CN105861463B - 环氧琥珀酸水解酶及其载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种环氧琥珀酸水解酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还设计了含有环氧琥珀酸水解酶的重组质粒以及含有重组质粒的大肠杆菌重组菌，并公开了大肠杆菌重组菌在超声辅助全细胞生产D‑酒石酸中的应用，同时对超声辅助大肠杆菌全细胞催化环氧琥珀酸转化为酒石酸的条件进行了优化。本发明可实现更高的全细胞环氧琥珀酸转化率，节约了时间，超声条件下的全细胞催化稳定性也比振荡条件下要好。

Description

环氧琥珀酸水解酶及其载体和应用

技术领域

本发明涉及基因工程，生物催化领域，更具体的，本发明涉及一种环氧琥珀酸水解酶及其载体和应用。

背景技术

D-酒石酸在医药、食品和化工等方面有着广泛的用途。在医药方面，手性合成的手性源及拆分剂，用于多种产品的合成,如D-葡萄糖-甘油-1,5-内酰胺、D-半乳糖-甘油-1,5-内酰胺等；在化工方面，因为左旋的光学活性，可用作拆分剂；在食品工业方面，D-酒石酸有着比柠檬酸更强的酸味,因此可以用作食品酸味剂,也可以用作稳定剂和防腐剂。具有良好的市场前景。

目前D-酒石酸主要以环氧琥珀酸为原料，采用生物酶法生产。但是不论是通过添加溶菌酶，还是冻融等方法来得到粗酶液，都会耗费时间及金钱，无形中增加了生产成本。如果直接用全细胞催化会减少这一部分的支出，但是直接利用全细胞催化会降低转化效率，所以要找出行之有效的办法来增加全细胞催化的效率。

超声可以产生瞬时空化作用，即使细胞产生瞬时非特异性孔道(临时针孔)，以增加细胞膜通透性，从而可以使底物与酶更充分接触，提高全细胞催化效率。目前这一技术已经应用于粘质沙雷氏菌，乳酸杆菌。目前利用超声辅助大肠杆菌全细胞催化环氧琥珀酸转化为酒石酸还未见报道。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种环氧琥珀酸水解酶。

本发明的第二目的是提供含有上述环氧琥珀酸水解酶的重组质粒。

本发明的第三目的是提供含有上述重组质粒的大肠杆菌重组菌。

本发明的第四目的是提供上述大肠杆菌重组菌的应用。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一种环氧琥珀酸水解酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

二、含有上述的环氧琥珀酸水解酶的重组质粒。

三、含有上述的重组质粒的大肠杆菌重组菌。

四、上述的大肠杆菌重组菌在超声辅助全细胞生产D-酒石酸中的应用。

进一步的，利用超声辅助大肠杆菌全细胞催化环氧琥珀酸转化为酒石酸，其催化时间为10 min ~ 60 min，催化功率为60 W ~ 100 W，底物浓度为60g/L ~ 180g/L，菌体浓度为5mg/ml ~ 12.5mg/ml。

作为本发明的进一步优化，所述的催化时间为20 min。

作为本发明的进一步优化，所述的催化功率为70 W。

作为本发明的进一步优化，所述的底物浓度为100g/L。

作为本发明的进一步优化，所述的菌体浓度为7.5mg/ml。

作为本发明的进一步优化，利用超声辅助大肠杆菌全细胞催化环氧琥珀酸转化为酒石酸，其催化时间为20 min，催化功率为70 W，底物浓度为100g/L，菌体浓度为7.5mg/ml。

具体如下：

1、获得环氧琥珀酸水解酶基因，具体步骤为：

（1）土壤样品采自南京工业大学东操场边上小花园附近；

（2）土壤总DNA的提取：称取1g 土壤样品, 加入1ml 0.1mol ml、pH 8.0 磷酸缓冲液、玻璃珠，振荡1min，加入溶菌酶2.5mg ml，室温振荡15min，放置冰箱30min，加125μl 20%SDS 振荡处理15min 后离心，加酚(1∶1 体积)抽提1 次，氯仿-异戊醇(1∶1 体积)抽提2次，加0 .6 体积异丙醇，室温放置1h，离心，70 %乙醇清洗，30μl TE 溶解；

（3）引物的设计与合成：根据GenBank 中Bordetella sp. BK-52 菌株的CESH基因设计PCR引物，引物序列如下：

P1: 5’- ATGGGTCGCGGATCCATGACTCGAACCAAGTTGAT-3’（SEQ ID NO.2）

P2:5’-CTCGAATTCGGATCC TTAGTTGCTAATACCCAGAATTTCC-3’ （SEQ ID NO.3）

（4）CESH基因的扩增：以土壤总DNA 为模板，以P1、P2 为引物，对

CESH基因进行扩增。

2、以E. coli BL21为宿主菌，构建含有环氧琥珀酸水解酶（CESH）的重组菌，具体步骤为：

（1）利用酶切线性化质粒pet-28a，酶切产物经1%的琼脂糖电泳后，用凝胶回收试剂盒回收线性化质粒片段。将回收得到的基因片段与质粒片段，利用一步克隆体系连接，得到连接产物；

（2）将上述连接产物利用Cacl₂转化法转化E. coli DH5α，挑取阳性克隆，提取重组质粒进行下一步实验；

（3）将上述得到的重组质粒转化E. coli BL21，经PCR和双酶切筛选，得到阳性克隆,测序。

3、酶的诱导表达，具体步骤为：

（1）挑取测序结果正确的阳性克隆于LB培养基中（酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl为5g/L），培养OD₆₀₀达到0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），诱导20h；

（2）离心收集菌体，0.1M磷酸缓冲液（PBS）洗涤三次，超声破碎得到粗酶液，经过SDS-PAGE检测，发现有蛋白表达，且大部分为可溶性表达；

（3）将离心收集的菌体及超声破碎得到的粗酶液与环氧琥珀酸反应，利用偏钒酸铵法进行检测，发现显色明显，CESH表达成功。

4、考察超声辅助是否能提高本文构建的重组菌全细胞催化效率，具体步骤为：

（1）采用LB培养基（酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L），按1%v/v接种量从冻存管接入试管中，有氧培养10～12h，进一步按1%（v/v）接种量接种至摇瓶（培养基也为LB），培养菌体OD₆₀₀至0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，诱导20h；

（2）离心收集0.2g湿细胞，用40ml，pH6.8, 80g/L的环氧琥珀酸一钠溶液重悬。将反应体系置于振荡以及超声条件下进行反应，每隔10min取一次样，每组反应做三个平行样。

（3）酶活定义为每生成1mmol的酒石酸所需要的湿细胞的量，酒石酸的含量用偏钒酸铵显色法进行测定。

5、考察振荡反应条件及超声反应条件的催化稳定性，具体步骤为：

（1）采用LB培养基（酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl为5g/L），按1%v/v）接种量从冻存管接入试管中，有氧培养10～12h，进一步按1%（v/v）接种量接种至摇瓶（培养基也为LB），培养菌体OD₆₀₀至0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，诱导20h；

（2）离心收集0.08g湿细胞，用5ml，pH6.8, 80g/L的环氧琥珀酸一钠溶液重悬。将反应体系置于振荡以及超声条件下进行反应，每次反应结束换新鲜的底物，进行6个批次反应，每组反应做三个平行样。

（3）酶活定义为每生成1mmol的酒石酸所需要的湿细胞的量，酒石酸的含量用偏钒酸铵显色法进行测定。

6、优化超声辅助反应条件，具体步骤为：

（1）采用LB培养基（酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl为5g/L），按1%v/v）接种量从冻存管接入试管中，有氧培养10～12h，进一步按1%（v/v）接种量接种至摇瓶（培养基也为LB），培养菌体OD₆₀₀至0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，诱导20h；

（2）对以下四个因素进行探索，分别为反应时间（10min-60min），底物浓度（60g/L-180g/L），菌体浓度（5mg/ml-12.5mg/ml）及超声功率（60W-100W）。

（3）酶活定义为每生成1mmol的酒石酸所需要的湿细胞的量，酒石酸的含量用偏钒酸铵显色法进行测定。

采用上述技术方案的积极效果：（1）可实现更高的全细胞环氧琥珀酸转化率，节约了时间，且较优超声反应条件是超声功率70W，超声时间20min，菌体浓度，7.5mg/ml，底物浓度100g/L；（2）超声条件下的全细胞催化稳定性也比振荡条件下要好，在超声功率为100W的条件下，反应20min时，超声辅助反应转化率已经达56.71%，而振荡条件还检测不到酒石酸的产生，并且经过6批反应之后，振荡条件下的酶活有所降低，而超声辅助反应的酶活依然可以保持在一个比较高的水平。

附图说明

图1是单酶切质粒验证凝胶电泳图；

图2是蛋白电泳图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：

实施例1

本实施例说明环氧琥珀酸水解酶基因的获得。

以土壤总DNA为模板，以GenBank 中Bordetella sp. BK-52 菌株的CESH基因设计PCR引物，经过PCR反应扩增得到目的片段。PCR扩增体系为：合成得到的DNA 1 µL，引物Primer 1和Primer 2各1 µL，dNTP 4 µL，5×Primer star缓冲液10 µL，Primer star聚合酶0.5 µL，ddH₂O 37.5µL。PCR反应程序为：95℃预变性5 min，94℃变性30 s；然后52℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环30次；72℃延伸10 min。将扩增条带切胶后用柱式割胶回收试剂盒回收。

实施例2

本实施例说明重组大肠杆菌的构建。

质粒pet-28a用BamHI酶切。酶切体系为：质粒80 µL，BamHI 5 µL，10×缓冲液25 µL，ddH₂O 140 µL，总体积250 µL。将酶切体系切胶后用柱式割胶回收试剂盒回收。

经胶回收的PCR片段和质粒进行连接。连接反应体系为：PCR产物1 µL，酶切质粒3µL，一步克隆Pro连接酶2 µL ，5×连接酶缓冲液4 µL，ddH₂O10µL，总体积20 µL。连接得到重组质粒pet-28a-CESH。

将上述连接体系pet-28a-CESH于200 µL感受态细胞中，冰浴30 min，42℃水浴热激90秒，快速置于冰上1~3分钟。加入新鲜的LB液体培养基800 µL，于37℃振荡培养1h，取200 µL菌体涂布于LB固体培养基表面，37℃培养12-16 h。将阳性菌落接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中培养并提取质粒，对重组质粒进行单双酶切鉴定，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定（如图1）。经电泳结果证明，该阳性克隆菌落含有DNA片段插入质粒，即构建完成含纤环氧琥珀酸水解酶基因的重组大肠杆菌。

实施例3

本实施例说明环氧琥珀酸水解酶的诱导表达。

将构建的重组大肠杆菌E. coli BL21接种于5 ml添加了卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃过夜培养；再以1%接种量转接100 ml含卡那霉素的LB培养基，发酵培养2~4小时至OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入终浓度0.1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）继续诱导表达20 h。结果如图2。

实施例4

本实施例说明粗酶液酶活的测定。

取5ml发酵液，离心，收集菌体。同等体积0.1M PBS洗涤三次，称湿重。5ml，pH 6.8，100g/L环氧琥珀酸一钠重悬菌体，超声破碎10min，离心取上清。置于37℃摇床，反应1h。利用偏钒酸铵显色法测定酒石酸的量，显色体系：1ml 1M硫酸，2.5 ml 1%偏钒酸铵，加适量反应液，摇匀，室温显色5min，产生的红色物质在波长480nm处有特殊吸收，将分光光度计读数带入标准曲线得到酒石酸的量。酶活定义：每小时生产1mmol的酒石酸所需要的湿细胞的量定义为1U。最后测得的粗酶液的酶活为32.48 U/g湿细胞。

实施例5

本实施例说明全细胞酶活的测定。

取5ml发酵液，离心，收集菌体。同等体积0.1M PBS洗涤三次，称湿重。5ml，pH 6.8，100g/L环氧琥珀酸一钠重悬菌体，置于37℃摇床，反应1h。利用偏钒酸铵显色法测定酒石酸的量。最后测得的全细胞酶活为7.22U/g湿细胞。

实施例6

本实施例说明超声辅助反应及振荡条件反应在不同时间的对比。

取20ml发酵液，离心，收集菌体。同等体积0.1M PBS洗涤三次，称湿重。20ml，pH6.8，100g/L环氧琥珀酸一钠重悬菌体，置于37℃摇床，每10min取一次样。还有一组同样的反应体系，置于超声清洗器中反应，也是每隔10min取一次样。利用偏钒酸铵显色法测定酒石酸的量。

结果表明，超声辅助反应在20min时，可以转化55.61%的底物，此时振荡条件下检测不到酒石酸的产生。1h后，超声辅助反应的转化率为70.77%，振荡条件反应的转化率为26.3%。

实施例7

本实施例说明重组大肠杆菌的全细胞催化稳定性实验。

取反应结束的发酵液离心收集菌体，用同样量的底物，将菌体重悬，进行第二轮转化反应，反应结束后测发酵液的酶活，如此循环，分别测定2、3、4、5、6个周期后发酵液的酶活。发现酶活振荡条件下的酶活有所降低，而超声条件下一直能保持一个较高的水平，说明超声辅助反应的催化稳定性良好。具体数据为：振荡条件下，第一批的酶活为9.22 U/g，而第六批的酶活为5.90 U/g，为初始酶活的63.99%；超声条件下，第一批酶活为21.26 U/g,而第六批酶活为59.63 U/g。超声辅助反应的催化稳定性良好。

实施例8

本实施例说明超声辅助反应条件探索。

对底物浓度，反应时间，菌体浓度及超声功率进行研究。发现较优条件如下：底物浓度100g/L，反应时间20min，菌体浓度7.5mg/ml和超声功率70W。

（1）酶活随着底物浓度的增大而增大，但是当底物浓度达到100g/L时转化率最高，并且之后酶活的增幅较小，即100g/L是本施例较优条件；

（2）酶活随着反应时间先增大后减小，所以选择酶活最高时的时间为本施例较优条件，即20min;

（3）酶活随着菌体量增加而增大直至平稳，所以选择酶活变平稳时的菌体浓度为本施例较优条件，即7.5mg/ml；

（4）酶活随着菌体量增加而增大后减小，所以选择酶活最高时的功率为本施例较优条件，即70W。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 环氧琥珀酸水解酶及其载体和应用

<130> xb16041201

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 885

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 环氧琥珀酸酶

<400> 1

atgactcgaa ccaagttgat acttgaagct cgtataaatg aatatatgcc gcgtcgcggt 60

aatgctcatg tgccatggac gccaaaggaa atcggtgagg ctgcggcaca ggcacgggag 120

gcgggtgcat cgattgtcca tttccatgcc cgtcaagctg acggttctcc cagccatgac 180

tatgaaactt atgcagaatc gatccgtgag attcgcgcac gcagtgacgt tctagtacat 240

ccgacactgg gccagatcac gcttggaggg agggaatcac gcctggcaca cattgagcga 300

ctgtgccttg acccagcact aaaaccggac tttgcaccgg tagacctggg tagcacgaac 360

atcgatcgtt atgacgatgt ggagaagcga tacgagacag gcgaccgcgt gtacttgaac 420

aacatcgaca cgctgcagca cttcagcaag agactacgag aactcggtgt taagcctgcg 480

tttatcgctt ggacggtccc cttcacccga acacttgacg cctttatgga tatggggttg 540

gtcgacgacc cggcatatct gctgtttgag ctcaccgact gcggcattcg cggtggacat 600

ccaggaacga tacgggggct gcgtgcacat accgacttcc tgccacccgg acgacagatc 660

caatggaccg tctgcaacaa gatcggcaac ctatttggcc ctgctgctgc ggccatcgag 720

gaaggaggac atgtcgcaat tggcctaggc gattacctct atccggaatt gggtacaccc 780

accaatgggg aagtcgttca gaccgtagcg aatatggcac gtgcgatggg tcgtgaaatt 840

gcaacgccag cagagacaaa ggaaattctg ggtattacta actaa 885

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P1

<400> 2

atgggtcgcg gatccatgac tcgaaccaag ttgat 35

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P2

<400> 3

ctcgaattcg gatccttagt tgctaatacc cagaatttcc 40

Claims (6)

1.大肠杆菌重组菌在超声辅助全细胞生产D-酒石酸中的应用，其特征在于，利用超声辅助大肠杆菌全细胞催化环氧琥珀酸转化为酒石酸，其催化时间为10min～60min，催化功率为60 W～100 W，底物浓度为60g/L～180g/L，菌体浓度为5mg/ml～12.5mg/ml；

所述大肠杆菌重组菌包含具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的环氧琥珀酸水解酶。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的催化时间为20min。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的催化功率为70 W。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的底物浓度为100g/L。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的菌体浓度为7.5mg/ml。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用超声辅助大肠杆菌全细胞催化环氧琥珀酸转化为酒石酸，其催化时间为20min，催化功率为70 W，底物浓度为100g/L，菌体浓度为7.5mg/ml。