CN105802995A - 一种利用cho细胞生产重组蛋白的基因表达系统及真核表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种利用CHO细胞生产重组蛋白的基因表达系统及真核表达载体。本发明提供一种pHLX201真核表达载体，包括GS表达单元，所述GS表达单元的序列包括5’至3’方向依次排列的SV40L启动子基因序列、谷氨酰胺合成酶基因序列，所述SV40L启动子基因序列如SEQ ID NO：2所示；所述谷氨酰胺合成酶基因序列如SEQ ID NO：3所示。本发明所提供的表达系统能够实现外源基因在CHO细胞基因组中的整合和高效表达。该系统的制备方法主要包括：构建真核表达载体，适合于目的基因在CHO细胞中的瞬时表达，并适合于目的基因高表达细胞株筛选。利用本发明的CHO表达系统可以实现重组蛋白、单克隆抗体等在CHO细胞中的整合和表达，具有广阔的应用前景。

Description

一种利用CHO细胞生产重组蛋白的基因表达系统及真核表达载体

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种利用CHO细胞生产重组蛋白的基因表达系统及真核表达载体。

背景技术

基因工程领域所用基因表达系统大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达系统。与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的糖基化修饰，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。哺乳动物细胞的规模化生产技术也日渐成熟和完善。因此，通过哺乳动物细胞培养表达制备治疗性重组蛋白质药物已经成为当今生物制药领域的主流技术。目前已经上市和正在进行临床试验的蛋白质药物中，主要来自于哺乳动物细胞，而这其中中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)是最常用基因工程宿主细胞。

为了获得高效的外源基因表达，基因工程CHO细胞中常使用二氢叶酸还原酶(Dihydrofolatereductase，DHFR)和谷氨酰胺合成酶(Glutaminesynthetase，GS)进行基因扩增和筛选。谷氨酰胺合成酶表达系统(GS表达系统)往往只需一轮加压筛选，所需筛选时间短；另外由于携带有GS基因的细胞株在放大培养过程中不需要添加谷氨酰胺，因此，受代谢副产物NH3毒的影响较小，有利于工艺优化及放大培养。

利用GS、DHFR基因扩增和筛选系统的表达载体多由美国等发达国家开发，其专利保护、技术转让壁垒极大地限制了我国生物制药技术及工业的发展，因此现在急需一种具有自主知识产权的表达系统，以促进相关蛋白药物的开发和我国生物制药工业的进步。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种pHLX201真核表达载体，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种pHLX201真核表达载体，包括GS表达单元，所述GS表达单元的序列包括5’至3’方向依次排列的SV40L启动子基因序列(SV40Lpromoter)、谷氨酰胺合成酶基因序列(GS)，所述SV40L启动子基因序列如SEQIDNO：2所示；所述谷氨酰胺合成酶基因序列如SEQIDNO：3所示。

优选的，所述GS表达单元基因序列如SEQIDNO：4所示。

优选的，所述GS表达单元的序列还包括酶切位点序列，所述GS表达单元的序列包括5’至3’方向依次排列的酶切位点序列、SV40L启动子基因序列(SV40Lpromoter)、谷氨酰胺合成酶基因序列(GS)以及酶切位点序列。

更优的，所述酶切位点序列选自HindIII酶、NotI酶、XhoI酶中的一种或多种的组合。

进一步优选的，所述含有酶切位点的GS表达单元序列可以如SEQIDNO：5所示。

优选的，本发明所提供的pHLX201真核表达载体是由pHLX101真核表达载体改造获得。

更优的，所述pHLX201真核表达载体是在pHLX101载体的GS基因序列的SV40PolyA末端和promotorA之间插入第二个外源基因表达单元，即启动子A、外源基因和SV40PolyA，再将原有GS表达单元替换为新的GS基因序列及其启动子。

本发明第二方面提供所述pHLX201真核表达载体的制备方法，由pHLX101真核表达载体改造获得，改造过程主要包括如下步骤：

通过PCR的方法将pHLX101载体线性化，并在两端添加酶切位点序列，将单基因表达载体改为双基因表达载体；替换原来的GS表达单元，采用PCR、酶切、连接的方法将新的GS表达单元插入表达载体，筛选、鉴定正确的连接产物为本发明的pHLX201真核表达载体。

具体方法为：

1)双基因载体的制备：利用引物S322(SEQIDNO：6)和S323(SEQIDNO：7)扩增抗体轻链表达单元，再用引物S324(SEQIDNO：8)、S325(SEQIDNO：9)获得线性化的抗体重链基因表达载体作为构建双基因载体的骨架，将以上两个片段连接、转化，筛选正确的转化子；

2)GS表达单元的优化：将CHO细胞的谷氨酰胺合成酶基因与SV40L启动子组成表达单元，并同时在两端添加酶切位点，通过酶切连接分别插入pHLX101双基因表达载体，替换载体上原有GS表达单元。

较优的，所述pHLX201真核表达载体适用于CHO细胞。

更优的，所述pHLX201真核表达载体适用于CHO-S细胞。

本发明第三方面公开了一种pHLX201-CHO真核表达系统，包括本发明所述的pHLX201真核表达载体以及中国仓鼠卵巢细胞。

优选的，所述中国仓鼠卵巢细胞为GS基因敲除的CHO-S细胞。

本发明第四方面公开了利用所述pHLX201-CHO真核表达系统制备重组蛋白的方法，包括如下步骤：

1)重组质粒的构建：先将重组蛋白1或重组蛋白2的外源基因分别插入pHLX201单基因表达载体中，然后再构建表达双基因的重组质粒；

2)表达系统的筛选：重组质粒转化CHO细胞，筛选稳定表达的细胞株作为pHLX201-CHO真核表达系统；

3)采用上一步筛选的pHLX201-CHO真核表达系统表达重组蛋白。

所述步骤1)中外源基因插入载体后，构成外源基因表达单元，所述外源基因表达单元的序列包括5’至3’方向依次排列的启动子序列、外源基因序列以及终止信号和polyA加尾信号序列。

更优的，步骤1)所述外源基因表达单元的序列还包括两端的酶切位点序列。

更优的，步骤1)具体为：将外源基因表达单元通过酶切、连接的方法插入pHLX201真核表达载体，连接产物转化感受态细胞，筛选正确连接的载体作为构建成功的重组质粒。

优选的，所述步骤2)中，筛选的具体方法为：采用添加有Amp的2YT培养基选择培养转化了连接产物的感受态细胞，挑取单克隆进行菌落PCR，对PCR产物电泳分析或者测序分析。

优选的，所述步骤2)中，筛选的具体方法为：重组质粒转化CHO细胞后，通过MSX进行加压筛选，获得稳定表达的细胞株。

较优的，所述MSX加压筛选的终浓度为20～60μmol。

本发明第五方面提供所述pHLX201真核表达载体、pHLX201-CHO真核表达系统在重组蛋白表达中的用途。

本发明公开了一种在CHO细胞中利用pHLX201双基因真核表达载体生产重组蛋白的基因表达系统，该表达系统能够实现外源基因在CHO细胞基因组中的整合和高效表达。该系统的制备方法主要包括：构建真核表达载体，适合于目的基因在CHO细胞中的瞬时表达，并适合于目的基因高表达细胞株筛选。利用本发明的CHO表达系统可以实现重组蛋白、单克隆抗体等在CHO细胞中的整合和表达，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：PCR扩增片段“启动子A+HLX01-LC+SV40polyA”及线性化pHLX101-HLX01-HC电泳图(L1-L4:用引物S322、S323扩增DNA片段“启动子A+HLX01-LC+SV40polyA”，L5-L8：用引物S324、S325线性化载体pHLX101-HLX01-HCPCR产物)

图2：菌液PCR鉴定阳性单克隆电泳图(M:DNAMaker，L1-L7：用引物S138和引物S146扩增的产物，大小约为4200碱基对，L8：以pHLX101-HLX01-HC载体为模板的PCR产物)

图3：GS基因前段和后段PCR产物电泳图(L1：用引物S341和引物S350对GS基因前段的PCR产物，L2：用引物S342和引物S3549对GS基因后段的PCR产物)

图4：TK启动子及GS基因融合电泳图(M：DNAMarker，L1-L2：TK及GS融合后产物，L3：回收胶中TK及GS融合后产物)

图5：菌液PCR鉴定阳性单克隆电泳图(M：DNAMarker，L1-L10：1-10个单克隆菌液为模板的PCR产物)

图6：SV40L启动子与GS前段PCR产物电泳图(M：DNAMarker，L1：SV40L启动子与GS前段PCR产物)

图7：SV40L启动子与GS融合电泳图(M：DNAMarker，L1：SV40L启动子与GS前段、后段融合产物，大小为4964碱基对)

图8：pHLX101-HLX01双基因表达载体用XhoI和NotI双酶切图谱

图9：质粒双酶切筛选阳性克隆电泳图(M：DNAMarker，L1：4#克隆小抽质粒，L3：4#克隆质粒双酶切XhoI和NotI，L2：8#克隆小抽质粒，L4：8#克隆小抽质粒双酶切XhoI和NotI，L5：13#小抽质粒，L6：13#克隆小抽质粒双酶切XhoI和NotI)

图10：pHLX201-HLX01双基因表达载体中增加I-SceI识别位点PCR电泳图(M：DNAMarker，L1：引物S364，S365扩增产物，SacII→I-SceI片段，大小为2262碱基对，L2：引物S366，S367扩增产物，I-SceI→HindIII片段，大小为1192碱基对)

图11：图11中SacII→I-SceI片段与I-SceI→HindIII片段融合电泳图(M：DNAMarker，L1：SacII→I-SceI片段与I-SceI→HindIII片段融合后产物，L2：融合产物用引物S364，S367扩增后产物，大小约为3300碱基对，L3：回收胶中融合产物)

图12：pHLX201-HLX01双基因表达载体酶切电泳图(M：DNAMarker，L1：pHLX201-HLX01小抽质粒，L2：L1中质粒用SacII和HindIII酶切后结果，L3：L1中质粒SacII和HindIII酶切后回收胶电泳结果)

图13：pHLX201-HLX01双基因表达载体增加I-SceI位点后阳性克隆筛选结果(M：DNAMarker，L1-11：1-11#克隆质粒用SacII，I-SceI和HindIII酶切后结果)

图14：pHLX201-HLX01与pEE14.4-HLX01双基因表达载体电转前线性化电泳图(M：DNAMarker，L1：pEE14.4-HLX01双基因表达载体，中抽质粒，L2：PvuI消化pEE14.4-HLX01双基因表达载体，L3：pHLX201-HLX01I-SceI中抽质粒，L4：I-SceI消化pHLX201-HLX01质粒)

图15：pHLX101双基因表达载体图谱

图16：pHLX101TKGS双基因表达载体图谱

图17：pHLX201双基因表达载体图谱

图18：环形pHLX101，pHLX201和pEE14.4双基因表达载体在CHO-S细胞中的表达能力比较

图19：线性化的pHLX201与pEE14.4双基因表达载体表达能力比较

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。

实施例1

pHLX101双基因表达载体的构建

用引物S322，S323将pHLX101-HLX01-HC(由上海复宏汉霖生物技术有限公司构建，参见中国专利201210211812.1)表达载体线性化，作为双基因表达载体的框架，再用引物S324，S325扩增pHLX101-HLX01-LC(由上海复宏汉霖生物技术有限公司构建，参见中国专利201210211812.1)表达载体的转录单元，包括启动子A序列、HLX01轻链基因序列和SV40polyA基因序列，同时引入酶切位点BglII和XhoI。

表1.PCR引物序列表

线性化pHLX101-HLX01-HCPCR反应条件：变性98℃10秒，退火58℃5秒，延伸72℃120秒，35循环。

扩增pHLX101-HLX01-LC表达载体的转录单元反应条件：变性98℃10秒，退火58℃5秒，延伸72℃60秒，35循环。

琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，将扩增的轻链表达单元和线性化载体进行胶回收纯化，然后分别用内切酶BglII和XhoI在37℃水浴中消化1个小时，反应结束后再次纯化DNA片段和载体，将轻链表达单元与载体在连接酶(NEB公司产品)作用下进行连接反应，将连接产物转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞。

用PCR反应进行阳性单克隆鉴定，所用引物为S138(SEQIDNO：10)和S146(SEQIDNO：11)，PCR反应条件为：变性98℃10秒，退火58℃5秒，延伸72℃60秒，35循环，如图2所示，将鉴定正确的载体命名为pHLX101Dual-HLX01。

实施例2

优化GS表达单元序列

1.构建含有TK启动子和CHO细胞GS基因的pHLX101双基因表达载体

1.1GS基因序列合成用化学合成法制备GS基因的前段和后段，其中前段序列为SEQIDNo.3的1-1691，后段为SEQIDNo.3的1686-4599。采用引物S341(SEQIDNo.12)和S350(SEQIDNo.13)以及S342(SEQIDNo.14)和S349(SEQIDNo.15)，利用PCR分别扩增GS基因的前段和后段，PCR反应条件：变性98℃5秒，退火58℃5秒，延伸72℃60秒，35循环。

1.2TK启动子序列合成用引物S355(SEQIDNo.16)和S337(SEQIDNo.18)以载体pHLX101为模板，扩增出TK启动子。PCR反应条件：变性98℃5秒，退火58℃5秒，延伸72℃10秒，25循环。

1.3融合TK启动子、GS基因前段和后段

表2.融合反应体系

反应条件：变性98℃10秒，退火58℃5秒，延伸72℃3分钟，25循环。融合后DNA片段进行琼脂糖凝胶分析，如图3所示，然后将大小为4770碱基对的片段回收。

1.4用内切酶XhoI和NotI消化融合片段(包括TK启动子、GS基因前段和后段)用XhoI和NotI同时对融合片段在37℃水浴中消化1个小时，同时载体pHLX101Dual-HLX01也用XhoI和NotI进行消化，经琼脂糖凝胶电泳，并回收大小为7200碱基对的载体片段，如图4所示。

1.5连接反应用快速连接酶对内切酶消化并纯化后的融合片段和载体进行连接，挑选单克隆在2YT培养基中培养，以菌液为模板做PCR反应，结果如图5所示，送阳性克隆去测序验证，将测序正确的载体命名为pHLX101DualTKGS-HLX01。

2.构建含有SV40L启动子和CHO细胞来源GS的pHLX101双基因表达载体即pHLX201双基因表达载体

2.1扩增CHO细胞来源GS前段及其启动子SV40L：化学合成制备SV40L和GS前段序列的融和片段(SEQIDNo.17)，以此序列为模板用引物S350(SEQIDNo.13)、S360(SEQIDNo.19)扩增得到SV40L及GS前段序列，反应条件：变性98℃10秒，退火58℃5秒，延伸72℃1分钟，30循环。结果如图6所示，再与实施例1.1中制备得到的GS后段融合，融合反应为：变性98℃10秒，退火58℃5秒，延伸72℃2分钟，20循环。融合成功的片段在琼脂糖凝胶中电泳，结果如图7所示，与非目的条带分离后，割胶回收。

2.2酶切连接反应：用NotI和XhoI同时消化实施例2.1制备得到的融合片段SV40L及GS全序列，同样用这两个酶对实施例1.4中得到的pHLX101Dual-HLX01双基因表达载体进行消化反应，目的片段在琼脂糖凝胶中电泳后割胶回收，结果如图8。取30ng酶切后的载体和70ng酶切后的SV40L及GS融合片段，用快速连接酶进行连接反应，连接产物转化入DH5α感受态细胞。提取阳性克隆的质粒，经NotI和XhoI酶切验证筛选阳性克隆，结果如图9。

2.3添加线性化酶切位点由于改变了pHLX101双基因表达载体中GS及其启动子序列，原有的载体线性化酶切位点不能继续使用，所以需要在不影响各元件功能前提下，在载体上增加一个新的限制性内切酶识别位点。

I-SceI识别序列为：TAGGGATAACAGGGTAAT(5’→3’)，序列较长，不易被重复，酶切反应易进行。为了在pHLX201第1061-1062碱基处引入I-SceI识别位点，设计引物S364(SEQIDNo.20)和S365(SEQIDNo.21)以及S366(SEQIDNo.22)和S367(SEQIDNo.23)，以实施例2.2得到的质粒为模板，采用PCR反应，反应条件为：变性98℃10秒，退火58℃5秒，延伸72℃1分钟，35循环。分别扩增出大小为2262碱基对和1192碱基对的DNA片段产物，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离结果如图10所示。在利用PCR融合反应将两段DNA融合在一起，使用引物为S364和S367融合反应条件为：变性98℃10秒，退火58℃5秒，延伸72℃2分钟，20循环。融合产物在琼脂糖凝胶中电泳并回收，结果如图11。

用SacII和HindIII分别对上述融合片段以及实施例2.2中制备的pHLX201双基因表达载体进行消化，反应结束后对片段DNA纯化试剂盒进行纯化，对pHLX201双基因经过琼脂糖凝结电泳，结果如图12，然后进行割胶回收。再用快速连接酶与片段、载体混合，在25℃水浴里反应5分钟，连接产物转化进入DH5α感受态细胞。用酶切验证筛选阳性克隆对比结果如图13。

3.比较实例1.4中的pHLX101和实例2.3中pHLX201双基因表达载体在CHO-S细胞中的表达

3.1电转：将pHLX101DualTKGS-HLX01，pHLX201-HLX01和pEE14.4-HLX01双基因表达质粒电转进入GS(谷氨酰胺合成酶基因)敲除的CHO-S细胞，48小时后对电转后细胞进行活力计数，以5000细胞/孔，10000细胞/孔的密度在96孔板中铺板，每个密度下筛选剂MSX的浓度分别为0μM，20μM，40μM,60μM，筛选使用的培养基为含有1×GSSupplement和一定浓度MSX的CDCHO。

3.2筛选：电转后细胞种入96孔板后放入37℃，5％CO₂的培养箱中，单克隆生长需要18至22天。从表3中可以看出，pHLX101DualTKGS-HLX01几乎没有克隆长出，而pHLX201-HLX01和pEE14.4-HLX01都有一定数量的克隆长出，说明带有TK启动子的质粒，无法表达有效的GS基因。而pHLX201-HLX01能够耐受一定浓度MSX的筛选，说明SV40L的启动子在该条件下优于TK启动子。

3.396孔板中IgG表达量定量：用2μg/mL抗人Fd多抗包被96半孔板，PBS缓冲液冲洗2次，再以含有5％牛奶的PBS封闭96半孔板1个小时，PBS缓冲液冲洗2次；取有克隆生长出的孔中上清10uL,用PBS稀释200或400倍，向半孔板中每孔加入30uL，室温结合1个小时；将上清吸去，PBS缓冲液冲洗3次；向每孔中加入30uL抗人kappa轻链并带有HRP标记的二抗，室温结合1个小时；将上清吸去，PBS冲洗4次。每孔加入30uLTMB，反应3到5分钟用2MH₂SO₄终止反应，最后在450nm波长下读取吸光值。结果如图18，可以看出pHLX201-HLX01的克隆的表达量，其中表达量高的能达到50μg/mL，与商业化的表达载体pEE14.4-HLX01的表达量相近。

表3.各筛选条件下单克隆数目统计

4.比较线性化实例2.3中质粒与pEE14.4-HLX01在CHO-S细胞中的表达

4.1线性化质粒：为提高质粒整合进入宿主细胞基因组效率，用限制性内切酶I-SceI消化实例2.3得到的质粒，限制性内切酶PvuI消化pEE14.4-HLX01，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图14。

4.2纯化并浓缩质粒：用等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)与质粒溶液充分混匀，高速离心后取上层水相至另一新管，用等体积氯仿与含有DNA的水相充分混匀，高速离心后取最上层水相至另一新管中，加入1/10体积的3MNaAC,pH5.2,再加入3倍体积的无水乙醇混匀后使质粒DNA发生沉淀，14000转/分钟离心10分钟，使DNA沉淀至管底，弃上清，用预冷的75％乙醇洗涤DNA沉淀2次，使DNA沉淀在室温下自然干燥，加入一定体积的超纯水使DNA溶解，并且浓度不低于1ug/uL。

4.3电转：将线性化的pHLX201-HLX01和pEE14.4-HLX01双基因表达质粒电转进入GS(谷氨酰胺合成酶基因)敲除的CHO-S细胞，48小时后对电转后细胞进行活力计数，以3000细胞/孔,6000细胞/孔和9000细胞/孔的密度在96孔板中铺板，每个密度下筛选剂MSX的浓度分别为0μM，20μM，40μM,60μM，筛选使用的培养基为含有1×GSSupplement和一定浓度MSX的CDCHO。

4.4筛选：电转后细胞种入96孔板后放入37℃，5％CO₂的培养箱中，单克隆生长需要18至22天。

4.596孔板中IgG表达量定量：用2μg/mL抗人Fd多抗包被96半孔板，PBS缓冲液冲洗2次，再以含有5％牛奶的PBS封闭96半孔板1个小时，PBS缓冲液冲洗2次；取有克隆生长出的孔中上清10uL,用PBS稀释200或400倍，向半孔板中每孔加入30uL，室温结合1个小时；将上清吸去，PBS缓冲液冲洗3次；向每孔中加入30uL抗人kappa轻链并带有HRP标记的二抗，室温结合1个小时；将上清吸去，PBS冲洗4次。每孔加入30uLTMB，反应3到5分钟用2MH₂SO₄终止反应，最后在450nm波长下读取吸光值。

4.6在管式反应器中比较表达量：将96孔板中表达量最高的细胞吸出放入24孔板中培养3到4天，细胞总数增加至10⁶个左右时，将细胞转移至5mL管式反应器中，进行扩增培养，将所有克隆的细胞密度调整为3×10⁵个/mL，开始做补料培养。培养期间对细胞活率和密度进行记录。待细胞活率下降至50％以下收集培养上清，用ELISA做定量，具体方法与4.5中描述相同。结果如图19，可以看出pHLX201载体的表达量能达到200μg/mL左右，与商业化的pEE4.4的表达量相当。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (12)

1.一种pHLX201真核表达载体，包括GS表达单元，所述GS表达单元的序列包括5’至3’方向依次排列的SV40L启动子基因序列、谷氨酰胺合成酶基因序列，所述SV40L启动子基因序列如SEQIDNO：2所示；所述谷氨酰胺合成酶基因序列如SEQIDNO：3所示。

2.如权利要求1所述的一种pHLX201真核表达载体，其特征在于，所述GS表达单元基因序列如SEQIDNO：4所示。

3.如权利要求1所述的一种pHLX201真核表达载体，其特征在于，所述GS表达单元的序列还包括酶切位点序列，所述GS表达单元的序列包括5’至3’方向依次排列的酶切位点序列、SV40L启动子基因序列、谷氨酰胺合成酶基因序列以及酶切位点序列。

4.如权利要求3所述的一种pHLX201真核表达载体，其特征在于，所述酶切位点序列选自HindIII酶、NotI酶、XhoI酶中的一种或多种的组合。

5.如权利要求4所述的一种pHLX201真核表达载体，其特征在于，所述含有酶切位点的GS表达单元序列如SEQIDNO：5所示。

6.如权利要求1所述的一种pHLX201真核表达载体，其特征在于，本发明所提供的pHLX201真核表达载体是由pHLX101真核表达载体改造获得。

7.如权利要求1-6任一权利要求所述的pHLX201真核表达载体的制备方法，由pHLX101真核表达载体改造获得，改造过程主要包括如下步骤：

通过PCR的方法将pHLX101载体线性化，并在两端添加酶切位点序列，将单基因表达载体改为双基因表达载体；替换原来的GS表达单元，采用PCR、酶切、连接的方法将新的GS表达单元插入表达载体，筛选、鉴定正确的连接产物为本发明的pHLX201真核表达载体。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1)双基因载体的制备：利用引物S322和S323扩增抗体轻链表达单元，再用引物S324、S325获得线性化的抗体重链基因表达载体作为构建双基因载体的骨架，将以上两个片段连接、转化，筛选正确的转化子；

2)GS表达单元的优化：将CHO细胞的谷氨酰胺合成酶基因与SV40L启动子组成表达单元，并同时在两端添加酶切位点，通过酶切连接分别插入pHLX101双基因表达载体，替换载体上原有GS表达单元。

9.一种pHLX201-CHO真核表达系统，包括如权利要求1-6任一权利要求所述的pHLX201真核表达载体以及中国仓鼠卵巢细胞。

10.如权利要求9所述的pHLX201-CHO真核表达系统，其特征在于，所述中国仓鼠卵巢细胞为GS基因敲除的CHO-S细胞。

11.如权利要求9-10任一权利要求所述的pHLX201-CHO真核表达系统制备重组蛋白的方法，包括如下步骤：

1)重组质粒的构建：先将重组蛋白1或重组蛋白2的外源基因表达单元分别插入pHLX201单基因表达载体中，然后再构建表达双基因的重组质粒；

2)表达系统的筛选：重组质粒转化CHO细胞，筛选稳定表达的细胞株作为pHLX201-CHO真核表达系统；

3)采用上一步筛选的pHLX201-CHO真核表达系统表达重组蛋白。

12.如权利要求1-6任一权利要求所述的pHLX201真核表达载体、如权利要求9-10任一权利要求所述的pHLX201-CHO真核表达系统在重组蛋白表达中的用途。