CN105861641A - 一种用于检测cho细胞dna残留的引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测CHO细胞DNA残留的引物对，采用GenBank登录号为J00052.1的核苷酸序列设计，同时提供了根据该核苷酸序列涉及的Taqman探针，以及相应的检测方法，所述方法为实时荧光定量PCR法，根据所获得的标准曲线，计算得到待检样本中CHO细胞DNA的量。本发明的检测方法可以用于检测以CHO细胞作为基因工程表达细胞株的生物蛋白，例如抗体、治疗性蛋白或疫苗等。本发明的实时荧光PCR检测CHO细胞DNA的方法和依据所述方法制备的PCR试剂盒，实现了检测CHO细胞DNA残留的定量限低至0.1fg/μl，表明本方法具有非常好的灵敏度，且具有较高的特异性。

Description

一种用于检测CHO细胞DNA残留的引物、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于定量检测CHO细胞(ChineseHamster Ovary，中国仓鼠卵巢细胞)DNA含量的引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

在现代，一大批生物蛋白如单抗类药物、重组蛋白类药物、疫苗等在临床上得到了广泛应用，生产这些生物蛋白的宿主细胞主要是细菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。因而在经过纯化得到的最终蛋白产品中会残留这些宿主细胞的DNA。DNA残留量虽然很低，但是蛋白产品中的残留DNA会对人体存在潜在的危险性。一般认为宿主细胞DNA中可能包含了某些未知的DNA片段，一些可能整合了病毒的DNA片段会使人体受到感染，还有一些带有癌变基因的DNA片段可能会诱发产生肿瘤。因此，让蛋白产品中的DNA残留量降至尽可能的低是人们共识。

目前CHO细胞是生物制药中最广泛使用的真核表达细胞系。外源基因转染到CHO细胞后，整合到染色体DNA上，能得到稳定持久的表达，CHO细胞适合在生物反应器中进行大规模培养，高表达目标蛋白。并能进行复杂的蛋白翻译后折叠和修饰，所表达的蛋白的糖基化修饰与人类天然蛋白的糖基化修饰相似性高。因此，CHO细胞成为表达复杂生物大分子蛋白的最理想的宿主细胞，已被广泛用于重组蛋白药物的表达生产。用CHO细胞生产的各种生物蛋白药物的给药剂量不等，剂量相差可以达到几十倍到上百倍。对于给药剂量小的生物蛋白，CHO细胞DNA残留的要求相对较低；对于给药剂量大，并且需要频繁给药的生物蛋白药物，CHO细胞DNA残留量限制严格，越低越好。

在很多生物制品质量标准中都对DNA残留量的进行严格的限制。美国FDA(Food and Drug Administration)在1997年发布的指导原则中规定，最终产品中宿主细胞DNA残留量不得高于100pg/dose；曾经，对于非肠道给药的最终产品中宿主细胞DNA残留量，WHO(World Health Organization)公布的相关标准是不得高于100pg/dose，但1998年这一标准修改为不高于10ng/dose；EU(European Union)，2001年公布的相关标准也是最终产品中宿主细胞DNA残留量不得高于10ng/dose；《中国药典》三部2010年版规定原核表达的生物制品其DNA残留量不高于10ng/dose，真核细胞表达的产品的DNA残留量应不高于100pg/dose。

为了保证在各步纯化工艺中DNA残留的清除达到标准，需要灵敏度非常高的DNA残留检测方法。目前2010年版《中国药典》三部外源DNA残留量检测项目上收录了DNA杂交法和荧光染色法。DNA杂交法需要的条件相对简单，但该方法存在时间长，操作繁琐，稳定性、敏感性、特异性较差等缺点。荧光染色法是利用PicoGreen这种高灵敏度的双链DNA荧光染料对DNA含量进行定量测定。该方法的检验灵敏度可达300pg·mL^-1，DNA含量在1.25～80ng·mL^-1范围内线性良好(R²≥0.99)。该方法缺点为容易受到RNA、ssDNA、dsDNA的干扰；对于大剂量的产品，比如单克隆抗体，灵敏度难以达到检测需求。

实时定量PCR是一种快速的高通量的检测方法，它是基于PCR扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针；产物的增加可以通过荧光信号指示，通过实时监控PCR体系中的荧光信号的变化，对样本中初始模板进行定量分析。该方法在特异性、灵敏性、准确性方面具有其独特的优势；此外定量PCR不仅能对残余DNA进行定量，还能对残余DNA进行特异性的扩增，对残余DNA风险的评估更加客观，因此定量PCR法是残余DNA测定未来的发展趋势。

申请号为CN20111006745.4的中国专利申请公开了用实时荧光PCR检测CHO细胞中DNA残留的试剂盒，其中使用的是EvaGreen为荧光染料，EvaGreen染料与双链DNA结合后可以检测到强的荧光信号；在双链DNA最多时，荧光信号最高，即出现吸收峰。EvaGreen染料对于双链DNA的结合并没有特异性，不能够识别出不同来源的DNA片段，虽然在假阳性和抗干扰方面强于原先的SYBR Green荧光染料，但是其特异性也无法与Taqman探针技术相媲美。

申请号为CN201110099204.1、CN201210475980.1和CN201210161343.7的中国专利申请公开了利用Taqman探针技术实时荧光PCR检测CHO细胞DNA残留的方法，其中CN201210475980.1利用多重PCR技术来检测，多重PCR技术操作困难繁琐，成功率低，数据处理复杂，受影响因素较多，应用不广泛。CN201110099204.1和CN201210161343.7的CHO细胞DNA残留量的定量限分别为3fg/μl和10fg/μl，2种方法分别使用不同的探针序列，然后得出不同的检测能力。这也说明选取的目的扩增片段、引物探针序列的设计对于PCR检测能力有着重要的影响。

发明内容

因此，针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种简单、廉价、准确率高、定量限更低的实时荧光PCR技术来定性与定量检测CHO细胞DNA的方法和试剂盒。所述方法可用于检测以CHO细胞作为基因工程表达细胞株的蛋白产品中残留DNA，从而对生物蛋白生产进行质量监测。

申请人发现，定量PCR法的检测能力除了与荧光技术息息相关外，还与所扩增的目的片段的拷贝数多少相关，本申请根据高度保守的CHO细胞Alu短重复序列片段设计出特异性的引物探针序列，Alu短重复序列在CHO细胞基因组DNA大量存在，拷贝数很多，能明显提高检测的灵敏度，确保了本申请的方法拥有较低的定量限。

定量限是某一分析方法的定量限度，即在合适的准确性和精密度下，能够定量测定样品中被分析物的最低量。

本发明采用GenBank登录号为J00052.1的核苷酸序列，设计特异引物和Taqman探针，以提取的CHO细胞基因组DNA为模板进行荧光定量PCR方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一方面，本发明提供了一种用于检测CHO细胞DNA残留的引物对，所述引物对为采用GenBank登录号为J00052.1的核苷酸序列设计的特异性引物；

所述用于检测CHO细胞的DNA残留的核苷酸引物对为：

正向引物序列：5'-CTACCAGAGGTCCTGAGTTCAATT-3'(SEQ IDNO:1)；

反向引物序列：5'-GGGCACCAGGTCTCATAACG-3'(SEQ ID NO:2)；

本发明还提供了采用GenBank登录号为J00052.1的核苷酸序列设计的Taqman探针；

所述的Taqman探针核苷酸序列为：

Taqman探针：5'-CCAGCAACCACATGGTGGCTCAC-3'(SEQ ID NO:3)。

优选地，所述Taqman探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有淬灭基团；优选地，所述荧光报告基团为FAM；优选地，所述淬灭基团为TAMRA。

另一方面，本发明提供了一种用于检测CHO细胞DNA残留的反应体系，所述反应体系的扩增反应液为2×Q-PCR反应预混液，内含Taq酶、dNTPs、Mg²⁺及PCR缓冲液，均为常见组分，其含量亦为常规。反应体系一般可设为30μl。所述DNA模板可以来自待测样本，也可以来自标准品或阳性内控品。

再一方面，本发明提供了一种用于检测CHO细胞DNA残留的方法，所述方法为实时荧光定量PCR法，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min，40个循环；根据所获得的标准曲线，计算得到待检样本中CHO细胞DNA的量。

所述实时荧光定量PCR中，每次检测均设立标准品，阴性质控品和阳性内控品(Internal Positive Control，IPC)。标准品为CHO细胞基因组DNA，其DNA浓度可为10-50ng/μl，如30ng/μl。使用时，用DNA稀释液稀释成6个浓度梯度，分别为300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、0.3pg/μl、0.03pg/μl、0.003pg/μl的标准曲线梯度浓度。阴性对照品为纯水。其中IPC含IPC模板，IPC正向引物、IPC反向引物，MGB(Minor Groove Binder)探针试剂，其中IPC模板是Progema的PGEM-T Easy Vector。

所述IPC试剂中核苷酸引物序列为：

IPC正向引物序列：5'-ACTTGGTCTGACAGTTACCAATG-3'(SEQ IDNO:4)

IPC反向引物序列：5'-GGAGTCAGGCAACTATGGATG-3'(SEQ IDNO:5)

所述IPC探针的核苷酸序列为：

IPC探针：5'-TAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGA-3'(SEQ IDNO:6)

所述IPC探针5'端的标记有荧光报告基团，所述荧光报告基团优选为VIC，也可以是其他的荧光报告基团；3'端标记有淬灭基团，所述淬灭基团优选为MGBNFQ，也可以是其他的荧光淬灭基团。

所述DNA稀释液可为常规。优选由EDTA、NaOH和Tris-HCl溶液配制而成，其中Tris-HCl浓度为5.0-10.0mmol/L，EDTA的浓度为0.5-1.0mmol/L，用NaOH溶液调节pH为6.0-8.5。该DNA稀释液能高效稀释低浓度的DNA样品，而且适合于PCR扩增。

所有待检样品均需通过提取后溶解于DNA稀释液或纯水中。

实时荧光定量PCR反应程序优选为：95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。根据所获得的标准曲线，计算得到待检样本中CHO细胞DNA的量。

其中，所述方法的检测样本为以CHO细胞作为基因工程表达细胞株的生物蛋白，优选地为抗体、治疗性蛋白或疫苗。

再另一方面，本发明提供了一种用于检测CHO细胞DNA残留的试剂盒，所述试剂盒包括PCR扩增反应液、标准品、阴性质控品、IPC以及DNA稀释液；

其中，所述PCR扩增反应液包括Taq酶、dNTPs、Mg²⁺、PCR缓冲液、引物对以及Taqman探针；所述引物对为采用GenBank登录号为J00052.1的核苷酸序列设计的特异性引物；优选地，所述引物对为SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物；

优选地，所述Taqman探针为采用GenBank登录号为J00052.1的核苷酸序列设计的Taqman探针；优选地，所述Taqman探针的序列SEQ ID NO:3所示；进一步优选地，所述Taqman探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有淬灭基团；优选地，所述荧光报告基团为FAM；优选地，所述淬灭基团为TAMRA；

优选地，所述标准品为CHO细胞基因组DNA；更优选地，所述DNA浓度为10-50ng/μl，更优选地为30ng/μl；进一步优选地，在使用时，用DNA稀释液稀释成6个浓度梯度，分别为300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、0.3pg/μl、0.03pg/μl、0.003pg/μl的标准曲线梯度浓度；

优选地，所述阴性质控品为纯水；

优选地，所述IPC包括IPC模板、IPC正向引物、IPC反向引物、IPC探针试剂；优选地，所述IPC模板为Progema的PGEM-T Easy Vector；优选地，所述IPC正向引物的序列如SEQ ID NO:4所示，所述IPC反向引物的序列如SEQ ID NO:5所示；优选地，所述IPC探针的序列如SEQ ID NO:6所示；更优选地，所述IPC探针5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有淬灭基团；所述荧光报告基团优选为VIC；所述淬灭基团优选为MGBNFQ；

优选地，所述DNA稀释液由EDTA、NaOH和Tris-HCl溶液配制而成；更优选地，所述Tris-HCl浓度为5.0-10.0mmol/L，所述EDTA的浓度为0.5-1.0mmol/L，所述DNA稀释液的pH用NaOH溶液调节为6.0-8.5。

本发明的实时荧光PCR技术来定性与定量检测CHO细胞DNA的方法和依据所述方法制备的PCR试剂盒，实现了检测CHO细胞DNA残留的定量限低至0.5fg/μl，表明本方法具有非常好的灵敏度，且具有较高的特异性。

另外，本方法中所用的IPC试剂中包括IPC扩增的模板，引物和VIC-IPC探针，产生的VIC荧光信号与FAM荧光信号区别开来，能对所有加入IPC试剂的Q-PCR反应管起质控作用，可以评价实验中所有PCR反应管是否成功的发生PCR反应，避免出现假阴性现象而不能识别判定。因为各反应管的中所加的IPC模板量都是一样的，可以通过统计各管的IPC的C_T值，来监督样品管中的扩增效率与标准曲线管中的扩增效率，各样品管中IPC的C_T平均值与标准曲线管的IPC的C_T平均值的比值介于90％～110％间时，表示实验结果可信；否则，样品管中的扩增效率与标准曲线管中的扩增效率有差异，样品管的扩增有可能受抑制，扩增效率与标准曲线管不一致，实验结果不可信，准确度无法保证。引入IPC试剂，可以有效的排查检测过程中出现的异常值，提高检测系统的准确性。

本发明提供的实时荧光定量PCR方法可以检测重组蛋白的中间过程样品、半成品、成品等样品中的CHO细胞残留DNA，同时还带有IPC试剂作为PCR反应的内参。可以为重组蛋白药物的生产提供可靠的质量检测数据，为重组蛋白药物的研发和安全生产提供重要支持。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明的CHO细胞DNA标准品扩增曲线图，显示扩增曲线有明显的指数增长期。

图2为本发明的CHO细胞DNA标准品标准曲线图，由图可知，所述曲线的线性方程：Y＝-3.258lg(X)+29.501，R²＝0.999，说明CHO细胞DNA标准品的在1fg至3000pg之间呈良好的线性关系，即CT值与DNA模板量的lg值呈良好的线性关系，R²均在0.99以上，可以检测出很低含量CHO细胞残余DNA。

图3为本发明的CHO细胞专属性试验扩增曲线图，从图中可以得知，加入人的淋巴瘤细胞、酵母菌、大肠杆菌的基因组与未加其他种类的基因组的CHO细胞DNA的扩增曲线高度重合，第1组扩增曲线为添加和未加其他种类的基因组的样品中CHO细胞DNA的扩增曲线图(FAM信号)；第二组扩增曲线为添加和未加其他种类的基因组的样品中IPC质粒的扩增曲线图(VIC信号)。

图4为加入人的淋巴瘤细胞、酵母菌、大肠杆菌的基因组与未加其他种类的基因组的CHO细胞DNA的标准曲线图，各标准曲线完全一致，高度重合。

具体实施方式

实施例1：方法学确认

1.1材料和试剂：2×Q-PCR预混液为市售产品，ViiA 7荧光定量PCR仪为Life Technologies产品，DNA稀释液由本实验室采用分子生物级试剂配制，基因组DNA提取试剂盒为Life Technologies产品；IPC试剂中IPC模板为Promage公司的PGEM-T Easy Vector系列产品，实验中涉及的引物和相应探针由Life Technologies公司合成。

方法学确认所使用的引物序列和探针序列如下：

正向引物序列：5'-CTACCAGAGGTCCTGAGTTCAATT-3'(SEQ IDNO:1)

反向引物序列：5'-GGGCAC CAGGTCTCATAACG-3'(SEQ ID NO:2)

所述的Taqman探针核苷酸序列为：

Taqman探针：5'-CCAGCAACCA CATGGTGGCT CAC-3'(SEQ ID NO:3)

Taqman探针5'端的荧光报告基团为FAM；3'端的淬灭基团为TAMRA。

所述IPC试剂中核苷酸引物序列为：

IPC正向引物序列：5'-ACTTGGTCTGACAGTTACCAATG-3'(SEQ IDNO：4)

IPC反向引物序列：5'-GGAGTCAGGCAACTATGGATG-3'(SEQ ID NO：5)

所述IPC探针的核苷酸序列为：

IPC探针：5'-TAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGA-3'(SEQ ID NO：6)

IPC探针5'端的荧光报告基团为VIC；3'端的淬灭基团为MGBNFQ。

DNA的提取：按照基因组DNA提取试剂盒的说明书所示步骤提取CHO细胞DNA。

IPC试剂即内控对照，含IPC模板，IPC正向引物、IPC反向引物，IPC探针试剂，其中含IPC模板是Progema的PGEM-T Easy Vector(Cat#A 1360)，按下列方法配制IPC试剂：每2.5μl的IPC试剂里含有1μl的1fg/μl的IPC模板、0.5μl 10μM的IPC正向引物、0.5μl 10μM的IPC反向引物、0.5μl5μM的IPC探针。将上述各试剂预先混合，进行PCR加样时，只需在每管中加入2.5μl即可。

将PCR反应的试剂取出：分别是Q-PCR预混液(2×)，正向引物，反向引物，Taqman探针，纯水，IPC试剂。每个样品和标准品做3个重复管，每管30μl的反应体系。根据样品的数量确定反应的管数，按下表表1准备PCR Mix。

表1：PCR反应试剂加样体积表

反应试剂(反应体系30μl)	加样体积(μl)
		Q-PCR预混液(2×)	15
正向引物	1
		反向引物	1
Taqman	0.5

IPC试剂	2.5
		DNA模板	10
总计	30

PCR反应体系配置完成后，在ViiA 7荧光定量PCR仪上进行PCR扩增。PCR条件为95℃预变性10min；95℃15s，60℃60s，40个循环；分析。

1.2灵敏度实验

除DNA模板外，按照表2把混合好的PCR Mix，加入到八联管中，每管20μl。

由于本申请的方法是在CHO细胞基因组的Alu短重复序列上设计的引物，Alu序列在基因组中具有大量的重复序列，所以能检测很低浓度的CHO细胞基因组DNA。为此，为了验证本方法的灵敏度，将CHO细胞DNA标准品用DNA稀释液(Tris-HCl 10mmol/L，EDTA 1mmol/L，pH为8.0)稀释成一系列浓度梯度。取无DNA残留的1.5ml离心管，分别标记：SD1，SD2，SD3，SD4，SD5，SD6、SD7和SD8。取30ng/μl的CHO细胞DNA标准品，用DNA稀释液((Tris-HCl 10mmol/L，EDTA1mmol/L，pH为8)稀释成300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、0.3pg/μl、30fg/μl、3fg/μl、0.5fg/μl、0.1fg/μl。

如图1的扩增曲线显示：扩增曲线有明显的指数增长期。如图2的标准曲线：线性方程：Y＝-3.258lg(X)+29.501，R²＝0.999，可知，每个反应管中加入CHO细胞DNA标准品的在1fg至3000pg之间呈良好的线性关系，即CT值与DNA模板量的lg值呈良好的线性关系，R²均在0.99以上，可以检测出很低含量CHO细胞残余DNA。

表2是额外三次实验结果的标准曲线，从表中可看出，三次实验在30fg至3000pg间的线性很好，R²均能达到0.99以上，具有良好的线性。

定量限：由上述标准曲线方程可知，在DNA模板量0.1fg/μl至300pg/μl间，具有良好的线性，所以本方法对CHO细胞DNA的定量限LOQ可达0.1fg/μl。

表2 CHO细胞DNA标准品扩增线性方程

1.3专属性实验

由于本实验是在CHO细胞基因组的Alu重复序列上设计的特异性引物，所以引物和探针具有高度的特异性，为了验证引物和探针的特异性，我们在加入CHO细胞基因组的模板的同时，同时分别加入人的淋巴瘤细胞、酵母菌、大肠杆菌的基因组，进行PCR扩增反应。

如图3所示，添加与未加其他种类的基因组DNA的扩增标准曲线差异较小，则说明了引物和探针不会在其他物种的基因组DNA发生非特异性反应；各组中IPC模板扩增曲线差异较小，说明实验结果可靠。因此图3说明本实验所设计的引物不会扩增CHO细胞DNA以外其他DNA，本实验所设计的引物和探针具有高度的特异性，专属性较好。

其中，图3中第一组扩增曲线中的A组为3pg/μl CHO DNA的扩增曲线，和分别掺入10ng/μl的人的淋巴瘤细胞、酵母菌、大肠杆菌的基因组的扩增曲线；

图3中第一组扩增曲线中的B组为0.3pg/μl CHO DNA的扩增曲线，和分别掺入10ng/μl的人的淋巴瘤细胞、酵母菌、大肠杆菌的基因组的扩增曲线；

图3中第一组扩增曲线中的C组为30fg/μl CHO DNA的扩增曲线，和分别掺入10ng/μl的人的淋巴瘤细胞、酵母菌、大肠杆菌的基因组的扩增曲线；

图3中第一组扩增曲线中的D组为3fg/μl CHO DNA的扩增曲线，和分别掺入10ng/μl的人的淋巴瘤细胞、酵母菌、大肠杆菌的基因组的扩增曲线；

图3中第一组扩增曲线中的E组为0.3fg/μl CHO DNA的扩增曲线，和分别掺入10ng/μl的人的淋巴瘤细胞、酵母菌、大肠杆菌的基因组的扩增曲线；

图3中第二组扩增曲线为添加和未加其他种类的基因组的样品中IPC质粒的扩增曲线图(VIC信号)。

从图中可以得知，添加与未加其他种类的基因组DNA的扩增标准曲线差异较小，则说明了引物和探针不会在其他物种的基因组DNA发生非特异性反应；各组中IPC模板扩增曲线差异较小，说明实验结果可靠。

图4为根据图3的扩增标准曲线绘制的图，图中为分别加入人的淋巴瘤细胞、酵母菌、大肠杆菌的基因组与未加其他种类的基因组DNA的PCR反应，不同CHO细胞DNA量的对数值与C_T绘制的标准曲线。从图4可以看到，加入人的淋巴瘤细胞、酵母菌、大肠杆菌的基因组与未加其他种类的基因组DNA的标准曲线高度重合，说明了引物和探针不会在其他物种的基因组DNA发生非特异性反应，说明本实验所设计的引物和探针具有高度的特异性，专属性较好。

实施例1的结论：(1)本方法参照FDA和EMA的要求，开发出了高灵敏度的Q-PCR法测CHO细胞DNA残留量试剂盒，每个Q-PCR反应管中都设置了内控试剂，保证所有的反应管中的PCR扩增效率的一致性，提高结果的可信度。

(2)每管中CHO细胞DNA标准品量在1fg至3000pg之间(也就是DNA浓度在0.1fg/μl至300pg/μl)时，C_T值与DNA量的对数值呈良好的线性关系，线性方程：Y＝-3.258lg(X)+29.501，R²＝0.999。本方法的CHO细胞DNA的定量限可达到0.1fg/μl。三次重复实验中，C_T值与DNA量的对数值呈良好的线性关系，线性方程均比较接近，而且R²均高于0.99。

(3)在专属性实验中，掺入人基因组DNA、酵母基因组DNA和大肠杆菌基因组DNA均不会产生非特异性扩增，所以，本方法的专属性很好，能特异性的检测CHO细胞基因组DNA。

实施例2试剂盒的制备

制备包括以下组成成分的试剂盒：

DNA稀释液(5mL/管)1管、Q-PCR预混液(1.5mL/管)1管、IPC试剂(250μl/管)1管、CHO细胞DNA标准品(40μl/管)1管、正向引物(100μl/管)1管、反向引物(100μl/管)1管、Taqman探针(50μl/管)1管、纯水(1mL/管)1管。

CHO细胞DNA标准品，浓度为3.0×10⁷fg/μl。

IPC试剂：每2.5μl的IPC试剂里含有1μl的1fg/μl IPC模板、0.5μl 10μM的IPC-F、0.5μl 10μM的IPC-R、0.5μl5μM的IPC-Probe。

正向引物、反向引物、Taqman探针都是10μM。

DNA稀释液：以去离子水为溶剂，Tris-HCl浓度为10mM/L，EDTA的浓度为0.5mM/L，用NaOH溶液调节pH为8.0。

2×Q-PCR预混液：Q-PCR预混液(2×)。

Claims (10)

1.一种用于检测CHO细胞DNA残留的引物对，其特征在于，所述引物对为采用GenBank登录号为J00052.1的核苷酸序列设计的特异性引物；

优选地，所述引物对为SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物。

2.一种用于检测CHO细胞DNA残留的反应体系，其特征在于，所述反应体系为实时荧光定量PCR反应体系，包含如权利要求1所述的引物对。

3.根据权利要求2所述的反应体系，其特征在于，所述体系还包括采用GenBank登录号为J00052.1的核苷酸序列设计的Taqman探针；

优选地，所述Taqman探针的序列SEQ ID NO:3所示。

4.如权利要求2或3所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系还包括Taq酶、dNTPs、Mg²⁺、PCR缓冲液和DNA模板；

优选地，所述DNA模板为待测样品、阴性质控品或IPC。

5.一种用于检测CHO细胞DNA残留的方法，其特征在于，所述方法为实时荧光定量PCR法，包括使用如权利要求1所述的引物对扩增序列的步骤；

优选地，所述实时荧光定量PCR法使用如权利要求2或3所述的反应体系进行反应。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min，40个循环；根据所获得的标准曲线，计算得到待检样本中CHO细胞DNA的量。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述方法的检测样本为以CHO细胞作为基因工程表达细胞株的生物蛋白，优选地为抗体、治疗性蛋白或疫苗。

8.一种用于检测CHO细胞DNA残留的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR扩增反应液、标准品、阴性质控品、IPC以及DNA稀释液；

其中，所述PCR扩增反应液包括Taq酶、dNTPs、Mg²⁺、PCR缓冲液、引物对以及Taqman探针；所述引物对为采用GenBank登录号为J00052.1的核苷酸序列设计的特异性引物；所述Taqman探针为采用GenBank登录号为J00052.1的核苷酸序列设计的Taqman探针。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对为SEQ IDNO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物。

10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述Taqman探针的序列如SEQ ID NO:3所示。