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CN105829542A - 改进的重组多肽生产方法 - Google Patents

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CN105829542A
CN105829542A CN201480069054.1A CN201480069054A CN105829542A CN 105829542 A CN105829542 A CN 105829542A CN 201480069054 A CN201480069054 A CN 201480069054A CN 105829542 A CN105829542 A CN 105829542A
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polypeptide
bdnf
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fusion
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CN201480069054.1A
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E·科佩特茨基
J·尼韦纳
P·迈尔
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HOFFMANN LA ROCHE
Original Assignee
HOFFMANN LA ROCHE
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Abstract

本文报道了用于产生融合多肽的方法，包括以下步骤：a)培养包含编码变体融合多肽的核酸的哺乳动物细胞，其中融合多肽的氨基酸序列已通过在原?融合多肽中将原?肽和融合多肽之间的内源性蛋白酶切割位点替换为外源性(相对于融合多肽的部分的来源)或人工蛋白酶切割位点而被修饰，和b)从细胞或培养基中回收融合多肽或融合原?多肽，并由此产生(重组的)融合多肽。

Description

改进的重组多肽生产方法
除其他事项外，本文报道了用于增加具有生物活性的重组生产的多肽的产量的方法。
发明背景
现今，大多数生物药物在动物(哺乳动物)细胞中生产，这类细胞通常以高效率、高品质且具有适当的翻译后(二次)修饰(如，举例来说，糖基化)地将感兴趣的重组多肽分泌到培养基中。然而，一些融合多肽，特别是复杂的融合多肽，具有低溶解性或折叠困难的多肽，以及与表达它的细胞相互作用的多肽往往以非常低的产量获得。
例如，抗体通常以生物活性形式在哺乳动物细胞中高效表达。然而，包含抗体的融合多肽(例如，绿色荧光蛋白(GFP)抗体缀合物)根本不表达和/或分泌，尽管这类蛋白质对于实验和诊断方法来说是高度感兴趣的(参见，例如，WO 2011/135040)。
在某些难以表达的情况下，多肽可以生产为可溶性的、分泌的、无活性前体蛋白(例如所谓的酶原，在蛋白酶的情况下)，随后可以在体外使其成熟，例如通过蛋白水解活化。在其它情况下，对特定的宿主细胞有害的多肽可以表达为细胞内的无活性不溶的蛋白质聚集体(包涵体(IB))，并随后在体外重折叠。然而，原-多肽(pro-polypeptides)的加工可能是困难的或者根本不可能。此外，所获得的成熟多肽不包含所有的翻译后修饰。
低表达多肽的例子是神经营养因子，如NGF、BDNF、GDNF和NT-3(参见，例如，Xia,Ch.-F.,J.Gene Med.10(2008)306-315；Boado,R.J.,Pharm.Res.24(2007)1772-1787；Negro,A.等人,J.Neurochem.62(1994)471-478)。
在WO 2008/005847中报道了一种通过重组方法生产因子viii蛋白的方法。在WO02/02597中报道了肽延伸糖基化多肽。在WO 2007/044323中报道了用于血脑屏障递送的融合蛋白。在WO 00/64482中报道了神经细胞生长调节剂(amphibodies)。在WO 2012/087835中报道了用于增强蛋白质折叠的组合物和方法。在WO 2006/131013中报道了抑制TNF-α的稳定和可溶的抗体。在WO 00/23473中报道了干扰素-β融合蛋白及用途。
发明概述
本文报道了用于改进重组生产多肽的生产过程的方法。
改进可以是例如增加的产量，更强健的生产过程，更简单的方法，和/或下游处理过程中降低的复杂性。
必须指出的是，实现该改进而不损害多肽的生物物理和/或生物化学特性和/或生物学功能。在某些情况下，这些特性中的一种或多种甚至得到改善。
在本文所报道的第一个方面中，已经发现，通过引入一个或多个糖基化位点，哺乳动物细胞中的多肽重组生产可以得到改进。
如本文所报道的一个方面是使用变体多肽产生重组多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
-培养包含编码变体多肽的核酸的哺乳动物细胞，其中多肽的氨基酸序列已经通过以下而被修饰：i)位于表面的氨基酸残基的一个或多个突变，其导致变体多肽与多肽相比具有较低的等电点，和/或ii)将融合多肽的两个多肽连接起来的接头肽，和/或iii)包含导致多肽具有较低的等电点的氨基酸的N-末端或C-末端融合的标签，
-从细胞或培养基中回收重组变体多肽，并由此产生重组多肽。
因此，本文报道了使用变体多肽产生重组多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
-培养包含编码变体多肽的核酸的真核细胞(在一个实施方案中是哺乳动物细胞)，其中多肽的氨基酸序列已被修饰以包含一个或多个人工糖基化位点，
-从细胞或培养基中回收变体重组多肽，并由此产生重组多肽。
如本文所报道的一个方面是使用变体多肽产生重组多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
-提供编码多肽的核酸，
-修饰核酸以编码变体多肽，其中多肽的氨基酸序列已被修饰以包含一个或多个人工糖基化位点，
-将核酸引入真核细胞(在一个实施方案中是哺乳动物细胞)中，
-培养真核细胞，以及
-从细胞或培养基中回收变体重组多肽，并由此产生重组多肽。
如本文所报道的方法特别适合例如在哺乳动物细胞中表达/分泌很差或完全不表达/分泌的多肽。
引入的一个或多个糖基化位点可以(彼此独立地位于)在多肽本身之中，或者位于将融合多肽的两个多肽连接起来的接头肽中，或者它可以是特定的糖基化标签。
在一个实施方案中，多肽包含糖基化标签。
在一个实施方案中，多肽包含人工糖基化位点。在一个实施方案中，人工糖基化位点通过位于表面的氨基酸的点突变引入。
在第二个方面，本文报道了，已发现通过在原-多肽中将原-区段和成熟多肽之间的内源性蛋白酶切割位点替换为外源性(相对于多肽的来源)或人工蛋白酶切割位点，成熟多肽的产量可以得到提高。这种变化改善了将原-多肽加工为成熟形式。
因此，如本文所报道的一个方面是使用变体原-多肽产生重组多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
-培养包含编码多肽为原-多肽(原-区段和多肽的融合多肽)的核酸的真核细胞(在一个实施方案中是哺乳动物细胞)，其中原-区段和多肽之间的内源性酶促切割位点被替换为外源性蛋白酶切割位点，
-从细胞或培养基中回收重组变体多肽或变体原-多肽，并由此产生重组多肽。
如本文所报道的一个方面是使用变体原-多肽产生重组多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
-提供编码多肽为原-多肽(原-区段和多肽的融合多肽)的核酸，
-修饰核酸以编码变体原-多肽，其中原-区段和多肽之间的内源性酶促切割位点被替换为外源性蛋白酶切割位点，
-将核酸引入真核细胞(在一个实施方案中是哺乳动物细胞)中，
-培养真核细胞，以及
-从细胞或培养基中回收重组变体多肽或变体原-多肽，并由此产生重组多肽。
在一个实施方案中，外源性蛋白酶切割位点选自包括血纤维蛋白溶酶切割位点、弗林蛋白酶切割位点、IgA蛋白酶切割位点、TEV蛋白酶切割位点(烟草蚀纹病毒)、颗粒酶B切割位点、凝血酶切割位点、因子10切割位点、肠激酶切割位点、枯草杆菌蛋白酶切割位点、组织蛋白酶切割位点、金属蛋白酶切割位点、IDES蛋白酶切割位点PreScission蛋白酶切割位点或它们的功能性变体的组。在一个实施方案中，外源性蛋白酶切割位点是IgA蛋白酶切割位点。
在一个实施方案中，原-多肽的切割位于培养基中。在一个实施方案中，能够切割外源性蛋白酶切割位点的外源性蛋白酶被加入到培养基中。在一个实施方案中，所述加入是在培养阶段期间。在一个实施方案中，所述加入是在培养阶段之后。
在一个实施方案中，由表达原-多肽的细胞共表达外源性蛋白酶。
在一个实施方案中，培养是共培养表达原-多肽的细胞和表达外源性蛋白酶的细胞。
在一个实施方案中，切割是在从培养基分离细胞之后。在一个实施方案中，切割是在下游处理期间。在一个实施方案中，切割在层析柱上进行。
在第三个方面，本文报道了，已发现伴随着降低多肽的等电点，多肽在哺乳动物细胞中的重组生产可以得到改善。
因此，如本文所报道的一个方面是使用变体多肽产生重组多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
-培养包含编码变体多肽的核酸的真核细胞(在一个实施方案中是哺乳动物细胞)，其中多肽的氨基酸序列已通过位于表面的氨基酸残基的一个或多个突变而被修饰，所述修饰导致变体多肽与多肽相比具有较低的等电点，
-从细胞或培养基中回收重组变体多肽，并由此产生重组多肽。
如本文所报道的一个方面是使用变体多肽产生重组多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
-提供编码多肽的核酸，
-修饰核酸以编码变体多肽，其中多肽的氨基酸序列已通过位于表面的氨基酸残基的一个或多个突变而被修饰，所述修饰导致变体多肽与多肽相比具有较低的等电点，
-将核酸引入真核细胞中(在一个实施方案中是哺乳动物细胞)，
-培养真核细胞，以及
-从细胞或培养基中回收重组变体多肽，并由此产生重组多肽。
在一个实施方案中，多肽具有高于9的等电点(高等电点，碱性等电点)并且变体多肽具有与(亲本/野生型)多肽相比低0.5或更多pH单位(更酸性)的等电点。
在一个实施方案中，多肽是神经营养蛋白/神经营养因子。
在一个实施方案中，通过引入带负电荷的部分降低等电点。
在一个实施方案中，带负电荷的部分是接头肽。
在一个实施方案中，带负电荷的部分是位于表面的氨基酸残基。在一个实施方案中，一个或多个碱性氨基酸残基被替换为一个或多个中性亲水性氨基酸残基和/或一个或多个酸性氨基酸残基或它们的组合。
在第四个方面，本文报道了，已发现通过调节接头肽的长度和连接性，可以改进真核细胞(如，举例来说，哺乳动物细胞)中的融合多肽的重组生产。
因此，如本文所报道的一个方面是用于产生(重组的)融合多肽的方法，包括以下步骤：
-培养包含编码融合多肽的核酸的真核细胞(在一个实施方案中是哺乳动物细胞)，
-从细胞或培养基中回收(重组的)融合多肽，并由此产生(重组的)融合多肽。
在一个实施方案中，融合多肽的一部分是神经营养蛋白，并且，融合多肽的另一部分是抗体或抗体片段。
在第五个方面，本文报道了，已发现
i)通过引入一个或多个糖基化位点，和/或
ii)通过在原-多肽中将原-区段和多肽之间的内源性蛋白酶切割位点替换为外源性(相对于融合多肽的部分的来源)或人工蛋白酶切割位点，和/或
iii)通过降低多肽的等电点，和/或
iv)通过调节接头肽的长度、连接性和电荷，
多肽在哺乳动物细胞中的重组生产可以得到改善。
因此，如本文所报道的一个方面是用于产生(重组的)(融合)多肽的方法，其包括以下步骤：
-培养包含编码变体(融合)多肽的核酸的真核细胞(在一个实施方案中是哺乳动物细胞)，其中(融合)多肽的氨基酸序列已被如下修饰
i)通过引入一个或多个人工糖基化位点，和/或
ii)通过在原-(融合)多肽中将原-区段和(融合)多肽之间的内源性蛋白酶切割位点替换为外源性(相对于融合多肽的部分的来源)或人工蛋白酶切割位点，和/或
iii)通过降低(融合)多肽的等电点，和/或
iv)通过调节接头肽长度，调节接头连接性，调节接头电荷，引入导致(融合)多肽具有较低等电点的位于表面的氨基酸残基的一个或多个突变中的一项或多项，
-从细胞或培养基中回收(融合)多肽或(融合)原-多肽，并由此产生(重组的)(融合)多肽。
如本文所报道的一个方面是用于产生(重组的)融合多肽的方法，其包括以下步骤：
-提供编码融合多肽的核酸，
-修饰核酸以编码变体融合多肽，其中融合多肽的氨基酸序列已通过如下而被修饰：调节接头肽长度，调节接头连接性，调节接头电荷，引入导致融合多肽具有较低等电点的位于表面的氨基酸残基的一个或多个突变，
-将核酸引入真核细胞中(在一个实施方案中是哺乳动物细胞)，
-培养真核细胞，以及
-从细胞或培养基中回收(重组的)变体融合多肽，并由此产生(重组的)融合多肽。
在前述方面的一个实施方案中，融合多肽包括生物活性实体、接头肽和与血脑屏障(BBB)受体结合的单价结合实体。
在一个实施方案中，血脑屏障受体选自由转铁蛋白受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)/α2-巨球蛋白受体，低密度脂蛋白受体相关蛋白8(也称为载脂蛋白E受体2(ApoER2))、低密度脂蛋白受体相关蛋白1(也称为α-2-巨球蛋白受体(A2MR))和结合肝素的表皮生长因子样生长因子组成的组。
在一个实施方案中，接头肽包含一个或多个带负电荷的氨基酸残基。在一个实施方案中，接头肽包含两个或更多个带负电荷的氨基酸残基。在一个实施方案中，接头肽包含两个，或三个，或四个，或五个带负电荷的氨基酸残基。
在一个实施方案中，生物活性实体是神经营养因子。在一个实施方案中，神经营养因子是脑源性神经营养因子(BDNF)。
在一个实施方案中，单价结合实体与血脑屏障受体结合，并且是单价抗体片段，优选地选自scFv、Fv、scFab、Fab、VHH。
在一个实施方案中，融合多肽是单链融合多肽，其包含作为第一部分的人脑源性神经营养因子和作为第二部分的单一的抗转铁蛋白受体抗体Fab或scFv，它们直接或经由接头肽彼此缀合。
如本文所报道的一个方面是融合多肽，其包括：
-恰好一个野生型神经营养因子多肽，或神经营养因子变体多肽，或具有神经营养因子活性的其片段，
-结合结构域，和
-神经营养因子多肽和抗体片段之间的接头肽。
如本文所报道的一个方面是具有神经营养因子活性的融合多肽(例如，二聚复合物)，其包括
-以下恰好一种：野生型神经营养因子多肽，或神经营养因子变体多肽或具有神经营养因子活性的其片段，
-结合结构域，和
-神经营养因子多肽和抗体片段之间的接头肽。
在一个实施方案中，结合结构域是抗体片段结合位点。在一个实施方案中，结合结构域是包含抗体结合位点的抗体片段。在一个实施方案中，抗体片段与血脑屏障受体特异性结合。在一个实施方案中，抗体片段是选自包括scFv、Fv、scFab、Fab、VHH的组的单价抗体片段。
在一个实施方案中，血脑屏障受体选自由转铁蛋白受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)/α2-巨球蛋白受体，低密度脂蛋白受体相关蛋白8(也称为载脂蛋白E受体2(ApoER2))、低密度脂蛋白受体相关蛋白1(也称为α-2-巨球蛋白受体(A2MR))和结合肝素的表皮生长因子样生长因子组成的组。
在一个实施方案中，融合多肽包括不与BBB受体结合的第二个单价或二价结合实体。
如本文所报道的一个方面是复合物，其包括
-作为第一组分，如本文所报道的融合多肽，和
-作为第二组分的野生型神经营养因子多肽，或神经营养因子变体多肽，或具有神经营养因子活性的其片段。
如本文所报道的一个方面是具有神经营养因子活性的多聚复合物，其包括
-作为第一组分，如本文所报道的融合多肽，和
-作为第二组分的野生型神经营养因子多肽，或神经营养因子变体多肽，或具有神经营养因子活性的其片段。
在一个实施方案中，复合物是二聚复合物。
在所有方面的一个实施方案中，神经营养因子选自神经生长因子(NGF)，脑源性神经营养因子(BDNF)，胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)，神经营养蛋白3(NT-3)，和神经营养蛋白4(NT-4)。在一个优选的实施方案中，神经营养生长因子是BDNF。
如本文所报道的所有氨基酸序列均是本发明的具体方面。
发明的详细说明
关于哺乳动物细胞中重组产生的多肽的低表达产量的一个或多个原因往往未知，并且一般不容易确定。
某些多肽在表达时能够干扰宿主细胞的功能。这可以是例如误分选到不正确的细胞位置或在错误的空间(例如，细胞类型)和/或时间(例如，依赖于细胞周期)环境中表达。此外，多肽的增加的重组表达和分泌能导致不利于蛋白折叠的条件，例如，导致蛋白聚集和/或细胞应激反应。总之，多肽的重组表达可以是困难的(例如，导致低表达产量)，或在特定宿主细胞中甚至不可能表达。
如本文所报道的方法在下文中以特定的多肽、融合多肽和抗体融合多肽例示。这些分子仅仅是用作例子，并且不应被解释为对本发明的范围的限制。
神经营养蛋白被认为是有高度治疗兴趣的。例如，脑源性神经营养因子(BDNF)被建议用于治疗或减轻以下病症：阿尔茨海默病、帕金森病，亨廷顿氏病和围产期脑白质病、唐氏病和孤独症/雷特氏综合征、精神分裂症、抑郁症、进食病症、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、神经元损伤(例如脊髓的神经元损伤)以及其它疾病(Apfel,S.C.,Clin.Chem.Lab Med.39(2001)351-355；Nagahara,A.H.和Tuszynski,M.H.,Nat.Rev.DrugDiscov.10(2011)209-219；Zuccato,C.和Cattaneo,E.,Nature Reviews Neurology 5(2009)311-322；Thoenen,H.和Sendtner,M.,Nature Neuroscience Supplement 5(2002)1046-1050；Gharami,K.,等人,J.Neurochem.105(2008)369-379)。
人体内的神经营养蛋白是非常低丰度的，并且通常由位于非常复杂的微环境中的专门的细胞类型表达(参见，例如，Greenberg,M.E.,等人,J.Neurosci.29(2009)12764-12767)。与其天然功能一致，在通常用于这类多肽的重组工业生产的真核细胞(如CHO细胞、COS细胞、NSO细胞和HEK细胞)中，神经营养蛋白的表达水平非常低(Acklin,C.,等人,Int.J.Pept.Protein Res.41(1993)548-552)。
I.通过引入N-糖基化位点提高表达
如本文所报道的一个方面是将一个或多个(人工)糖基化位点引入多肽中用于其重组生产。通过引入一个或多个(人工)糖基化位点，真核细胞尤其是哺乳动物细胞中的多肽重组生产可以得到改善。该方法特别适用于例如在哺乳动物细胞中很难或根本不表达/分泌的多肽。引入的糖基化位点可以位于多肽本身之中，或者位于将融合多肽的两个多肽连接在一起的接头肽中，或者它可以是特定的糖基化标签。特别有利的是通过位于表面的氨基酸的点突变引入糖基化位点以生成(人工)N-糖基化基序。
实例：包含抗体部分和GFP的融合多肽
构建了包含抗体和GFP部分的示例性融合多肽。
GlySer接头(GGGGSGGGGSG；SEQ ID NO:01)被用于融合i)eGFP部分(增强型绿色荧光蛋白；SEQ ID NO:02)，或ii)emGFP部分(翠绿色荧光蛋白；SEQ ID NO:03)，或iii)tagGFP部分(SEQ ID NO:04)与IgG1亚类的抗IGF-1R抗体(HC:SEQ ID NO:05；LC:SEQ ID NO:06)的重链(HC)的C-末端。不同的重链融合物具有SEQ ID NO:07、08、和09的氨基酸序列。
使用蛋白质印迹和/或基于蛋白A的高效液相色谱(HPLC)测定法，在瞬时转染的HEK293细胞的细胞培养上清液中完全不能检测到抗体融合多肽的分泌。同样地，生物活性GFP通过其生物发光特性(GFP特异性荧光)也无法被监测到。但是通过蛋白质印迹分析可以在细胞沉淀级分中检测到融合多肽。结果示于下表。
表1
GFP分子 分泌的融合多肽[μg/ml]
eGFP <1
emGFP <1
tagGFP <1
<1μg/ml＝低于检测极限
不受该理论束缚，GFP是细胞质单体蛋白，其具有形成(弱)二聚体的倾向。因此，野生型GFP“从性质来说”(天然维多利亚多管发光水母(Aequorea Victoria)细胞)并不注定是要被分泌的，并且，因此，因其与哺乳动物细胞分泌机器不相容而必须使GFP分子适于分泌。
为了提供分泌的含GFP的融合多肽，源自在视网膜感光细胞中发现的人类光敏膜结合G蛋白偶联视蛋白受体的多肽已被进一步包含在融合多肽中，即，作为糖基化标签。通过该糖基化标签，额外的(人工)N-糖基化位点被引入融合多肽中。
将视蛋白受体来源的多肽与GFP部分的C-末端直接融合，即，没有间插接头肽。视蛋白衍生的多肽(NGTEGPNFYVPFSNATGVV；视蛋白标签；SEQ ID NO:10)包括两个N-糖基化位点基序：NGT基序和NAT基序(一般的N-糖基化位点基序：NxS/T；Asn后面跟着除Pro以外的任何氨基酸，后面跟着Ser或Thr)。包含视蛋白糖基化标签(SEQ ID NO:11)的融合多肽在HEK293细胞中的瞬时表达导致融合多肽的分泌。结果示于下表。
表2
GFP分子 视蛋白标签 分泌的融合多肽[μg/ml]
eGFP 否 <1
eGFP 是 15
<1μg/ml＝低于检测极限
从SDS-PAGE分析(条带变宽)可以看出分泌的融合多肽包含额外的碳水化合物。
通过两步法纯化抗体-GFP-视蛋白标签-融合多肽，特别是，蛋白A亲和层析然后是尺寸排阻层析。使用表面等离子体共振(BIAcore)，通过与IGF-1R受体蛋白结合，以及，通过FACS和/或共聚焦显微镜，经由过表达IGF-1R的细胞上受体介导的胞吞作用内化到细胞中，来证实融合多肽中的抗体部分的功能。GFP部分的功能由于其绿色荧光特性而显示。
实例：神经营养蛋白
示例性的神经营养蛋白是脑源性神经营养因子(BDNF)。
i)糖基化标签
包含经由GSG-接头融合的C-末端T7-His6标签(MASMTGGQQMG-HHHHHH；用于亲和纯化；SEQ ID NO:12)的人野生型前-原-BDNF在HEK239细胞中表达(前-原-BDNF-T7-His6；SEQID NO:13)。成熟BDNF的氨基酸序列不包含N-糖基化位点基序，因此未糖基化。成熟BDNF仅以几μg/ml的低产量得到。通过优化基因密码子使用，或者通过去除潜在的蛋白酶切割位点(前-原-BDNF(-RGR)-T7-His6)，或者通过将天然BDNF信号序列与良好表达的抗体的信号序列(MGWSCIILFL VATATGVHS；SEQ ID NO:14)交换，或者通过将BDNF前-原-区段与NGF的前-原-区段交换，均无法改善低表达产量。结果示于下表(归一化至成熟BDNF的浓度)。
表3
为了提高BDNF的(分泌)产量，使用不同长度的视蛋白糖基化标签将(人工)糖基化位点引入BDNF分子，所述不同长度的视蛋白糖基化标签为：16个氨基酸残基(NGTEGPNFYVPFSNAT；SEQ ID NO:15)，19个氨基酸残基(NGTEGPNFYVPFSNATGVV；SEQ ID NO:10)，以及20个氨基酸残基(NGTEGPNFYVPFSNATGVVR；SEQ ID NO:16)。使用这种修饰，表达产量(归一化为成熟的BDNF的浓度)可以得到提高。结果示于下表(归一化至成熟BDNF的浓度)。
表4
＊：超出定量的线性范围
出人意料的是，当与天然的非糖基化BDNF相比时，包含糖基化标签的BDNF变体也具有提高的生物活性(CHO-TrkB荧光素酶报告基因测定)。结果示于下表。
表5
其它可能的糖基化标签是AAANGTGGA(一个N糖基化位点基序；SEQ ID NO：17)，ANITVNITV(两个N-糖基化位点基序；SEQ ID NO：18)，和NATGADNGTGAS(两个N-糖基化位点基序；SEQ ID NO：19)。
ii)引入的一个或多个N-糖基化位点基序
为了提高BDNF的(分泌)产量，将人工N-糖基化位点引入BDNF氨基酸序列。人工N-糖基化位点可以例如通过对BDNF氨基酸序列进行点突变而被引入(N-糖基化位点基序：Asn-Xxx-Ser/Thr；Xxx是除了Pro以外的任何氨基酸)。制备相应的编码核酸序列并在HEK293细胞中瞬时表达。突变编号基于成熟BDNF的氨基酸序列(SEQ ID NO:25)。分析分泌的BDNF变体的表达/分泌水平，N-糖基化程度(通过免疫印迹分析从条带的迁移推导，其中，每引入和使用一个N-糖基化位点，MW大约增大3-5kDa(当与非糖基化BDNF参考相比时))，以及经由CHO-TrkB荧光素酶报告基因测定的功能/受体结合。结果示于下表(表达产量和生物活性归一化至成熟BDNF的浓度)和图3。
表6
n.d.：未确定
-：没有糖基化
+：部分糖基化
++：完全糖基化
表7
n.d.：未确定
-：没有糖基化
+：部分糖基化
++：完全糖基化
有活性：与表达于大肠杆菌中、重折叠和纯化的非糖基化的成熟野生型BDNF的活性可比的BDNF活性
无活性：未测定到活性
糖基化的BDNF变体的功能/生物活性也在背根神经节(DRG)测定中显示。在DRG测定中确定的活性与非糖基化的野生型BDNF可比。
II.通过修饰酶促切割位点改善表达
通常，分泌的多肽合成为前-原-多肽(pre-pro-polypeptide)。前-区段(pre-segment)表示所谓的信号序列。原-区段(pro-segment)可以是例如以下所需要的：蛋白折叠，细胞定位/运输到特定的细胞区室(例如，运输到溶酶体)，或者，成熟蛋白在细胞内运输和储存或者胞外运输(例如，分泌到培养基中)期间的失活。前-和原-区段对于成熟多肽的生物活性来说不是必需的。如果原-区段未能正确地处理，即，(前-)原-区段未从成熟蛋白切掉(例如，在生产/分泌细胞中)，它可改变成熟多肽的生物物理、生物化学和/或生物学活性。
下文报道的方法适合于在体内通过酶促切割从原-多肽产生的多肽。
如本文所报道的一个方面是使用变体原-多肽从原-多肽产生重组多肽的方法，包括以下步骤：
-培养包含编码原-多肽(原-区段和多肽的融合多肽)的核酸的哺乳动物细胞，其中原-区段和多肽之间的内源性酶促切割位点已被替换为外源性蛋白酶切割位点，
-从细胞或培养基中回收重组变体原-多肽，切割所述原-多肽，并由此产生重组多肽。
如本文所报道的一个方面是用于从原-融合多肽产生融合多肽的方法，包括以下步骤：
-培养包含编码变体原-融合多肽的核酸的哺乳动物细胞，其中原-融合多肽的氨基酸序列已通过以下而被修饰，即，将天然原-融合多肽中的原-区段和融合多肽之间的内源性蛋白酶切割位点替换为外源性(相对于所述融合多肽的部分的一个或多个来源)或人工蛋白酶切割位点，
-从细胞或培养基中回收原-融合多肽，切割所述原-融合多肽，并由此产生所述(重组的)融合多肽。
在如本文所报道的一个方面中，原-多肽中的原-区段和成熟多肽之间的蛋白酶切割位点被替换为外源性(相对于多肽或融合多肽的部分的来源)或人工蛋白酶切割位点。
如在此上下文中使用的术语“内源性蛋白酶切割位点”表示在原-区段和成熟多肽之间的天然发现的蛋白酶切割位点。
如在此上下文中使用的术语“外源性蛋白酶切割位点”表示在原-区段和成熟多肽之间的非天然发现的蛋白酶切割位点。
通过从内源性蛋白酶切割位点改变成外源性蛋白酶切割位点，将分泌的原-多肽加工和切割成其成熟形式可以得到改善。
外源性蛋白酶切割位点可以来自任何蛋白酶，只要蛋白酶不存在/表达于原-多肽所源自的细胞(即，原-多肽天然存在(部分或完全地)的细胞)中。
外源性蛋白酶切割位点(相对于多肽的来源)可以是任何蛋白酶切割位点，如，举例来说，IgA蛋白酶切割位点，TEV蛋白酶切割位点(烟草蚀纹病毒)，颗粒酶B切割位点，凝血酶切割位点，因子10切割位点，肠激酶切割位点，枯草杆菌蛋白酶切割位点，组织蛋白酶切割位点，金属蛋白酶切割位点，IDES蛋白酶切割位点，PreScission蛋白酶切割位点，或者它们的功能性变体。
原-多肽的切割可以在多肽的重组生产期间的不同时间点发生。
原-多肽的切割可以是在培养基中。在本文中，外源性蛋白酶(实现原-多肽的切割)被加入到培养基中，或者，外源性蛋白酶(实现原-多肽的切割)共表达于培养基中。
也可以在原-多肽从细胞分离后切割原-多肽，例如，在下游加工之前、期间和之后(但是在培养之后)。
在一个优选的实施方案中，外源性蛋白酶切割位点与原-多肽和表达原-多肽的重组细胞来自不同的生物体。这样具有可以限定原-多肽的加工点的优点。如果表达变体原-多肽的细胞不共表达外源性蛋白酶，并且，外源性蛋白酶不被加入到培养基中，那么分别来说，切割可以不再由表达变体原-多肽的细胞或者在培养期间实现。
在一个实施方案中，在纯化期间进行原-多肽的切割。
在一个实施方案中，在纯化过程期间在柱上进行原-多肽的切割。在一个具体的实施方案中，所述柱是亲和柱。
在一个优选的实施方案中，在原-多肽已从培养基中分离之后通过将原-多肽和蛋白酶孵育进行原-多肽的切割。在一个实施方案中，在第一(层析)纯化步骤之后进行所述孵育。在一个实施方案中，在柱上完成所述孵育。
该技术也允许例如将人工纯化标签(如，举例来说，His6标签，myc标签，HA标签，或者生物素/亲和素标签)包含在原-区段中用于改善/简化纯化。
在一个实施方案中，原-多肽包含原-区段和成熟多肽，其中所述原-区段包含纯化标签。在一个实施方案中，所述纯化标签选自包括His6标签、myc标签、HA标签、以及生物素/亲和素标签的纯化标签的组。
在一个实施方案中，包含纯化标签的原-多肽的切割在使用所述纯化标签的纯化步骤之后进行。
在任何情况下，在将成熟多肽施用给患者之前进行原-区段从成熟多肽的切割。在一个实施方案中，所述切割在体外进行。
在一个优选的实施方案中，内源性蛋白酶切割位点是IgA蛋白酶切割位点并且所述纯化标签是6-组氨酸(His6)标签。在一个实施方案中，所述6-组氨酸标签经由GSG肽与所述蛋白酶切割位点缀合。
实例：在BDNF原-多肽中具有外源性蛋白酶切割位点的前-原-BDNF变体
被表达为(前-)原-多肽并被切割成成熟形式的示例性多肽是BDNF。
野生型的人BDNF在HEK293细胞中表达。在多肽加工期间(即，在表达/重组生产期间)，原-区段仅被宿主细胞的蛋白酶部分去除，由此得到成熟BDNF和未加工的原-BDNF的混合物。人原-BDNF主要由分泌性原-蛋白转化酶弗林蛋白酶在宿主细胞内在分泌期间加工。
原-BDNF变体这样工程化，其中天然存在的弗林蛋白酶切割位点被替换为外源性IgA蛋白酶切割位点。IgA蛋白酶识别并切割包含氨基酸序列N-X-Z-Pro-Pro/-Y-Pro-C(X＝优选Pro或Ser；Y＝Thr、Ser或Ala；Z＝优选Arg或Thr)的蛋白质。原-BDNF多肽的氨基酸序列包含弗林蛋白酶切割位点(RVRR；SEQ ID NO:21)。该弗林蛋白酶切割位点被替换为IgA蛋白酶切割位点(GSVVAPPAP；SEQ ID NO:22)。另外，His6标签经由GSG接头肽与BDNF的C-末端融合(HHHHHH；用于亲和纯化；SEQ ID NO:23)。此外，去除了潜在的蛋白酶切割位点(缺失C-末端氨基酸序列RGR；SEQ ID NO:24)。在比较性变体中，R54A突变被引入BDNF的原-多肽中(前-原-BDNF多肽在氨基酸位置54具有氨基酸残基Ala而不是Arg)，和/或用T7-His6标签代替His6标签。结果示于下表(生物活性归一化至成熟BDNF的浓度)。
表8
R54A突变的编号是基于野生型前-原-BDNF的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)。
工程化的前-原-BDNF多肽在HEK293细胞以高产量表达。分泌的工程化的原-BDNF多肽通过用IgA蛋白酶切割在体外高效地转化成成熟天然BDNF。
因此，与包含天然弗林蛋白酶/PC转化酶切割位点的天然前-原-BDNF多肽的表达形成对照，包含外源性IgA蛋白酶切割位点的工程化的原-BDNF多肽作为单一表达产物而获得。另外，获得了提高的表达产量。此外，在TrkB荧光素酶报道子细胞测定中，与从野生型前-原-BDNF获得的成熟BDNF多肽对比，从工程化的原-BDNF多肽获得的成熟BDNF多肽具有提高的生物活性。
实例：具有外源性蛋白酶切割位点和位于BDNF原-多肽内的工程化纯化标签的前-原-BDNF变体
亲和标签对于重组产生的多肽的简单和高效的纯化是非常有用的。然而，残留在最终的治疗性蛋白质中的人工纯化标签在临床用途上是不可接受的，这归因于多种原因，包括：潜在的免疫原性，生物物理和生物化学性质以及生物活性的变化。为了克服这些局限性，可去除的纯化标签是有利的。
在一个实施方案中，(BDNF)原-多肽包含纯化标签。
原-BDNF变体这样工程化，其中，将His6标签引入原-多肽中。此外，将天然存在的弗林蛋白酶切割位点替换为外源性IgA蛋白酶切割位点和/或将R54A突变引入原-多肽中。
在比较性变体中，His6标签经由GSG接头肽与BDNF的C-末端融合。另外，用T7-His6标签代替His6标签。结果示于下表(生物活性归一化至成熟BDNF的浓度)和图2。
表9
用体外和体内测定确认从不同的原-BDNF变体多肽得到的BDNF多肽的生物活性/功能。包含IgA蛋白酶切割位点的构建体显示出提高的活性。
插入原-多肽的N-末端区域内的可去除的纯化标签(例如，6-组氨酸标签)可用于高效纯化，并且在体外蛋白质成熟过程中将被切掉。由此，在将用于体内施用的成熟多肽中将不会保留潜在免疫原性的肽序列。
III.通过降低等电点提高表达
一些具有碱性等电点(IEP)(即，等电点高于9)的多肽，例如神经营养蛋白，倾向于形成聚集体。
在如本文所报道的一个方面中，降低多肽的等电点被用于增加用哺乳动物细胞重组产生的多肽的产量。此方法特别适用于具有高于9的等电点(高等电点，碱性等电点)的多肽，如，举例来说，神经营养蛋白。等电点的降低(减小)可以通过增加多肽中的负电荷的数量来实现，例如，通过引入带负电荷的氨基酸残基和/或与带负电荷的部分(如，接头肽)融合。或者，IEP的降低可以通过从多肽表面移除正电荷来实现，例如，通过在多肽表面引入带负电荷的氨基酸残基。这可以例如通过将一个或多个碱性氨基酸残基替换为一个或多个中性亲水性氨基酸残基和/或一个或多个酸性氨基酸残基或它们的组合来完成。
实例：具有降低的等电点的BDNF变体
BDNF具有大约为10的等电点，并且是一种粘性的碱性(basic)/碱性(alkaline)分子(参见，例如Leibrock,J.等人,Nature 341(1989),149–152)。
为了提高(分泌)产量，BDNF变体这样工程化，其中，氨基酸残基被改变以降低分子的等电点。此外，T7-His6标签经由GSG接头肽与BDNF的C-末端融合。另外，在一个比较性变体中，去除了潜在的蛋白酶切割位点(缺失C-末端氨基酸序列RGR；SEQ ID NO:23)。在第一变体中，引入了以下氨基酸突变：P60E、K65D、K73D和K95A。在第二变体中，引入了以下氨基酸突变：K65D、K73D、K95A和R97A。已经用EMBOSS IEP方法(Alan Bleasby(ajbebi.ac.uk)；欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute)，WellcomeTrust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK)计算了IEP值。结果示于下表(生物活性归一化至成熟BDNF的浓度)。
表10
＊：超出定量的线性范围
与野生型BDNF形成对照，具有降低的IEP的工程化BDNF变体在瞬时转染的HEK293细胞的细胞培养基/上清液中稳定积累超过3至6天。这也通过细胞培养研究得到显示，其中纯化的成熟BDNF(在大肠杆菌中产生)和纯化的降低IEP的myc标记的BDNF变体被加入生长的HEK293宿主细胞培养物(BDNF浓度为10μg/ml)中。4天的细胞培养之后，通过还原的SDSPAGE和蛋白质印迹分析确定了细胞培养上清液中剩余的BDNF浓度：4天后，成熟BDNF从细胞培养上清液中被完全清除，而myc标记的BDNF变体几乎完全稳定(参见图1)。
IV.通过不同修饰的组合提高表达
在如本文中所报道的一个方面中，已进行/引入以下修饰中的一种或多种，以改进多肽的重组生产：
i)引入一个或多个糖基化位点，和/或
ii)将原-区段和成熟多肽之间的内源性蛋白酶切割位点替换为外源性(相对于多肽的来源)或人工蛋白酶切割位点，和/或
iii)降低多肽的等电点，和/或
iv)通过调节接头肽长度、连接性和电荷。
为了进一步改进多肽的重组生产，在某些实施方案中，组合使用任何两种、任何三种或所有四种上述修饰。
实例：神经营养蛋白
示例性的神经营养蛋白是脑源性神经营养因子(BDNF)。
在BDNF的氨基酸序列中，已进行以下修饰中的两种或更多种：
-引入一个或多个人工N-糖基化位点，
-引入视蛋白标签作为N-糖基化标签，和
-将内源性弗林蛋白酶切割位点替换为外源性IgA蛋白酶切割位点。
结果示于下表(生物活性归一化至成熟BDNF的浓度)。
表11
从图4可以看出，与不具有额外的N-糖基化位点的BDNF变体(图4中的C、D和E道)相比，包含一个或多个额外的N-糖基化位点的BDNF变体多肽的表达/分泌产量得到提高(图4中的A、B和F道)。
表12
V.血脑屏障转运的融合多肽的提高的表达
大的生物治疗药物的脑渗透受到广泛的和不能渗透的血脑屏障(BBB)以及神经血管单元(NVU)中的其它细胞组分的严格限制。已经试验了用于克服这一障碍的许多策略，并且其中一个是利用转胞吞作用(transcytosis)途径，该途径由在大脑毛细血管内皮上表达的内源性受体所介导。已经针对这些受体设计重组蛋白如单克隆抗体或多肽，以允许将生物治疗药物由受体介导递送至大脑。
生物治疗药物对中枢神经系统(CNS)中的病理的治疗具有巨大治疗潜力。然而，它们进入大脑的路线被BBB所阻止。先前的研究已阐明，注入血流的IgG中的非常小的百分比(大约0.1％)能够渗透到CNS区室中(Felgenhauer,Klin.Wschr.52(1974)1158-1164)。这必定会限制任何药理作用，因为该生物治疗药物在CNS中处于低浓度。因此，介导生物治疗药物(如神经营养因子)运输进入大脑的、包括抗体片段的载体具有很高的医疗需求。
因此，已经开发了包含效应子实体和与BBB受体结合的单价或二价结合实体的融合多肽(参见，例如，EP 12182181.3)。
在一个实施方案中，所述单价结合实体特异性结合血脑屏障受体，或者与血脑屏障受体特异性结合的单价抗体片段，优选地，选自scFv、Fv、scFab、Fab和VHH。
在一个实施方案中，所述效应子实体是神经营养多肽，如BDNF。
在一个实施方案中，所述血脑受体选自由转铁蛋白受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白8、低密度脂蛋白受体相关蛋白1，和结合肝素的表皮生长因子样生长因子组成的组。
实例：包含抗体部分和BDNF的融合多肽
Boado等人(Biotechnol.Bioeng.97(2007)1376-1386)报道了一种抗体-BDNF-融合多肽，其中人BDNF的氨基末端与识别人胰岛素受体的嵌合抗体的重链的羧基末端融合。然而，该融合多肽的表达是不可能的，因为该融合多肽在细胞内聚集。
通常，野生型BDNF或BDNF变体可以经由其C-末端或其N-末端与抗体多肽链融合。由于BDNF仅作为同源二聚体而有活性，生物活性的抗体-BDNF融合多肽的工程化需要i)BDNF部分的折叠、成熟和装配以及ii)抗体多肽链/结构域的折叠和装配均正确。因此，不同的融合多肽形式(复合物)是可能的，如，举例来说，由两条重链和轻链组成的完整抗体，由轻链和重链片段组成的抗体Fab片段，单链Fab(scFab)或单链Fv(scFv)，与BDNF多肽的N-末端或C-末端融合的组合。另外，融合多肽复合物可以包含两条或更多条不同的多肽链，如，下列组合，例如，BDNF-scFv融合多肽和成熟(非融合)BDNF多肽，BDNF-Fab(重链)融合多肽和BDNF-Fab(轻链)融合多肽，或者BDNF-Fab(重链)融合多肽和Fab(轻链)融合多肽和成熟(非融合)BDNF多肽。此外，BDNF多肽可以直接或经由接头肽与相应的抗体链多肽融合。接头肽可以在以下方面不同：i)氨基酸数量，ii)氨基酸种类(例如，带负电荷的氨基酸和/或疏水性氨基酸)，和iii)工程化的推定翻译后修饰基序(例如，N-连接的糖基化位点基序)。例如，BDNF多肽可以与经由不同的接头肽连接的不同抗体片段(例如，Fab、scFab和scFv)缀合，导致不同的生物活性融合多肽。
如本文所报道的一个方面是一种融合多肽，其包括
-恰好一个野生型BDNF多肽，或者具有BDNF活性的BDNF变体多肽或其片段，
-抗体片段，和
-BDNF多肽和抗体片段之间的接头肽。
如本文所报道的一个方面是一种具有BDNF活性的融合多肽(例如，二聚复合物)，其包括
-恰好一种野生型BDNF多肽，或者具有BDNF活性的BDNF变体多肽或其片段，
-抗体片段，和
-BDNF多肽和抗体片段之间的接头肽。
如本文所报道的另一个方面是一种二聚复合物，其由以下组成
-作为第一组分，如本文所报道的融合多肽，和
-作为第二组分的野生型BDNF多肽，或具有BDNF活性的BDNF变体多肽或其片段。
已经发现，BDNF-抗体-融合形式仅在与第二非融合BDNF多肽的复合物中以生物活性形式表达和正确装配，如果该形式包括恰好一个经由接头肽与抗体片段共价融合的BDNF多肽和恰好一个非融合BDNF多肽。
另外，已经发现，使用包含一个或多个带负电荷的氨基酸残基的接头肽，可以进一步提高这类构建体的表达。
不同的融合多肽形式在HEK293细胞中瞬时表达。使用蛋白质印迹和/或基于蛋白A的高效液相色谱(HPLC)测定进行分析。结果示于下表(生物活性归一化至成熟BDNF的浓度)。
表13
pp-BDNF＝前-原-BDNF
n.a.＝不适用
n.d.＝未测定
VL(I)＝与抗IGF-1R抗体的轻链可变结构域的N-末端融合的BDNF
VH(I)＝与抗IGF-1R Fab抗体片段的重链可变结构域的N-末端融合的BDNF
VL(II)＝与抗TfR抗体(抗转铁蛋白受体抗体)的轻链可变结构域的N-末端融合的BDNF
VH(II)＝与抗TfR Fab抗体片段的重链可变结构域的N-末端融合的BDNF
无-LC＝与所用重链同源的无融合BDNF的轻链抗体多肽链
scFv＝与抗IGF-1R抗体的scFv的N-末端融合的BDNF
＊：来自Peprotech的商业材料
＊＊：在大肠杆菌中重组产生
附图说明
图1在细胞培养期间BDNF变体的稳定性。在大肠杆菌中产生的野生型BDNF(A)和通过在HEK293细胞中瞬时表达产生的myc标记的BDNF(B)被加入到HEK293细胞的生长培养物(10μg/ml)中，并且，在第0天和第4天通过还原性SDS PAGE和蛋白质印迹分析确定样品中的BDNF浓度，所述蛋白质印迹分析使用抗BDNF抗体用于染色/可视化；1道：来自Peprotech(大肠杆菌)的参考物质；2道：分子量标记；为简单起见，该蛋白质印迹已被切割和重新组装。
图2含有表达/分泌的BDNF变体多肽的细胞培养上清的SDS-PAGE/蛋白质印迹分析；1道：分子量标记；2道：表9第1行；3道：表9第5行；4道：表9第2行；5道：表9第4行；6道：表9第3行；7道＝mBDNF参考；为简单起见，该蛋白质印迹已被切割和重新组装。
图3含有表达/分泌的BDNF变体多肽的细胞培养上清的SDS-PAGE/蛋白质印迹分析；1道：分子量标记；2道：表6第1行(糖基化的原-BDNF)；3道：表6第2行(原-BDNF)；4道：表6第3行(糖基化的成熟BDNF)；5道：表6第4行(成熟BDNF)。
图4含有如表11中的表达/分泌的BDNF变体多肽的细胞培养上清的SDS-PAGE/蛋白质印迹分析；A道：表11第1行；B道：表11第2行；C道：表11第3行；D道：表11第4行；E道：表11第5行；F道：表11第6行；星号表示使用不同的表达条件。
提供下列实施例、序列和附图以帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求中阐述。应当理解，可以在所阐述的方法中做出修改，而不脱离本发明的精神。
实施例
重组DNA技术
使用如Sambrook,J.等人,Molecular cloning:A laboratory manual；ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中记载的标准方法操作DNA。按照制造商的说明使用分子生物学试剂。
基因合成
在Geneart GmbH(Regensburg,Germany)通过化学合成制备期望的基因和基因片段。将合成的基因和基因片段克隆到大肠杆菌质粒中用于增殖/扩增。通过DNA测序验证亚克隆的基因和基因片段的DNA序列。
蛋白质测定
使用基于多肽的氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过在280nm处测定光密度(OD)来确定纯化的多肽的蛋白质浓度。
基本/标准哺乳动物表达质粒的描述
通过人胚肾细胞(HEK293)的瞬时转染表达期望的基因/多肽。关于期望的基因/多肽(例如，抗体-GFP-融合多肽，野生型BDNF，BDNF变体多肽，BDNF-Fab-和BDNF-scFv-融合多肽)的表达，使用了包含以下功能元件的转录单元：
-包括内含子A的、来自人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期增强子和启动子，
-人重链免疫球蛋白5'-非翻译区(5'UTR)，
-待表达基因，和
-牛生长激素多腺苷酸化序列(BGH pA)。
除包括待表达的期望基因的表达单元/盒之外，基本/标准的哺乳动物表达质粒包含
-来自载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌中的复制，和
-β-内酰胺酶基因，其赋予大肠杆菌氨苄青霉素抗性。
实施例1
生成抗体表达质粒
a)生成亲本人抗人IGF-1R抗体的抗体表达质粒
将编码人κ轻链(Vk)和重链可变区(VH)的基因区段分别连接到编码人κ轻链恒定区(Ck)或人γ-1重链恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)的基因区段。两个抗体链基因由两个独立的表达质粒表达，所述表达质粒包括抗体基因的基因组外显子-内含子结构。抗人IGF-1R抗体的成熟(不含信号序列)重链和轻链的氨基酸序列示于SEQ ID NO:05和SEQ ID NO:06。
抗体链的表达受控于：缩短的、删除内含子A的、来自人巨细胞病毒(HCMV)的立刻早期增强子和启动子(包括人重链免疫球蛋白5'-非翻译区(5'UTR))，鼠免疫球蛋白重链信号序列，以及来自牛生长激素的多腺苷酸化信号(BGH pA)。该表达质粒还包含来自载体pUC18的复制起点和β-内酰胺酶基因，用于在大肠杆菌中质粒扩增(参见Kopetzki,E.等人,Virol.J.5(2008)56；Ji,C.等人,J.Biol.Chem.284(2009)5175-5185)。
b)生成抗转铁蛋白受体抗体轻链表达质粒
为了获得抗转铁蛋白受体抗体的轻链，化学合成了这样的轻链基因，该轻链基因编码鼠免疫球蛋白重链信号序列MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO:14)，大鼠抗鼠转铁蛋白受体的VL可变结构域，以及人Vκ轻链恒定区。大鼠抗体的VL结构域的氨基酸序列获自Boado,R.J.等人,Biotechnol.Bioeng.102(2009)1251-1258。嵌合大鼠/人抗转铁蛋白受体抗体轻链的氨基酸序列示于SEQ ID NO:80。
实施例2
生成抗体-GFP-融合多肽表达质粒
a)生成关于抗IGF-1R抗体-GFP融合多肽的表达质粒
通过将编码相应的GFP变体和由2Gly4Ser重复和另外的Gly组成的甘氨酸-丝氨酸接头(重链…LSPG--gggsggggsg--GFP)的、化学合成的DNA片段融合至编码稍微截短的人γ-1重链恒定区(去除最后一个天然氨基酸Lys)的抗-IGF-1R抗体重链基因的3'端，装配整个抗人IGF-1R抗体重链-GFP-融合多肽编码基因。抗IGF-1R抗体重链eGFP、emGPF和tagGFP融和蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:07，SEQ ID NO:08和SEQ ID NO:09。
抗体重链和轻链基因从两个独立的表达质粒表达，所述表达质粒包括抗体基因的基因组外显子-内含子结构。
b)生成抗IGF-1R抗体重链-eGFP-视蛋白标签-融合多肽的表达质粒
用于在HEK293细胞中瞬时表达抗IGF-1R抗体重链-GFP-视蛋白标签-融合多肽的表达质粒衍生自上述表达载体。它们的不同之处仅在于编码GFP-视蛋白标签的DNA区段，其中19个氨基酸的肽(NGTEGPNFYVPFSNATGVV；视蛋白(M)；SEQ ID NO:10)与相应GFP的C-末端直接融合。作为示例，抗IGF-1R抗体重链-eGFP-视蛋白(M)标签-融合多肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO:33。
实施例3
生成BDNF表达质粒
a)生成野生型前-原-BDNF的表达质粒
通过化学合成制备编码人前-原-BDNF基因的DNA区段，并插入到上述基本表达载体中。为此目的，前-原-BDNF基因在其5'端与CMV启动子连接，并且在其3'端与牛生长激素多腺苷酸化序列连接。野生型前-原-BDNF蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:20。
b)生成BDNF变体的表达质粒
为了获得最佳产量，构建了几个BDNF变体(见下表)：
-在一些变体中，野生型BDNF信号序列(前-区段)被交换为源自高表达的鼠免疫球蛋白重链抗体的信号序列(MGWSCIILFLVATATGVHS)；
-在一些变体中，编码BDNF基因的密码子使用被交换为BDNF的原-区段中和/或成熟部分中的优化的密码子使用；通过使用来自Geneart的算法回译相应氨基酸序列获得具有优化的密码子使用的BDNF基因(参见，例如，Fath,S.等人,PLOS One 6(2011)e17596)；
-在一些变体中使用了T7-His6标签(SEQ ID NO:12)，因为它通常被认为增强蛋白质表达(参见，例如，Luan,C.H.等人,Genome Res.14(2004)2102-2110)；
-在大多数的BDNF变体中包括了His6标签，以便简化样品制备/纯化；
-在一些变体中，删除了最后三个C-末端氨基酸(成熟BDNF的RGR基序)，因为它可能起到隐蔽的蛋白酶切割位点(用于蛋白酶，如弗林蛋白酶或其它PC转化酶)的作用；
-在另一变体中，BDNF的信号序列和原-区段被交换为人NGF的相应氨基酸序列，因为据公布，该变异提高另一种神经营养蛋白的表达(Iwane等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.41(1994)225-232)。
表14
1：缺失了BDNF的C-末端RGR基序(ΔRGR)
2：源自如SEQ ID NO:14中所示氨基酸序列所定义的高表达的鼠免疫球蛋白重链抗体的信号序列(MGWSCIILFLVATATGVHS)
3：将BDNF的信号序列和原-区段交换为来自人NGF的相应序列
c)生成前-原(IgA)-BDNF和前-原(IgA；His6)变体的表达质粒，部分在原-区段中 在成熟BDNF N-末端包括His6标签
前-原-(IgA)-BDNF基因编码原-多肽变体，其中天然存在的弗林蛋白酶切割位点(RVRR)被替换为具有序列GSVVAPPAP的工程化IgA蛋白酶切割位点(参见下表)。
此外，在一些变体中，R54A点突变被引入到BDNF的原-多肽中，以破坏推定的蛋白酶切割位点(参见Mowla,S.J.等人,J.Biol.Chem.276(2001)12660-12666)。此外，在一些变体中，在原-片段中在成熟BDNF N-末端还包括可去除的His6标签。此标签简化了原(IgA；His6)-BDNF变体蛋白的蛋白纯化。在用IgA蛋白酶进行最终的体外蛋白质成熟时，原(IgA；His6片段)被去除，并因此避免了免疫原性的潜在风险。
用于在HEK293细胞中瞬时表达前-原(IgA)-BDNF和前-原(IgA；His6)-BDNF变体基因/蛋白的表达质粒衍生自上述编码前-原-BDNF(-RGR)-T7-His6蛋白的表达载体。它们在以下特征中不同：
表15
R54A突变的编号基于野生型前-原-BDNF的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)
d)生成等电点工程化的BDNF变体的表达质粒
先前一些在大肠杆菌中表达和重折叠的BDNF变体已记载具有工程化的降低的IEP。对前-原-BDNF(-RGR)-T7-His6基因进行相应突变，并在HEK293细胞中瞬时表达所得到的突变体BDNF基因(参见下表)。此外，构建了myc标记的BDNF变体，因为(1)myc-标签(EQKLISEEDL；SEQ ID NO:90)引入大约-3的净电荷差，和(2)myc-标签是人来源的，因此推测具有较低的免疫原性。
表16
-RGD和(ΔRGR)；缺失成熟BDNF的最后3个C-末端氨基酸；
氨基酸突变编号开始于成熟BDNF的第一个氨基酸；
使用来自欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS)的蛋白质统计程序pepstats计算成熟BDNF(-RGR)变体的IEP。
e)生成具有额外的糖基化位点的BDNF变体的表达质粒
生成BDNF变体，其具有(1)包含糖基化位点的C-末端标签或(2)成熟化的BDNF部分中的一个工程化的糖基化位点。
从公布的序列(例如，Meder,D.等人,J.Cell Biol.168(2005)303-313；Bulbarelli,A.等人,J.Cell Sci.115(2002)1689-1702；Perlman,S.等人,J.Clin.Endocrinol.Metab.88(2003)3227-3235；WO 2002/002597)推断出糖基化标签，并且，用人工神经网络(NetNglyc服务器；http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)预测推定的N-糖基化位点。
为了在成熟化的BDNF部分中引入N-糖基化位点，对序列进行检查以确定成熟BDNF序列中天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸的存在。然后，基于人BDNF的三维蛋白质结构(1bnd；www.rcsb.org)，排除了所有非位于表面的Asn、Ser或Thr残基。对于其余的暴露于表面的Asn、Ser和Thr残基，鉴定了相邻氨基酸残基，以便通过定点诱变工程化推定的N-糖基化位点(共有基序：N-X-(S/T)，X＝除Pro以外的任何氨基酸)。通过序列比对和蛋白质3D结构比较，使用这些推定的工程化N-糖基化位点的氨基酸位置来鉴定结构和功能同源的神经营养蛋白NGF和NT-3中的相应氨基酸。基于同源的受体::配体晶体结构(例如，3buk,3ij2and2ifg)，预期是神经营养蛋白::p75NTR或neutrophin::Trk(A,B)交互界面的一部分的氨基酸位置被排除。在推定的BDNF-TrkB/p75交互界面之外的暴露于表面的推定的N-糖基化位点的所选突变列于下表(第二列)。
用于在HEK293细胞中瞬时表达N-糖基化的BDNF变体蛋白的表达质粒衍生自编码BDNF变体前-原-BDNF(-RGR)-T7-His6(-RGR：截短的成熟野生型BDNF，其中最后3个C-末端氨基酸RGR被缺失；T7标签和His6标签经由GSG接头附接至BDNF的截短的C-末端)的表达载体。被引入用于生成额外的人工N-糖基化位点的BDNF区段、标签、糖接头(glycolinkers)和突变示于下表。
表17
关于BDNF变体前-原-BDNF(-RGR；M61T)-T7-His6和前-原-BDNF(-RGR；R81N)-T7-His6，示例性地示出通过定点诱变引入成熟BDNF(ΔRGR)中的氨基酸突变的SEQ ID No。
f)生成包含用于引入多个(两个或更多个)N-糖基化位点和IgA切割位点的组合的 突变的BDNF变体的表达质粒
为了产生具有多个N-糖基化位点的BDNF变体，将先前实验中鉴定的额外的N-糖基化位点中的一些进行组合。起始构建体前-原(IgA)-BDNF(-RGR)-His6变体多肽的特征在于：原-区段中的IgA蛋白酶切割位点而不是天然弗林蛋白酶位点，C-末端截短的成熟BDNF(缺失了最后3个氨基酸RGR)和C-末端His6标签。如下表所示引入/附接期望突变和标签。
表18
g)生成包含用于引入多个(两个或更多个)N-糖基化位点的组合的突变的BDNF变 体的表达质粒
为了产生具有多个N-糖基化位点的BDNF变体，将先前实验中鉴定的额外的N-糖基化位点中的一些进行组合。为此目的，特征在于C-末端截短的成熟BDNF(缺失了最后3个氨基酸RGR)和C-末端T7-His6标签的前-原-BDNF(-RGR)-T7-His6变体蛋白被用作起始物料。如下表所示插入期望的突变。
表19
实施例4
生成BDNF抗体片段融合多肽表达质粒
a)生成BDNF-Fab抗体重链融合多肽的表达质粒
为了获得BDNF-(Gly4Ser)n-Fab(抗IGF-1R抗体重链)融合多肽，构建了用于在HEK293细胞中瞬时表达的质粒，其具有CDS(编码DNS序列)的化学合成的DNA片段，该CDS编码具有以下特征的多肽：
-缺失了C-末端RGR基序的野生型前-原-BDNF部分在C-末端与富含甘氨酸的接头融合，后面跟随着人抗IGF-1R抗体的Fab重链部分(VH-CH1)和C-末端His6标签；
-富含甘氨酸的接头由(G4S)2-GG或(G4S)4-GG或(G4S)6-GG基序组成(参见下表)。
b)生成BDNF-Fab抗体轻链融合多肽的表达质粒
为了获得BDNF-(Gly4Ser)n-Fab融合多肽，构建了用于在HEK293细胞中瞬时表达的质粒，其具有CDS的化学合成的DNA片段，该CDS编码具有以下特征的多肽：
-缺失了C-末端RGR基序的野生型前-原-BDNF部分在C-末端与富含甘氨酸的接头融合，后面跟随着人抗IGF-1R抗体的Fab VL-Cκ轻链结构域和C-末端His6标签；
-富含甘氨酸的接头由(G4S)2-GG或(G4S)4-GG或(G4S)6-GG基序组成(参见下表)。
表20
c)生成抗IGF-1R抗体轻链的表达质粒
天然抗IGF-1R抗体轻链被用于产生基于抗-IGF-1R的BDNF-Fab复合物。抗IGF-1R抗体轻链表达质粒的产生记载于实施例1。
d)生成包含带负电荷的Gly-Asp接头的BDNF-Fab(抗IGF-1R抗体重链)融合多肽的 表达质粒
为了获得BDNF-(G3D)4-Fab(抗IGF-1R抗体重链)融合多肽，构建了用于在HEK293细胞中瞬时表达的质粒，其具有CDS的化学合成的DNA片段，该CDS编码具有以下特征的多肽：
-缺失了C-末端RGR基序的野生型前-原-BDNF部分在C-末端与富含甘氨酸的带负电荷的接头融合，后面跟随着人抗IGF-1R抗体的Fab VH-CH1重链结构域和C-末端His6标签；
-富含甘氨酸的带负电荷的接头由(G3D)4-GGGS基序组成。
e)生成具有原-BDNF区段中的IgA切割位点、带负电荷的GlyAsp接头和多个N-糖基 化位点的BDNF-Fab(抗IGF-1R抗体重链)融合蛋白的表达质粒
为了获得具有多个N-糖基化位点的原(IgA)-BDNF-(G3D)4-Fab(抗IGF-1R抗体重链)融合多肽，构建了用于在HEK293细胞中瞬时表达的质粒，其具有CDS的化学合成的DNA片段，该CDS编码具有以下特征的多肽：
-缺失了成熟BDNF的C-末端RGR基序的前-原(IgA)-BDNF部分在C-末端与延长的视蛋白标签(NGTEGPNFYVPFSNATGVVR；视蛋白(L)；SEQ ID NO:16)融合，后面跟随着带负电荷的富含甘氨酸-天冬氨酸的接头和针对人胰岛素样生长因子1(IGF-1R)的人单克隆抗体Fab重链部分(VH-CH1，用衍生自铰链的肽EPKSC部分延长)和C-末端His6标签；
-带负电荷的富含甘氨酸-天冬氨酸的接头由(G3D)4-GGGS基序或(G2D)5-G2SG基序组成。
构建体的详情概括于下表中。
表21
f)生成具有原-BDNF区段中的IgA切割位点、带负电荷的GlyAsp接头和多个N-糖基 化位点的BDNF-Fab(抗转铁蛋白受体抗体重链)融合多肽的表达质粒
为了获得具有带负电荷的GlyAsp接头和多个N-糖基化位点的原(IgA)-BDNF-(G3D)4-Fab(抗TfR)抗体重链融合多肽，构建了用于在HEK293细胞中瞬时表达的质粒，其具有CDS的化学合成的DNA片段，该CDS编码具有以下特征的多肽：
-缺失了C-末端RGR基序的前-原(IgA)-BDNF部分在C-末端与视蛋白(L)标签融合，后面跟随着带负电荷的富含甘氨酸-天冬氨酸的接头和嵌合大鼠/人Fab重链部分，其中VH可变结构域源自大鼠8D3单克隆抗体(其针对小鼠转铁蛋白受体(mTfR))并且其中CH1结构域源自人IgG1，以及C-末端His6标签；抗体的VH结构域的氨基酸序列获自Boado,R.J.等人,Biotechnol.Bioeng.102(2009)1251-1258)；
-带负电荷的富含甘氨酸-天冬氨酸的接头由(G3D)4-GGGS基序组成；
-在大多数变体中，BDNF的原-区段和成熟部分之间的内源性弗林蛋白酶/PC转化酶切割位点被交换为IgA蛋白酶切割位点(GSVVAPPAP)；
-在一些变体中，截短的野生型成熟BDNF部分(BDNF；ΔRGR)被交换为具有人工R209N糖基化位点的截短的成熟BDNF变体(BDNF(ΔRGR；R209N))。
构建体的详情概括于下表中。
表22
实施例6
生成BDNF-scFv融合多肽的表达质粒
为了获得BDNF(G4S)3-scFv-抗IGF-1R抗体重链融合多肽，构建了用于在HEK293细胞中瞬时表达的质粒，其具有CDS的化学合成的DNA片段，该CDS编码具有以下特征的多肽：
-缺失了C-末端RGR基序的野生型前-原-BDNF部分在C-末端与(G4S)3接头融合，后面跟随着人抗人IGF-1R抗体的scFv部分；
-抗人IGF-1R抗体的scFv部分这样构造：VL结构域，后面跟随(G4S)4-GG接头、VH区和His6标签；前-原-BDNF(-RGR)_(G4S)3_scFv-His6<IGF-1R>融合蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:78。
实施例7
多肽的瞬时表达、纯化和分析表征
瞬时表达
通过对F17培养基(Invitrogen公司)中培养的HEK293细胞(衍生自人胚肾细胞系293)进行瞬时转染来产生多肽。关于转染，使用“无293(293-Free)”转染试剂(Novagen)。包含抗体和抗体片段(Fab和scFv)的融合蛋白从一个、两个或三个不同质粒表达，在转染时使用等摩尔质粒比例。如制造商的说明中所指明的那样进行转染。在转染后4至7天收获包含重组多肽的细胞培养上清。将上清保存在降低的温度下，直至纯化。
关于在例如HEK293细胞中重组表达人免疫球蛋白的一般信息在例如Meissner,P.等人,Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203中给出。
纯化
a)使用两步法纯化GFP融合多肽，该两步法包括蛋白A层析和Superdex200 TM 柱上的 尺寸排阻层析
过滤含有GFP融合多肽的培养上清。然后，使用以PBS(1mM KH2PO4，10mM NaHPO4，137mM NaCl，2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的HiTrap MabSelectSuRe(GE Healthcare)通过亲和层析捕获GFP融合多肽。通过用平衡缓冲液洗涤去除未结合的多肽，并且用pH 2.8的0.1M柠檬酸盐缓冲液回收融合多肽。洗脱后，立即用pH 9.0的1M Tris碱将级分中和至pH 6.0。
Superdex 200TM(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)上的尺寸排阻层析用作第二纯化步骤。尺寸排阻层析在50mM组氨酸缓冲液，0.15M NaCl，pH 6.8中进行。回收的GFP融合多肽保存在-80℃。
b)用两步方案纯化组氨酸标记的蛋白，该两步法开始是固定化金属离子亲和层析 (IMAC)并且接着是Superdex75TM柱上的尺寸排阻层析
用NaCl将包含组氨酸标记多肽的培养上清调节为最终NaCl浓度500mM。使用explorer 100系统(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)，以1ml/min的流速将经过滤的培养上清加样到Ni-SepharoseTM6快速流动柱，该柱用NiA-缓冲液(50mM TRIS，300mMNaCl，5mM咪唑，如制造商的说明中所指明的，含有无EDTA蛋白酶抑制剂混合物片剂；无EDTA完整迷你片剂；Roche Applied Science)预平衡。用NiA-缓冲液冲洗该柱直到UV读数回到紧贴基线。用10倍柱体积的pH 8.0的50mM TRIS和500mM NaCl中的5mM至300mM线性咪唑梯度洗脱组氨酸标记的多肽。
Superdex 75TM(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)上的尺寸排阻层析用作第二纯化步骤。尺寸排阻层析在50mM组氨酸缓冲液，0.15M NaCl，pH 6.8中进行。洗脱的组氨酸标记的蛋白保存在-80℃。
分析表征
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度(OD)确定纯化的多肽的蛋白质浓度。在存在和不存在还原剂(5mM的1,4-二硫苏糖醇)的情况下，通过SDS-PAGE分析多肽的纯度和正确二聚体形成，用考马斯亮蓝染色。使用Superdex 200TM分析性尺寸排阻柱(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)，通过高性能SEC确定Fc融合多肽制备物的聚集物含量。在通过用神经氨酸苷酶、O-聚糖酶和肽-N-糖苷酶F(Roche AppliedScience,Mannheim,Germany)的组合的酶促处理去除N-聚糖后，通过纳米电喷雾QTOF质谱仪(Nano Electrospray QTOF mass spectrometry)验证还原的多肽的氨基酸骨架的完整性。
培养物上清中的BDNF浓度的测定
通过半定量蛋白质印迹分析来确定培养物上清中的野生型BDNF、BDNF变体和包含BDNF的融合多肽的浓度，使用来自Peprotech(目录号：450-02)的重组人BDNF作为参考标准。使用兔抗BDNF抗体(Santa Cruz；目录号：sc-20981)(一抗)和缀合辣根过氧化物酶的羊抗兔抗血清(1:5000稀释，Roche Diagnostics GmbH,Germany)(二抗)和增强的化学发光底物(LUMI-Light plus蛋白质印迹底物，Roche Diagnostics GmbH,Germany)进行染色。
也根据供应商的说明使用来自Promega(目录号：G7610)的BDNF免疫测定试剂盒(ImmunoAssay Kit)用BDNF ELISA确定BDNF融合多肽的浓度。
实施例8
体外功能表征
野生型GFP和包含GFP的融合多肽的生物活性的测定
纯化的野生型GFP和包含GFP的融合多肽的生物活性通过其生物发光特性(GFP特异性荧光)来监测。
经由表面等离子共振(SPR，BIAcore)测定BDNF结合亲和力
根据制造商的手册(由GE Healthcare,Uppsala,Sweden提供)，使用胺偶联试剂盒在pH 4.5在CM5芯片上进行捕获系统(对人IgG特异性的捕获单抗(mAb)，JacksonImmunoresearch)的约750共振单位(RU)的胺偶联。人Fc标记的TrkB(R&D Systems，目录号：688-TK-100)以5μg/ml的浓度被捕获。通过以1.25μM的浓度注入人Fc混合物(Biodesign，目录号：50175)封闭过量的结合位点。范围从0.1nM至50nM的不同浓度的包含BDNF的融合多肽以10μL/min的流速、在298K下通过流动池120至240秒。监测解离阶段多至600秒，并通过从样品溶液切换为运行缓冲液触发。通过用100mM磷酸溶液以30μL/min的流速冲洗1分钟使表面再生。对于所有实验，均选择由GE Healthcare提供的HBS-P+缓冲液(10mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，pH 7.4，150mM NaCl，0.05％(v/v)表面活性剂P20)。
通过减去从空白偶联的界面获得的响应校正体积折射率差异。还减去了空白注射(双参照)。
使用BIAevaluation 4.1软件包，通过对用若干不同浓度获得的传感图曲线进行分析，确定平衡解离常数(Kd)(定义为ka/kd)。按照适当的结合模型进行数据拟合。
通过ELISA测定BDNF结合亲和力
用TrkB ELISA测定了包含BDNF的融合蛋白的结合特性。用PBS中的1μg/mL的TrkB-Fc融合物(R&D Systems)包被Maxisorb板，4℃过夜。用PBSTC(含0.05％Tween-20和2％鸡血清(Gibco)的PBS)在室温下对板封闭1小时并用PBST洗涤3次后，将包含BDNF的融合蛋白或单独的BDNF以PBSTC中的15至500ng/mL的浓度加入到孔中并在室温下孵育2小时。洗涤6次后，用小鼠抗BDNF抗体(克隆4F11.1A1，PBSTC中1μg/mL)对孔进行孵育，并且，进一步洗涤后，用抗小鼠-HRP抗体(PBSTC中1:10000)进行孵育，两者均在室温下孵育1小时。用PBST洗涤3次后，使用ABTS底物和492nm波长处的光度定量，检测HRP活性。
通过TrkB报告基因测定来测定包含BDNF的融合蛋白的生物活性
用包含稳定转染的荧光素酶报告基因(该报告基因受控于含SRE(血清应答元件)的启动子)的TrkB转染的CHO细胞系(CHO-K1-hTrkB/pSRE-Luc)测定BDNF变体和包含BDNF的融合蛋白的生物活性。在实验前一天，将细胞培养基由生长培养基(含有10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、300μg/mL G418和3μg/mL嘌呤霉素的Ham’s F12)改变为无FCS的相同培养基，用于饥饿化。第二天，105细胞接种于96孔板的每个孔中的50μL培养基中，然后，在50μL培养基中，以0.02nM和115nM之间的浓度加入BDNF融合蛋白。在37℃,7.5％CO2下孵育4小时后，细胞在室温下平衡30分钟，并且，每孔加入100μL的BrightGlo荧光素酶测定试剂(Promega)。孵育5分钟后，用Tecan酶标仪读取发光(积分时间100ms)。
在SH-SY5Y神经突生长测定中测定包含BDNF的融合蛋白的生物活性
使用人SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞，用神经突生长测定确定BDNF变体和包含BDNF的融合蛋白的生物活性。简言之，在正常生长培养基(Ham’s F12，1×非必需氨基酸(PAN)，10％FCS，2mM L-谷氨酰胺，1×丙酮酸钠(PAN))中，以4000细胞每孔，将SH-SY5Y细胞接种于96孔板中，通过加入10μM视黄酸(Sigma)来诱导神经元分化。三天后，将培养基更换为含有不同浓度BDNF融合蛋白的生长培养基。另外三天后，用PBS中的4％多聚甲醛在室温下对细胞固定10分钟，洗涤，简单通透处理(0.1％Triton-X-100)，用PBS中的1％BSA进行封闭，并且使用在PBS/1％BSA中以1:1000稀释的TuJ1抗体(Covance)针对抗β-微管蛋白免疫反应性染色，然后洗涤3次，并且用Alexa-488标记的抗山羊抗体(Invitrogen)孵育。通过荧光显微镜确定神经突的数目，每孔评估一个视场。
通过FACS测定包含抗体/抗体片段的融合蛋白的结合活性
通过FACS测定BDNF融合蛋白与相应目标受体(转铁蛋白受体，IGF-1R)的结合活性。表达相应受体的细胞(小鼠转铁蛋白受体：MEF-1小鼠胚胎成纤维细胞；IGF-1R：用人IGF-1R稳定转染的3T3成纤维细胞)从它们的生长培养基中收获，用PBS洗涤，并重悬于FACS缓冲液(PBS+5％FCS；96孔圆底平板的每孔为100μL，包含3×105细胞)中。以1-10μg/mL加入一抗(取决于所使用的BDNF融合蛋白，例如，抗人Fab(Jackson ImmunoResearch)或抗His6抗体(Roche))，并且在冰上孵育细胞2小时。用FACS缓冲液洗涤三次后，结合的抗体使用PE标记的二抗(Jackson ImmunoResearch，1:5000–1:10000)来检测，冰上1小时。再次洗涤细胞，并在FACS Canto细胞计数器(Becton-Dickinson)上测量平均荧光。

Claims (8)

1.使用变体原-多肽产生重组多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
-培养包含编码多肽为原-多肽(原-区段和多肽的融合多肽)的核酸的哺乳动物细胞，其中将原-区段和多肽之间的内源性酶促切割位点替换为外源性蛋白酶切割位点，
-从细胞或培养基中回收重组变体多肽或变体原-多肽，并由此产生重组多肽。
2.根据权利要求1的方法，其中外源性蛋白酶切割位点选自包括血纤维蛋白溶酶切割位点、弗林蛋白酶切割位点、IgA蛋白酶切割位点、TEV蛋白酶切割位点(烟草蚀纹病毒)、颗粒酶B切割位点、凝血酶切割位点、因子10切割位点、肠激酶切割位点、枯草杆菌蛋白酶切割位点、组织蛋白酶切割位点、金属蛋白酶切割位点、IDES蛋白酶切割位点、PreScission蛋白酶切割位点或它们的功能性变体的组。
3.根据权利要求1至2中任一项的方法，其中原-多肽的切割在多肽的纯化期间进行。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中外源性蛋白酶是IgA蛋白酶。
5.用于产生融合多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
-培养包含编码变体融合多肽的核酸的哺乳动物细胞，其中融合多肽的氨基酸序列已通过在原-融合多肽中将原-区段和融合多肽之间的内源性蛋白酶切割位点替换为外源性(相对于融合多肽的部分的(一个或多个)来源)或人工蛋白酶切割位点而被修饰，
-从细胞或培养基中回收融合多肽或原-融合多肽，并由此产生(重组的)融合多肽。
6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其特征在于融合多肽包括生物活性实体、接头肽和与血脑屏障(BBB)受体结合的单价结合实体。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于接头肽包含一个或多个带负电荷的氨基酸残基。
8.根据权利要求1至7中任一项的方法，其特征在于多肽是神经营养因子。
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