优选为5至80mg/mL，优选的蔗糖浓度为10至40mg/mL。在另一个优选的实施方案中，蔗糖的最优浓度为10mg/mL。在另一个优选的实施方案中，蔗糖的最优浓度为34mg/mL。在另一个优选的实施方案中，赋形剂是蔗糖和海藻糖的组合物，浓度范围分别为5至80mg/mL和10至80mg/mL。赋形剂优选蔗糖，浓度约为34mg/mL，进一步优选的蔗糖浓度为(约)10mg/mL。

按照本发明内容，组合物可以进一步包含一个水溶性缓冲液。所述的水溶性缓冲液优选磷酸钠、磷酸钾、钠或钾的柠檬酸盐、马来酸、乙酸铵、3-羟甲基-氨基甲烷(TRIS)、乙酸盐、琥珀酸盐、二乙醇胺、组氨酸或它们的组合。在一个优选的实施方案中，水溶性缓冲液是磷酸钠。在一个优选的实施方案中，水溶性缓冲液是琥珀酸盐。在另一个优选的实施方案中，选择的水溶性缓冲液是组氨酸。

无论在本发明所述组合物中所使用的缓冲液是单独使用或是联合使用，其浓度优选为15mM到100mM之间，例如从20至30mM。在一个优选的实施方案中，所述的浓度为20mM和100mM之间，优选在25mM至50mM的范围内。在另一个优选的实施方案中，所述的浓度为(约)22mM或25mM。在另一个优选的实施方案中，所述的浓度为(约)50mM。优选的缓冲液是磷酸钠和琥珀酸盐缓冲液(例如琥珀酸钠)，最优的缓冲液是(约)22mM的琥珀酸。

在另一个实施方案中，不管是否存在水溶性缓冲液，本发明所公布的组合物，除了已经包含的赋形剂(海藻糖和/或蔗糖)外，还可以进一步包含一种或多种赋形剂。在某些实施方案中，组合物中所述的一种或多种赋形剂的浓度约为0.001至5％(重量百分比)，而在其它一些实施例中，组合物中所述的一种或多种赋形剂的浓度约为0.1至2％(重量百分比)。赋形剂均为本领域熟知品种，可以由已知方法配制或购自供应商。优选的所述赋形剂包括乳糖、甘油、木糖醇、山梨醇、甘露醇、麦芽糖、肌醇、葡萄糖、牛血清白蛋白、人血清白蛋白(SA)、重组血凝素(HA)、葡聚糖、聚乙烯醇(PVA)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚乙烯亚胺、明胶、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羟乙基纤维素(HEC)、聚乙二醇、乙二醇、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、L-脯氨酸、L-丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、肌氨酸、伽马氨基丁酸、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、十二烷基硫酸钠(SDS)、聚山梨醇酯、聚氧乙烯共聚物、磷酸钾、乙酸钠、硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、三甲胺N-氧化物、甜菜碱、锌离子、铜离子、钙离子、锰离子、镁离子、3-[(3-酰基氯丙基)-二甲基铵]-1-磺酸丙烷(CHAPS)、蔗糖、单月桂酸酯或它们的组合。在更优选的实施方案中，赋形剂是聚山梨酯20。在甚至更优选的实施方案中，聚山梨酯20的浓度为0.1％。在另一个更优选的实施方案中，赋形剂是甘氨酸，在甚至更优选的实施方案中，甘氨酸的浓度为0.5％。

在另一个优选的实施方案中，组合物的pH值在6.0至7.0之间，可以为6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8和6.9任一pH值。在更优选的实施方案中，组合物的pH值为约6.3。

在一个具体方案，本发明的组合物包含50mg/ml的依那西普，25mM的磷酸钠缓冲液，10mg/ml蔗糖，125mM的氯化钠，其中组合物的pH值是6.3。

在另一个具体方案中，本发明的组合物包含50mg/ml的依那西普，25mM的磷酸钠缓冲液，10mg/ml蔗糖，100mM的氯化钠，其中组合物的pH值是6.3。

在另一个实施方案中，本发明的组合物包含50mg/ml的依那西普，50mM磷酸钠缓冲液，60mg/ml的海藻糖二水合物，0.1％聚山梨醇酯20，其中组合物的pH值为约pH 6.2。

在进一步的具体实施方案中，本发明的组合物包含50mg/ml的依那西普，25mM磷酸钠，34mg/ml蔗糖，90mM的氯化钠，其中组合物的pH值是6.3。

在进一步的具体实施方案中，本发明的组合物包含50mg/ml的依那西普，25mM磷酸钠，10mg/ml蔗糖，90mM的氯化钠，0.5％的甘氨酸，其中组合物的pH值是6.3。

在进一步的具体实施方案中，本发明的组合物包含50mg/ml依那西普、50mM琥珀酸盐、10mg/ml的蔗糖、90mM氯化钠；所述组合物的pH值为6.3。优选地，该组合物(除了构成依那西普的氨基酸之外)不含额外氨基酸。优选地，该组合物中既不含精氨酸和半胱氨酸，也不含赖氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、蛋氨酸。

在进一步的具体实施方案中，本发明的组合物包括或可替代性含有50mg/ml依那西普、22mM琥珀酸盐、10mg/ml的蔗糖、90mM氯化钠；所述组合物的pH值为6.3。优选地，该组合物(除了构成依那西普的氨基酸之外)不含额外氨基酸。优选地，该组合物中既不含精氨酸和半胱氨酸，也不含赖氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、蛋氨酸。

本发明所公开的组合物可以肠胃外给药，例如通过皮下、肌内、静脉内、腹膜内、脑脊液内、关节内、滑膜内及/或鞘内等方式给药。

构成本发明所公开组合物中分离的多肽的已知疗效包括可用于但不限于治疗以下疾病：类风湿关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、肉芽肿病、克罗恩病、慢性阻塞性肺病、丙型肝炎、子宫内膜异位症、哮喘、恶病质、牛皮癣或特应性皮炎、或其它炎性或自身免疫相关性疾病、功能障碍或病症。足够剂量(例如，治疗有效量)的所述组合物可用于相应病症的治疗(减轻症状、停止或延缓进展)。

以下实施例用于进一步阐明本发明，而不应被理解为对于本发明范围的限定。

实施例

组合物的制备

以下组成通过简单的混合得到：

原材料：

62.5mg/mL的依那西普、1.2mg/mL的Tris溶液、40mg/mL的甘露糖醇、10mg/mL的蔗糖。溶液pH值为7.4，-20℃下储存。

以市售同一批次商业制剂作为对照样本(在此设定为“Enbrel组”或“创新组”)。市售Enbrel制剂含有50mg/mL的依那西普、25mM磷酸钠、25mM的精氨酸、100mM的氯化钠、10mg/mL的蔗糖、溶液pH值6.3。

在例如Enbrel制剂这样的相同制剂中，依那西普被用作内部对照成分(50.9mg/mL的依那西普、25mM磷酸钠、25mM的精氨酸、100mM的NaCl、10mg/mL蔗糖、溶液pH值6.3)。这种制剂被称为F1。

候选配方：

F2：依那西普的水溶性制剂(49.4mg/mL依那西普、25mM磷酸钠、100mM氯化钠、10mg/mL蔗糖，pH值6.3)。

F3：依那西普的水溶性制剂(49.5mg/mL依那西普、25mM磷酸钠、125mM氯化钠、10mg/mL蔗糖，pH值6.3)。

F4：依那西普的水溶性制剂(50.9mg/mL依那西普、50mM磷酸钠、，60mg/mL海藻糖二水合物、0.1％聚山梨醇酯20，pH值6.2)。

F5：依那西普的水溶性制剂(50.0mg/mL依那西普、25mM磷酸钠、90mM氯化钠、34mg/mL蔗糖，pH值6.3)。

F6：依那西普的水溶性制剂(50.0mg/mL依那西普、25mM磷酸钠、90mM氯化钠、10mg/mL蔗糖、0.5％(5mg/mL)甘氨酸，pH值6.3)。

F7：依那西普的水溶性制剂(50.0mg/mL依那西普、28mM组氨酸/盐酸、90mM氯化钠、10mg/mL蔗糖、6mg/mL甘氨酸，pH值6.3)。

F8：依那西普的水溶性制剂(50.0mg/mL依那西普、22mM琥珀酸盐、90mM氯化钠、10mg/mL蔗糖、pH值6.3)。所述的琥珀酸盐缓冲液由22mM的琥珀酸制备并用氢氧化钠(NaOH)调节pH值至6.3。

实施例1

内在蛋白荧光发射光谱和静态光散射

内在蛋白的荧光发射光谱在266nm处激发获得，静态光散射数据在266nm和473nm获得。每个样品装入微量比色皿阵列(MCA)并放入Optim 1000来说明胶体和构象稳定性的差异。在这项研究中热斜坡实验温度从15到95℃每次升高1℃，样品在每个温度下维持60秒以达到热平衡。在等温的实验中，温度固定在62℃，样品在一个60秒内被重复测量200次。

样品被266和473nm激光源照射的时长称为曝光时间。曝光时间的选择取决于很多因素，如荧光发射的强度和样品褪色的灵敏度。此处所述所有样品的曝光时间均设定为1秒。

随着曝光时间的变化，物理缝隙的大小可以调节以控制进入检测器的光量。增大这一开口的大小会增加测量的荧光信号，但仪器的光谱分辨率随之降低。

Optim 1000仪器进行的分析包括两个层次，主要的和次要的。Optim 1000软件提供了自动化的主次分析。正如任何一个自动化的数据拟合软件，必须采取合理措施以确保输入数据具有良好的质量，使自动功能得以输出可靠的结果。并且，所有的结果已经由一位专业熟练的分析师手动验证过。

原发性荧光发射和光散射数据的主要分析提取光谱参数如下：

·Optim可以借助数学函数提供基础信息如期望的波长(也被称为质心平均数)，该参数在科学文献中已经越来越常用。它着眼于在平均发射波长(或质量中心)，是一种很好的消除光谱数据中各种噪声的方法。

·散射光的强度由260和270nm之间(瑞利散射紫外激发光)的综合强度计算而来。散射效率高度依赖波长：波长越短，溶液中的分子散射光的效能就能越高。266nm处的激光的散射可以敏锐地探测出平均分子量的细微变化。

在本项研究中，350和330nm之间的荧光强度比值已被用于研究抗体的热展开，266nm和473nm激光的散射光强度被用于测量热诱导的样品聚集。

次要分析借助初步分析得出的参数来确定样本的熔融温度“Tm”和聚集起始温度“Tagg”，如果此两项指标存在的话。熔融温度的确定表现为根据主要分析数据绘制而成的温度函数上的拐点值。聚集温度的起点的确定表现为在该温度下的散射光强度随数据中的噪声增大而超越某一阈值。从测量到的最低的温度，每一个测量的散射强度值被添加到所有先前测量值的数据集。分析进程中的每一个点使用线性拟合并确定拟合优度。如果数据明显从一条直线偏离(直线意义由数据中的噪声确定)，那么这就被定义为聚集起始温度。如果没有明显偏离，那么在数据集的下一个点上进行核算，再次检验该偏离。这种方法已经测试过各种各样的蛋白质和条件，并且被证明是有效的。在存在大型聚集体形成和沉淀的极端情况下，如果悬浮液中的颗粒离开入射激光的焦距，光散射信号实际上会降低。然而，不管后来出现何种沉淀，最初的起点仍然可以重现。

在所有的静态光散射数据的情况下，无论样品中有无沉淀析出，所有的点均被包含。相同的样品在不同的重复实验有时会沉淀，有时不会，但在每一种情况下聚合过程的开始都可以重现。

结论

所有样品的Tagg和Tonset数据非常相似。

·在F1缓冲产品中，荧光Tonset为63.7±0.3℃，Tagg为66.8±0.3℃。

·在F2缓冲产品中，荧光Tonset为63.2±0.1℃，Tagg为65.9±0.1℃.

·在F3缓冲产品中，荧光Tonset为63.4±0.3℃，Tagg为65.6±0.4℃.

·在F4缓冲产品中，荧光Tonset为63.3±0.1℃，Tagg为64.8±0.1℃.

·在F5缓冲产品中，荧光Tonset为64.5±0.4℃，Tagg为63.0±0.6℃

·在F6缓冲产品中，荧光Tonset为63.9±0.5℃，Tagg为65.4±0.2℃.

·在F7缓冲产品中，荧光Tonset为61.0±0.7℃，Tagg为63.6±0.1℃.

·在F8缓冲产品中，荧光Tonset为64.0±0.0℃，Tagg为66.2±0.8℃.

·创新药Enbrel本身的荧光Tonset为63.4±0.1℃，Tagg为65.6±0.1℃.

因此，该数据指示所有试样间的胶体及构形稳定性高度类似。

图1显示了配方F1、F5、F6、F7、F8和创新药(对照)的结果，其趋势为F5>F8>F6>F1>Enbrel>F7。

在热升温实验后，实施等温实验。在分析及综述热升温结果后，似乎所有试样皆具有约64℃之Tagg值，且因此选择62℃之温度用于等温实验，即其仅低于Tagg，且其接近到足够使试样在合理时段内经历构形及胶体改变。

发现荧光的T起始值系介于63.2℃与63.7℃之间，且平均值63.4℃及相对低的0.3℃的标准偏差，从而指示5个试样(F1至F4及Enbrel液体配方)间具有高度可比性。

所有试样的稳定性仍然皆可视为极其相当。

实施例二

短压力稳定性研究

在实施长期研究之前进行一项为期约两个星期的短期稳定性研究实验，来评估配方。此外，F3配方将进行6个月的长期稳定性研究，F5、F6、F8配方进行3个月的长期稳定性研究。

九个配方进行测试：

除了搅拌和冻融应力外，每种配方均被暴露在两种人为高温(25℃和50℃)和一种实时温度下，以评价其在实验开始后0、3、7、14天时的稳定性。

配方F3的稳定性除了在-20℃冻/25℃融的条件下进行1、2、4次冻融循环以评估其冻融应力外，还在试验开始后0、1、3、6个月的时候通过暴露于三个温度(2-8℃、-20C和25℃)下进行评价。

配方F5、F6、F8的稳定性除了在-20℃冻/25℃融的条件下进行1、2、4次冻融循环以评估其冻融应力外，还在实验开始后0、1、3个月的时候通过暴露于三个温度(2-8℃、-20C和25℃)下进行评价。

每组用以下8项分析测定指标来评估每个配方的稳定性

·pH(仅在0天时)

·渗透压(仅在0天时)

·蛋白浓度(A280nm)

·浊度(A330nm)

·HIAC

·SDS-PAGE(考马斯亮蓝染色)

·分子排阻色谱(SE-HPLC)

·基于细胞的效力

pH值和渗透压

图2A and 2B显示了初始时候溶液的pH值和渗透压的柱状图。在每种条件下设置样品之前，所有配方的测定值都在目标pH或者理论渗透压的范围内。

蛋白质含量/A280

图3A显示在所有时间(0至14天)及条件(-20℃、25℃、50℃、3次冷冻/解冻(3×FzTh)及3天搅动)下的蛋白质浓度量测值(280nm下的吸光度)。针对所有试样在所有时间点及条件下获得的数据皆在目标值的范围内且在分析的差异性内。

图3B显示配方F3在0个月、1个月、3个月及6个月及条件(-20℃、2-8℃、25℃、1次、2次及4次冷冻/解冻(1×、2×及4×FzTh))下的蛋白质浓度量测值(280nm下的吸光度)。对于所有条件在至多3个月，观察到蛋白质浓度自目标(50mg/mL)略微增加，但其仍在分析差异性内。用于构筑该图3B的数据提供于下表中：

下面的表总结了配方F1、F5、F6、F8和作为对照的创新药(创新药只测试了25℃T＝0个月，T＝3个月)在0个月和3个月时，在-20℃、2-8℃和25℃条件下，在–20℃/25℃冻融4次的数据。所有配方的蛋白浓度达到或接近目标(50mg/mL)

除F1以外，配方F5、F6及F8在时间＝3个月在所有条件下的蛋白质浓度量测值(280nm下的吸光度)皆在所有该等配方的目标值处(未显示图)。

浊度/A330

图4A显示在所有时间(0至14天)及条件(-20℃、25℃、50℃、3次冷冻/解冻(3×FzTh)及3天搅动)下的浊度量测值(330nm下之吸光度)。根据该等结果，在50℃条件下检测到浊度显著增加，且F3随时间呈现最低增加。在-20℃、25℃、冷冻-解冻或搅动下在任一配方中观察到并未发生显著改变。

图4B(1)显示配方F3在时间t＝0个月、1个月及3个月及条件(-20℃、2-8℃、25℃、1次冷冻/解冻(1×及2×FzTh(-20/25℃))下的浊度量测值(330nm下的吸光度)。如在图4B(1)中可看出，观察到在25℃下经受3个月储存的试样的浊度略微增加。在试样于-20℃、2-8℃下储存3个月及经受2个冷冻-解冻循环后，观察到并未发生改变。用于构筑该图4B(1)的数据提供于下表中：

下表总结了配方F1、F5、F6、F7、F8、F9在0个月和3个月，以及在–20℃/25℃条件下冻融1、2和4次后的数据，创新药(作为对照)仅在0个月，温度在25℃时的浊度数据。配方F1、F5和F8在浊度方面没有大的变化。储存在25℃时F6显示了最高的浊度变化。

如上所述，和0个月相比(图4B(2))，在1或3个月后，配方F5、F8或F1在所有条件下，浊度没有观察到明显的进一步增加。

HIAC(液体粒子计数器)

方法：

用HIAC 9703液体颗粒计数系统做这个实验。该计数器由取样器、颗粒计数器和ROYCO传感器组成。该ROYCO传感器能够将2μm到100μm之间的颗粒测出尺寸并计数。这个设备可计数的颗粒≤10000个/毫升。

·样品体积(mL)：0，2

·流速mL/min：10

运行次数(每个样品)：4(第一次运行结果丢弃)

过程：

·最初的样品不经过稀释而直接分析，但由于样品的高粘度，他们需要被稀释后进行测定以获得更准确的结果。

·样品放于室温1小时。

·样品用适量的配方缓冲液按1:3比例稀释，脱气(1.5小时)并在测量前仔细混合。

·标准杜克科学计数仪：系统适用性检查是用EZY-Cal 5μm和15μm尺寸的颗粒作为对照组标准。在开始时，先对对照组标准进行分析以验证该传感器的分辨率。

图5A显示了HIAC仪器的亚可见粒子分析，使用标准杜克计数仪测定配方F1、F2、F3和F4在所有条件下(-20℃、25℃、50℃、3次冷冻/解冻循环(-20℃/25℃条件下)及搅动3天)的。

如在图5A中可看出，针对F1、F2及F4在50℃条件下测得亚可视粒子计数显著增加，且F2早自7天显示最高增加。

针对任一配方在-20℃、25℃、3×FzTh或在3d RT搅动后观察到并未发生显著改变。F3配方在所有条件及时间点下储存后如与t＝0对照相比未呈现亚可视粒子有所改变。

图5B显示了HIAC仪器的亚可见粒子分析，使用标准杜克计数仪测定配方F3在0、1和3个月，以及在-20℃、2-8℃和25℃、1、2次冷冻/解冻循环(1x、2xFzTh，在-20℃/25℃条件下)。

如在图5B中可看出，观察到对于25℃条件在3个月的亚可视粒子计数略微进一步增加。-20℃条件截止3个月时呈现最显著的亚可视粒子增加。对于2-8℃时间点在3个月后或在2个冷冻-解冻循环后观察到自t＝0并未发生改变。在-20℃条件下观察到亚可视粒子计数自1个月略微进一步增加。

用于构筑该图5B的数据提供于下表中：

图5C(1及2)结果显示了HIAC仪器的亚可见粒子分析，采用标准杜克科学计数仪分析配方F1、F3、F5、F6和F8在–20℃、2-8℃时放置0、1个月和3个月(图5C(1))，以及在25℃时进行1、2、3和4次冻融(在–20℃/25℃时，1倍、2倍、3倍和4倍的FzTh)时(图5C(2))的亚可见粒子。

图5C(1)数据如下表中

图5C(2)显示是HIAC仪器的亚可见粒子分析，针对配方F1、F5、F6及F8在t＝0、t＝1个月及t＝3个月及1次、2次及4次冷冻/解冻(1×、2×及4×FzTh)(在-20℃/25℃下)下使用标准杜克计数仪量测。

用于构筑图5C(2)之数据提供于下表中。

可以在图5C看出，配方F1、F3、F5F6和F8从t＝0到2-8℃放置3个月后，亚可见粒子计数无明显变化。另外，在25℃下的性能类似的F1及F6的亚可视粒子随至多3个月的时间有所增加。配方F8在25℃放置一段时间，亚可见粒子计数无明显变化，表明该配方的稳定性。对照组样本(创新药)亚可见颗粒的数目在25℃时3个月后无显著变化。与配方F1、F3、F5、F6和F8相比，创新产品表现出了最高的粒子数，见下表)。

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

图6A显示在所有条件(-20℃、25℃、50℃、3次冷冻/解冻及3天搅动)下在时间0天及14天培育的利用考马斯染色的SDS-PAGE凝胶。(A)中为F1试样，(B)中为F2试样，(C)中为F3试样且(D)中为F4试样。

在所有配方中针对50℃条件在所有时间点皆观察到显著改变，其中第14天试样显示可能共价改质的高分子量(HMW)物质，如由所存在的其他HMW条带(>约250kDa)及低分子量(LMW)分解物质(<50kDa)所证实，该等对于所有配方在50℃下早自3天即存在。

在任一配方中针对所有其他条件及时间点且如与参考标准相比观察到并未发生改变。

图6B(1)显示针对配方F3在t＝3个月在所有条件(-20℃、2-8℃、25℃、2次冷冻/解冻(在-20℃/25℃下))下培育利用考马斯染色的SDS-PAGE凝胶。

在25℃下在3个月后观察到改变，且出现约100kDa及约140kDa处的额外条带，且在约50kDa及约30kDa处的LMW(低分子量)分解条带的强度有所增加。

在2个冷冻-解冻循环(-20℃/25℃)后观察到改变，且约30kDa及约50kDa的条带变黑。

图6B(2)显示针对配方F3在t＝6个月在所有条件(-20℃、2-8℃、25℃、4次冷冻/解冻(在-20℃/25℃下))下培育利用考马斯染色的SDS-PAGE凝胶。

针对F3在25℃下在6个月后观察到改变，且出现约100kDa处的额外条带，且在约50kDa及约30kDa处的LMW分解条带的强度有所增加。

图6C显示针对配方F5、F6及F7及创新药(对照)在t＝0及在1次冷冻/解冻(在-20℃/25℃下)后，利用考马斯染色的SDS-PAGE凝胶。

配方F5、F6、F7及创新药(对照)在t＝0与参考标准相当。

配方F5、F6、F7在1个冷冻-解冻循环(在-20℃/25℃下)后与参考标准相当。

图6D显示针对配方F8、F9及F1及创新药(对照)在t＝0及在1次冷冻/解冻(在-20℃/25℃下)的条件下利用考马斯染色的SDS-PAGE凝胶。

配方F8、F9、F1在t＝0及在1个冷冻-解冻循环(在-20℃/25℃下)后与参考标准相当。

图6E(1)显示针对配方F1及F5在t＝1个月在-20℃、2-8℃及25℃下及在2个冷冻/解冻循环(在-20℃/25℃下)后的条件下利用考马斯染色的SDS-PAGE凝胶。

配方F1及F5在所有条件下在1个月时间点与参考标准相当。

在25℃下在1个月后显示配方F5的其他约100kDa条带的少量证据。

图6E(2)显示针对配方F1及F5在t＝3个月在-20℃、2-8℃及25℃下及在4个冷冻/解冻循环(在-20℃/25℃下)后的条件下利用考马斯染色的SDS-PAGE凝胶。

F5在25℃下在3个月后且如与F1在25℃下在3个月后相比，略微证实约100kDa、约50kDa及约30kD处的极微弱条带的出现，此亦显示该等其他条带。

图6F(1)显示配方F6和F8在–20℃、2-8℃和25℃时放置1个月以及在–20℃/25℃2次冻融循环条件下的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶电泳图。

配方F6、F8在–20℃和2-8℃放置一个月后以及在–20℃/25℃两次冻融循环条件下与参考标准具有可比性。

在25℃1个月后配方F6显示整个主带以及几个额外的低分子量的击穿带几乎完全丧失。

图6F(2)示配方F6和F8在–20℃、2-8℃和25℃时放置3个月以及在–20℃/25℃2次冻融循环条件下的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶电泳图。

配方F6在25℃放置3个月后发生了显著的变化。150KD带消失了，出现一些低分子量的击穿带。在F6和F8中仅在～50kDa和～30kD显示出微弱的电泳带。

SE HPLC(尺寸排阻高效液相色谱法，又称凝胶高效液相色谱法)

条件：

·色谱柱：superSW3000色谱柱4.6x300mm，4μm(Tosoh，18675)CV＝2.5毫升

·柱温：25℃

·流动相：0.2M磷酸缓冲液，pH值6.8

·流速：0.35mL/min

·运行时间：20分钟

·样品量：37.6μg

·自动采样器温度：4℃

图7显示在所有配方中针对所有条件(-20℃(7A)、25℃(7B)、50℃(7C)、3次冷冻/解冻及3天搅动(7D))在所有时间点的尺寸排阻HPLC的层析图。已量测峰％且示于表中。

在所有配方中针对50℃条件在所有时间点皆观察到显著改变，其中F2的总体性能最差，且前峰聚集早在3天即急剧增加(分别为26.3％及22.7％)。F1及F3显示在50℃下在3天后的前峰聚集增加相对更缓和(分别为11.9％及9.3％)，但所有四种配方在14天后的前峰聚集皆增加至>50％。

25℃条件亦使得所有配方在7天后的主峰面积％及前峰％略微改变，在14天进一步增加，其中在此条件下F4显示最高的前峰聚集增加(0.5％)且F3显示最低的总体聚集增加。

在任一配方中在暴露于搅动及冷冻-解冻的条件或在-20℃下储存至多14天时观察到并未发生显著改变。

图7E(1)显示配方F3针对t＝3个月在-20℃、2-8℃、25℃及2次冷冻/解冻(2×FxTh)(在-20℃/25℃下)条件下的尺寸排阻HPLC的层析图。

对于此配方于25℃暴露3个月且如与所有其他条件相比，观察到显著前峰聚集及后峰降解。

图7E(2)显示配方F3针对t＝6个月在-20℃、2-8℃、25℃及4次冷冻/解冻(4×FxTh)(在-20℃/25℃下)条件下的尺寸排阻HPLC的层析图。

对于此配方于25℃暴露6个月且如与所有其他条件在6个月后及在4个冷冻-解冻循环后相比，观察到显著前峰聚集及后峰降解。

图7F显示配方F3针对t＝0个月、1个月、3个月及6个月在25℃下及配方创新药在25℃下在t＝3个月后的尺寸排阻HPLC之层析图。

如与1个月及3个月的时间点相比，配方F3显示前峰聚集及后峰聚集进一步增加。

创新药在25℃下保持3个月显示最高的总体前峰％且其系如与F3在所有其他测试条件(包括25℃在6个月)下相比。

图7G(1)显示配方F3针对t＝0个月及3个月在25℃下及与创新药(对照)在t＝0下相比的尺寸排阻HPLC的层析图。

创新药(对照)在t＝0较F3在25℃下在3个月后呈现的总体前峰聚集显著更高，但后峰降解产物更少。

图7G(2)显示配方创新药在t＝0及3个月在25℃下的尺寸排阻HPLC的层析图。

如与创新药在t＝0相比，观察到创新药在3个月后在25℃下之前峰聚集及后峰降解产物二者有所增加。

图7H提供在配方F3中针对t＝0在-20℃、2-8℃、25℃及1次及2次冷冻/解冻(1×及2×FxTh)(在-20℃/25℃下)的条件下利用尺寸排阻HPLC较长期研究的表格式结果。

配方F3显示前峰聚集显著进一步增加(0.9％，自t＝1个月在25℃下)且后峰降解产物略微进一步增加(自1个月LMW-1峰进一步增加0.1％)。

图7I显示配方F1、F5、F6、F7、F8、F9和创新药(对照组)在0个月时尺寸排阻高效液相色谱法的色谱图。

在0个月时，所有这些配方都显示出具有可比的色谱图。

配方F9在t＝0较F1、F6、F6、F7及F8呈现略微更高的前峰。

在0个月时，相比于配方F1、F5、F6、F7、F8和F9，创新药(对照组)显示出较高的峰前和峰后百分数。

图7J显示配方F1、F5、F6、F7、F8和F9在–20℃/25℃1次冻融循环后的尺寸排阻HPLC色谱图。

1次冻融循环后，配方F1、F5、F6、F7和F8是具有可比性的。其中F9显示略微更高的前峰％(然而自t＝0未进一步增加)。

下表提供了配方F1、F5、F6、F7、F8、F9和新药(对照组)在0个月以及在–20℃/25℃条件下1次循环冻融后(1x FzTh)的用尺寸排阻色谱法进行的长期研究的结果。

在0个月时，与配方F1、F5、F6、F7、F8和F9相比，对照组(创新药)显示出最高的峰前百分比总量。

图7K(1)显示配方F1、F5、F6、F8在–20℃条件下1个月时的尺寸排阻HPLC色谱图。

在-20℃条件下存储1个月，配方之间没有显著性差异。仅配方F5前峰值略低。

图7K(2)显示F1、F3、F5、F6、F8在–20℃条件下存储3个月时的尺寸排阻HPLC色谱图。

配方F1、F5、F6和F8在-20℃条件下贮存3个月后没有显著差异。配方F3在-20℃条件下3个月后相比其他配方具有更高的峰前和峰后值。

图7L(1)显示配方F1、F5、F6、F8在2-8℃条件下存储1个月时尺寸排阻HPLC色谱图。

配方在2-8℃条件下贮存1个月后没有显著性差异。配方F5峰后值稍稍降低。

图7L(2)显示配方F1、F3、F5、F6、F8在2-8℃条件下贮存3个月时尺寸排阻HPLC色谱图。

配方在2-8℃条件下贮存3个月后没有显著差异。配方F3在2-8℃条件下3个月后相比其他配方具有更高的峰前和峰后值。

图7M(1)显示配方F1、F1、F5、F6、F8在25℃条件下贮存1个月时尺寸排阻HPLC色谱图。

配方F6在25℃条件下贮存1个月后发生戏剧性的变化，主峰完全缺失，导致峰值后下降。其他配方(F1、F5、F8)在25℃条件下贮存1个月后中无显著变化。

图7M(2)s显示配方F1、F3、F5、F6、F8和创新药在25℃条件下贮存3个月时尺寸排阻HPLC色谱图。

配方F1、F3、F5、F6、F8在25℃条件下存储3个月后，配方之间没有显著性差异，配方F5峰后值略减少。25℃条件下存储3个月后创新药峰前和峰后值最高。配方F6发生了戏剧性的变化，其主峰完全消失。

图7N(1)显示配方F1、F5、F8在25℃条件下存储1个月时尺寸排阻HPLC色谱图。

图7N(2)显示配方F1、F3、F5、F8和创新药在25℃条件下存储3个月时尺寸排阻HPLC色谱图。

配方F1、F3F5和F8配方在25C条件下贮存3个月后没有显著性差异。创新药相比其他配方具有明显的峰前聚集和峰后值降解。

图7O显示配方F1、F3、F5、F8在25℃条件下贮存1个月时尺寸排阻HPLC色谱图。

配方F3在25℃条件下贮存1个月后显示出最高的峰前聚集百分比。

图7P显示配方F1、F5、F6、F8在–20℃/25℃进行2次冻融循环条件下的尺寸排阻HPLC色谱图。

配方在-20℃/25℃2次冻融循环后没有显著差异。只有配方F5峰后值稍稍降低。

下表提供了配方F1在–20℃、2-8℃、25℃条件下，储存0、1和3个月时，以及在–20℃/25℃条件下进行1、2、4次冻融循环后(1x、2x和4x FzTh)采用尺寸排阻高效液相色谱进行的长期研究结果。

下表提供了配方F5在–20℃、2-8℃、25℃条件下，储存0、1和3个月以及在–20℃/25℃条件下进行1、2、4次冻融循环后(1x、2x and 4x FzTh)采用尺寸排阻高效液相色谱进行长期研究的结果。

下表提供了配方F6在–20℃、2-8℃、25℃条件下储存0、1和3个月以及在–20℃/25℃条件下进行1、2、4次冻融循环后(1x、2x and 4x FzTh)采用尺寸排阻高效液相色谱进行长期研究的结果。

下表提供了配方F8在–20℃、2-8℃、25℃条件下储存0、1和3个月以及在–20℃/25℃条件下进行1、2、4次冻融循环后(1x、2x and 4x FzTh)采用尺寸排阻高效液相色谱进行长期研究的结果。

图7Q、7R和7S显示配方F1、F3、F5、F6和F8在以下条件下尺寸排阻色谱图的色谱图形汇总：-20℃(图7Q)、2-8℃(7R)和25℃(7S)，配方F3放样到6个月，配方F1、F5、F6和F8放样到3个月。峰值百分比被测定(％峰前值，％主峰值和％峰后值)。

图7T显示配方F1、F3、F5、F6和F8在0个月时以及在–20℃/25℃条件下1次和2次冻融循环(1x和2x FzTh)后尺寸排阻色谱图的图形汇总。峰值百分比被测定(％峰前值，％主峰值和％峰后值)。条形图是按下面配方的顺序排列：每个条件下都是配方F1、F3、F5、F6和F8(即0个月时，1xFzTh或2x FzTh)。

下表提供了25℃条件下储存0个月，创新药采用尺寸排阻高效液相色谱图进行的长期研究的结果。

下表提供在配方F3中针对t＝0个月、1个月、3个月及6个月在-20℃、2-8℃及25℃储存条件下及在1次、2次及4次冷冻/解冻(1×、2×及4×FxTh)(在-20℃/25℃下)后的条件下，利用尺寸排阻HPLC的较长期研究结果。

结果显示于图7U中。F3显示在6个月前峰聚集显著进一步增加(在25℃下自t＝3个月增加1.1％)且后峰降解产物略微进一步增加(自3个月后峰进一步增加2.1％)。

基于细胞的效价测定

方法：

-短时间点(0、3、7和14天)

·两批样品进行测试(在第0和3天后和在第7和14天后)。

·除了对照样品外，所有的样品都由同一个分析师进行一次生物测定。对照样品连续6天，每一天都要测试一次。

·在280nm处测量吸光度来确定最初的稀释制剂和随后的样品的精确浓度。

·整体的检测性能是可以接受的。由53个板测得的106个剂量-反应曲线中，3条曲线需要对一个孔进行2种不同浓度的封板处理，以满足孔间变异性分析标准。

·孔与孔之间的差异CV％≤20％

·检测窗口(D/A)≥6

·R2≥0.98

测定了47个测试样品的相对效价，对照组测定了6个不同的时间。对照组的平均相对效价为100.2％，95％可信区间为96.9％～103.6％。

·对照组六次独立测定的方法变异性(％GCV)为3.2％。这种方法的低检测变异性表明，单一测定获得的测试样品的相对效价是可以接受的。

·基于单一测定结果，大部分的测试样品的相对效价接近100％(与参考标准具有可比性)。

·在50℃下贮存3天，试验样品开始失去效价，在稍后的时间点效价逐步降低。

-长期时间(3个月和6个月)

·对一个批次样品进行了测试，包括配方F3放置6个月的时间以及其他所有样品和条件下放置3个月的时间。

·所有的样品都由同一个分析师进行一次生物测定，所使用的参考标准为E16ADS LotDC-4168-85.

·在280nm处测定吸光度以确定最初的稀释制剂和随后的样品的精确浓度。

·整体的检测性能是可以接受的。所有的剂量-反应曲线(即6个板中的12个剂量-反应曲线)符合孔间变异性分析标准，无需对任何孔做封孔处理。TME 0498-01规定的检测验收标准如下：

·孔间变异性百分比CV％≤20％

·检测窗口(D/A)≥6

·R2≥0.98

·剂量-反应曲线的检测窗口范围从4到4.5。剂量-反应曲线的所有关键参数(A、B、C和D)都处在正常范围内。此前也已证明，较小的检测窗口(＞3)不会影响测定方法的准确性，因此，该试验的结果能被接受。

在本例中，SoftMax Pro V5.2被用来进行数据分析，以验证检测验收标准。如果必要的话，可以对部分孔做封孔处理。

基于细胞的生物测定结果：

图8显示包括在所有配方中针对所有条件(-20℃(8A)、25℃(8B)、50℃(8C)、3次冷冻/解冻及3天搅动(8D))在所有时间点基于细胞的效能分析(相对效能％，如与参考标准的效能相比)的分析图形。

在所有配方中在50℃条件下检测效能差异(如与参考标准的效能相比)，且所有测试试样早在3天皆失去效能且是由在50℃下储存14天显著增加。

F3显示在14天后在50℃下的效能最高，且剩余42.2％相对效能。

除冷冻-解冻及RT搅动条件以外，在-20℃、25℃及50℃下所有配方的相对效能皆接近100％。

图8E显示包括在配方F3中针对下列条件：-20℃、2-8℃、25℃在时间点t＝0、t＝1个月、t＝3个月及t＝6个月及在1×、2×及4×冷冻/解冻(在-20℃/25℃下)后的基于细胞效能分析(相对效能％，如与参考标准的效能相比)的分析图形。亦在图旁提供数据表。

配方F3在至多6个月及在4个冷冻-解冻循环(在-20℃/25℃下)后的所有条件下皆显示相对效能％，该等相对效能％与参考标准相当且在分析差异性内(≤20％)。针对F3在25℃下在3个月后测得最低相对效能值％(89.5％)。

图8F显示包括与创新药在3个月后在25℃下相比配方F1、F3、F5、F6及F8在3个月后(且对于F3，在6个月后)在-20℃、2-8℃、25℃下及在-20℃/25℃下4×冷冻/解冻后的基于细胞效能分析(相对效能％，如与参考标准的效能相比)的分析图形。亦在图旁提供数据表。

与创新药在所有条件下相比，观察到F1、F3、F5及F8间的相对效能％无显著差异。所有试样的相对效能皆与参考标准相当。F6在3个月后在25℃下无剩余效能。

所有试样的相对效能皆与参考标准相当。

全面总结

配方F5(25mM磷酸钠、90mM氯化钠、34毫克/毫升蔗糖，pH值6.3)和F8(50毫摩尔琥珀酸/氢氧化钠、90毫摩尔氯化钠、10mg/mL蔗糖，pH值6.3)从分析来看具有最高稳定性和相对效力，被确定为主导配方。并且如上表所示，配方F8相当或优于F1(创新药的液体配方)，也优于配方F3和F6。

项目

1.一种水溶液组合物，其包含：

一种分离的多肽，是由人的p75肿瘤坏死因子受体的胞外配体结合部分与人类IgG1的Fc部分融合而成；

一种浓度范围在为90mM至130mM的盐；

一种赋形剂，选自海藻糖和蔗糖或它们的组合；

其特征在于其组份中既不含精氨酸也不含半胱氨酸。

2.如项目1的组合物，所述的盐的浓度为105mM至130mM。

3.如项目1或2中任一项的组合物，所述的盐的浓度为125mM。

4.如项目1至3中任一项的组合物，所述的盐为氯化钠。

5.如项目1至4中任一项的组合物，所述的分离的多肽为依那西普。

6.如项目1至5中任一项的组合物，所述的赋形剂为浓度为20mg/mL至80mg/mL的海藻糖。

7.如项目1至6中任一项的组合物，所述的赋形剂为浓度5mg/mL至80mg/mL的蔗糖。

8.如项目1至7中任一项的组合物，所述的组分中还包括水溶性缓冲液。

9.如项目8之组合物，所述的水溶性缓冲液为磷酸钠、磷酸钾、钠或钾的柠檬酸盐、琥珀酸、马来酸、乙酸铵、3-羟甲基-氨基甲烷(TRIS)、乙酸盐、二乙醇胺、组氨酸或其组合。

10.如项目8或9中任一项的组合物，所述的水溶性缓冲液的浓度为20mM至100mM。

11.如项目1至10中任一项的组合物，其组分中还含有一种或多种赋形剂。

12.如项目11的组合物，所述的赋形剂可为乳糖、丙三醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、麦芽糖、肌醇、葡萄糖、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血凝素、重组右旋糖酐、聚乙烯醇、羟丙甲纤维素、聚乙烯亚胺、明胶、聚乙烯吡咯烷酮羟乙基纤维素、聚乙二醇、乙二醇、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、脯氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、肌氨酸、γ-氨基丁酸、聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-80、十二烷基硫酸钠、聚山梨醇酯、聚氧乙烯共聚物、钾磷酸盐、醋酸钠、硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氧化三甲胺、甜菜碱、锌离子、铜离子、钙离子、锰离子、镁离子、3-[(3-丙基乙醇胺)-二甲胺]1-丙烷硫酸盐、蔗糖单月桂酸酯或它们的混合物。

13.如项目1至12中任一项的组合物，所述的组合物溶液的pH值在6.0至7.0之间。

14.如项目1至13中任一项的组合物，其包含50mg/mL依那西普、25mM磷酸钠缓冲液、10mg/mL蔗糖、125mM氯化钠，该组合物的pH值为6.3。

15.如项目1至13中任一项的组合物，其包含50mg/mL依那西普、50mM磷酸钠缓冲液、60mg/mL海藻糖二水合物、0.1％聚山梨醇酯20，该组合物的pH值为6.2。

16.如项目1至13中任一项的组合物，其包含50mg/mL依那西普、25mM磷酸钠缓冲液、90mM氯化钠、24mg/mL蔗糖，该组合物的pH值为6.3。

17.如项目1至13中任一项的组合物，其包含50mg/mL依那西普、25mM磷酸钠缓冲液、90mM氯化钠、10mg/mL蔗糖、5mg/mL甘胺酸，该组合物的pH值为6.3。

18.如项目1至13中任一项的组合物，其包含50mg/mL依那西普、22mM琥珀酸盐、90mM NaCl、10mg/mL蔗糖，该组合物的pH值为6.3。

发明的第二部分

本发明第二部分系关于适于储存含有TNFR:Fc的多肽且不含一些所选胺基酸及一些所选盐的稳定水溶液组合物。

本发明第二部分系基于以下发现：根据下文所揭示技术特征的水溶液组合物可使得蛋白质在高温(高于5℃)下稳定性增加。

因此，本发明的第二部分关于一种水溶液组合物，包括：

一种分离的多肽，是由人的p75肿瘤坏死因子受体的胞外配体结合部分与人类IgG1的Fc部分融合而成；

单糖或二糖；

水溶性缓冲液；

其特征在于该组合物既不含有精胺酸亦不含有半胱胺酸、也不含选自氯化钠、氯化钾、柠檬酸钠、硫酸镁、氯化钙、次氯酸钠硝酸钠、硫化汞、铬酸钠及二氧化镁的盐类。

附图简要说明

图9显示在初始时间量测pH及渗透压的柱状图。

图10显示在所有时间(0至14天)及条件(-20℃、25℃、50℃、3次冷冻/解冻(3×FzTh)及3天搅动)下的蛋白质浓度量测值(280nm下的吸光度)。

图11显示在所有时间(0至14天)及条件(-20℃、25℃、50℃、3次冷冻/解冻(3×FzTh)及3天搅动)下的浊度量测值(330nm下的吸光度)。

图12显示通过HIAC，在所有条件(-20℃、25℃、50℃、3次冷冻/解冻(3×FzTh)及3天搅动)下使用标准杜克计数仪测量的亚可见粒子分析。

图13显示在所有条件(-20℃、25℃、50℃、3次冷冻/解冻及3天搅动)下在时间0天及14天培育利用考马斯染色法处理后的SDS-PAGE凝胶。(A)中为F1试样且(D)中为F4试样。

图14显示在所有配方中针对以下条件(-20℃(14A)、25℃(14B)、3次冷冻/解冻及3天搅动(14C))在所有时间点的尺寸排阻HPLC色谱图；测量的波峰百分数如表所示。

图15显示了所有配方在所有条件下(-20℃(15A)、25℃(15B)、3次冷冻/解冻及3天搅动(15C))在所有时间点的基于细胞的效价测定分析(相对效价％，相比于参考标准的效力)。

具体实施方式

本发明的第二部分关于一种水溶液组合物，包括：

一种分离的多肽，是由人的p75肿瘤坏死因子受体的胞外配体结合部分与人类IgG1的Fc部分融合而成；

单糖或二糖；

水溶性缓冲液，

其特征在于该组合物既不含有精胺酸亦不含有半胱胺酸、也不含选自氯化钠、氯化钾、柠檬酸钠、硫酸镁、氯化钙、次氯酸钠硝酸钠、硫化汞、铬酸钠及二氧化镁的盐类。

本发明的第二部分所提到的术语“组合物”可以指包含适用于以注射和/或其它给药方式用于所需人群的某种或某类多肽配方。“组合物”也可以被称做“制药组合物”。在某些实施方案中，本文提供的组合物基本上是无菌的，不含有对接受者有毒性或感染性的成分。此外，本发明的第二部分所提到的溶液或水溶液组合物可以指含有一种或多种溶解在适宜溶剂里(如，水和/或其他溶剂，例如，有机溶剂)或互溶性的溶剂里的化学物质。此外，本文提到的术语“大约”是指所标示的值的±5％范围内，最好就是标示值本身(±0％)。

注意，按照本发明的内容，尽管组合物组份中不包含单一的精氨酸或半胱氨酸或它们的组合，但是多肽本身在其链中可能含有精氨酸或半胱氨酸的氨基酸残基。

在某些实施方案中，含有多肽的Fc结构域通过标准方法进行纯化。当含有多肽的Fc结构域在细胞内产生时，颗粒碎片可以通过离心或超滤的方式进行移除。当多肽被分泌到培养基中，这种表达系统的上清液可以事先使用标准的多肽浓集过滤器进行浓缩。也可通过加入蛋白酶抑制剂抑制蛋白水解以及加入抗生素抑制微生物的生长。在一些实施方案中，包含Fc结构域的多态可以使用以下方式进行纯化，例如，羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析，以及任何已知或尚待发明的纯化技术的组合。例如，若含FC结构域的多肽是基于人体伽玛1、伽玛2或伽玛4重链构建，则可用蛋白A进行纯化(Lindmark等人，1983，《免疫学方法杂志》62：1-13)。

根据具体需要，其它多肽纯化技术如离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀法、反相HPLC法、硅胶色谱法、肝素SEPHAROSET^TM层析色谱法、阴离子或阳离子交换树脂(例如，使用聚天冬氨酸柱)法、层析聚焦SDS-PAGE法和硫酸铵沉淀法均可加以运用。另外，其它未及的多肽纯化技术均可使用。

在本发明第二部分的一个优选实施方案中，分离的多肽是依那西普。依那西普的Fc组分包含恒重2(CH 2)结构域，恒重3(CH 3)结构域和铰链区，但是并非人源性IgG1恒重1(CH1)结构域。依那西普可以通过DNA重组技术在中国仓鼠(黑线仓鼠)卵巢(CHO)的哺乳动物细胞表达系统内生产。它由934个氨基酸组成，表观分子量为150千道尔顿(《医师案头参考》2002年，医学经济公司)。

分离的多肽，其浓度优选为10至100mg/mL，在20至60mg/mL之间更好，在大约25mg/mL或约50mg/mL时最好。

在本发明第二部分的一个优选实施方案中，单糖或二糖是选自海藻糖及蔗糖。优选的，海藻糖浓度为20mg/mL至80mg/mL、更优选为40mg/mL至60mg/mL甚至更优选为60mg/mL，且优选以海藻糖二水合物的形式存在。优选的，蔗糖浓度为10mg/mL至80mg/mL、更优选为40mg/mL至60mg/mL甚至更优选为60mg/mL。在本发明第二部分的另一个优选实施方案中，赋形剂是蔗糖与海藻糖的组合。

在本发明第二部分的一个优选实施方案中，本发明组合物的水溶性缓冲液优选磷酸钠、磷酸钾、钠或钾的柠檬酸盐、马来酸、乙酸铵、3-羟甲基-氨基甲烷(TRIS)、乙酸盐、二乙醇胺或它们的组合。无论缓冲液是单独或组合用于组合物中，该缓冲液的浓度优选介于20mM与150mM之间，更优选该浓度为约50mM且优选水溶性缓冲液是磷酸钠。

在本发明第二部分另一实施例中，本发明组合物可进一步包含一或多种赋形剂。在本发明第二部分的某些实施例中，组合物中所述的一种或多种赋形剂的浓度约为0.001至5％(重量百分比)，而在本发明的第二部分的其他实施例中，组合物中所述的一种或多种赋形剂的浓度约为0.1至2％(重量百分比)。赋形剂均为本领域熟知品种，可以由已知方法配制或购自供应商。优选的所述赋形剂包括乳糖、甘油、木糖醇、山梨醇、甘露醇、麦芽糖、肌醇、葡萄糖、牛血清白蛋白、人类血清白蛋白(SA)、重组血球凝集素(HA)、右旋糖酐、聚乙烯醇(PVA)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚乙烯亚胺、明胶、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羟乙基纤维素(HEC)、聚乙二醇、乙二醇、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、脯氨酸、L-丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、肌氨酸、伽马氨基丁酸、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、十二烷基硫酸钠(SDS)、聚山梨醇酯、聚氧乙烯共聚物、磷酸钾、乙酸钠、硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、三甲胺N-氧化物、甜菜碱、锌离子、铜离子、钙离子、锰离子、镁离子、3-[(3-酰基氯丙基)-二甲基铵]-1-磺酸丙烷(CHAPS)、蔗糖、单月桂酸酯或其组合。在更优选实施例中，赋形剂为聚山梨醇酯20，在甚至更优选的实施方案中，聚山梨酯20的浓度为0.1％。

在本发明第二部分另一优选实施例中，组合物的pH值在6.0至7.0之间，可以为6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8和6.9任一pH值。在更优选的实施方案中，组合物的pH值为约6.2。

在本发明第二部分具体实施例中，组合物包含50mg/mL依那西普、50mM磷酸钠缓冲液、60mg/mL海藻糖二水合物，其中该组合物pH值为6.2。

在本发明第二部分具体实施例中，组合物包含50mg/mL依那西普、50mM磷酸钠缓冲液、60mg/mL海藻糖二水合物、0.1％的聚山梨醇酯20，其中该组合物pH值为6.2。

在本发明之此第二部分具体实施例中，组合物包含50mg/mL依那西普、50mM磷酸钠缓冲液、60mg/mL蔗糖，其中该组合物pH值为6.2。

在本发明之此第二部分具体实施例中，组合物包含50mg/mL依那西普、50mM磷酸钠缓冲液、60mg/mL蔗糖、0.1％聚山梨醇酯20，其中该组合物pH值为6.2。

本发明的第二部分所公开的组合物可以肠胃外给药，例如通过皮下、肌内、静脉内、腹膜内、脑脊液内、关节内、滑膜内及/或鞘内等方式给药。

构成本发明第二部分所公开组合物中分离的多肽的已知疗效包括可用于但不限于治疗以下疾病：类风湿关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、肉芽肿病、克罗恩病、慢性阻塞性肺病、丙型肝炎、子宫内膜异位症、哮喘、恶病质、牛皮癣或特应性皮炎、或其它炎性或自身免疫相关性疾病、功能障碍或病症。足够剂量(例如，治疗有效量)的所述组合物可用于相应病症的治疗(减轻症状、停止或延缓进展)。

以下实例用于进一步阐明本发明的第二部分，而不应被理解为对于本发明范围的限定。

本发明第二部分实例

组合物的制备

以下组成通过简单的混合得到：

原材料：

62.5mg/mL的依那西普、1.2mg/mL的Tris溶液、40mg/mL的甘露糖醇、10mg/mL的蔗糖。溶液pH值为7.4，-20℃下储存。

参考配方(本文称为「Enbrel」)：

以市售同一批次配方作为对照样本。市售Enbrel配方含有50mg/mL的依那西普、25mM磷酸钠、25mM的精氨酸、100mM的氯化钠、10mg/mL的蔗糖、溶液pH值6.3。

候选配方：

F1：在例如Enbrel配方这样的相同配方中，依那西普被用作内部对照成分(50.9mg/mL的依那西普、25mM磷酸钠、25mM的精氨酸、100mM的NaCl、10mg/mL蔗糖、溶液pH值6.3)。

F2：依那西普的水溶性制剂(49.4mg/mL依那西普、25mM磷酸钠、100mM氯化钠、10mg/mL蔗糖，pH值6.3)。

F3：依那西普的水溶性制剂(49.5mg/mL依那西普、25mM磷酸钠、125mM氯化钠、10mg/mL蔗糖，pH值6.3)。

F4：依那西普的水溶性制剂(50.9mg/mL依那西普、50mM磷酸钠、，60mg/mL海藻糖二水合物、0.1％聚山梨醇酯20，pH值6.2)。

在一些实验中，亦使用大量商业作为参考(参见上文)。

实施例一

内在蛋白荧光发射光谱和静态光散射

内在蛋白的荧光发射光谱在266nm处激发获得，静态光散射数据在266nm和473nm获得。每个样品装入微量比色皿阵列(MCA)并放入Optim 1000来说明胶体和构象稳定性的差异。在这项研究中热斜坡实验温度从15到95℃每次升高1℃，样品在每个温度下维持60秒以达到热平衡。在等温的实验中，温度固定在62℃，样品在一个60秒内被重复测量200次。

样品被266和473nm激光源照射的时长称为曝光时间。曝光时间的选择取决于很多因素，如荧光发射的强度和样品褪色的灵敏度。此处所述所有样品的曝光时间均设定为1秒。

随着曝光时间的变化，物理缝隙的大小可以调节以控制进入检测器的光量。增大这一开口的大小会增加测量的荧光信号，但仪器的光谱分辨率随之降低。

Optim 1000仪器进行的分析包括两个层次，主要的和次要的。Optim 1000软件提供了自动化的主次分析。正如任何一个自动化的数据拟合软件，必须采取合理措施以确保输入数据具有良好的质量，使自动功能得以输出可靠的结果。并且，所有的结果已经由一位专业熟练的分析师手动验证过。

原发性荧光发射和光散射数据的主要分析提取光谱参数如下：

·Optim可以借助数学函数提供基础信息如期望的波长(也被称为质心平均数)，该参数在科学文献中已经越来越常用。它着眼于在平均发射波长(或质量中心)，是一种很好的消除光谱数据中各种噪声的方法。

·散射光的强度由260和270nm之间(瑞利散射紫外激发光)的综合强度计算而来。散射效率高度依赖波长：波长越短，溶液中的分子散射光的效能就能越高。266nm处的激光的散射可以敏锐地探测出平均分子量的细微变化。

在本项研究中，350和330nm之间的荧光强度比值已被用于研究抗体的热展开，266nm和473nm激光的散射光强度被用于测量热诱导的样品聚集。

次要分析借助初步分析得出的参数来确定样本的熔融温度“Tm”和聚集起始温度“Tagg”，如果此两项指标存在的话。熔融温度的确定表现为根据主要分析数据绘制而成的温度函数上的拐点值。聚集温度的起点的确定表现为在该温度下的散射光强度随数据中的噪声增大而超越某一阈值。从测量到的最低的温度，每一个测量的散射强度值被添加到所有先前测量值的数据集。分析进程中的每一个点使用线性拟合并确定拟合优度。如果数据明显从一条直线偏离(直线意义由数据中的噪声确定)，那么这就被定义为聚集起始温度。如果没有明显偏离，那么在数据集的下一个点上进行核算，再次检验该偏离。这种方法已经测试过各种各样的蛋白质和条件，并且被证明是有效的。在存在大型聚集体形成和沉淀的极端情况下，如果悬浮液中的颗粒离开入射激光的焦距，光散射信号实际上会降低。然而，不管后来出现何种沉淀，最初的起点仍然可以重现。

在所有的静态光散射数据的情况下，无论样品中有无沉淀析出，所有的点均被包含。相同的样品在不同的重复实验有时会沉淀，有时不会，但在每一种情况下聚合过程的开始都可以重现。

结论

所有样品的Tagg和Tonset数据非常相似。

·在F1缓冲产品中，荧光Tonset为63.7±0.3℃，Tagg为66.8±0.3℃。

·在F2缓冲产品中，荧光Tonset为63.2±0.1℃，Tagg为65.9±0.1℃.

·在F3缓冲产品中，荧光Tonset为63.4±0.3℃，Tagg为65.6±0.4℃.

·在F4缓冲产品中，荧光Tonset为63.3±0.1℃，Tagg为64.8±0.1℃.

·创新药Enbrel本身的荧光Tonset为63.4±0.1℃，Tagg为65.6±0.1℃.

因此，该数据指示所有试样间的胶体及构形稳定性高度类似。

发现荧光的T起始值系介于63.2℃与63.7℃之间，且平均值63.4℃及相对低的0.3℃的标准偏差，从而指示5个试样(F1至F4及Enbrel液体配方)间具有高度可比性。

如所有实验中所示，F4配方在构形及胶体稳定性构形方面与Enbrel液体配方极为类似。

实施例二

短压力稳定性研究方法

在实施长期研究之前进行一项为期约两个星期的短期稳定性研究实验，来评估配方。

测试下列4种配方：

除了搅拌和冻融应力外，每种配方均被暴露在两种人为高温(25℃和50℃)和一种实时温度下，以评价其在实验开始后0、3、7、14天时的稳定性。

每组用以下8项分析测定指标来评估每个配方的稳定性

·pH(仅在0天时)

·渗透压(仅在0天时)

·蛋白浓度(A280nm)

·浊度(A330nm)

·HIAC

·SDS-PAGE(考马斯亮蓝染色)

·分子排阻色谱(SE-HPLC)

·基于细胞的效力

pH值及渗透压

图9显示了初始时候溶液的pH值和渗透压的柱状图。在每种条件下设置样品之前，所有配方的测定值都在目标pH或者理论渗透压的范围内。

蛋白质浓度/A280

图10显示在所有时间(0至14天)及条件(-20℃、25℃、50℃、3次冷冻/解冻(3×FzTh)及3天搅动)下的蛋白质浓度量测值(280nm下的吸光度)。针对所有试样在所有时间点及条件下获得的数据皆在目标值的范围内且在分析的差异性内。

浊度/A330

图11显示在所有时间(0至14天)及条件(-20℃、25℃、50℃、3次冷冻/解冻(3×FzTh)及3天搅动)下的浊度量测值(330nm下之吸光度)。根据该等结果，在50℃条件下检测到浊度显著增加，且F3随时间呈现最低增加。在-20℃、25℃、冷冻-解冻或搅动下在任一配方中观察到并未发生显著改变。

HIAC(液体粒子计数器)

方法：

用HIAC 9703液体颗粒计数系统做这个实验。该计数器由取样器、颗粒计数器和ROYCO传感器组成。该ROYCO传感器能够将2μm到100μm之间的颗粒测出尺寸并计数。这个设备可计数的颗粒≤10000个/毫升。

过程：

·最初的样品不经过稀释而直接分析，但由于样品的高粘度，他们需要被稀释后进行测定以获得更准确的结果。

·样品放于室温1小时。

·样品用恰量的配方缓冲液按1:3比例稀释，脱气(1.5小时)并在测量前仔细混合。

·标准杜克科学计数仪：系统适用性检查是用EZY-Cal 5μm和15μm尺寸的颗粒作为对照组标准。在开始时，先对对照组标准进行分析以验证该传感器的分辨率。

图12显示了通过HIAC，使用标准杜克计数仪测定配方F1、F2、F3和F4在所有条件下(-20℃、25℃、50℃、3次冷冻/解冻循环(-20℃/25℃条件下)及搅动3天)的亚可见粒子分析。

针对F1、F2及F4在50℃条件下测得亚可视粒子计数显著增加，且F2早自7天显示最高增加。

针对任一配方在-20℃、25℃、3×FzTh或在3d RT搅动后观察到并未发生显著改变。

F4在所有条件及时间点下储存后如与t＝0对照相比未呈现亚可视粒子有所改变。

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

图13显示在所有条件(-20℃、25℃、50℃、3次冷冻/解冻及3天搅动)下在时间0天及14天培育的利用考马斯染色的SDS-PAGE凝胶。(A)中为F1试样且(D)中为F4试样。

在所有配方中针对50℃条件在所有时间点皆观察到显著改变，其中第14天试样显示可能共价改质的高分子量(HMW)物质，如由所存在的其他HMW条带(>约250kDa)及低分子量(LMW)分解物质(<50kDa)所证实，该等对于所有配方在50℃下早自3天即存在。

在任一配方中针对所有其他条件及时间点且如与参考标准相比观察到并未发生改变。

SE HPLC(尺寸排阻高效液相色谱法)

条件：

·色谱柱：superSW3000色谱柱4.6x300mm，4μm(Tosoh，18675)CV＝2.5毫升

·柱温：25℃

·流动相：0.2M磷酸缓冲液，pH值6.8

·流速：0.35mL/min

·运行时间：20分钟

·样品量：37.6μg

·自动采样器温度：4℃

图14显示在所有配方中针对所有条件(-20℃(14A)、25℃(14B)、3次冷冻/解冻及3天搅动(14C))在所有时间点的尺寸排阻HPLC的层析图。已量测峰％且示于表中。

25℃条件亦使得所有配方在7天后的主峰面积％及前峰％略微改变，在14天进一步增加，其中在此条件下F4显示最高的前峰聚集增加(0.5％)，但此增加无关紧要不值得考虑。

在任一配方中在暴露于搅动及冷冻-解冻的条件或在-20℃下储存至多14天时观察到并未发生显著改变。

基于细胞的效价测定

方法：

·两批样品进行测试(在第0和3天后和在第7和14天后)。

·除了对照样品外，所有的样品都由同一个分析师进行一次生物测定。对照样品连续6天，每一天都要测试一次。

·在280nm处测量吸光度来确定最初的稀释制剂和随后的样品的精确浓度。

·整体的检测性能是可以接受的。由53个板测得的106个剂量-反应曲线中，3条曲线需要对一个孔进行2种不同浓度的封板处理，以满足孔间变异性分析标准。

·孔与孔之间的差异CV％≤20％

·检测窗口(D/A)≥6

·R2≥0.98

测定了47个测试样品的相对效价，对照组测定了6个不同的时间。对照组的平均相对效价为100.2％，95％可信区间为96.9％～103.6％。

·对照组六次独立测定的方法变异性(％GCV)为3.2％。这种方法的低检测变异性表明，单一测定获得的测试样品的相对效价是可以接受的。

·基于单一测定结果，大部分的测试样品的相对效价接近100％(与参考标准具有可比性)。

基于细胞的生物测定结果：

图15显示包括在所有配方中针对所有条件(-20℃(15A)、25℃(15B)、3次冷冻/解冻及3天搅动(15C))在所有时间点基于细胞的效能分析(相对效能％，如与参考标准的效能相比)的分析图形。

如自图15可看出，除冷冻/解冻及RT搅动条件以外，在-20℃及25℃下所有配方的相对效能皆接近100％。

本发明的第二部分的项目

1.一种水溶液组合物，其包含：

一种分离的多肽，是由人的p75肿瘤坏死因子受体的胞外配体结合部分与人类IgG1的Fc部分融合而成；

单糖或二糖；

水溶性缓冲液；

其特征在于该组合物既不含有精胺酸亦不含有半胱胺酸、也不含选自氯化钠、氯化钾、柠檬酸钠、硫酸镁、氯化钙、次氯酸钠硝酸钠、硫化汞、铬酸钠及二氧化镁的盐类。

2.如项目1的组合物，所述的分离的多肽为依那西普。

3.如项目1或2中任一项的组合物，其中该单糖或二糖选自海藻糖、蔗糖及其组合。

4.如项目3的组合物，所述的海藻糖的浓度为20mg/mL至80mg/mL。

5.如项目3的组合物，所述的蔗糖的浓度为10mg/mL至80mg/mL。

6.如项目1至5中任一项的组合物，所述的水溶性缓冲液选自磷酸钠、磷酸钾、钠或钾的柠檬酸盐、马来酸、乙酸铵、3-羟甲基-氨基甲烷(TRIS)、乙酸盐、二乙醇胺或其组合。

7.如项目6的组合物，其中该水溶性缓冲液浓度20mM至150mM。

8.如项目1至7中任一项的组合物，其组分中还含有一种或多种赋形剂。

9.如项目8之组合物，所述的赋形剂可为乳糖、丙三醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、麦芽糖、肌醇、葡萄糖、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血凝素、重组右旋糖酐、聚乙烯醇、羟丙甲纤维素、聚乙烯亚胺、明胶、聚乙烯吡咯烷酮羟乙基纤维素、聚乙二醇、乙二醇、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、脯氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、肌氨酸、γ-氨基丁酸、聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-80、十二烷基硫酸钠、聚山梨醇酯、聚氧乙烯共聚物、钾磷酸盐、醋酸钠、硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氧化三甲胺、甜菜碱、锌离子、铜离子、钙离子、锰离子、镁离子、3-[(3-丙基乙醇胺)-二甲胺]1-丙烷硫酸盐、蔗糖单月桂酸酯或它们的混合物。

10.如项目1至9中任一项的组合物，所述的组合物溶液的pH值在6.0至7.0之间。

11.如项目1至10中任一项的组合物，其包含50mg/mL依那西普、50mM磷酸钠缓冲液、60mg/mL海藻糖二水合物，该组合物的pH值为6.2。

12.如项目1至10中任一项的组合物，其包含50mg/mL依那西普、50mM磷酸钠缓冲液、60mg/mL蔗糖，该组合物的pH值为6.2。

13.如项目1至10中任一项的组合物，其包含50mg/mL依那西普、50mM磷酸钠缓冲液、60mg/mL海藻糖二水合物、0.1％聚山梨醇酯20，该组合物的pH值为6.2。

14.如项目1至10中任一项的组合物，其包含50mg/mL依那西普、50mM磷酸钠缓冲液、60mg/mL蔗糖、0.1％聚山梨醇酯20，该组合物的pH值为6.2。

Claims (15)

1.一种水溶液组合物，包括：

一种分离的多肽，是由人p75的肿瘤坏死因子受体的胞外配体结合部分与人类IgG1的Fc部分融合而成；

一种浓度范围在80至130mM的盐；

一种赋形剂，选自海藻糖和蔗糖或它们的组合；

其特征在于：其组份中既不含精氨酸也不含半胱氨酸。

2.根据权利要求1所述的水溶液组合物，其特征在于：所述的盐的浓度为90mM。

3.根据权利要求1到2中任一所述的水溶液组合物，其特征在于：所述的盐为氯化钠。

4.根据权利要求1到3中任一所述的水溶液组合物，其特征在于：所述的分离的多肽是依那西普。

5.根据权利要求1到4中任一所述的水溶液组合物，其特征在于：所述的赋形剂为浓度在5到80mg/mL之间的蔗糖。

6.根据权利要求1到5中任一所述的水溶液组合物，其特征在于：所述的组分中还包括水溶性缓冲液。

7.根据权利要求6所述的水溶液组合物，其特征在于：所述的水溶性缓冲液为磷酸钠、磷酸钾、钠或钾的柠檬酸盐、琥珀酸、马来酸、乙酸铵、3-羟甲基-氨基甲烷(TRIS)、乙酸盐、二乙醇胺、组氨酸或其组合。

8.根据权利要求6或7所述的水溶液组合物，其特征在于：所述的水溶性缓冲液的浓度为15至100mM。

9.根据权利要求8所述的水溶液组合物，其特征在于：所述的水溶性缓冲液的浓度在20至30mM之间。

10.根据权利要求6至9中任一所述的水溶液组合物，其特征在于：所述的水溶性缓冲液为琥珀酸(琥珀酸盐)。

11.根据权利要求1至10中任一所述的水溶液组合物，其特征在于：其组份中还含有一种或多种赋形剂。

12.根据权利要求11所述的水溶液组合物，其特征在于：所述的赋形剂可为乳糖、丙三醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、麦芽糖、肌醇、葡萄糖、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血凝素、重组右旋糖酐、聚乙烯醇、羟丙甲纤维素、聚乙烯亚胺、明胶、聚乙烯吡咯烷酮羟乙基纤维素、聚乙二醇、乙二醇、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、脯氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、肌氨酸、γ-氨基丁酸、聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-80、十二烷基硫酸钠、聚山梨醇酯、聚氧乙烯共聚物、钾磷酸盐、醋酸钠、硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氧化三甲胺、甜菜碱、锌离子、铜离子、钙离子、锰离子、镁离子、3-[(3-丙基乙醇胺)-二甲胺]1-丙烷硫酸盐、蔗糖单月桂酸酯或它们的混合物。

13.根据权利要求1至12中任一所述的水溶液组合物，其特征在于：所述组合物溶液的pH值在6.0至7.0之间。

14.根据权利要求1至13中任一所述的水溶液组合物，其特征在于：所述组合物包括50mg/mL依那西普、22mM琥珀酸、90mM氯化钠、10mg/mL蔗糖，溶液的pH值为6.3。

15.根据权利要求1至14中任一所述的水溶液组合物，其特征在于：所述组合物包括50mg/mL依那西普、25mM磷酸钠缓冲液、90mM氯化钠、34mg/mL蔗糖，溶液的pH值为6.3。