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CN105820955B - 一种高通量筛选高产谷氨酰胺转氨酶菌株的培养基 - Google Patents

一种高通量筛选高产谷氨酰胺转氨酶菌株的培养基 Download PDF

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CN105820955B CN201610168342.3A CN201610168342A CN105820955B CN 105820955 B CN105820955 B CN 105820955B CN 201610168342 A CN201610168342 A CN 201610168342A CN 105820955 B CN105820955 B CN 105820955B
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Abstract

本发明涉及微生物育种筛选领域，公开了一种新型高通量筛选产谷氨酰胺转氨酶菌株的培养基，包括以下重量配比的原料组成成分：谷氨酰胺转氨酶底物：0.1％‑2％；琼脂：1.5％‑4％；淀粉：2％；硝酸钾：1％；磷酸氢二钾：0.5％；氯化钠：0.5％；七水硫酸镁0.5％；七水合硫酸亚铁：0.01％；酸碱指示剂：0.0001％‑0.01％；pH：6‑8。本发明的培养基用于谷氨酰胺转氨酶菌株筛选时，其具有短周期、可同时筛选大量菌株、不需要任何标记、可以直接筛选得到高产谷氨酰胺转氨酶的菌株等优点。本发明还公开所述培养基的使用方法，在所述培养基上，培养待选菌株3‑5天用于筛选高产菌株。

Description

一种高通量筛选高产谷氨酰胺转氨酶菌株的培养基
技术领域
本发明涉及微生物育种技术领域，具体是涉及一种新型高通量筛选高产谷氨酰胺转氨酶菌株的培养基及其制作方法。
背景技术
谷氨酰胺转氨酶是一种用途广泛的生物催化剂，其商业价值也已在食品行业中得到充分体现。得到高产谷氨酰胺转氨酶的菌株在育种方面是一项重点，可以说一种高通量筛选培养基对得到高产菌株是有着极大优势的。传统高产谷氨酰胺转氨酶菌株的筛选都依靠96孔板发酵后测酶活，但其在准确度和效率上都不甚理想。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种短周期、可以同时筛选大量菌株的培养基以及其制作方法和使用方法。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：本发明新型高通量筛选高产谷氨酰胺转氨酶菌株的培养基包括以下重量配比的原料组成成分：谷氨酰胺转氨酶底物：0.1％-2％；琼脂：1.5％-4％，；淀粉：2％；硝酸钾：1％；磷酸氢二钾：0.5％；氯化钠：0.5％；七水硫酸镁0.5％；七水合硫酸亚铁：0.01％；酸碱指示剂：0.0001％-0.01％；pH：6-8。
优选地，本发明新型高通量筛选高产谷氨酰胺转氨酶菌株的培养基，其包括以下重量配比的原料组成成分：谷氨酰胺转氨酶底物：1％；琼脂：2％；淀粉：2％；硝酸钾：1％；磷酸氢二钾：0.5％；氯化钠：0.5％；七水硫酸镁：0.5％；七水合硫酸亚铁：0.01％；酸碱指示剂：0.001％；pH：7.4。
其中，所述谷氨酰胺转氨酶底物包括酶水解干酪素、明胶。
其中，所述酸碱指示剂包括甲酚红、苯酚红。
本发明还提出了所述新型高通量筛选高产谷氨酰胺转氨酶菌株的培养基的制备方法：
(1)称取1％谷氨酰胺转氨酶底物、2％琼脂、2％淀粉、1％硝酸钾、0.5％磷酸氢二钾、0.5％氯化钠、0.5％七水硫酸镁、0.01％七水合硫酸亚铁。
(2)用水补足体积后，调整pH至7.4，121℃高温高压灭菌20分钟后，放入65℃烘箱恒温一小时，加入过滤除菌的0.001％酸碱指示剂。
(3)将配置好的培养基混匀后，以20mL/皿的体积倒入各培养皿中待冷却至室温。
本发明还提出了一种所述高通量筛选高产谷氨酰胺转氨酶菌株的培养基的使用方法，在所述培养基上，培养待选菌株3-5天用于筛选高产菌株。
其中，所述菌株包括链霉菌属茂源链霉菌。
具体地，本发明所述培养基的使用方法，包括如下步骤：
(1)将待选菌株悬浮在无菌生理盐水中，并用无菌的生理盐水进行充分稀释，使悬浮细胞不超过500个/mL。
(2)将稀释好的菌株悬液吸取0.1mL滴加在本发明所述培养基上，并将滴加的菌株悬液均匀涂布在培养基表面。
(3)把涂布有菌液的本发明所述培养基放在28℃恒温培养3-5天。
(4)根据单菌落周围培养基的颜色来挑选出高产谷氨酰胺转氨酶的菌株。
本发明还提出了将本发明的培养基用于菌株筛选的应用。
其中，所述菌株包括链霉菌属茂源链霉菌。
本发明培养基提供了一种可直观筛选出高产谷氨酰胺转氨酶的菌株的方法。缩短了现有“育种—培养—筛选”的过程，实现了“育种-筛选”的简化过程。与营养缺陷型培养基完全不同，不需要任何标记，可以直接筛选得到高产谷氨酰胺转氨酶的菌株。同时相较其他靠筛选标记筛选的方法，本发明培养基避免了因标记不完全而漏掉高产菌株的弊病。
本发明有益效果包括：(1)缩短了育种筛选的整体周期；(2)降低了育种筛选周期所需的成本；(3)可有效筛选得到高产谷氨酰胺转氨酶的菌株；(4)增加了一次性可筛选的通量。
本发明利用谷氨酰转氨酶在单底物下水解释放氨的原理，加之酶浓度与反应速率成正相关的原理，利用指示剂表征酶浓度，直接测量菌株在普通培养基中的产酶效率。同时所用筛选用底物都不为菌株本身利用，以排除菌株本身的影响。
附图说明
图1是实施例1利用酶水解干酪素作为基质，甲酚红作为指示剂的本发明筛选鉴定结果。
图2是实施例2利用明胶作为基质，苯酚红作为指示剂的本发明筛选鉴定结果。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1配制本发明新型高通量筛选高产谷氨酰胺转氨酶菌株的培养基，包括以下重量配比的原料组成：
酶水解干酪素：1％
琼脂：2％
淀粉：2％
硝酸钾：1％
磷酸氢二钾：0.5％
氯化钠：0.5％
七水硫酸镁：0.5％
七水合硫酸亚铁：0.01％
甲酚红：0.001％
pH：7.4
制作如上所述新型高通量筛选高产谷氨酰胺转氨酶菌株的培养基的方法：
1.称取1％酶水解干酪素、2％琼脂、2％淀粉、1％硝酸钾、0.5％磷酸氢二钾、0.5％氯化钠、0.5％七水硫酸镁、0.01％七水合硫酸亚铁。
2.用水补足体积后，调整pH至7.4，121℃高温高压灭菌20分钟后，放入65℃烘箱恒温一小时，加入过滤除菌的0.001％酸碱指示剂。
3.将配置好的培养基混匀后，以20mL/皿的体积倒入各培养皿中待冷却至室温。
4.将两种需要鉴定的产谷氨酰胺转氨酶菌株进行培养，培养基采用步骤(3)制得的新型培养基。
5.培养3天后，根据单菌落周围的培养基红色深浅进行判断，如图1所示。图中显示，B比A菌株的颜色更深，根据本发明的说明，B菌株的产酶比A的产酶更高。随后对两种需鉴定的菌种进行在普通发酵培养基中进行发酵，利用N-α-苄氧羟基-谷氨酰胺-甘氨酸作为底物的比色法进行酶活测定。进行酶活比对发现，A菌株在30h发酵培养基中酶活约为1.8U/mL，B菌株在30h培养基中酶活约为2.4U/mL。
利用本发明新型筛选培养基进行筛选培养，相比较96孔板筛选，节省了单细胞扩增为单菌落的时间，同时稀释涂板效率远远高于96孔板的挑菌筛选。大大缩短筛选周期，同时也提高了筛选效率。
实施例2配制本发明新型高通量筛选高产谷氨酰胺转氨酶菌株的培养基，包括以下重量配比的原料组成：
明胶：2％
琼脂：2％
淀粉：2％
硝酸钾：1％
磷酸氢二钾：0.5％
氯化钠：0.5％
七水硫酸镁：0.5％
七水合硫酸亚铁：0.01％
苯酚红：0.01％
pH：7.4
制作如上所述的一种新型高通量筛选高产谷氨酰胺转氨酶菌株的培养基的方法：
1.称取2％明胶、2％琼脂、2％淀粉、1％硝酸钾、0.5％磷酸氢二钾、0.5％氯化钠、0.5％七水硫酸镁、0.01％七水合硫酸亚铁。
2.用水补足体积后，调整pH至7.4，121℃高温高压灭菌20分钟后，放入65℃烘箱恒温一小时，加入过滤除菌的0.01％苯酚红。
3.将配置好的培养基混匀后，以20mL/皿的体积倒入各培养皿中待冷却至室温。
4.将两种需要鉴定的产谷氨酰胺转氨酶菌株进行培养，培养基采用步骤(3)制得的新型培养基。
5.培养5天后，根据单菌落周围的培养基红色深浅进行判断，如图2所示。图中显示，B比A菌株的颜色更深，根据本发明的说明，B菌株的产酶比A的产酶更高。随后对两种需鉴定的菌种进行在普通发酵培养基中进行发酵，利用N-α-苄氧羟基-谷氨酰胺-甘氨酸作为底物的比色法进行酶活测定。进行酶活比对发现，A菌株在30h发酵培养基中酶活约为1.8U/mL，B菌株在30h培养基中酶活约为2.4U/mL。

Claims (4)

1.一种高通量筛选高产谷氨酰胺转氨酶菌株的培养基，其特征在于，所述培养基由以下重量配比的原料组成：
谷氨酰胺转氨酶底物：1％-2％；
琼脂：2％；
淀粉：2％；
硝酸钾：1％；
磷酸氢二钾：0.5％；
氯化钠：0.5％；
七水硫酸镁0.5％；
七水合硫酸亚铁：0.01％；
酸碱指示剂：0.001％-0.01％；
pH：7.4；
其中，所述谷氨酰胺转氨酶底物为酶水解干酪素或明胶，所述酸碱指示剂为甲酚红或苯酚红。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，其使用方法是在该培养基上，培养待选菌株3-5天用于筛选高产菌株。
3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述菌株包括链霉菌属产谷氨酰胺转氨酶的菌株。
4.将权利要求1所述的培养基用于在高产谷氨酰胺转氨酶的茂源链霉菌筛选中的应用。
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