CN105861235B - 一种降低浓香型白酒酒醅中尿素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种降低浓香型白酒酒醅中尿素的方法，属于微生物生产利用领域。本发明在白酒酒醅入窖池发酵之前加入罗伊氏乳杆菌或其粗酶液，酒醅中EC的重要前体物质尿素的含量减少了100％，而未加入菌株、未加酶液或者加入腐生葡萄球菌或其酶液，则基本没有效果。本发明采用的罗伊氏乳杆菌是食品安全菌，应用到酒醅中不会产生其它有害物质。本发明提供的方法具有良好的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种降低浓香型白酒酒醅中尿素的方法，属于微生物生产利用领域。
背景技术
氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)被世界卫生组织归为2A类致癌物质，与丙烯胺同等危险。它能够导致肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等严重性肿瘤疾病。氨基甲酸乙酯广泛存在于传统发酵食品中，包括酒类、酱油等食品。此前检测到中国白酒中含有氨基甲酸乙酯，长期过量饮用会增加致癌几率。而国内对白酒中氨基甲酸乙酯的降低方法未见报道。我国是白酒消费大国，消耗量巨大，人们日常饮用量较大，次数较多。白酒中中氨基甲酸乙酯前体物质主要有乙醇、瓜氨酸、尿素。对中国江苏一家白酒厂的浓香型白酒研究结果表明：入窖酒醅中尿素含量为20-30mg/kg，粮食原料中也会带有尿素，含量为51.5mg/kg。基于国人的健康考虑，及早地开展研究，降低白酒酒醅中尿素，减少健康隐患，势在必行。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种降低白酒酒醅中氨基甲酸乙酯前体物质尿素的方法，是在酒醅入窖发酵之前加入罗伊氏乳杆菌和/或罗伊氏乳杆菌所产的脲酶，降低白酒酒醅中尿素的含量。
在本发明的一种实施方式中，所述罗伊氏乳杆菌是在酒醅入窖发酵之前加入，使酒醅中罗伊氏乳杆菌的浓度达到107～108CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述罗伊氏乳杆菌所产的脲酶是以粗酶液的形式在酒醅入窖发酵之前加入，使酶活达到是0.19U/g。
在本发明的一种实施方式中，所述罗伊氏乳杆菌选用Lactobacillus reuteri，购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC6124。
在本发明的一种实施方式中，所述白酒可以是浓香型白酒。
在本发明的一种实施方式中，所述方法的具体步骤为：(1)菌种活化；(2)粗酶液制备：将培养好的菌液用洗涤悬浮，破壁，收集破壁液上清中的粗酶液；(3)发酵：取入窖大茬酒醅，加入菌液或的粗酶液，发酵酿酒。
在本发明的一种实施方式中，所述方法的具体步骤为：(1)菌种活化：罗伊氏乳杆菌接入MRS培养基，30℃厌氧培养72h；(2)粗酶液制备：将培养好的菌液用20mM，pH7.0的PBS缓冲液洗涤悬浮，加入直径0.1mm的玻璃珠，进行机械破碎，10000rpm离心10分钟，取上清液，即为粗酶液；(3)发酵：取入窖大茬酒醅，加入用生理盐水悬浮的菌液或制备好的粗酶液，搅拌均匀，30℃厌氧发酵15天。
本发明在白酒酒醅入窖池发酵之前加入罗伊氏乳杆菌或其粗酶液，酒醅中EC的重要前体物质尿素的含量减少了100％，而未加入菌株、未加酶液或者加入腐生葡萄球菌或其酶液，则基本没有效果。本发明采用的罗伊氏乳杆菌是食品安全菌，应用到酒醅中不会产生其它有害物质。
附图说明
图1单菌株和商品脲酶对酒醅中尿素的降解效果；A不添加罗伊氏乳杆菌或腐生葡萄球菌及其菌液的对照组的起始状态；B不添加罗伊氏乳杆菌或腐生葡萄球菌及其菌液的对照组的发酵终了状态；C罗伊氏乳杆菌；D腐生葡萄球菌M3；E腐生葡萄球菌M26；F腐生葡萄球菌M39；G商品脲酶。
图2不同粗酶液和商品脲酶对酒醅中尿素的降解效果；A不添加罗伊氏乳杆菌或腐生葡萄球菌及其菌液的对照组的起始状态；B不添加罗伊氏乳杆菌或腐生葡萄球菌及其菌液的对照组的发酵终了状态；C罗伊氏乳杆菌；D腐生葡萄球菌M3；E腐生葡萄球菌M26；F腐生葡萄球菌M39；G商品脲酶。
具体实施方式
脲酶活性检测方法：
测量所需试剂：
显色剂I：将30g苯酚和1.25g亚硝基铁氰化钠溶于超纯水，定容至500mL。
显色剂II：将26.25g氢氧化钠和15mL次氯酸钠溶于超纯水，定容至500mL。
终止剂：称取50g三氯乙酸溶于超纯水，定容至500mL。
酶活定义：在常压、37℃、pH 7.0的条件下，每分钟分解尿素生成1μmol氨为一个酶活力单位(U)。
测定原理：脲酶降解尿素生成二氧化碳和NH3，根据NH3与苯酚-次氯酸钠的显色反应，于分光光度计625nm处测量OD值，根据NH3的生成量计算酶活。
测量方法：取1mL粗酶液和1mL超纯水，各加入1mL 4％的尿素溶液。37℃恒温水浴反应15min后加入1mL 10％三氯乙酸终止反应，震荡混匀。加入1mL的显色剂I和显色剂II，混匀后于37℃水浴20min。显色反应结束后用超纯水稀释至10mL，于分光光度计625nm处测定吸光值。
酶活计算公式：
式中ΔOD625为样品与空白对照吸光值之差，n为酶液稀释倍数，k为标准曲线斜率倒数，15为反应的时间(min)。
白酒酒醅中尿素含量的检测：
样品处理：取发酵后酒醅20g，用30mL超纯水溶解，超声30min，离心，取上清液400μl，加入600μl 0.02mol/L占顿醇，再加入100μl1.5mol/L HCl，避光反应30min。反应后样品过0.22um滤头过滤后进样检测。
检测条件：安捷伦液相色谱仪Agilent 1260(美国安捷伦公司)；分析方法：采用占顿醇在酸性避光条件下与尿素发生衍生化反应，通过FLD检测衍生化产物，得到尿素含量。色谱柱：Gemini-NX 5u C18110A(250×4.6mm)，柱温：35℃；流速：1.0ml/min；荧光检测器：λex＝213nm，λem＝308nm。流动相A相：称取1.640g无水乙酸钠于1000mL烧杯中，加入1000mL超纯水溶解，将pH调至7.20，过0.22μm水系滤膜，超声15min备用；流动相B：纯乙腈(HPLC)；流动相C：取500mL超纯水过0.22μm水系滤膜，备用。梯度洗脱程序见表1。
表1流动相之间的比例及时间
实施例1白酒酿制流程
五粮(大米、糯米、玉米、小麦、高粱，比例为24:18:10:11:17)加水润料后，加入出窖大茬酒醅，混匀后入甑蒸馏出酒，摊晾，加水(90℃)，待温度降至常温(18～19℃)，拌入大曲，同时分别加入腐生葡萄球菌、罗伊氏乳杆菌或者粗酶液或者商品脲酶(商品脲酶购买自生物工程(上海)股份有限公司，编号A003885，生产厂家Worthington BiotecnicalCorperation)，腐生葡萄球菌接种量为107～108CFU/g，罗伊氏乳杆菌接种量为107～108CFU/g，腐生葡萄球菌的酶液加入量为43.9～45.6U/g，罗伊氏乳杆菌的酶液加入量为0.19U/g，商品脲酶的加入量为0.19U/g。以不加菌株或酶为对照，设置3个平行样，每个质量100g。控温30℃，厌氧发酵70天，取发酵15天样品测定尿素含量。
实施例2白酒酒醅中尿素含量与加入不同菌株的关系
(1)腐生葡萄球菌和罗伊氏乳杆菌浓菌液准备
3株腐生葡萄球菌(腐生葡萄球菌从白酒大曲中筛选，分别是Staphylococcussaprophyticus strain M3、Staphylococcus saprophyticus strain M26、Staphylococcus saprophyticus strain M39)接入发酵培养基(pH6.8)，30℃220rpm摇床培养24h，离心收集菌体，用0.9％的生理盐水悬浮配制腐生葡萄球菌浓菌液(109～1010CFU/mL)。罗伊氏乳杆菌接入MRS培养基(pH自然)，厌氧培养3d，离心收集菌体，用0.9％生理盐水悬浮配制罗伊氏乳杆菌浓菌液(109～1010CFU/mL)。
(2)将浓菌液加入入窖酒醅
在酒醅入窖之前分别将3株腐生葡萄球菌和罗伊氏乳杆菌浓菌液加入酒醅，每100g酒醅加40mL，搅拌均匀，以不加菌液为对照，每组3个平行，30℃厌氧发酵15d。每种添加方式酒醅中尿素含量取3个平行的平均值。
(3)酒醅中尿素含量的检测
不同菌株对酒醅中氨基甲酸乙酯前体尿素的含量影响如图1，发酵起始时尿素含量为21.13mg/kg，分别添加三株腐生葡萄球菌、罗伊氏乳杆菌、商品脲酶进行厌氧发酵15天后，不添加菌株的酒醅中尿素含量为21.13mg/kg，添加腐生葡萄球菌的酒醅中尿素含量分别为21.13mg/kg、24.02mg/kg，22.09mg/kg，没有明显效果；添加商品脲酶的酒醅中尿素含量为20.60mg/kg，没有明显效果；添加罗伊氏乳杆菌的酒醅中尿素含量降为0mg/kg，效果显著。
实施例3白酒酒醅中尿素含量与加入不同粗酶液的关系
(1)腐生葡萄球菌和罗伊氏乳杆菌粗酶液制备
腐生葡萄球菌接入50mL发酵培养基(pH6.8)，30℃220rpm摇床培养24h，离心收集菌体，用PBS缓冲液(pH7.0)洗涤菌体3次，悬浮至30mL，加入0.1mm玻璃珠，用FastPrep细胞破碎仪进行机械破碎80s，用低温冷冻离心机10000rpm，4℃离心10min，获取上清液，酶活为153.9～159.5U/mL。罗伊氏乳杆菌接入200mL MRS培养基，30℃厌氧培养3d，离心收集菌体，用PBS缓冲液(pH7.0)洗涤菌体3次，悬浮至80mL，加入0.1mm玻璃珠，用FastPrep细胞破碎仪进行机械破碎100s，用低温冷冻离心机10000rpm，4℃离心10min，获取上清液，酶活为0.6537U/mL。
(2)将粗酶液加入入窖酒醅
在酒醅入窖之前分别将3株腐生葡萄球菌和罗伊氏乳杆菌的粗酶液加入酒醅，每100g酒醅加40mL，搅拌均匀，以不加菌液为对照，每组3个平行，30℃厌氧发酵15d。每种添加方式酒醅中尿素含量取3个平行的平均值。
(3)酒醅中尿素含量检测
不同菌株粗酶液对酒醅中氨基甲酸乙酯前体尿素的含量影响如图2，发酵起始时尿素含量为21.13mg/kg，分别加入三株腐生葡萄球菌、罗伊氏乳杆菌的粗酶液以及商品脲酶进行厌氧发酵15天后，不添加粗酶液的酒醅中尿素含量为22.09mg/kg；添加腐生葡萄球菌粗酶液的酒醅中尿素含量分别为21.13mg/kg、22.09mg/kg、22.09mg/kg，无明显效果；添加商品脲酶的酒醅中尿素含量为20.60mg/kg，没有明显效果；添加罗伊氏乳杆菌粗酶液的酒醅中尿素含量降为0mg/kg，效果显著。
从上述结果可以看出，虽然来源于白酒大曲的腐生葡萄球菌产生的粗酶液的活力远高于罗伊氏乳杆菌的，但是将两菌或其所产粗酶液分别添加到酒醅中进行发酵时，腐生葡萄球菌或其产生的粗酶液能够发挥的效果可以忽略不计，而罗伊氏乳杆菌却能彻底去除尿素。原因可能是，体外测定脲酶活力的条件下，腐生葡萄球菌的脲酶活力保持在较高的水平，而在白酒酿造那个菌种复杂的条件下，腐生葡萄球菌的脲酶不能发挥其活性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (3)
1.一种降低白酒酒醅中尿素含量的方法，其特征在于，是在酒醅入窖发酵之前加入罗伊氏乳杆菌，使酒醅中罗伊氏乳杆菌的浓度达到107～108 CFU/g；所述方法包括以下步骤：(1)菌种活化：罗伊氏乳杆菌接入MRS培养基，30℃厌氧培养72h；(2)发酵：取入窖大茬酒醅，加入菌液，30℃厌氧发酵15天，
所述罗伊氏乳杆菌选用Lactobacillus reuteri，购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC6124。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤为：(1)菌种活化：罗伊氏乳杆菌接入MRS培养基，30℃厌氧培养72h；(2)发酵：取入窖大茬酒醅，加入用生理盐水悬浮的菌液，搅拌均匀，30℃厌氧发酵15天。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白酒是浓香型白酒。
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