CN105866082A - 一种生物样品中腺苷含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物样品中腺苷含量的检测方法，表面修饰腺苷适配体片段1的四氧化三铁磁性纳米粒子与表面修饰腺苷适配体片段2的碲化镉量子点混合形成腺苷探针；腺苷探针与腺苷通过碱基配对结合形成腺苷三明治结构并使之从生物样品中分离；运用银离子与腺苷三明治结构中的碲化镉量子点中镉离子的离子交换作用定量腺苷含量，该法具有灵敏度、准确度和精确度都很高的特点。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于核酸适配体识别技术和离子交换信号放大机制的高灵敏度的腺苷检测方法。
背景技术
腺苷(Adenosine, AD)即腺嘌呤核苷，是机体RNA的代谢产物，属于生物小分子化合物，它是一种内源性核苷，能参与血管神经舒张活动，具有抗心律失常的功效。在中枢神经系统中，它对神经传递的调节及对抵抗缺血性与疾病性神经伤害等方面具有重要作用。同时腺苷作为腺苷脱氨酶的作用底物，其含量变化也会间接反应腺苷脱氨酶的体内代谢水平，而腺苷脱氨酶活性的检测对于临床许多疾病的诊断都具有重要参考价值，因此发展腺苷的新型检测方法对于医学临床诊断及机体代谢水平具有重要意义。
有研究证实，腺苷作为肿瘤的潜在生物标志物具有重要意义，尿液中腺苷含量可以被用来检测疾病的病程。目前腺苷的检测方法，虽然可以达到检测要求，但是却存在许多的缺点，例如高效液相色谱法、紫外检测、流式检测法及气质/液质色谱法等都存在需要复杂的样本前处理、操作费时和仪器昂贵等缺点，因此建立一种简单、快速和高灵敏度的腺苷检测新方法有着重要的现实意义。
适配体是指通过指数富集配位系统进化技术（SELEX）体外筛选得到的能特异结合蛋白或者其他小分子物质的带有特定3D结构的RNA或DNA分子，一般长度在20-60个碱基左右。相比于传统抗体，适配体具有易合成、易修饰、易固定、可反复使用、可长期保存及没有或极小的免疫原性等特点，而且与目标分子结合表现出高效、专一的特性，因而核酸适配体生物传感器在蛋白质研究、药物检测、医学诊断等方面得到广泛应用。目前已报道的基于适配体生物传感器检测腺苷的方法有表面等离子体共振、电化学发光、比色法以及荧光分析方法等，其中荧光分析法具有灵敏度高、操作简单等优点，使其在各种适配体方法中脱颖而出。
近年来，为了提高检测的灵敏度，量子点（quantum dots, QDs）作为信号放大标记物已经被广泛的应用于各种分析检测中，如荧光、表面拉曼散射和电化学分析等。而由于量子点纳米晶体中包含成千上万的金属离子，离子交换成为一种新型的荧光信号放大方法。在加入银离子后，量子点中的阳性金属离子能够迅速与银离子发生离子交换反应，将金属离子从纳米材料中置换出来，再通过荧光探针检测这些金属离子，从而放大量子点的荧光信号，具有快速、温和、高效、成本低等优点。该反应能够在室温下迅速反应，而且不需要使用强酸或者腐蚀性氧化剂，因此可以应用于生物分析的信号放大反应，为超灵敏的生物分子检测提供了方法。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种生物样品中腺苷含量的检测方法，基于核酸适配体识别技术和离子交换信号放大机制，具有高灵敏度、准确度和精确度。
为了实现上述发明目的，本发明以四氧化三铁纳米粒子（Fe3O4）为磁性分离器，碲化镉量子点（CdTe QDs）为荧光标记，核酸适配体为腺苷分子识别器件，银离子为离子交换反应置换离子。
一种生物样品中腺苷含量的检测方法，包括以下步骤：
步骤一、腺苷探针的制备：
（1）、表面修饰羧基的四氧化三铁磁性纳米粒子和氨基修饰的腺苷适配体1（ABA1）通过缩合反应结合；
（2）、巯基丙酸修饰的碲化镉量子点和氨基修饰的腺苷适配体2（ABA2）通过缩合反应结合；
（3）、将两种结合产物以等摩尔比溶于pH 7.4的PBS缓冲溶液中形成腺苷探针；
四氧化三铁纳米粒子的粒径为8～12nm；
碲化镉量子点激发波长为370nm，发射波长为550nm；
表面修饰羧基的四氧化三铁磁性纳米粒子和氨基修饰的腺苷适配体1，其摩尔比为200: 1～250:1；巯基丙酸修饰的碲化镉量子点和氨基修饰的腺苷适配体2，其摩尔比为20:1～25:1。
步骤二、腺苷探针与腺苷结合并使之从生物样品中分离：
将腺苷加入步骤一制得的腺苷探针体系中，通过碱基配对形成腺苷三明治结构（Fe3O4-ABA1-AD-ABA2-CdTe
QDs），通过磁性分离将其从生物样品中分离；
孵育时间为30min，孵育温度为20～40℃。
步骤三、运用银离子与三明治结构中的镉离子的离子交换作用定量腺苷含量：在步骤二分离得到的腺苷三明治结构中加入定量且相对过量的银离子溶液，银离子与腺苷三明治结构中的碲化镉量子点进行离子交换反应，取代二价镉离子生成碲化银沉淀并破坏原有量子点结构，消耗了部分银离子，其消耗含量与腺苷含量成正比。经过离心弃去沉淀，利用碲化镉量子点作为荧光探针，检测出反应上清液中剩余的银离子浓度。通过计算在加入腺苷和未加入腺苷的情况下银离子检测体系的荧光的比值对腺苷进行定性和定量。
离子交换反应时间为20min，离子交换的反应体系为pH 7.4的PBS缓冲溶液。
本发明以腺苷适配体分别标记碲化镉量子点与四氧化三铁磁性纳米粒子组成生物荧光探针，结合离子交换荧光信号放大技术，建立了一种简便、快速地检测癌症指标物腺苷的新方法，腺苷检测原理图示如图1所示：图A中，腺苷适配体（5′-ACC TGG GGG AGT ATT GCG
GAG GAA GGT-3′）被切分成两个不同的片段（ABA1和ABA2）。这两个核酸片段没有腺苷的存在下无法形成稳定的DNA二聚体结构。在加入腺苷后，这两段核酸片段能够结合腺苷，重新装配成稳定的三级结构。利用该特点，在偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）的作用下，将羧基修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子和巯基丙酸修饰的碲化镉量子点分别与均用氨基修饰的腺苷适配体片段ABA1和ABA2通过CO-NH化学键结合。由于腺苷适配体ABA1和ABA2只有在腺苷的存在下才能通过碱基配对互补结合在一起，因此，如图B所示，加入目标分子腺苷，腺苷与四氧化三铁纳米粒子连接的ABA1以及与碲化镉量子点连接的ABA2能够形成三明治结构（Fe3O4-ABA1-AD-ABA2-CdTe
QDs）。通过磁性分离，将该三明治结构从生物样品中分离。由于碲化镉量子点纳米晶体中包含成千上万的二价镉离子，加入银离子溶液作为离子交换试剂，生成的碲化银相比于碲化镉更具有热力学稳定性，因此在常温下银离子就能够迅速地将三明治结构中的镉离子置换出来，将量子点的结构完全破坏。因此在腺苷三明治体系中加入过量的银离子溶液，银离子与腺苷三明治结构中的碲化镉量子点进行离子交换反应，消耗了部分银离子，其消耗含量与腺苷含量成正比。经过离心弃去沉淀，利用碲化镉量子点作为荧光探针，检测出反应上清液中剩余的银离子浓度。由于银离子对碲化镉量子点有很强的荧光猝灭作用，因此荧光检测探针碲化镉量子点的荧光猝灭值越小，说明剩余的银离子含量越少，则与三明治结构中的碲化镉量子点发生离子交换反应的银离子含量越多，则三明治结构中腺苷的浓度越高。因此腺苷的浓度与作为荧光探针的碲化镉量子点的荧光淬灭值成反比。通过计算在加入腺苷和未加入腺苷的情况下银离子检测体系的荧光的比值对腺苷进行定量。
本发明可高灵敏检测分析目标，能够检测到0.210nM的腺苷，线性范围在0.330nM～167nM，线性范围广。
附图说明
图1为本发明的腺苷检测原理示意图；
图2为本发明实施例1所检测的尿液中的腺苷线性图，可见实现了尿液样品中腺苷的准确定量；图2中，从低到高的曲线所对应的腺苷标准溶液的浓度是0nM，1nM，5nM，10nM，20nM，50nM，100nM，200nM，250nM，300nM，400nM，500nM，其中的小插图是所得标准曲线，R2=0.99。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例
1
在本实施例中，检测的是肺癌患者尿液中的腺苷含量，步骤如下：
（1）表面修饰羧基的四氧化三铁磁性纳米粒子的制备（P. Sun, H. Y. Zhang, C.
Liu, J. Fang, Langmuir 2010, 26(2), 1278–1284.）：利用共沉淀法制备磁性Fe3O4纳米粒子：将80 mL去氧超纯水加入250 mL三颈瓶中，磁力搅拌，保持搅拌速度为800 rpm，氮气保护下加入1.72 g的FeCl2 · 4H2O和4.72 g FeCl3 · 6H2O，当温度升至80℃逐滴加入浓氨水10 mL，PEG 2mL，反应 1 h，去离子水洗至中性，分散于100 mL乙醇中制得Fe3O4磁性纳米粒。取10.5 g一水合柠檬酸超生溶解于100 mL水中，加入研细的Fe3O4
0.5 g，超声分散20 min，室温机械搅拌4 h，反应液分装4支离心管9000 rpm 离心10 min，取上清，丙酮洗三次，40℃真空干燥，得到羧基修饰的Fe3O4。
（2）表面修饰羧基的四氧化三铁磁性纳米粒子和氨基修饰的腺苷适配体1通过缩合反应结合：取0.005 g制备的羧基修饰的Fe3O4，溶于1 mL 的0.01M的PBS缓冲溶液（pH7.4）中。向其中加入10 µL 0.1M的EDC，混合、室温培育15min后，再加入100 µM适配体ABA1 10 µL，25℃震荡反应2h。随后加入1% BSA进一步反应30min以封闭Fe3O4表面未反应的位点。羧基修饰的Fe3O4与适配体的结合物通过磁性分离，并反复水洗三次以除掉未反应的适配体和其他杂质。最终的复合物重新溶解于1 mL 0.01M PBS缓冲溶液中。
（3）巯基丙酸修饰的碲化镉量子点的制备（F.D. Wei, X. L. Lu, Y. Z.
Wu, Z. Cai, L. Liu, P. Zhou and Q. Hu,Chem. Eng. J., 2013, 226, 416–422.）：室温下，将2 M的醋酸镉溶于75 mL水中，而后加入4.8 M的巯基丙酸（33.5 μL），用1.0 MNaOH调节pH到10左右。将溶液转移至三颈瓶中，通氮气30 min后加入新鲜制备的碲氢化钠，加热至100 ℃反应大约5 h，用无水乙醇沉淀离心两次洗去未反应的物质，纯化所得CdTe QDs，沉淀物溶解于0.01M的PBS缓冲溶液（pH7.4）。
（4）巯基丙酸修饰的碲化镉量子点和氨基修饰的腺苷适配体2通过缩合反应结合：取2.0mMCdTeQDs1 mL与10 µL 0.1 M的EDC混合室温培育15min后，加入100 µM适配体ABA2 10 µL，25℃震荡反应2h。随后加入1% BSA进一步反应30min以封闭CdTeQDs表面未反应的位点。CdTeQDs与适配体的结合物使用100KDa超滤管低温离心，以除掉未反应的CdTeQDs和其他杂质。最终的复合物重新溶解于1mL 0.01M PBS缓冲溶液中。
（5）将两种结合产物以等摩尔比溶于PBS（pH 7.0）缓冲溶液中形成腺苷探针。
（6）标准曲线的绘制：准确称取267.2 mg腺苷标准品溶于适量超纯水中，充分溶解后，定容至100mL，得到10 M腺苷储备液。分别配制十一个不同浓度（1nM，5nM，10nM，20nM，50nM，100nM，200nM，250nM，300nM，400nM，500nM）的腺苷标准溶液。取十一份体积为200µL腺苷探针溶液，再加入100 µL上述配制的不同浓度腺苷标准溶液混合均匀，在室温条件下震荡反应30min。待上述反应结束，对三明治结构外加磁场，同时倾去未被磁力吸附的溶液，加入适量0.01M的PBS缓冲溶液（pH7.4）清洗2~3次，再加入100 μL的10 mM的现配的AgNO3溶液，在室温条件下震荡反应20 min后，高速离心取上清液。各取不同浓度腺苷反应所得的上清液30 μL，各加入3 mL CdTe QDs，在室温条件下震荡反应20 min后，分别测定未加入腺苷时体系荧光强度F0和加入腺苷时体系的荧光强度F，计算荧光增强强度F/F0，以腺苷的浓度对F/F0进行回归计算得标准曲线（R2=0.99）。
（7）尿液样品中腺苷的含量检测：取适量肺癌患者尿液样品，用0.2µM滤膜过滤以除去大分子杂质，用0.01M的PBS缓冲溶液（pH7.4）稀释500倍，取稀释后尿液样品100μL加入200µL腺苷探针体系，操作过程同标准曲线绘制过程。通过测定空白荧光强度F0和加入尿液样品后体系荧光强度F，计算荧光增强强度F/F0，根据上述绘制的腺苷标准曲线计算样品中腺苷含量。结果如表1所示：尿液样品基质不会干扰腺苷的含量检测，而且加样回收率均符合要求。
表1
以上所述，仅为本发明最佳实施方式，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地的得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (5)
1. 一种生物样品中腺苷含量的检测方法，包括以下步骤：
步骤一、腺苷探针的制备：
（1）、表面修饰羧基的四氧化三铁磁性纳米粒子和氨基修饰的腺苷适配体1通过缩合反应结合；
（2）、巯基丙酸修饰的碲化镉量子点和氨基修饰的腺苷适配体2通过缩合反应结合；
（3）、将两种结合产物以等摩尔比溶于pH 7.4的PBS缓冲溶液中形成腺苷探针；
步骤二、腺苷探针与腺苷结合并使之从生物样品中分离：将腺苷加入步骤一制得的腺苷探针体系中，通过碱基配对形成腺苷三明治结构，并将其从生物样品中分离；
步骤三、运用银离子与腺苷三明治结构中的镉离子的离子交换作用定量腺苷含量：在步骤二分离得到的腺苷三明治结构中加入定量且相对过量的银离子溶液，银离子与腺苷三明治结构中的碲化镉量子点进行离子交换反应，离心，弃去沉淀，利用碲化镉量子点作为荧光探针，检测出反应上清液中剩余的银离子浓度，通过计算加入腺苷和未加入腺苷的情况下银离子检测体系的荧光的比值对腺苷进行定性和定量。
2.根据权利要求1所述的生物样品中腺苷含量的检测方法，其特征在于步骤一中，四氧化三铁纳米粒子的粒径为8～12nm；表面修饰羧基的四氧化三铁磁性纳米粒子和氨基修饰的腺苷适配体1摩尔比为200: 1～250:1；巯基丙酸修饰的碲化镉量子点和氨基修饰的腺苷适配体2摩尔比为20:1～25:1。
3.根据权利要求1所述的生物样品中腺苷含量的检测方法，其特征在于步骤二中孵育时间为30min，孵育温度为20～40℃。
4.根据权利要求1所述的生物样品中腺苷含量的检测方法，其特征在于步骤三中，离子交换反应时间为20min，离子交换的反应体系为pH 7.4的PBS缓冲溶液。
5.根据权利要求1所述的生物样品中腺苷含量的检测方法，其特征在于步骤二中，所述的腺苷三明治结构是Fe3O4-ABA1-AD-ABA2-CdTe
QDs。
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