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CN105793307A - 杂臂支化聚合物 - Google Patents

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CN105793307A
CN105793307A CN201480065118.0A CN201480065118A CN105793307A CN 105793307 A CN105793307 A CN 105793307A CN 201480065118 A CN201480065118 A CN 201480065118A CN 105793307 A CN105793307 A CN 105793307A
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CN
China
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homopolymer
ester
polymer
methyl
chain
Prior art date
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Pending
Application number
CN201480065118.0A
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English (en)
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帕蒂拉贾·阿拉奇拉格·古纳蒂拉克
特蕾西·米歇尔·欣顿
桑·霍阿·唐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Original Assignee
Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Application filed by Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO filed Critical Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
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Abstract

本发明涉及支化聚合物，所述支化聚合物包括支撑部分和各自共价连接至所述支撑部分并从所述支撑部分延伸的至少三种均聚物链，其中所述至少三种均聚物链包括阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链。

Description

杂臂支化聚合物
技术领域
本发明总体上涉及杂臂支化聚合物(mikto-armbranchedpolymer)。换句话说，发明总体上涉及具有至少三种不同聚合物臂的支化聚合物。杂臂支化聚合物特别适合于在形成具有核酸分子的复合物中使用，并且因此其将便于连同针对本申请的重点描述本发明。然而，应该理解杂臂支化聚合物可以在各种其他应用中使用。因此发明也涉及核酸分子和杂臂支化聚合物的复合物，涉及这种复合物在递送核酸分子至细胞的方法中的用途，并且涉及沉默基因表达的方法。发明进一步涉及杂臂支化聚合物在保护核酸分子不受酶降解的方法中的用途。
背景技术
支化聚合物是本领域已知的一类聚合物，包括支撑部分(supportmoiety)诸如原子或分子，至少三种聚合物链附接至其上。至少三种聚合物链可以称为支链化组合物的“臂(arm)”。特定类型的支化聚合物包括星型聚合物、梳型聚合物、刷型聚合物和树状物。
已经发现支化聚合物展现出各种独特的性能并且已经在不同种类的应用功能中采用，例如弹性体、表面活性剂、润滑剂和用于生物活性剂(生物活性物，bioactive)的递送剂。
由于存在影响结果的多种变量诸如生物活性剂稳定性、释放速率、释放触发物和生物相容性，生物活性剂的递送仍具有挑战。
因此，仍具有机会开发展现出适合于进一步延伸这类化合物的利用性(utility)的性能的新型支化聚合物结构。
发明内容
本发明提供了支化聚合物，包括支撑部分和各自共价连接至支撑部分且从支撑部分延伸的至少三种均聚物链，其中至少三种均聚物链包括阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链。
现在已经发现根据本发明的支链化聚合物提供了至少阳离子、亲水性和疏水性均聚物特征的独特组合，这令人惊讶的是使它们不仅能够有效地形成与核酸分子的复合物，而且增强了产生的复合物的血清稳定性和细胞摄取。
附接至支撑部分的至少三种均聚物臂的每一种均是不同的，且因此支化聚合物也可以称为杂臂支化聚合物。
WO2013/113071公开了支化聚合物，包括支撑部分和共价连接至该部分且从该部分延伸的至少三种嵌段共聚物链。嵌段共聚物链各自包括亲水性聚合物嵌段和阳离子聚合物嵌段，以及可选的疏水性聚合物嵌段。令人惊讶地，尽管具有与WO2013/113071中公开的支化聚合物相似的聚合物组分，但是根据本发明的支化聚合物的杂臂均聚物结构展示了相比于WO2013/113071中公开的支链化嵌段共聚物结构的改进的性能。
例如，根据本发明的支化聚合物的杂臂均聚结构展示了改进的基因沉默特性。这种改进的性能包括在低剂量下的基因沉默。例如，与在至少250nM的siRNA浓度下使用WO2013/113071中公开的支链化的嵌段共聚物结构相比，在低至50nM的siRNA浓度下获得有效基因沉默。在多细胞系中的使用也已经展示出指示的多功能性(versatility)。与使用WO2013/113071中公开的支链化的嵌段共聚物结构实现相同的目的所需的多步方法相比，根据本发明的支化聚合物的杂臂均聚物结构也可以是在臂端部更容易官能化。
在一个实施方式中，支化聚合物是杂臂星型聚合物(mikto-armstarpolymer)。
在另一个实施方式中，至少三种均聚物链的一种或多种通过可降解的官能团共价连接至支撑部分。
可降解的官能团的降解产生共价连接的断裂并且均聚物链从支撑部分上分割开。
至少三种均聚物链的每一种可以通过可降解的官能团共价连接至支撑部分。
在另一个实施方式中，支撑部分具有分子结构，包括一种或多种可降解的官能团，当经历降解之后这在分子结构中产生一个或多个共价键的断裂并且从支撑部分释放至少三种均聚物链的至少一种。
从支化聚合物失去一种或多种均聚物链可以有利地促进聚合物性能诸如亲水性、疏水性或阳离子特性的改变。支化聚合物的分子量当然也将减少。
通过可降解官能团的合适的选择和定位，可以设计支化聚合物在特定的降解环境中经历特定地结构转变。
在一个实施方式中，可降解的官能团是生物可降解官能团。
例如，可以设计支化聚合物以与核酸分子形成复合物，其中当给予复合物和随后转染之后，合适位置的可生物降解官能团经历生物降解，产生一种或多种均聚物链从支化聚合物结构分离。可以在细胞内提供这种支化聚合物的结构转变以用于增强核酸分子的有效性(availability)并且也促进支化聚合物(和/或其残基)的代谢和清除。
因此本发明也提供了包括支化聚合物和核酸分子的复合物，支化聚合物包括支撑部分和各自共价连接至该部分且从该部分延伸的至少三种均聚物链，其中至少三种均聚物链包括阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链。
在上下文中，应该理解复合物本身由支化聚合物和核酸分子形成。
支化聚合物可以与各种核酸分子形成稳定的复合物，产生的复合物提供了对于核酸分子至各种细胞类型的改进的转染。也发现当以复合物形式时，支化聚合物对核酸分子提供良好的保护以避免酶的降解。
可以有利地调节设计(tailor-design)支化聚合物的至少三种均聚物臂的每一种以提供与给定的核酸分子的有效的复合和/或核酸分子与给定的细胞类型的有效地转染。也可以有利的调节设计支化聚合物和/或核酸分子以结合引导复合物至选择的目标细胞类型的靶向配体。
在一个实施方式中，支化聚合物和/或核酸分子与靶向配体结合(conjugated)。
在另一个实施方式中，支化聚合物具有共价连接至支撑部分的多于一种阳离子均聚物链、亲水性均聚物链或疏水性均聚物链。
本发明也提供了将核酸分子递送至细胞的方法，该方法包括：
(a)提供包括支化聚合物和核酸分子的复合物，支化聚合物包括支撑部分和各自共价连接至该部分且从该部分延伸的至少三种均聚物链，其中至少三种均聚物链包括阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链；以及
(b)将复合物递送至细胞。
在一个实施方式中，为了沉默细胞表达的目的将核酸分子递送至细胞。
因此本发明也提供了沉默基因表达的方法，该方法包括使用包括支化聚合物和核酸分子的复合物转染细胞，支化聚合物包括支撑部分和各自共价连接至该部分且从该部分延伸的至少三种均聚物链，其中至少三种均聚物链包括阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链。
在发明的这个或其他方面的一个实施方式中，核酸分子选自DNA和RNA。
在进一步的实施方式中，DNA和RNA选自gDNA、cDNA、双或单链DNA寡核苷酸、正义RNA、反义RNA、mRNA、tRNA、rRNA、小/短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、短发卡状RNA(shRNA)、piwi-相互作用RNA(piwi-interactingRNA，PiRNA)、微RNA/小时序RNA(miRNA/stRNA)、核仁小RNA(smallnucleolarRNA)(SnoRNA)、小核RNA(SnRNA)核酶、适体、DNA酶、核糖核酸酶类型复合物、发卡状双链RNA(发卡状dsRNA)、介导空间展开的miRNA(sdRNA)、应激反应RNA(srRNA)、细胞周期RNA(ccRNA)和双或单链RNA寡核苷酸。
也发现了根据本发明的支化聚合物保护核酸分子不受酶降解。
因此本发明也提供了保护核酸分子不受酶降解的方法，该方法包括使核酸分子与枝化的聚合物复合，枝化的聚合物包括支撑部分和各自共价连接至该部分且从该部分延伸的至少三种均聚物链，其中至少三种均聚物链包括阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链。
也提供了复合物在将核酸分子递送至细胞的用途，该复合物包括支化聚合物和核酸分子，枝化的聚合物包括支撑部分和各自共价连接至该部分且从该部分延伸的至少三种均聚物链，其中至少三种均聚物链包括阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链。
本发明进一步提供了复合物在沉默基因表达的用途，该复合物包括支化聚合物和核酸分子，枝化的聚合物包括支撑部分和各自共价连接至该部分且从该部分延伸的至少三种均聚物链，其中至少三种均聚物链包括阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链。
本发明又进一步提供了支化聚合物在保护核酸分子不受酶降解的用途，该支化聚合物包括支撑部分和各自共价连接至该部分且从该部分延伸的至少三种均聚物链，其中至少三种均聚物链包括阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链。
下文中本发明的具体实施方式公开了本发明的进一步的方面和实施方式。
附图说明
将参考下文非限制性附图描述本发明，其中：
图1描绘了根据本发明的支化聚合物的示意性图；
图2描绘了用于制备根据本发明的支化聚合物的方法的示意性图；
图3描绘了通过使用4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基]戊酸作为链转移剂的RAFT在90℃下在DMF中[RAFT]:[ACCN]的相对摩尔比为1.0:0.3的情况下，对于聚[(低聚(甲基丙烯酸乙二醇酯)]、聚[甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯]、聚(甲基丙烯酸正-丁基酯)的线性聚合的单体转化率的(A)半对数曲线图和(B)数均分子量和分散性的发展；
图4(I)描绘了分别使用P(OEGMA8-9)、P(DMAEMA)和P(n-BMA)的三种大分子RAFT(macro-RAFT)试剂获得的GPC迹线，(表示为图4I的M-RAFT1、2、3)；图4(II)描绘了使用不同的[交联剂/大分子-RAFT]比例＝8、12、16合成的杂臂星型聚合物的GPC迹线；图4(III)描绘了使用不同的P(n-BMA)摩尔比：P(OEGMA8-9)/P(DMAEMA)/P(n-BMA)＝3/3/x，其中x＝3、2、1、0合成的杂臂星型聚合物的GPC迹线；并且图4(IV)描绘了粗星型聚合物(crudestarpolymer)、纯化的星型聚合物、混合臂聚合物和断裂的星型聚合物(cleavedstarpolymer)的GPC迹线；
图5示出了纯化的杂臂聚合物S3-6的1HNMR光谱(细节参见表2)；
图6示出了杂臂星型聚合物和季铵化的杂臂星型聚合物S3-6的1HNMR光谱(细节参见表2)；
图7描绘了作为实施例1实验结果中制备的聚合物的系列的聚合物：siRNA的比例(w/w)的函数的杂臂聚合物与siRNA的结合：(I)单独的聚合物，(II)N:P比为2，(III)5，(IV)10；
图8描绘了在还原性条件(TCEP)下siRNA的释放；
图9描绘了在不同的聚合物浓度下在Huh7、A549和CHO-GEP细胞系中在实施例1中制备的杂臂星型聚合物的细胞活力(cellviability)；
图10描绘了在细胞系CHO-GEP、A549和Huh7中在用于沉默实验的不同浓度下杂臂聚合物的细胞活力；
图11描绘了通过在N:P比为2和1下如在实施例1中描述制备的杂臂聚合物的％GFP平均荧光测量的在CHO-GFP细胞中的基因沉默；
图12描绘了在125和50nM的浓度下通过杂臂聚合物S4-1和S4-5在A549和Huh7细胞中的COPA沉默。
图13描绘了使用杂臂聚合物S4-4将癌症药物SN38递送至Huh7细胞。
图14描绘了使用共聚焦显微术展示的内化的CHO细胞的细胞质中siRNA(绿)和标记(红)颗粒的内化。
图15描绘了使用根据WO2013/113071中描述的方法制备的4-臂星型嵌段共聚物：TL38-50(50％季铵化)、TL38-100(100％季铵化)、TL-84(100季铵化，没有PolyFluor)和TL-85(100％季铵化，具有PolyFluore)在CHO-GFP细胞中的基因沉默。
图16描绘了通过qRT_PCR分析A)脾B)肾C)肺D)肝在ssBmRNA表达中的倍数变化。与PBS对照相比，通过用Tukeypost分析重复测量ANOVA分析数据，**p<0.05，***p<0.005，NS不显著。
一些附图包括彩色图或实体(entity)。根据需要可获得附图的彩色版本。
具体实施方式
除非上下文中另外需要，整个说明书和随后的权利要求书中，词语“包括”和其变体诸如“包括了”和“包括有”将被理解为暗示包含陈述的整数或步骤或整数或步骤的组，但是不排除任何其他的整数或步骤或整数或步骤的组。
本说明书中提及任何现有公开(或源自其的信息)或任何已知的材料不是且不应该看做是承认或认同或任何形式的暗示现有公开(或源自其的信息)或已知材料形成本说明书相关的技术领域中公知常识的部分。
除非上下文中另外清楚地规定，在本文中使用的单数形式的“一种”、“一个”以及“该”意指包括复数方面。因此，例如提及“细胞”包括单个细胞以及两个或更多的细胞；提及“试剂”包括一种试剂，以及两种或更多种试剂，等等。
如本发明的上下文中使用的表述“支化聚合物”意指表示包括至少三种均聚物链附连至其上的支撑部分的聚合物。支化聚合物可以包括多于一种的这种支撑部分。
附接至支撑部分的至少三种均聚物臂的每一种是不同的，并且因此支化聚合物也可以称为杂臂支化聚合物。
特定类型的支化聚合物包括但不限于星型聚合物、梳型聚合物、刷型聚合物和树状物。
根据本发明的支化聚合物具有各自共价连接至支撑部分的至少一种阳离子均聚物链、至少一种亲水性均聚物链和至少一种疏水性均聚物链。为了方便，共价连接至支撑部分的至少三种均聚物链可以称为支化聚合物的“臂”。
在一个实施方式中，支化聚合物是杂臂星型聚合物。
支化聚合物可以具有多于三条臂。；例如，支化聚合物可以具有附接至支撑部分的4、5、6、7、8、9、10或更多的均聚物链。
在一个实施方式中，支化聚合物具有共价连接至支撑部分的多于一种的以下各项(i)阳离子均聚物链、(ii)亲水性均聚物链，和/或(ii)疏水性均聚物链。
在另一实施方式中，阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链的比例为约1:1:1.
在至少三种均聚物链各自共价连接至支撑部分的条件下，支化聚合物也可以具有一种或多种共价连接至支撑部分的共聚物链。
在本文中使用的“均聚物”链意指表示具有衍生自相同单体的聚合的残基的分子结构的聚合物链。
本文中使用的“共聚物”链意指表示具有衍生自至少两种不同单体的聚合的残基的分子结构的聚合物链。
附接至支撑部分的至少三种均聚物链可以各自独立地是支链的或直链的均聚物链。
根据本发明的支化聚合物可以具有支链和直链的均聚物链的组合。
附接至支撑部分的均聚物链是“支链化的”意指均聚物链存在来自具有支链结构的主聚合物主链的侧基(pendantgroup)。例如，支链化的均聚物链可以衍生自包括支链化的寡氧化乙烯(oligoethyleneoxide)部分(例如寡(甲基丙烯酸(乙二醇)酯)的单体，并且因此存在来自主聚合物主链的支链化的寡氧化乙烯基团侧基。
在一个实施方式中，附接至支撑部分的至少三种均聚物链是直链均聚物链。
在进一步的实施方式中，根据本发明的支化聚合物是星型聚合物。
星型聚合物意指包括从其中发出至少三种共价连接的聚合物链或臂的单个支链部分的大分子。根据本发明(i)支链部分表示支撑部分，且支撑部分可以是在本文中描述的合适的原子、分子或分子结构的形式，以及(ii)至少三种共价连接的聚合物链或臂是至少三种均聚物链。
当根据本发明的支化聚合物是星型聚合物时，至少三种均聚物链可以各自独立地是直链或支链的。
已经发现根据本发明的支化聚合物的星型聚合物形成物(formation)提供了优异的性能。
“支撑部分”意指部分诸如原子、分子或核芯结构(corestructure)，支化聚合物的臂共价连接至其上。因此，支撑部分用于支撑共价连接的臂。
为帮助描述支化聚合物，并且更具体地通过表述“支化聚合物”和“支撑部分”意指的，可以参考以下通式(A)：
其中，SM表示支撑部分，HP1表示阳离子均聚物链，HP2表示亲水性均聚物链，HP3表示疏水性均聚物链，且a、b和c各自独立地是大于或等于1的整数，例如各自独立地是从1至10范围内的整数。当a、b和c是大于1时，应该理解的是这将表示多于一种相关均聚物链共价连接至支撑部分的情况。至少三种均聚物臂(HP1、HP2和HP3)的一种或多种可以通过连接部分共价连接至SM。
参考通式(A)，支撑部分(SM)具有共价连接至其上的至少三种均聚物臂(HP1、HP2和HP3)的每一种，并且因此，SM可以简单地被看做由其产生支链化的结构特征。
通式(A)的特征可以提供多种支链化的结构。
根据本发明的支化聚合物可以具有由其产生支链化的多个这种结构特征。例如，支撑部分可以是以侧链形式共价连接有多种阳离子均聚物链、多种亲水性均聚物链和多种疏水性均聚物链的直链大分子以形成聚合物刷状结构。
因此，根据本发明的支化聚合物可以描述为包括通式(A)的结构特征。
当支撑部分是原子时，其将通常是C、Si或N。在原子时C或Si的情况下，可以存在共价连接至相应原子的第四聚合物链。
当支撑部分是分子时，关于提供的部分的特性将没有特别的限制，其可以具有共价连接至其上的至少三种均聚物臂。换句话说，分子必须至少是三价的(即，具有发生共价附接的至少三个点)。例如，分子可以选自可选取代以下各项的至少三价形式：烷基、烯基、炔基、芳基、碳环基、杂环基、杂芳基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳氧基、碳环氧基、杂环氧基、杂芳氧基、烷硫基、烯硫基、炔硫基、芳硫基、碳环硫基、杂环硫基、杂芳硫基、烷基烯基、烷基炔基、烷基芳基、烷基酰基、烷基碳环基、烷基杂环基、烷基杂芳基、烷氧基烷基、烯氧基烷基、炔氧基烷基、芳氧基烷基、烷基酰氧基、烷氧基酰基烷基、烷基碳环氧基、烷基杂环氧基、烷基杂芳氧基、烷硫基烷基、烯硫基烷基、炔硫基烷基、芳硫基烷基、烷基酰硫基、烷基碳环硫基、烷基杂环硫基、烷基杂芳基硫基、烷基烯基烷基、烷基炔基烷基、烷基芳基烷基、烷基酰基烷基、芳基烷基芳基、芳基烯基烷基、芳基炔基芳基、芳基酰基芳基、芳基酰基、芳基碳环基、芳基杂环基、芳基杂芳基、烯氧基芳基、炔氧基芳基、芳氧基芳基、芳基酰氧基、芳基碳环氧基、芳基杂环氧基、芳基杂芳基氧基、烷硫基芳基、烯硫基芳基、炔硫基芳基、芳基硫基芳基、芳基酰基硫基、芳基碳环硫基、芳基杂环硫基、芳基杂芳基硫基、配位复合物、和聚合物链，其中任何烷基链中存在的这个和每个-CH2-基团可以通过独立选自以下的二价基团取代：-O-、-OP(O)2-、-ΟΡ(O)2O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N＝N-、-OSi(ORa)2O-、-Si(ORa)2O-、-OB(ORa)O-、-B(ORa)O-、～NRa～、～C(O)～、～C(O)O～、～OC(O)O～、-OC(O)NRa～和～C(O)NRa～，其中这个或每个Ra可以独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、碳环基、杂芳基、杂环基、芳基烷基和酰基。这个或每个Ra也可以独立地选自氢、C1-18烷基、C1-18烯基、C1-18炔基、C6-18芳基、C3-18碳环基、C3-18杂芳基、C3-18杂环基和C7-18芳基烷基。
当支撑部分是核芯结构时，关于提供的部分的特性没有特别的限制，其可以具有共价连接至其上的至少三种均聚物臂。换句话说，核芯结构必须具有发生共价附接的至少三个点。例如核芯结构可以是固体颗粒材料的形式诸如纳米颗粒材料，或聚合物颗粒诸如交联聚合物颗粒。在这种情况下，核芯结构的尺寸将通常在从约5埃至约500nm的范围内，例如从约10埃至约100nm，或从约20埃至约10nm。
交联聚合物支撑部分的实例包括含有聚合的残基的那些或通过聚合由选自下列的一种或多种多官能的单体形成：二硫醚二甲基丙烯酸酯(disulfidedimethacrylate)、二(甲基)丙烯酸乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸三乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸四乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸1,3-丁二醇酯、三(甲基)丙烯酸三羟甲基丙烷酯、二(甲基)丙烯酸1,4-丁二醇酯、二(甲基)丙烯酸新戊二醇酯、二(甲基)丙烯酸1,6-己二醇酯、乙氧基化二丙烯酸1,6-己二醇酯(HEDA)、二(甲基)丙烯酸季戊四醇酯、三(甲基)丙烯酸季戊四醇酯、四(甲基)丙烯酸季戊四醇酯、二(甲基)丙烯酸丙三醇酯、烯丙氧基二(甲基)丙烯酸丙三醇酯、二(甲基)丙烯酸1,l,l-三(羟基甲基)乙烷酯、三(甲基)丙烯酸1,1,1-三(羟基甲基)乙烷酯、二(甲基)丙烯酸1,1,1-三(羟基甲基)丙烷酯、三(甲基)丙烯酸1,1,1-三(羟基甲基)丙烷酯、氰脲酸三烯丙基酯、异氰脲酸三烯丙基酯、偏苯三酸三烯丙基酯、邻苯二甲酸二烯丙基酯、对苯二甲酸二烯丙基酯、二乙烯基苯、羟甲基(甲基)丙烯酰胺、三烯丙基胺、马来酸油烯基酯、三丙烯酸甘油基丙氧基酯、甲基丙烯酸烯丙基酯、甲基丙烯酸酐、亚甲基双(甲基)丙烯酰胺、丁-2-烯-1,4-二丙烯酸酯(BDA)、双酚A乙氧基化二丙烯酸酯(BEDA)、Ν,Ν'-双(丙烯酰基)半胱亚胺(N,N’-bis(acryloyl)cystanimine)(DSBAm)、己二酸二乙烯基酯(DVA)、4,4’-二乙烯基联苯(DVPB)和N,Ν'-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)。
当支化聚合物仅包括一种支撑部分且至少三种均聚物臂是直链时，支化聚合物可以方便地称为星型聚合物或杂臂星型聚合物。
当定义支撑部分时，其也可以方便地称为从其中衍生出该部分的化合物或核芯结构。例如支撑结构可以衍生自具有提供了反应位点的三种或更多种官能团的化合物或核芯结构，通过该反应位点至少三种均聚物臂将进行共价连接。在这种情况下，支撑部分可以衍生自具有选自以下的三种或更多种官能团的化合物或核芯结构，例如醇、卤素、硫醇、羧酸、胺、环氧化物、异腈酸酯和酰氯。
具有从其中可以衍生出支撑部分的三种或更多醇官能团的化合物的实例包括但不限于丙三醇、季戊四醇、二季戊四醇、三季戊四醇、1,2,3-三羟基己烷、三羟甲基丙烷、肌醇(myoinisitol)、葡萄糖和其异构体(例如d-半乳糖、d-甘露糖、d-果糖)、麦芽糖、蔗糖和甘露醇。
具有从其中可以衍生出支撑部分的三种或更多官能(羧基、巯基、卤素或异腈酸酯)基团的化合物的实例包括但不限于联苯-3,4’,5-三羧酸、顺,顺,-l,3,5-三甲基环己烷-1,3,5-三羧酸、1,2,4-苯三羧酸、松蕈酸、苯-1,3,5-三羧酸、三乙基l,1,2-乙烷三羧酸、环己烷-1,24,5-四羧酸、环戊烷-1,2,3,4-四羧酸、双环[2.2.2]辛-7-烯-2,3,5,6-四羧酸、季戊四醇四(3-巯基丙酸酯)、1,2,3-三氯丙烷、1,3,3-三氯丁烷、1,2,3-三氯丁烷、赖氨酸三异腈酸酯和三苯基甲烷-4,4’,4’-三异腈酸酯。
具有从其中可以衍生出支撑部分的三个或更多胺官能团的化合物的实例包括但不限于聚(亚乙基亚胺)(poly(ethyleneimine))、1,2,3-三氨基-2-(氨基甲基)丙烷、PAMAM树状物、丁烷-1,2,3,4-四胺和戊烷-1,2,3,3-四胺。
至少三种均聚物链各自(即，单独地)共价连接至支撑部分。每个均聚物链可以直接或间接共价连接至支撑部分。
“直接”共价连接意指在均聚物链和支撑部分之间仅具有共价键。
“间接”共价连接意指在均聚物链和支撑部分之间的位置具有一个或多个共价连接的原子或分子。
当均聚物链间接共价连接至支撑部分时，其可以方便地称为通过连接部分共价连接至支撑部分的均聚物链。
在一个实施方式中，至少三种均聚物链的至少一种通过连接部分共价连接至支撑部分。
在另一个实施方式中，至少三种均聚物链的每一种通过连接部分各自共价连接至支撑部分。
关于提供的这种连接部分的特性没有特别的限制，其可以用于将均聚物链连接至支撑部分。由于这将导致形成整体共聚物链连接至支撑部分，因此连接部分将当然不能是另一聚合物链。
合适的连接部分的实例包括可选地取代以下各项的二价形式：氧(-O-)、二硫化物(硫醚，-S-S-)、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、(包括-C(O)-)、碳环基、杂环基、杂芳基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳氧基、酰氧基、碳环氧基、杂环氧基、杂芳氧基、烷硫基、烯硫基、炔硫基、芳基硫基、酰基硫基、碳环基硫基、杂环基硫基、杂芳基硫基、烷基烯基、烷基炔基、烷基芳基、烷基酰基、烷基碳环基、烷基杂环基、烷基杂芳基、烷氧基烷基、烯氧基烷基、炔氧基烷基、芳基氧基烷基、烷基酰基氧基、烷基氧基酰基烷基、烷基碳环基氧基、烷基杂环基氧基、烷基杂芳基氧基、烷基硫基烷基、烯基硫基烷基、炔基硫基烷基、芳基硫基烷基、烷基酰基硫基、烷基碳环基硫基、烷基杂环基硫基、烷基杂芳基硫基、烷基烯基烷基、烷基炔基烷基、烷基芳基烷基、烷基酰基烷基、芳基烷基芳基、芳基烯基芳基、芳基炔基芳基、芳基酰基芳基、芳基酰基、芳基碳环基、芳基杂环基、芳基杂芳基、烯基氧基芳基、炔基氧基芳基、芳基氧基芳基、芳基酰基氧基、芳基碳环基氧基、芳基杂环基氧基、芳基杂芳基氧基、烷基硫基芳基、烯基硫基芳基、炔基硫基芳基、芳基硫基芳基、芳基酰基硫基、芳基碳环基硫基、芳基杂环基硫基和芳基杂芳基硫基，其中任何烷基链中存在的这个或每个-CH2-基团可以通过独立地选自下列的二价基团进行取代：-O-、-OP(O)2-、-ΟΡ(O)2O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N＝N-、-OSi(ORa)2O-、-Si(ORa)2O-、-OB(ORa)O-、-B(ORa)O-、～NRa～、～C(O)～、～C(O)O～、～OC(O)O～、-OC(O)NRa～和～C(O)NRa～，其中这个或每个Ra均可以独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、碳环基、杂芳基、杂环基、芳基烷基和酰基。这个或每个Ra也可以独立地选自氢、C1-18烷基、C1-18烯基、C1-18炔基、C6-18芳基、C3-18碳环基、C3-18杂芳基、C3-18杂环基和C7-18芳基烷基。
本文提及的包括两个或更多个子基团(例如[基团A][基团B])的基团并不意指限制子基团存在的顺序。因此，限定为[基团A][基团B](例如烷基芳基)的两个子基团也意指提及两个子基团限定为[基团B][基团A](例如芳基烷基)。
连接部分可以是或包括可降解的官能团。
在一个实施方式中，至少三种均聚物链的一种或多种通过可降解的官能团共价连接至支撑部分，从而当可降解的官能团经历降解之后，使得共价连接(covalentcouple)断裂并且使均聚物链与支撑部分分离。
至少三种均聚物链的每一种可以通过可降解的官能团共价连接至支撑部分。
在另一实施方式中，支撑部分具有包括一种或多种可降解的官能团的分子结构，从而当可降解的官能团经历降解之后，使得分子结构中的一个或多个共价键断裂，且从支撑结构释放(即，变为自由)至少三种均聚物链的至少一种。
官能团是“可降解的”意指其具有当暴露降解环境之后通过化学反应易断裂的分子结构(即，经历键断裂)。
在一个实施方式中，可降解的官能团是生物可降解官能团。
官能团是“生物可降解的”意指其具有当暴露于生物环境(例如，在受试者内或接触生物材料例如血液、组织等)之后通过化学反应易于断裂(即，经历键断裂)的分子结构。生物降解可以在体外或体内发生。这些化学分解或生物降解可以通过水解、氧化或还原。因此，可生物降解官能团通常将是易于经历水解、氧化或还原断裂。可以根据多种外在或内在因素(例如，光、热、辐射、pH、酶或非酶介导等)改变生物降解的速率。
定位可降解官能团，从而当其经历降解时，使得至少三种均聚物链的一种或多种从支撑部分释放(即，不再共价附接)。
当支撑部分具有包含可降解官能团的分子结构时，这些可降解官能团的降解导致支撑部分结构断裂，进而导致均聚物链从支撑部分释放(即，不再共价附接)
本领域技术人员将理解容易经历降解或生物降解的官能团的类型。这些官能团可以包括例如酯、酸酐、碳酸酯、过氧化物、过氧酯、磷酸酯、硫酯、脲、硫代氨基甲酸酯(硫尿烷，thiourethane)、醚、二硫醚、氨基甲酸酯(尿烷)和硼酸酯。
在一个实施方式中，可生物降解官能团选自酯、酸酐、碳酸酯、过氧化物、过氧酯、磷酸酯、硫酯、脲、硫尿烷、醚、二硫醚、氨基甲酸酯(尿烷)和硼酸酯。
在另一实施方式中，连接部分可通过选自以下各项的一种或多种官能团生物降解：酯、酸酐、碳酸酯、过氧化物、过氧酯、磷酸酯、硫酯、脲、硫尿烷、醚、二硫醚、氨基甲酸酯(尿烷)和硼酸酯。
在酸、碱、酶和/或在键断裂过程中可以催化或至少帮助的其他内源性生物化合物存在下可以促进可生物降解官能团的降解。例如，可以水解断裂酯以产生羧酸基团和醇基团，并且可以水解断裂酰胺以产生羧酸基团和胺基团，并且可以还原断裂二硫醚以产生巯基基团。
降解可以发生在生物流体中诸如血液、血浆、血清、尿、唾液、乳液、精液、阴道液、滑液、淋巴液、羊水、汗液和泪液；以及由植物产生的水性溶液包括例如渗出物和排水液(guttatonfluid)、木质部、韧皮部、树脂和花蜜。
降解也可以发生在细胞中或细胞组分诸如核内体和细胞质中。
可以选择可生物降解官能团使得当暴露于特定生物环境之后其可以经历降解。例如，氧化还原电位梯度存在于正常和病理生理状态中的细胞外和细胞内环境之间。在还原的细胞内环境中可以容易地还原作为可生物降解官能团的二硫醚键，同时在氧化的细胞外部空间中保持不变。通常通过小氧化还原分子诸如谷胱甘肽(GSH)和硫氧还原蛋白单独或在酶机器的帮助下执行二硫醚键的细胞内还原。
根据这些官能团和降解环境的特性，当使用两种或更多的可降解官能团时，可以仅一种官能团实际促进期望的键断裂。例如，可降解官能团可以包括酯和二硫醚官能团。在还原环境中，可以仅二硫醚官能团将经历降解。在水解环境中，可以仅酯官能团将经历降解。在还原和水解环境中，可以二硫醚和酯官能团均经历降解。
“阳离子”均聚物链意指存在或能够存在净正电荷的均聚物链。在一个实施方式中，阳离子均聚物链存在净正电荷。
“亲水性”均聚物链意指存在净亲水特征的均聚物链。亲水性均聚物链通常将不存在或不能存在净负或净正电荷。因此亲水性均聚物链可以描述为不存在或不能存在净负或净正电荷的亲水性均聚物链。换言之，亲水性均聚物链不意指本文描述的阳离子均聚物链(即，其不存在或不能存在净正电荷)。因此，亲水性均聚物链也可以描述为非阳离子亲水性均聚物链。
在一个实施方式中，亲水性均聚物链是中性亲水性均聚物链(即，其不存在或不能存在电荷)。在这种情况下，亲水性均聚物链可以描述为非可离子化(non-ionisable)的亲水性均聚物链。
“疏水性”均聚物链是指存在净疏水特性的均聚物链。疏水性均聚物链通常不存在或不能存在净负电荷或正电荷。因此疏水性均聚物链可以描述为不存在或不能存在净负电荷或净正电荷的疏水性均聚物链。换言之，疏水性均聚物链并不旨在是本文限定的阳离子均聚物链(即，它不存在或不能存在净正电荷)。因此，疏水性均聚物链还可以描述为非阳离子疏水性均聚物链。
在一个实施方式中，疏水性均聚物链是中性疏水性均聚物链(即，它不存在或不能存在电荷)。在这种情况下，疏水性均聚物链可以描述为是非可离子化的疏水性均聚物链。
关于通过表述“阳离子”、“亲水性”和“疏水性”均聚物链指示的进一步细节在下文中呈现。
阳离子、亲水和疏水性均聚物链各自将包括多种单体单元的聚合的残基。关于可以用于形成这些均聚物链的单体的进一步的细节在下文中呈现。
根据本发明的阳离子均聚物链通常将包括从约5至约250，或约10至约200，或约30至约150个单体残基单元。
阳离子均聚物链可以以在水性介质中的可溶性或可混合性的方面表现出亲水特性。
在一个实施方式中，支化聚合物不包括具有或能够具有负电荷的聚合的单体残基单元。换句话说，在一些实施中，支化聚合物不是两性支化聚合物。
本文中提及的分别与例如阳离子均聚物链或核酸分子结合的“正”或“负”电荷意指表示阳离子均聚物链或核酸分子具有存在的一种或多种官能团或部分，或分别意指能够存在正或负电荷。
因此，这种官能团或部分可以内在地具有电荷，或其可以能够转换为带电状态，例如通过亲电子试剂的添加或去除。换句话说，在正电荷的情况下，官能团或部分可以具有内在电荷，诸如季铵官能团或部分，或官能团或部分自身可以是中性的，且通过例如叔铵阳离子的pH依赖性形成或叔胺基团的季铵化其可以带电荷以形成阳离子。在负电荷的情况下，官能团或部分可以例如包括提供负电荷的有机酸盐，或官能团或部分可以包括可以是中性的有机酸，且通过例如酸性质子的pH依赖性去除其可以带电荷以形成阴离子。
在一个实施方式中，可以使用含有在聚合时为中性状态的官能团或部分的单体制备支化聚合物的阳离子均聚物链，且形成的聚合物链可以随后转化为正电荷状态。例如，单体可以包括叔胺官能团，当聚合以形成阳离子均聚物链之后，其随后季铵化为正电荷状态。
在另一实施方式中，支化聚合物的阳离子均聚物链是正电荷状态。换句话说，阳离子均聚物链是带正电荷的阳离子均聚物链。
本领域技术人员将理解在带电荷状态下，与阳离子均聚物链结合的阳离子自身，或与例如核酸分子结合的阴离子自身将具有与其结合的合适的反离子(counterion)。
当根据本发明的支化聚合物用于与核酸分子形成复合物时，应该理解的是阳离子均聚物链单独地或共同地(如果存在多于一种)将包括足够的正电荷位点以促进与核酸分子的复合。
在一个实施方式中，根据本发明的阳离子均聚物链可以包括从约5至约250，或约10至约200，或约30至约150个各自包括正电荷的单体残基单元。
根据本发明的亲水性均聚物链通常将包括从约5至200，或约10至150，或约20至100个单体残基单元。
根据本发明的疏水性均聚物链通常将包括从约10至200，或约15至150，或约30至100个单体残基单元。
诸如亲水性和输水性的术语在本领域通常用以表达一种组分与另一个组分之间的相互作用(例如，吸引或排斥相互作用，或溶解性特征)，并且并未定量地限定特定组分相对于其他组分的特征。
例如，亲水性组分更可能被诸如水的水性介质湿润或溶剂化，相反疏水性组分不太可能被诸如水的水性介质湿润或溶剂化。
在本发明的上下文中，亲水性均聚物链意指表示在水性介质中表现出可溶性或可混合性的均聚物链，包括生物流体，诸如血液、血浆、血清、尿、唾液、乳液、精液、阴道液、滑液、淋巴液、羊水、汗液和泪液；以及由植物生产的水性溶液，包括例如渗出物和排水液、木质部、韧皮部、树脂和花蜜。
作为比较，疏水性均聚物链意指表示在水性介质中表现处较少或没有可溶性或可混合性的均聚物链，水性介质包括生物流体，诸如血液、血浆、血清、尿、唾液、乳液、精液、阴道液、滑液、淋巴液、羊水、汗液和泪液；以及由植物生产的水性溶液，包括例如渗出物和排水液、木质部、韧皮部、树脂和花蜜。
本领域技术人员可以通过(a)均聚物链的分子组分，和/或(b)均聚物链在水性介质中的可溶性和可混合性(或缺少它)的简单评估容易地确定给出的均聚物链的阳离子、亲水性或疏水性特征。
通常将选择亲水性均聚物链使得支化聚合物呈现在水性介质中的可溶性或可混合性。
在一个实施方式中，亲水性均聚物链可以包括从约5至约200，或约10至约150，或约20至约100个亲水性单体残基单元。
在一个实施方式中，疏水性均聚物链可以包括从约10至约200，或约15至约150，或约30至约100个疏水单体残基单元。
每个均聚物链均可以衍生自(或包括其聚合的残基)包括具有支链化结构的基团的单体。
阳离子均聚物单体可以衍生自(或包括其聚合的残基)选自下列项的一种或多种单体：甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙基酯、甲基丙烯酸N,N-二乙基氨基乙基酯、丙烯酸N,N-二甲基氨基乙基酯、丙烯酸N,N-二乙基氨基乙基酯、甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐、N-[3-(N,N-二甲基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐、N-[3-(N,N-二甲基氨基)丙基]丙烯酰胺、N-[2-(N,N-二甲基氨基)乙基]甲基丙烯酰胺、丙烯酸2-N-吗啉代乙基酯、甲基丙烯酸2-N-吗啉代乙基酯、丙烯酸2-(N,N-二甲基氨基)乙基酯、甲基丙烯酸2-(N,N-二甲基氨基)乙基酯、甲基丙烯酸2-(N,N-二乙基氨基)乙基酯、2-丙烯酰氧基乙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酰胺基丙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酸2-(叔-丁基氨基)乙基酯、烯丙基二甲基氯化铵、2-(二乙基氨基)乙基苯乙烯、2-乙烯基吡啶和4-乙烯基吡啶。
亲水性均聚物链可以衍生自(或包括其聚合的残基)选自下列项的一种或多种单体：丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸羟基乙基酯、甲基丙烯酸羟基丙基酯、低聚(亚烷基二醇)甲基醚(甲基)丙烯酸酯(OAG(M)A)、低聚(乙二醇)(甲基)丙烯酸酯(OEG(M)A)、丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺、丙烯酸羟基乙基酯、N-甲基丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙基酯、Ν,Ν-二甲基氨基丙基甲基丙烯酰胺、N-羟基丙基甲基丙烯酰胺、4-丙烯酰基吗啉、2-丙烯酰胺基-2-甲基-l-丙烷磺酸、磷酰胆碱甲基丙烯酸酯和N-乙烯基吡咯烷酮。
疏水性均聚物链可以衍生自(或包括其聚合的残基)选自下列项的一种或多种单体：苯乙烯、α-甲基苯乙烯、丙烯酸丁基酯、甲基丙烯酸丁基酯、甲基丙烯酸戊基酯、甲基丙烯酸己基酯、甲基丙烯酸月桂基酯、甲基丙烯酸十八烷基酯、甲基丙烯酸乙基己基酯、甲基丙烯酸巴豆基酯、甲基丙烯酸肉桂基酯、甲基丙烯酸油烯基酯、甲基丙烯酸蓖麻油酯(ricinoleylmethacrylate)、甲基丙烯酸胆固醇基酯、丙烯酸胆固醇基酯、乙烯基丁酸酯、乙烯基叔-丁酸酯、乙烯基硬脂酸酯和乙烯基月桂酸酯。
可以参考下文的通式(A)描述根据本发明的支化聚合物的实例：
其中SM表示支撑部分，HP1表示衍生自(即，其聚合形式)甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙基酯、甲基丙烯酸N,N-二乙基氨基乙基酯、丙烯酸N,N-二甲基氨基乙基酯、丙烯酸N,N-二乙基氨基乙基酯、甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐、N-[3-(N,N-二甲基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐、N-[3-(N,N-二甲基氨基)丙基]丙烯酰胺、N-[2-(N,N-二甲基氨基)乙基]甲基丙烯酰胺、丙烯酸2-N-吗啉代乙基酯、甲基丙烯酸2-N-吗啉代乙基酯、丙烯酸2-(N,N-二甲基氨基)乙基酯、甲基丙烯酸2-(N,N-二甲基氨基)乙基酯、甲基丙烯酸2-(N,N-二乙基氨基)乙基酯、2-丙烯酰氧基乙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酰胺基丙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酸2-(叔-丁基氨基)乙基酯、烯丙基二甲基氯化铵、2-(二乙基氨基)乙基苯乙烯、2-乙烯基吡啶和4-乙烯基吡啶的阳离子均聚物链。HP2表示衍生自(即，是其聚合形式)丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸羟基乙基酯、甲基丙烯酸羟基丙基酯、低聚(亚烷基二醇)甲基醚(甲基)丙烯酸酯(OAG(M)A)、低聚(乙二醇)(甲基)丙烯酸酯(OEG(M)A)、丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺、丙烯酸羟基乙基酯、N-甲基丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙基酯、Ν,Ν-二甲基氨基丙基甲基丙烯酰胺、N-羟基丙基甲基丙烯酰胺、4-丙烯酰基吗啉、2-丙烯酰胺基-2-甲基-l-丙烷磺酸、磷酰胆碱甲基丙烯酸酯或N-乙烯基吡啶的亲水性均聚物链。HP3表示衍生自(即，是其聚合形式)苯乙烯、α-甲基苯乙烯、丙烯酸丁基酯、甲基丙烯酸丁基酯、甲基丙烯酸戊基酯、甲基丙烯酸己基酯、甲基丙烯酸月桂基酯、甲基丙烯酸十八烷基酯、甲基丙烯酸乙基己基酯、甲基丙烯酸巴豆基酯、甲基丙烯酸肉桂基酯、甲基丙烯酸油烯基酯、甲基丙烯酸蓖麻油基酯、甲基丙烯酸胆固醇基酯、丙烯酸胆固醇基酯、乙烯基丁酸酯、乙烯基叔-丁酸酯、乙烯基硬脂酸酯或乙烯基月桂酸酯的疏水性均聚物链，且a、b和c各自独立地是在从1至50，或从1至30，或从1至20，或从1至15，或从1至10，或从1至5的范围内的整数。当a、b或c大于1时，应该理解的是这将表示多于一种相应的均聚物链共价连接至支撑部分的情况。至少三种均聚物臂(HP1、HP2和HP3)的一种或多种可以通过连接部分共价连接至SM。
在一个实施方式中，支化聚合物进一步包括靶向配体，生物活性剂和/或成像剂。在这种情况下，靶向配体、生物活性剂或成像剂通常将共价连接至支化聚合物。靶向配体、生物活性剂或成像剂可以共价连接至支撑部分、支化聚合物的至少三种均聚物链的一种或多种、或它们的组合。还考虑了靶向配体、生物活性剂和/或成像剂的两种或更多种的组合。
可以连接至支化聚合物的适合的靶向配体的实例包括衍生自这些糖、肽、蛋白质、适体和胆固醇的糖和低聚糖。适合的糖的实例包括半乳糖、甘露糖和葡萄糖胺。适合的肽的实例包括铃蟾肽(bobesin)、lutanizing激素释放肽、细胞穿透肽(CPP)、GALA肽、流感衍生的膜融合肽(influenza-derivedfusogeneicpeptide)、RGD肽、聚(精氨酸)、聚(赖氨酸)、穿膜肽(penetratin)、tat-肽和转运子(transporan)。可以靶向癌细胞的其他配体诸如叶酸也可以连接至支化聚合物。可以连接至支化聚合物的生物活性剂的实例包括活性有机化合物、蛋白质或抗体(或它们的片段)，以及肽。适合的蛋白质的实例包括传递鱼精蛋白(transferringprotamine)，和抗体诸如抗-EGFR抗体和抗-K-ras抗体。适合的有机化合物的实例包括化学治疗剂，如阿霉素(doxorubicin)、紫杉醇、喜树碱和palatinate。
可以连接至支化聚合物的适合的成像剂的实例包括PolyfluorTM(甲基丙烯酰氧基乙基硫基氨基甲酰基若丹明B)、AlexaFluor568和BOPIDY颜料。
为了进一步描述根据本发明的支化聚合物的特性，参考图1，其中表示支撑部分，-表示普通共价键，表示阳离子均聚物链，表示亲水性均聚物链，且表示疏水性均聚物链。一种或多种均聚物链可以通过连接部分(未示出)共价连接至支撑部分。连接部分可以是或包括可生物降解官能团。
根据本发明的支化聚合物可以通过任何合适的方法制备。
在一个实施方式中，制备支化聚合物的方法包括烯不饱和单体的聚合。烯不饱和单体的聚合优选使用活性聚合技术进行。
在本领域通常认为活性聚合是链聚合的形式，其中基本上没有不可逆的链终止。活性聚合的重要特征是聚合物链将连续生长，同时提供支持聚合的单体和反应条件。通过活性聚合制备的聚合物链可以有利地展现出良好限定的分子结构、预定的分子量和窄分子量分布或较低的多分散性。
活性聚合的实例包括阴离子聚合和控制的自由基聚合(CRP)。CRP的实例包括但不限于引发转移终止剂(iniferter)聚合、稳定自由基介导聚合(SFRP)、原子转移自由基聚合(ATRP)和可逆加成断裂链转移(RAFT)聚合。
用于进行活性聚合的装置、条件和试剂是本领域技术人员公知的。
当烯不饱和单体键将通过活性聚合技术进行聚合时，通常将需要使用所谓的活性聚合试剂。“活性聚合试剂(livingpolymerizationagent)”意指可以参与和控制或调节一种或多种烯不饱和单体的活性聚合从而形成活性聚合物链(即，已经根据活性聚合技术形成的聚合物链)的化合物。
活性聚合试剂包括但不限于选自阴离子聚合和CRP的促进活性聚合技术的(livingpolymerizationtechnique)那些。
在本发明的一个实施方式中，使用阴离子聚合制备支化聚合物(branchedpolymer)。
在本发明的一个实施方式中，使用CRP制备支化聚合物。
在本发明的进一步的实施方式中，使用引发转移终止剂(iniferter)聚合制备支化聚合物。
在本发明的另一个实施方式中，使用SFRP制备支化聚合物。
在本发明的进一步的实施方式中，使用ATRP制备支化聚合物。
在本发明的又进一步的实施方式中，使用RAFT聚合制备支化聚合物。
通过RAFT聚合形成的聚合物可以方便地称为RAFT聚合物。由于聚合的原理，这种聚合物将包括促进单体聚合的RAFT试剂的残余物。
适合用于根据本发明的使用的RAFT试剂包括硫代羰基硫基团(其是由-C(S)S-表示的二价部分)。多个公开中描述了RAFT聚合和RAFT试剂，诸如WO98/01478，MoadG.；Rizzardo,E；ThangS,H.Polymer2008,49,1079-1131和Aust.J.Chem.,2005,58,379-410；Aust,J.Chem.,2006,59,669-692；和Aust.J.Chem.,2009,62,1402-1472(其全部内容通过参考的形式结合与本文中)。在用于制备支化聚合物中使用的适合的RAFT试剂包括黄原酸酯(xanthate)、双硫酯、二硫代氨基甲酸酯和三硫代碳酸酯化合物。
适合用于根据本发明的使用的RAFT试剂也包括通过通式(I)或(II)表示的那些：
其中Z和R是基团，且R*和Z*分别是x-价和y-价基团，其独立地选择从而使得试剂可以在一种或多种烯不饱和单体的聚合中起到RAFT试剂的作用；x是≥1的整数；且y是≥2的整数。
在一个实施方式中，x是≥3的整数；且y是≥3的整数。在这种情况下，R*和Z*可以表示支撑部分(supportmoiety)(SM)。
为了在一种或多种烯不饱和单体的聚合中起到RAFT试剂的作用，本领域技术人员将理解R和R*通常将是在采用的聚合条件下起到自由基离去基团作用的可选取代的有机基团，并且作为自由基离去基团，其保持重新引发聚合的能力。本领域技术人员也将理解Z和Z*通常将是在不减慢RAFT-加合物自由基的破碎速率至过度延缓聚合的程度的情况下，起到朝向自由基加成的在RAFT试剂中给予C＝S部分的合适的较高反应性的可选取代的有机基团。
在式(I)中，R*是x-价基团，x是≥1的整数。因此R*可以是单价、二价、三价或更高价态。例如R*可以是C20烷基链，式(I)中描述的RAFT试剂的剩余部分表示为从链悬挂的多个取代基团。通常，x将是从1至约20范围内的整数，例如从约2至约10，或从1至约5。在一个实施方式中，x＝2。
相似地，在式(II)中，Z*是y-价基团，y是≥2的整数。因此，Z*可以是二价、三价或更高价态。通常，y将是从2至约20范围内的整数，例如，从约2至约10，或从2至约5。
可以根据本发明使用的RAFT试剂中的R的实例包括可选取代，并且在可以根据本发明使用的RAFT试剂中的R*包括可选取代的x-价形式的情况下：烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、碳环基、杂环基、杂芳基、烷硫基、烯硫基、炔硫基、芳硫基、酰硫基、碳环硫基、杂环硫基、杂芳硫基、烷基烯基、烷基炔基、烷基芳基、烷基酰基、烷基碳环基、烷基杂环基、烷基杂芳基、烷氧基烷基、烯氧基烷基、炔氧基烷基、芳氧基烷基、烷基酰氧基、烷基碳环氧基、烷基杂环氧基、烷基杂芳氧基、烷硫基烷基、烯硫基烷基、炔硫基烷基、芳硫基烷基、烷基酰硫基、烷基碳环硫基、烷基杂环硫基、烷基杂芳硫基、烷基烯基烷基、烷基炔基烷基、烷基芳基烷基、烷基酰基烷基、芳基烷基芳基、芳基烯基芳基、芳基炔基芳基、芳基酰基芳基、芳基酰基、芳基碳环基、芳基杂环基、芳基杂芳基、烯氧基芳基、炔氧基芳基、芳氧基芳基、烷硫基芳基、烯硫基芳基、炔硫基芳基、芳硫基芳基、芳基酰硫基、芳基碳环硫基、芳基杂环硫基、芳基杂芳硫基和聚合物链。
为了避免任何疑问，本文中提及“可选取代：”烷基、烯基、…等意指表示每个基团诸如烷基和烯基是可选取代的。
可以根据本发明使用的RAFT试剂中的R的实例也包括可选取代，并且在可以根据本发明使用的RAFT试剂中的R*也包括可选取代的x-价形式的情况下：烷基；饱和的、不饱和的或芳香族碳环或杂环；烷硫基；二烷基氨；有机金属物质和聚合物链。
包括聚合物链的活性聚合试剂通常在本领域中称为“大分子(macro)”活性聚合试剂。可以在控制给定的活性聚合试剂的情况下，通过聚合烯不饱和单体方便地制备这种“大分子”活性聚合试剂。
在一个实施方式中，在控制活性聚合试剂例如RAFT试剂的情况下，通过聚合烯不饱和单体形成至少三种均聚物链。
可以根据本发明使用的RAFT试剂中的Z的实例包括可选取代，并且在可以根据本发明使用的RAFT试剂中的Z*包括可选取代的y-价形式的情况下：F、Cl、Br、I、烷基、芳基、酰基、氨基、碳环基、杂环基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、酰胺基、碳环氧基、杂环氧基、杂芳氧基、烷硫基、芳硫基、酰硫基、碳环硫基、杂环硫基、杂芳硫基、烷基芳基、烷基酰基、烷基碳环基、烷基杂环基、烷基杂芳基、烷氧基烷基、芳氧基烷基、烷基酰氧基、烷基碳环氧基、烷基杂环氧基、烷基杂芳氧基、烷硫基烷基、芳硫基烷基、烷基酰硫基、烷基碳环硫基、烷基杂环硫基、烷基杂芳硫基、烷基芳基烷基、烷基酰基烷基、芳基烷基芳基、芳基酰基芳基、芳基酰基、芳基碳环基、芳基杂环基、芳基杂芳基、芳氧基芳基、芳基酰氧基、芳基碳环氧基、芳基杂环氧基、芳基杂芳氧基、烷硫基芳基、芳硫基芳基、芳基酰硫基、芳基碳环硫基、芳基杂环硫基、芳基杂芳硫基、二烷氧基-、二杂环氧基-或二芳氧基氧膦基(diaryloxy-phosphinyl)、二烷基-、二杂环基-、或二芳基-氧膦基(diaryl-phosphinyl)、氰基(即，-CN)、和-S-R，其中R如式(II)中的限定。
在一个实施方式中，可以根据本发明使用的RAFT试剂是三硫代碳酸酯RAFT试剂，且Z或Z*是可选取代的烷硫基基团。
适合于根据本发明使用的大分子RAFT(MacroRAFT)试剂是可商购的，例如在SigmaAldrich目录(www.sigmaaklrich.com)上看到的那些。
可以根据本发明使用的其他RAFT包括在WO2010/083569和Benagliaetal,Macromolecules.(42),9384-9386,2009中描述的那些(其全部内容通过参考的形式结合到本发明中)。
在本文列出的可以从中选择Z、Z*、R和R*的限定基团列表中，每个烷基、烯基、炔基、芳基、碳环基、杂环基、杂芳基和聚合物链部分均可以是可选取代的。
在本文列出的从中可以选择Z、Z*、R和R*的限定基团的列表中，当给出Z、Z*、R或R*包含两个或更多的子基团(例如[基团A][基团B])时，子基团的顺序并不意指限定为它们呈现的顺序(例如，烷基芳基也可以认为是指芳基烷基)。
Z、Z*、R或R*可以是支化的和/或可选取代的。当Z、Z*、R或R*包括可选取代的烷基部分时，可选的取代基包括其中通过选自-O-、-S-、-NRa-、-C(O)-(即，羰基)、-C(O)C-(即，酯)和-C(O)NRa-(即，酰胺)的基团替换烷基链中的-CH2-基团，其中Ra可以选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、碳环基、杂芳基、杂环基、芳基烷基和酰基。
本文中提及x-价、y-价、多价或二价“形式的…”意指表示特定基团分别是x-价、y-价、多价或二价基团。例如，当x或y是2时，特定基团意指是二价基团。本领域技术人员将理解如何应用这些原理以提供较高价的形式。
支化聚合物的制备通常将包括烯不饱和单体的聚合。
可以用于制备支化聚合物的烯不饱和单体的适合的实例包括式(III)的那些：
其中，U和W独立地选自-CO2H-、-CO2R1-、-COR1-、-CSR1、-CSOR1、-COSR1、-CONH2、-CONHR1、-CONR1 2、氢、卤素和可选取代的C1-C4烷基或U和W一起形成内酯、酐或酰亚胺环，其可以自身是可选取代的，其中可选的取代基独立的选自羟基、-CO2H、-CO2R1-、-COR1-、-CSR1、-CSOR1、-COSR1、-CN、-CONH2、-CONHR1、-CONR1 2、-OR1、-SR1、-O2CR1、-SCOR1和-OCSR1；
V选自氢、R1、-CO2H、-CO2R1-、-COR1-、-CSR1、-CSOR1、-COSR1、-CONH2、-CONHR1、-CONR1 2、-OR1、-SR1、-O2CR1、-SCOR1和-OCSR1；
其中这个或每个R1独立地选自可选取代的烷基、可选取代的烯基、可选取代的炔基、可选取代的芳基、可选取代的杂芳基、可选取代的碳环基、可选取代的杂环基、可选取代的芳基烷基、可选取代的杂芳基烷基、可选取代的烷基芳基、可选取代的烷基杂芳基和可选取代的聚合物链。
式(III)的单体的特定实例包括在WO2010/083569、WO98/01478，MoadG.；Rizzardo,E；ThangS.H,Polymer2008,49,1079-1131和Aust.J.Chem.2005,58,379-410；Aust.J.Chem.,2006,59,669-692；Aust.J.Chem.,2009,62,1402-1472,Greenlee,R.Z.,在第三版聚合物手册中(Brandup,J,和Immergut.E.H.Eds)Wiley:NewYork,1989,pII/53和Benagliaetal,Macromolecules,(42),9384-9386,2009的一种或多种中概述的那些(其全部内容以参考的形式结合于本文中)。
当讨论用于制备支化聚合物的单体的类型时，其方便地称为性质上是亲水、疏水或阳离子的单体。在上下文中性质上是(“incharacter”)亲水、疏水或阳离子表示当聚合时，这些单体分别产生了亲水、疏水和阳离子均聚物链。例如，将通过聚合亲水性单体制备亲水性均聚物链。
仅作为指导，亲水性烯不饱和单体的实例包括但不限于丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸羟基乙基酯、甲基丙烯酸羟基丙基酯、低聚(亚烷基二醇)甲基醚(甲基)丙烯酸酯(OAG(M)A)、低聚(亚乙基二醇)(甲基)丙烯酸酯(OEG(M)A)、丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺、丙烯酸羟基乙基酯、N-甲基丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙基酯、Ν,Ν-二甲基氨基丙基甲基丙烯酰胺、N-羟基丙基甲基丙烯酰胺、4-丙烯酰基吗啉、2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙烷磺酸、磷酰胆碱甲基丙烯酸酯和N-乙烯基吡咯烷酮。
当使用的单体产生阳离子均聚物链时，如前文的概述，形成的均聚物链可以不是固有地处于带阳离子电荷状态。换句话说，均聚物链可能需要与一种或多种其他化合物反应以转化为带阳离子电荷状态。例如，选择以形成阳离子均聚物链的单体可以包括叔胺官能团。当聚合单体以形成阳离子均聚物链之后，随后可以将叔胺官能团季铵化为带正电荷状态。
仅作为指导，阳离子烯不饱和单体的实例包括但不限于甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙基酯、甲基丙烯酸N,N-二乙基氨基乙基酯、丙烯酸N,N-二甲基氨基乙基酯、丙烯酸N,N-二乙基氨基乙基酯、甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐、N-[3-(N,N-二甲基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐、N-[3-(N,N-二甲基氨基)丙基]丙烯酰胺、N-[2-(N,N-二甲基氨基)乙基]甲基丙烯酰胺、丙烯酸2-N-吗啉代乙基酯、甲基丙烯酸2-N-吗啉代乙基酯、丙烯酸2-(N,N-二甲基氨基)乙基酯、甲基丙烯酸2-(N,N-二甲基氨基)乙基酯、甲基丙烯酸2-(N,N-二乙基氨基)乙基酯、2-丙烯酰氧基乙基三甲基氯化铵、甲基酰胺基丙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酸2-(叔-丁基氨基)乙基酯、烯丙基二甲基氯化铵、2-(二乙基氨基)乙基苯乙烯、2-乙烯基吡啶和4-乙烯基吡啶。
仅作为指导，疏水性烯不饱和单体的实例包括但不限于苯乙烯、α-甲基苯乙烯、丙烯酸丁基酯、甲基丙烯酸丁基酯、甲基丙烯酸戊基酯、甲基丙烯酸己基酯、甲基丙烯酸月桂基酯、甲基丙烯酸十八烷基酯、甲基丙烯酸乙基己基酯、甲基丙烯酸巴豆基酯、甲基丙烯酸肉桂基酯、甲基丙烯酸油烯基酯、甲基丙烯酸蓖麻油酯(ricinoleylmethacrylate)、甲基丙烯酸胆固醇基酯、丙烯酸胆固醇基酯、乙烯基丁酸酯、乙烯基叔-丁酸酯、乙烯基硬脂酸酯和乙烯基月桂酸酯。
在亲水性烯不饱和单体OAG(M)A的情况下，亚烷基部分通常是C2-C6，例如C2或C3，亚烷基部分。本领域技术人员将理解与“(亚烷基二醇)”相关的术语“低聚”表示存在多个亚烷基二醇单元。通常，OAG(M)A的低聚组分将包括约2至约200，例如从约2至约100，或从约2至约50或从约2至约20个亚烷基二醇重复单元。
因此亲水性均聚物链可以描述为包括聚合的亲水性烯不饱和单体的残基。
因此阳离子均聚物链可以描述为包括聚合的阳离子烯不饱和单体的残基。
因此疏水性均聚物链可以描述为包括聚合的疏水性烯不饱和单体的残基。
当将在聚合烯不饱和单体中使用自由基聚合技术从而形成至少部分支化聚合物时，聚合通常需要来自自由基的来源的引发。
可以通过产生自由基的任何适合的方法提供引发自由基的来源，诸如适合化合物的热诱导的均裂裂解(thermallyinducedhomolyticscission)(热引发剂诸如过氧化物、过氧化酯、或偶氮化合物)，由单体自发产生的(例如苯乙烯)、氧化还原引发系统、光化学引发系统或高能辐射诸如电子束、X-或伽马辐射。这种引发剂的实例可以在例如WO2010/083569和MoadandSolomon“TheChemistryofFreeRadicalPolymerisation”,Pergamon,London,.1995,pp53-95中找到(其全部内容以参考的形式结合于本文中)。
可以使用本领域已知的技术构建支化聚合物。例如，聚合物的均聚物臂可以首先使用合适的聚合反应形成，并且然后，随后连接至适合的支撑部分。这种技术被称为“连接(couplingonto)”方法。这种连接方法可以包括将预制的均聚物链连接至预制的支撑部分。可替代地，在同时形成支撑部分的过程中可以连接预制的均聚物链。例如，具有共价键连到其上的活性聚合物试剂(或部分)的预制均聚物链可以用于控制多烯不饱和单体的聚合，从而形成共价附接均聚物链的交联聚合物支撑部分。
为了进一步描述根据本发明的支化聚合物可以如何制备，参考图2，其中表示交联聚合物结构形式中的支撑部分，表示通用共价键，表示具有共价键连至其上的RAFT试剂的阳离子均聚物链，表示具有共价键连至其上的RAFT试剂的亲水性均聚物链，以及表示具有共价键连至其上的RAFT试剂的疏水性均聚物链，其中R和Z如在本文适合的RAFT试剂的上下文中的定义。
参考图2，阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链形式的预制的大分子RAFT试剂用于控制多烯不饱和单体(DSDMA)的聚合，从而形成共价附接均聚物链的交联聚合物支撑部分
因此本发明也提供了制备包括支撑部分和各自共价连接至支撑部分且从支撑部分延伸的至少三种均聚物链的支化聚合物的方法，其中至少三种均聚物链包括阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链，该方法包括：
(i)提供阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链，每个均聚物链具有共价键连至其上的活性聚合部分；以及
(ii)在控制活性聚合部分的情况下，聚合一种或多种多烯不饱和单体，从而形成共价附连每个阳离子、亲水和疏水性均聚物链的交联聚合物支撑部分。
在该方法的一个实施方式中，步骤(i)中提供的每种均聚物链均具有共价连接至其上的RAFT部分；
在本文中使用的“活性聚合部分(livingpolymerizationmoiety)”意指表示可以参与且控制一种或多种烯不饱和单体的活性聚合，从而形成活性聚合物链的部分。
适合用于根据本发明用途的活性聚合部分包括但不限于促进选自离子聚合和受控自由基聚合(controlledradialpolymerisation)(CRP)的活性聚合技术的那些。CRP的实例包括但不限于本文中描述的引发转移终止剂聚合(iniferterpolymerisation)、稳定自由基介导聚合(stablefreeradialmedicatedpolymerisation)(SFRP)、原子转移自由基聚合(atomtransferradicalpolymersation)(ATRP)和可逆加成断裂链转移(reversibleadditionfragmentationchaintransfer)(RAFT)聚合。
可以根据本发明使用的多烯不饱和单体(或多官能单体)的实例包括二硫化物二甲基丙酸酯、二硫化物二甲基丙烯酸酯、二(甲基)丙烯酸乙二醇酯、二丙烯酸乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸三乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸四乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸聚(乙二醇)酯、二(甲基)丙烯酸1,3-丁二醇酯、三(甲基)丙烯酸三羟甲基丙烷酯、二(甲基)丙烯酸1,4-丁二醇酯、二丙烯酸1,4-丁二醇酯、二(甲基)丙烯酸新戊二醇酯、二(甲基)丙烯酸1,6-己二醇酯、二(甲基)丙烯酸季戊四醇酯、三(甲基)丙烯酸季戊四醇酯、四(甲基)丙烯酸季戊四醇酯、二(甲基)丙烯酸丙三醇酯、二(甲基)丙烯酸丙三醇烯丙氧基酯、二(甲基)丙烯酸1,l,l-三(羟基甲基)乙烷酯、三(甲基)丙烯酸1,1,1-三(羟基甲基)乙烷酯、二(甲基)丙烯酸1,1,1-三(羟基甲基)丙烷酯、三(甲基)丙烯酸1,1,l-三(羟基甲基)丙烷酯、氰尿酸三烯丙基酯、异氰尿酸三烯丙基酯、偏苯三酸三烯丙基酯、邻苯二甲酸二烯丙基酯、对苯二甲酸二烯丙基酯、二乙烯基苯、二乙烯基己二酸、4.4’-二乙烯基联苯、羟甲基(甲基)丙烯酰胺、三烯丙基胺、马来酸油烯基酯、甘油基丙氧基三丙烯酸酯、甲基丙烯酸烯丙基酯、甲基丙烯酸酐和亚甲基双(甲基)丙烯酰胺、双(2-甲基丙烯酰基)氧基乙基二硫化物、Ν,Ν'-双(丙烯酰基)胱胺和Ν,Ν'-亚甲基双丙烯酰胺。
也可以通过直接从适合的支撑部分聚合单体形成支化聚合物。这种技术被称为“先核(corefirst)”方法。
也可能使用连接和先核方法的组合。例如，可以直接从适合的支撑部分聚合单体以形成阳离子均聚物链(先核)。然后可以将预制的亲水和疏水性均聚物链连接至支撑部分(连接)。
本发明也提供了包括支化聚合物和核酸分子的复合物。本文中使用的术语“复合物”表示通过支化聚合物和核酸分子的离子结合的联接。离子结合源自与支化聚合物的阳离子均聚物链和核酸分子相关的带相反电荷的离子之间的静电吸引。将理解阳离子均聚物链将提供正电荷，并且因此核酸分子将提供负电荷，从而促进所需的静电吸引和复合物的形成。
核酸分子上的净负电荷通常将源自带负电荷的核酸分子自身(例如，来自磷酸盐基团)。对核酸分子的任何修饰均可以保持净负电荷至允许通过与支化聚合物的离子结合形成复合物的程度。
不期望受理论限制，支化聚合物和核酸分子被认为通过核酸分子的带负电荷的骨架与支化聚合物的阳离子均聚物链之间离子相互作用形成纳米微粒。根据在给定支化聚合物中的阳离子电荷的数量，可以使一种或多种核酸分子与聚合物结合以形成复合物，并且复合核酸分子的数量可以随着聚合物中臂/支链数量的增加而增加。因此，支化聚合物可以具有的优势为与那些直链对应物相比，每个支化聚合物分子可以复合更多的核酸分子。
可以使用用于制备阳离子聚合物/核酸分子复合物的已知的技术制备包括支化聚合物和核酸分子的复合物。例如，可以将悬浮于水中的所需量的聚合物引入到包括低血清介质诸如的容器中。然后可以将所需量的核酸分子引入到这个溶液中，并且在合适的时间量内涡旋(vortexed)产生的混合物从而形成复合物。
核酸分子可以是可商购的或使用本领域公知的技术制备或分离。
对于可以用于形成复合物的核酸分子与支化聚合物的比例是没有特别的限制。本领域技术人员将理解支化聚合物和核酸分子的电荷密度(如通过ζ电势(Zetapotential)表示)、与支化聚合物和核酸分子的比例一起将影响产生的复合物的总电荷/中性状态。
在一个实施方式中，复合物具有正ζ电势。在进一步的实施方式中，复合物具有的正ζ电势在从大于0mV至约100mV，或从大于0mV至约50mV的范围内，例如从约10mV至约40mV，或从约15mV至约30mV，或从约20mV至约25mV。
通过MalvernZetasizer测量根据本发明的复合物的ζ电势。由电场中微粒的迁移率(电泳迁移率)和样品中微粒尺寸分布的测量计算ζ电势。
本文中使用的术语“核酸分子”表示包括DNA(gDNA、cDNA)、寡核苷酸(双链或单链)、RNA(正义RNA、反义RNA、mRNA、tRNA、rRNA、小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、短发卡状RNA(shRNA)、piwi-相互作用RNA(piwi-interactingRNA，PiRNA)、微RNA(miRNA)、核仁小RNA(smallnucleolarRNA)(SnoRNA)、小核RNA(smallnuclear)(SnRNA)核酶、适体、DNA酶、核糖核酸酶型复合物和在本文中描述的其他这种分子的核酸分子。为了避免疑问，术语“核酸分子”包括非自然发生的修饰形式，以及自然发生的形式。
在一些实施方式中，核酸分子包括从约8至约80个核碱基(即，从约8至约80个连续连接的核酸)。本领域普通技术人员将理解本发明采用8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个核碱基长度的核酸分子。
术语“核酸分子”也包括其他家族的化合物诸如寡核苷酸类似物、嵌合体、杂化物和模拟物(mimetic)形式。
也可以形成作为两种或更多种核酸分子的复合物结构的嵌合体寡聚化合物包括但不限于寡核苷酸、寡核苷酸类似物、寡核苷(oligonucleoside)和寡核苷酸模拟物。常规使用的嵌合体化合物包括但不限于杂化物、半聚体(hemimer)，间聚体(gapmer)、延长的间聚体、反向间聚体和嵌段聚体(blockmer)，其中从天然或修饰的DNA和RNA类型单元和/或模拟物类型子单元诸如例如锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、吗啉等选择各种点修饰和或区域。这种杂合结构的制备在例如美国专利号5,013,830；5,149,797；5,220,007；5.256,775；5.366.878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；和5,700,922中进行了描述，其全部内容以参考的形式结合到本文中。
RNA和DNA适体也是考虑的。适体是通过除典型沃森-克里克(Watson-Crick)碱基对外的相互作用对非核酸或核酸分子具有特定结合亲和力的核酸分子。适体在例如美国专利号5,475,096；5,270,163；5,589,332；5,589,332；和5,741,679中进行了描述。越来越多的识别它们的非核酸目标的DNA和RNA适体已经被开发且已经被表征(参见，例如Goldetal,Anna.Rev.Biochem.,64:763-797.1995；Bacheretal.DrugDiscoveryToday,3(6):265-273,1998)。
可以对核酸分子进行进一步的修饰并且可以包括附接至终点、选择的核碱基位置、糖位置中的一种或核苷间连接中的一种的结合基团(conjugategroup)。
本发明也提供了将核酸分子递送至细胞的方法，该方法包括：
(a)提供包括支化聚合物和核酸分子的复合物，支化聚合物包括支撑部分和共价连接至该部分且从该部分延伸的至少三种均聚物链，其中至少三种均聚物链包括阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链；以及
(b)将该复合物递送至细胞。
这种方法可以体内(invivo)、离体(exvivo)或体外(invitro)进行。
本发明进一步提供了基因治疗的方法，包括如在本文中描述的，给予需要其的受试者根据本发明的治疗有效量的核酸分子复合物。
例如，当在遗传病如囊性纤维化、血友病和血红蛋白病(globinopathies)，诸如镰形细胞贫血和β-地中海贫血的背景下研究时，作为基因治疗的DNA修复和介导重组的相关性是明显的。例如，如果靶基因包含引起遗传疾病的突变，那么将核酸分子递送至受试者的细胞中可以有用于促进突变修复，以将异常靶基因的DNA序列恢复到正常。可替换地，引入至受试者的细胞中的核酸分子可以导致另外地疾病状态的抑制或沉默的基因的表达。这种核酸分子可以自身编码沉默或抑制基因，或者它们可以激活另外的抑制或沉默的靶基因的转录和/或翻译。
本领域技术人员将理解的是，使用本发明的方法待治疗的疾病或状况可以是能够通过基因治疗而治疗的任何疾病或状况，并且将使用的基因物质(geneticmaterial)(即，核酸分子)的选择将清楚地取决于特定的疾病或状况。可以被治疗的疾病或状况包括但不限于，癌症(例如，骨髓紊乱)、地中海贫血、囊性纤维化、耳聋、视觉障碍(例如，莱贝尔先天性黑矇)、糖尿病、亨廷顿病、X连锁性严重联合免疫缺陷病和心脏病。可替换地，基因疗法可以用于引入非内源性基因，例如，用于生物发光的基因，或者引入敲除内源性基因的基因(例如，RNA干扰)。
本领域技术人员还将理解的是，核酸分子的性质将总是取决于将治疗或预防的疾病或状况。例如，通过将本发明的核酸分子复合物递送至受试者(以靶向或非靶向方法)，可以治疗或预防至少部分归因于纤维化细胞外基质物质(例如，II型胶原)的累积的疾病或状况，其中，核酸分子(例如，siRNA)能够沉默编码细胞外基质物质的基因。在一些实施方式中，疾病或状况是传染性疾病、炎症性疾病、或癌症。
在体内进行根据本发明的核酸分子复合物至细胞的递送时，通过在该情况下适当的任何给药途径，可以将核酸分子复合物引入至细胞。例如，在旨在系统递送时，复合物可以静脉内给药、皮下给药、肌肉内给药、口服给药等。可替换地，通过本领域技术人员已知的方法，复合物可以靶向特定细胞或细胞类型。出于多种原因如，例如，对于靶癌细胞，如果核酸分子对于非癌症细胞具有不可接受的毒性，或如果其将另外需要过高剂量，靶向可以是可期望的。
可以体外、体内或离体地进行靶向递送，并且可以通过本领域技术人员已知的方法实现靶向递送。例如，可以通过受体介导的靶向或通过将核酸复合物直接给予包含靶细胞的组织实现这个目的。
通过支化聚合物和/或核酸分子与本文描述的适合靶向配体连接或结合，可以实现受体介导的靶向。
例如，可以通过核酸分子与蛋白质配体例如通过聚赖氨酸的结合，可以实现受体介导的靶向。
通常基于靶细胞/组织类型的表面上存在的相应配体受体选择靶向配体。
配体-核酸分子结合物可以与根据本发明的支化聚合物复合并且根据需要系统地给药(例如，静脉内)，其中，它们将被导向受体结合发生的靶细胞/组织。
在一个实施方式中，支化聚合物和/或核酸分子与靶向配体结合以促进细胞的受体介导靶向。
在另一个实施方式中，核酸分子与蛋白质配体结合以促进细胞的受体介导靶向。
术语“连接”、“相连”和“结合”、“结合了”在本文中可互换使用并且意指表示至少两个实体通常通过共价键的方式连接从而形成单一实体。
在另一个实施方式中，离体进行根据本发明的核酸分子至细胞的递送方法。例如，从受试者分离细胞，并且与本发明的核酸分子复合物一起离体引入以产生包含外源核酸分子的细胞。可以从将被治疗的受试者或从同基因的(同源的，syngeneic)宿主中分离细胞。之后，为了治疗或预防的目的，将细胞重新导回受试者中(或到同基因的受体中)。在一些实施方式中，细胞可以是造血祖细胞(hematopoieticprogenitor)或干细胞。
在一个实施方式中，为了沉默(或抑制)基因表达的目的，将核酸分子递送至细胞。在一些实施方式中，通过降低翻译效率或降低信息稳定性或这些效应的组合来沉默基因表达。在一些实施方式中，未加工的RNA的剪接是导致无功能或较低活性蛋白质的生产的靶向目标。
在一些实施方式中，通过将DNA分子递送至细胞来沉默基因表达，包括但不限于，gDNA、cDNA以及DNA寡核苷酸(双链或单链)。
在一些实施方式中，通过RNA干扰(RNAi)沉默基因表达。在没有将本发明限制于特定理论或作用模式的情况下，“RNA干扰”通常描述基于降解或另外地防止mRNA翻译，例如，以序列特异性方式，沉默基因表达的机理。本领域技术人员将理解的是，外源性干扰RNA分子可以导致mRNA降解或者mRNA翻译抑制。在一些实施方式中，通过改变读码框以引入一种或多种导致无义介导衰变的提前终止密码子(prematurestopcodon)来实现RNA干扰。
RNAi包括涉及通过靶mRNA降解在基因表达中导致序列特异性降低的双链(正义和反义)RNA的基因沉默的过程。通常通过短双链siRNA或者单链微RNA(miRNA)介导RNAi。
也已经描述了具有RNA类似性质的其他寡核苷酸，并且可以开发更多不同类型的RNAi。例如，反义寡核苷酸已经用于改变外显子使用以及用于调节pre-RNA剪接(参见，例如，Madocsaietal.,MolecularTherapy,12:1013-1022,2005和Aartsma-Rusetal.,BMCMedGenet.,8:43,2007)。反义和iRNA化合物可以是双链或单链寡核苷酸，其是特异性地与感兴趣的靶基因的DNA或RNA杂交的RNA或RNA类(RNA样，RNA-like)或DNA或DNA类(DNA样，DNA-like)分子。
适合用于本发明的上下文中的RNA分子的实例包括但不限于：长双链RNA(dsRNA)；发夹双链RNA(发夹dsRNA)；短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA微RNA/小时序RNA(miRNA/stRNA))；介导空间发展的miRNA(sdRNA)，应激反应(srRNA)或细胞周期(ccRNA)；以及设计以杂交并防止内源性表达miRNA或stRNA或外源性引入的siRNA的功能的RNA寡核苷酸。
在其他实施方式中，核酸分子抑制翻译引发、在剪接供体位点或剪接受体位点的剪接。在其他实施方式中，剪接的修饰改变读码框并且引发无义介导的转录本降解。
在关于根据本发明适合使用的核酸分子的设计的另一个实施例中，在本领域技术人员的技术内的是确定分子的特定结构和长度，例如，其是否采取dsRNA、发夹dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、pre-miRNA、pri-miRNA的形式或如在本文中描述的任何其他的适合形式。
术语“基因”以其最宽含义使用并且包括相对于基因外显子的cDNA。在此，提及的“基因”也包括：由转录和/或翻译调节序列和/或编码区域和/或非翻译序列(即，内含子，5′-和3′-未翻译序列)构成的经典基因组基因；或与编码区域(即，外显子)、pre-mRNA和基因的5′-和3′-非翻译序列相对应的mRNA或cDNA分子。
提及的“表达”是指对基因表达的广泛提及并且包括从基因或核酸分子，从前转录(pre-transcription)，通过转录和翻译至翻译后(post-translation)生成蛋白或RNA过程中的任何阶段。
如在本文中使用的“细胞”包括真核细胞(例如，动物细胞、植物细胞和真菌或原生生物的细胞)，和原核细胞(例如，细菌)。在一个实施方式中，细胞是人类细胞。
如在本文中使用的术语“受试者”意指动物或人受试者。“动物”意指灵长类动物、家畜(包括牛、马、绵羊、猪和山羊)、陪伴动物(包括狗、猫、兔和豚鼠)、捕获的野生动物(包括动物园环境中通常发现的那些)、和水生动物(包括淡水和咸水动物，如鱼和甲壳类动物)。实验室动物如兔、小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠也被考虑，因为它们可以提供方便的测试系统。在一些实施方式中，受试者是人类受试者。
复合物或组合物“给予”受试者意指提供试剂或组合物，使得其能够被或被转移至受试者。对给药模式没有特殊的限制，但这将通常通过口服、肠胃外(包括皮下、皮内、肌肉内、静脉内、鞘内、以及脊柱内)、吸入(包括雾化)、直肠和阴道(vaginal)模式。
在不受理论约束或限制的情况下，已经发现本发明的复合物保护核酸分子免于被酶如RNA酶和/或DNA酶降解。
因此，本发明还提供了保护核酸分子免于酶降解的方法，该方法包括将核酸分子与支化聚合物复合，支化聚合物包括支撑部分和共价连接至该部分并且从该部分延伸的至少三种均聚物链，其中至少三种均聚物链包括阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链。
还提供了复合物用于将核酸分子递送至细胞的用途，复合物包括支化聚合物和核酸分子，支化聚合物包括支撑部分和共价连接至该部分并且从该部分延伸的至少三种均聚物链，其中至少三种均聚物链包括阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链。
本发明进一步提供了复合物用于沉默基因表达的用途，复合物包括支化聚合物和核酸分子，支化聚合物包括支撑部分和共价连接至该部分并且从该部分延伸的至少三种均聚物链，其中至少三种均聚物链包括阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链。
在一个实施方式中，核酸分子选自DNA和RNA。在进一步的实施方式中，DNA和RNA选自gDNA、cDNA、双链或单链DNA寡核苷酸、正义RNA、反义RNA、mRNA、tRNA、rRNA、小/短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)、piwi-相互作用RNA(PiRNA)、微RNA/小时序RNA(miRNA/stRNA)、小核仁RNA(SnoRNA)、小核(SnRNA)核酶、适体、DNA酶、核糖核酸酶类型复合物、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、介导空间发展的miRNA(sdRNA)、应激反应RNA(srRNA)、细胞周期RNA(ccRNA)和双链或单链RNA寡核苷酸。
本发明.进一步提供了支化聚合物在保护核酸分子免于酶降解中的用途，支化聚合物包括支撑部分和共价连接至该部分并且从该部分延伸的至少三种均聚物链，其中至少三种均聚物链包括阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链。
本发明还涉及组合物如药用组合物，包括本发明的核酸分子复合物。在一些实施方式中，组合物将包括本发明的核酸分子复合物和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
在本发明的组合物中，核酸分子复合物通常配制用于以有效量给药。如在本文中使用的术语核酸复合物的“有效量”和“治疗有效量”通常意指在至少统计上显著数量的受试者中，在疗程(course)中提供期望的治疗或预防效果的复合物的足够的量。
在一些实施方式中，用于人类受试者的有效量位于约0.1ng/kg体重/剂量至lg/kg体重/剂量的范围内。在一些实施方式中，范围是约1μg至1g、约lmg至lg、lmg至500mg、lmg至250mg、lmg至50mg、或者1μg至lmg/kg体重/剂量。剂量方案被调整以适应紧急情况并且可以被调整以产生最佳治疗或预防剂量。
“药学上可接受的”载体、赋形剂或稀释剂意指由非生物学或者其他不希望的物质组成的药用载体；即，该物质可以与本发明的复合物一起给予受试者，而不引起任何的或实质性的不良反应。
本发明的方面包括针对传染性疾病、炎症性疾病或者癌症用于治疗受试者的方法，所述方法包括将根据本发明的复合物给予受试者，或者将根据本发明的药用组合物给予受试者。
也发现了根据本发明的支化聚合物在农业行业、化妆品行业中可以用作用于生物活性剂(bioactive)的递送载体，作为粘度改性剂、表面活性剂、分散剂或作为添加剂，例如在涂料和化妆品的配制品中。
如在本文中使用的(单独或以复合词使用的)术语“烷基”表示直链、支链或环状烷基，优选地，C1-20烷基，例如C1-10或C1-6。直链和支链烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1,2-二甲基丙基、1,1-二甲基-丙基、和己基。环状烷基的实例包括单环或多环烷基基团，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基等。在将烷基基团通常称作“丙基”、“丁基”等时，将理解的是，在适当时，这可以指任何直链、支链和环状异构体。烷基基团可以由如在本文中定义的一种或多种可选的取代基可选地取代。
如在本文中使用的术语“烯基”表示从包含至少一个碳-碳双键的直链、支链或环状烃残基形成的基团，包括如之前定义的烯类单-、双-或多不饱和烷基或环烷基基团，优选地，C2-20烯基(例如，C2-10或C2-6)。烯基的实例包括乙烯基、烯丙基、l-甲基乙烯基和丁烯基。烯基基团可以由如在本文中定义的一种或多种可选的取代基可选地取代。
如在本文中使用的，术语“炔基”表示从包含至少一个碳-碳三键的直链、支链或环状烃残基形成的基团，包括如之前定义的烯类单-、双-或多不饱和烷基或环烷基基团。除非指定碳原子的数量，该术语优选表示C2-20炔基(例如，C2-10或C2-6)。实例包括乙炔基、l-丙炔基、2-丙炔基、和丁炔基异构体，和戊炔基异构体。炔基基团可以由如在本文中定义的一种或多种可选的取代基可选地取代。
术语“卤素”(“卤”)表示氟、氯、溴或碘(氟代、氯代、溴代或碘代)。
术语“芳基”(或“碳芳基”)表示芳香族烃环系统的任何单核、多核、共轭和稠和的残基(例如，C6-24或C6-18)。芳基的实例包括苯基、联苯基(biphenyl)、三联苯基、四联苯基(quaterphenyl)和萘基。芳基基团可以由或可以不由如在本文中定义的一种或多种可选的取代基可选地取代。术语“亚芳基”意指表示芳基的二价形式。
术语“碳环基”包括任何非芳香族单环、多环、稠和或共轭烃残基，优选C3-20(例如，C3-10或C3-8)。环可以是饱和的，例如，环烷基，或可以具有一个或多个双键(环烯基)和/或一个或多个三键(环炔基)。碳环基基团可以由如在本文中定义的一种或多种可选的取代基可选地取代。术语“亚碳环基”意指表示碳环基的二价形式。
如在本文中使用的，术语“杂原子”或“杂”以其最宽的含义表示可以是环状有机基团的成员的除碳原子之外的任何原子。杂原子的特别的实例包括氮、氧、硫、磷，硼、硅、硒和碲，更特别地是氮、氧和硫。
当单独或以复合词使用时，术语“杂环基”包括任何单环、多环、稠和或共轭烃残基，优选C3-20(例如，C3-10或C3-8)，其中，一个或多个碳原子被杂原子代替以提供非芳香族残基。合适的杂原子包括O、N、S、P和Se，特别是O、N和S。在两个或更多碳原子被代替时，这可以是通过两个或更多相同杂原子或不同杂原子。杂环基团可以是饱和或部分不饱和的，即，具有一个或多个双键。杂环基基团可以由如在本文中定义的一种或多种可选的取代基可选地取代。术语“亚杂环基”意指表示杂环基的二价形式。
术语“杂芳基”包括任何单环、多环、稠和或共轭烃残基，其中，一个或多个碳原子被杂原子取代以提供芳香族残基。优选的杂芳基具有3-20个环原子，例如3-10个。特别优选的杂芳基是5-6和9-10元的双环系统。合适的杂原子包括O、N、S、P和Se，特别是O、N和S。在两个或更多碳原子被代替时，这可以是通过两个或更多相同杂原子或通过不同杂原子。杂芳基基团可以由如在本文中定义的一种或多种可选的取代基可选地取代。术语“亚杂芳基”意指表示杂芳基的二价形式。
术语“酰基”(单独或以复合词)表示包含部分C＝O(并且不是羧酸、酯或酰胺)的基团。优选的酰基包括C(O)-Re，其中，Re是氢或烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环基、或杂环基残基。
术语“亚砜”(单独或以复合词)表示基团-S(O)Rf，其中，Rf选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、碳环基和芳烷基。优选的Rf的实例包括C1-20烷基，苯基和苄基。
术语“磺酰基”(单独或以复合词)表示基团S(O)2-Rf，其中，Rf选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、碳环基和芳烷基。
术语“磺酰胺”(单独或以复合词)表示基团S(O)NRfRf，其中，每个Rf独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、碳环基和芳烷基。
本文中使用的术语“氨基(amino)”，以如其在本领域中理解的最宽的含义使用并且包括式NRaRb的基团，其中，Ra和Rb可以是独立选自以下的任一种：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、碳环基、杂芳基、杂环基、芳基烷基，和酰基。Ra和Rb与它们附接至其上的氮一起也可以形成单环、或多环系统，例如3-10元环，尤其5-6和9-10元系统。
本文中使用的术语“酰氨基(amido)”以如其在本领域中理解的最宽的含义使用并且包括具有式C(O)NRaRb的基团，其中，Ra和Rb如以上所定义的。
本文中使用的术语“羧基酯”以其在本领域中理解的最宽的含义使用并且包括具有式CO2Rg的基团，其中，Rg可以选自包括烷基、烯基、炔基、芳基、碳环基、杂芳基、杂环基、芳基烷基、和酰基的基团。
如在本文中使用的术语“芳氧基”表示通过氧桥附接的“芳基”基团。芳氧基取代基的实例包括苯氧基、联苯氧基(biphenyloxy)、萘氧基等。
如在本文中使用的术语“酰氧基”表示其中“酰基”基团进而通过氧原子附接的“酰基”基团。
如在本文中使用的术语“烷氧基羰基”表示通过羰基基团附接的“烷氧基”基团。“烷氧基羰基”基团的实例包括甲酸丁酯、甲酸仲丁酯、甲酸己酯、甲酸辛酯、甲酸癸酯、甲酸环戊酯等。
如在本文中使用的术语“芳基烷基”表示由用芳香族环取代的直链或支链烷烃形成的基团。芳基烷基的实例包括苯基甲基(苄基)、苯乙基和苯丙基。
如在本文中使用的术语“烷基芳基”表示由用直链或支链烷烃取代的芳基基团形成的基团。烷基芳基的实例包括甲基苯基和异丙基苯基。
在本说明书中“可选取代的”用于意指基团可以被或可以不被一个、两个、三个或更多有机和无机基团取代或稠和(以便形成缩合的多环基团)，包括选自以下的那些：烷基、烯基、炔基、碳环基、芳基、杂环基、杂芳基、酰基、芳烷基、烷芳基、烷杂环基、烷杂芳基、烷碳环基、卤素、卤烷基、卤烯基、卤炔基、卤芳基、卤碳环基、卤杂环基、卤杂芳基、卤酰基、卤芳烷基、羟基、羟基烷基、羟基烯基、羟基炔基、羟基碳环基、羟基芳基、羟基杂环基、羟基杂芳基、羟基酰基、羟基芳烷基、烷氧基烷基、烷氧基烯基、烷氧基炔基、烷氧基碳环基、烷氧基芳基、烷氧基杂环基、烷氧基杂芳基、烷氧基酰基、烷氧基芳烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳氧基、碳环氧基、芳基烷氧基、杂芳氧基、杂环氧基、酰氧基、卤烷氧基、卤烯氧基、卤炔氧基、卤芳氧基、卤碳环氧基、卤芳基烷氧基、卤杂芳氧基、卤杂环氧基、卤酰氧基、硝基、硝基烷基、硝基烯基、硝基炔基、硝基芳基、硝基杂环基、硝基杂芳基、硝基碳环基、硝基酰基、硝基芳烷基、氨基(NH2)、烷氨基、二烷基氨基、烯基氨基、炔基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、芳烷基氨基、二芳烷基氨基、酰氨基、二酰氨基、杂环氨基、杂芳基氨基、羧基、羧基酯、酰氨基(amido)、烷基磺酰氧基、芳基亚磺酰基氧基(arylsulphenyloxy)、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、硫基、烷硫基、烯硫基、炔硫基、芳硫基、芳烷基硫基、碳环硫基、杂环硫基、杂芳基硫基、酰硫基、亚砜、磺酰基、磺酰胺(sulfonamide)、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基、氨基碳环基、氨基芳基、氨基杂环基、氨基杂芳基、氨基酰基、氨基芳烷基、硫代烷基、硫代烯基、硫代炔基、硫代碳环基、硫代芳基、硫代杂环基、硫代杂芳基、硫代酰基、硫代芳烷基、羧基烷基、羧基烯基、羧基炔基、羧基碳环基、羧基芳基、羧基杂环基、羧基杂芳基、羧基酰基、羧基芳烷基、羧基酯烷基、羧基酯烯基、羧基酯炔基、羧基酯碳环基、羧基酯芳基、羧基酯杂环基、羧基酯杂芳基、羧基酯酰基、羧基酯芳烷基、酰氨基烷基(amidoalkyl)、酰氨基烯基、酰氨基炔基、酰氨基碳环基、酰氨基芳基、酰氨基杂环基、酰氨基杂芳基、酰氨基酰基、酰氨基芳烷基、甲酰烷基、甲酰烯基、甲酰炔基、甲酰碳环基、甲酰芳基、甲酰杂环基、甲酰杂芳基、甲酰酰基(formylacyl)、甲酰芳烷基、酰基烷基、酰基烯基、酰基炔基、酰基碳环基、酰基芳基、酰基杂环基、酰基杂芳基、酰基酰基、酰基芳烷基、亚砜烷基、亚砜烯基、亚砜炔基、亚砜碳环基、亚砜芳基、亚砜杂环基、亚砜杂芳基、亚砜酰基、亚砜芳烷基、磺酰烷基、磺酰烯基、磺酰炔基、磺酰碳环基、磺酰芳基、磺酰杂环基、磺酰杂芳基、磺酰酰基、磺酰芳烷基、磺酰酰氨基烷基、磺酰酰氨基烯基、磺酰酰氨基炔基、磺酰酰氨基碳环基、磺酰酰氨基芳基、磺酰酰氨基杂环基、磺酰酰氨基杂芳基、磺酰酰氨基酰基、磺酰酰氨基芳烷基、硝基烷基、硝基烯基、硝基炔基、硝基碳环基、硝基芳基、硝基杂环基、硝基杂芳基、硝基酰基、硝基芳烷基、氰基、硫酸酯、磷酸酯、三芳基甲基、三芳基氨基、噁二唑和咔唑基团。可选取代也可以用于表示其中链或环中的-CH2-基团被选自以下的基团取代：-O-、-S-、-NRa-、-C(O)-(即，羰基)、-C(O)O-(即，酯)、和-C(O)NRa-(即，酰胺)，其中，Ra如在本文中所定义的。
现在，将参照以下非限制性实施例描述本发明。
实施例
实施例1
材料
从Aldrich购买低聚甲基丙烯酸(乙二醇)酯(OEGMA8-9，Mn～475gmol-1)、甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯(DMAEMA)、甲基丙烯酸正丁酯(n-BMA)单体和二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)交联剂，并且在使用之前，在存在用于氢醌或氢醌单甲醚的抑制剂-去除剂(Aldrich)下通过搅拌30分钟，进行纯化。根据公开的文献制备4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基]戊酸(DTTCP)RAFT试剂(G.Moad,Y.K.Chong,A.Postma,E.Rizzardo,S.HThang,Polymer2005,46,8458.)[1]，二硫化物二甲基丙烯酸酯(DSDMA)交联剂(J.Rosselgong,S.P,Armes,W.Barton,D.Price,Macromolecules2009,42,5919)[2]。1,1’-偶氮双(环己烷腈)(ACCN或VAZO-88，杜邦)引发剂、三丁基膦(Bu3P，Aldrich)还原剂以接收形式使用。N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、正己烷、正庚烷、二异丙醚、甲醇和其他化学物质是商业试剂并且不需要进一步纯化即可使用。
表征
使用BrukerAdvance400MHz光谱仪(1H400MHZ)获得质子核磁共振(1H-NMR)谱。在装备有CMB-20A控制系统、SIL-20AHT自动进样器、LC-20AT串联泵系统、DGU-20A脱气机单元、CTO-20AC柱温箱、RD1-10A折射指数检测器且装备有4×WatersStyragel柱(HT2、HT3、HT4、HT5，每个柱为300mm×7.8mm，提供100-4000000范围内的有效摩尔质量)的Shimadzu系统上，且在80℃下使用N,N-二甲基乙酰胺(NMAc)(具有2.1gL-1的氯化锂(LiCl))作为洗脱液在1mLmin-1的流速下进行凝胶渗透色谱(GPC)测量。由使用具有低多分散性指数值的聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)标准(PolymerLaboratories)构建的校准曲线获得试样的摩尔质量。使用三阶多项式(third-orderpolynomial)拟合logMp相对于时间的校准曲线，其在摩尔质量范围内是线性的。使用装备有在633nm下操作的4mWHeNe激光、具有高量子效率的雪崩光电二极管检测器(avalanchephotodiodedetector)和ALV/LSE-5003多τ数字相关器电子系统的MalvernInstrumentsZetasizerNanoseries仪器进行动态光扫描(DLS)实验。在具有10mMNaCl的背景电介质的水性1mg.mL-1星型聚合物溶液上实施水性光散射研究。
丹磺酰RAFT-试剂(3)的合成：
根据公开的文献Schraderet.al.,Chem.Eur.J.2007,13,7701-7707，在二氯甲烷：正己烷(1:1)溶剂混合物中重结晶之后，以84.8％产率制备用于制造标题丹磺酰-RAFT试剂的前体丹磺酰乙二胺(或2-丹磺酰氨基乙基胺)(1)。
丹磺酰-RAFT试剂：
向处于二氯甲烷(5mL)中的丹磺酰乙二胺(293mg，1.0mmol)、4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基]戊酸(2)(4.3mg，1.0mmol)和催化剂N,N-二甲基氨基吡啶(DMAP)的溶液中加入二异丙基碳二亚胺(DIC)(140mg，1.1mmol)，允许反应混合物在室温下搅拌4h。过滤DIC-脲副产物，真空去除挥发物，以及通过柱层析法(乙酸乙酯：正己烷3:2v/v作为洗脱液)纯化粗反应混合物(790mg)以作为黄色液体给出标题产物丹磺酰-RAFT试剂(2)(460mg，67.8％)。1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.88(t,3H,CH3),1.21-1.40(br.s,18,9xCH2),1.70(m,2H,CH2),1.85(s,3H,CH3),2.30-2.42(m,4H,CH2CH2),2.89(s,6H,(CH3)2),3.05(m,2H,C(＝O)NHCH2),3.30(m,2H,S(O)2NHCH23.33(dd,2H,CH2S),5.49(t.1HNH),5.99(t.1H,NH),7.21(d,1H,Ar-H).7.53(dd,1H,Ar-H).7.60(dd1H,Ar-H),8.24(dd,1H,Ar-H),8.55(d,1H,Ar-H)。
SN38RAFT试剂的合成：
根据公开的文献Williamsetal.,ChemMedChem.2012,7,281-291在两步合成中制备SN38-RAFT试剂。首先，根据Zhaoetal.,(BioconjugateChem.2008,19,849-59)的步骤由SN38(SN38是抗癌药物)制备10-Boc-SN38(Boc保护的SN38的10-OH基团)，并且然后在第二步中，允许在处于二氯甲烷溶剂中的DIC偶联剂存在下，使获得的10-Boc-SN38与4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基]戊酸反应。
向处于DCM(15mL)中的10-Boc-SN38(510mg，1.035mmol)、4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基]戊酸(426mg，1.05mmol)与催化剂N,N-二甲基氨基吡啶的溶液中加入处于DCM中的二异丙基碳二亚胺(DIC)(195mg，1.56mmol，1.5eq)的溶液，允许反应混合物在室温下搅拌16h。过滤DIC-脲副产物，真空去除挥发物并且通过柱层析法(乙酸乙酯：正己烷1:1v/v作为洗脱液)纯化粗反应混合物以作为黄色固体给出SN38-RAFT试剂(498mg，55％)。1HNMR(CDCl3)δ(ppm)0.84(t.3H,CH3),0.96(t,3H,CH3),1.21-1.36(br.m,1.8H,9xCH2),1.35(t,3HCH3),.1.58(s,9H,3xCH3),1.63(m,2H,CH2),1.81(s,3H,CH3),2.14(m,1H),2.25(m,1.H),2.35(m,1H),2.50(m,lH),2.79(m,2H),3.10(dd,2H,CH2S),3.21(dt,1H),3.27(t,lH),5.18(s,2H,),5.37(d,1H,),5.64(d.1H),7.14(d,1H,Ar-H),7.64(dd.1H,Ar-H),7.84(d,1H,Ar-H),8.21(dd.1H,Ar-H).
通过先臂法(armfirstapproach)合成杂臂星型聚合物(mikto-armstarpolymer)
聚合动力学方案：通过进行单独的聚合实验确定OEGMA8-9、DMAEMA和BMA的聚合速率，且使用的通用步骤总结如下：
在烧瓶中制备处于DMF(2.5g)中的VAZO-88(25mg)的储备溶液(stocksolution)I。在第二烧瓶中制备DTTCP(106mg)、OEGMA8-9(5.0g)，储备溶液I(643mg)和DMF(4.5g)的混合物。将这种储备溶液的等分部分(aliquot)(1.0g)转移至五个安瓿瓶，它们通过三个重复的冷冻-抽空-解冻循环脱气并在真空下密封。安瓿瓶在90℃下加热特定时间，并且然后经历GPC和1H-NMR分析。图3示出了针对时间和单体转化率以及聚合物分散性，三种单体的聚合物分子量的增长。制备的三种聚合物的GPC迹线在图3(I)中示出，来自聚合物的GPC和多分散性(D)的分子量结果在表1中示出。
表1.OEGMA8-9、DMAEMA和n-BMA的均聚物的制备，以及它们的GPC分子量结果
a)由1H-NMR计算的单体转化率；b)由单体转化率计算的Mn(理论)；c)使用PMMA标准由DMAcGPC获得的Mn(GPC)和D(GPC)。
杂臂聚合物的合成：使用安瓿瓶用于合成杂臂聚合物的典型步骤如下：在烧瓶中制备处于DMF中的ACCN(1.0wt.％)、P(OEGMA8-9)(30.0wt.％)P(DMAEMA)(30.1wt.％)、P(n-BMA)(27.3wt.％)、DSDMA(20.0wt.％)的储备溶液。将特定量的每种单体([单体]:[聚合物]＝6:1)分别加入至聚合物溶液。在烧瓶中制备ACCN溶液(73mg)、P(OEGMA8-9)溶液(129mg)P(DMAEMA)溶液(127mg)、P(n-BMA)溶液(120mg)、DSDMA溶液(146mg)和DMF(127mg)的混合物。将储备溶液转移至安瓿瓶，其通过三个冷冻-抽空-解冻循环脱气并在真空下密封。安瓿瓶在90℃下加热20h。
根据这个过程制备七种星型聚合物，并且表2总结了每种均聚物大分子RAFT试剂(homopolymermacroRAFT)和使用过的其他试剂的相对量，以及基于GPC分析的杂臂聚合物分子量。图4(III)中示出了选择的杂臂聚合物的GPC迹线。图4(IV)示出了在聚合前、聚合后(粗聚合物)混合的臂、纯化的聚合物、和降解的聚合物的GPC迹线。图5示出了纯化的杂臂聚合物的1H-NMR谱。
杂臂星型聚合物的季铵化：
为了季化杂臂星型聚合物的P(DMAEMA)臂的叔胺基基团，使用DMF稀释前文提及的星型物的储备溶液，然后将过量的MeI加入到该溶液中，并且在室温下搅拌16h。最后，在旋转蒸发器上去除过量的MeI；通过星型聚合物针对水透析4天去除DMF(分子量膜截留(molecularweightmembranecutoff)25,000Da)。在冷冻-干燥之后获得包含季铵化的P(DMAEMA)的星型聚合物。图6示出了季铵化的聚合物的1H-NMR谱。
图2.根据实施例1中描述的过程制备的杂臂星型聚合物的组成、聚合时间、单体和臂转化率和分子量数据(使用PMMA标准的DMAc)的总结。
a)由GPC迹线计算的臂转化率：臂转化率＝面积星型/(面积星型+面积大分子-RAFT)；b)使用PMMA标准由DMAcGPC获得Mn(GPC)和D(GPC)。
实施例2
使用三丁基膦还原裂解杂臂星型聚合物
将在其核芯中包含二硫键的杂臂聚合物(5mg)溶解于包含20mg的三丁基膦的1mLDMAc。在进行GPC分析前，在室温下在氮气氛下搅拌溶液30分钟。图3(IV)示出了星型聚合物和降解的聚合物的GPC迹线证明了交联的核芯的裂解以产生具有与臂可比较的分子量的低分子量聚合物。
实施例3
合成结合荧光染料若丹明甲基丙烯酸酯类似于S4-1(参照表2)的杂臂星型聚合物
使用先臂方法(arm-firstapproach)合成具有PolyFlour的杂臂星型聚合物。
对于第一步，用于合成具有PolyFlour的线型聚合物的典型过程如下。在烧瓶中制备处于DMF(2.5g)中的VAZO-88(25mg)的储备溶液I。在第二烧瓶中制备DTTCP(32mg)、PolyFlour(若丹明甲基丙烯酸酯MA)(11mg)、OEGMA8-9(1.5g)、储备溶液I(190mg)和DMF(1.3g)的混合物。将这种储备溶液转移至安瓿瓶，其通过三个重复的冷冻-抽空-解冻循环脱气并在真空下密封。安瓿瓶在90℃下加热特定的时间并且然后经历GPC和1H-NMR分析。
表3.由单体OEGMA8-9、DMAEMA和n-BMA合成具有PolyFluor的均聚物大分子RAFT试剂(homopolymermacroRAFT)的反应时间、单体转化率和分子量数据。
然后第二步，在烧瓶中制备处于DMF中的ACCN(1.0wt.％)、P(OEGMA8-9-RhMA)(30.0wt.％)、P(DMAEMA-RhMA)(30.0wt.％)、P(n-BMA-RhMA)(30.0wt.％)、DSDMA(20.6wt.％)的储备溶液。将特定量的每种单体([单体]:[聚合物]＝6:1)分别加入至聚合物溶液。在烧瓶中制备ACCN溶液(86mg)、P(OEGMA8-9-RhMA)溶液(111mg)、P(DMAEMA-RhMA)溶液(109mg)、P(n-BMA-RhMA)溶液(107mg)、DSDMA溶液(178mg)和DMF(284mg)的混合物。将储备溶液转移至安瓿瓶，其通过三个冷冻-抽空-解冻循环脱气并在真空下密封。安瓿瓶在90℃下加热20h。
表4.对于交联剂与均聚物RAFT试剂比例为12和8，由表3中列出的均聚物制备的杂臂聚合物的单体转化率、聚合物分子量和分散性。也示出了杂臂聚合物的降解产物的分子量
样品编码 DSDMA：M-RAFT 臂转化率(％) Mn D
S4-10 12 87.5 117,100 1.27
裂解的S4-10 15,000 1.32
S4-11 8 86.9 78,300 1.20
裂解的S4-11 14,300 1.26
实施例4
材料和方法
细胞
在5％CO2和37℃下，组成型表达绿色荧光蛋白的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-GFP)(CSIROAustralia)在补充有10％胎牛血清、10mM的Hepes、0.01％的青霉素和0.01％的链霉素的MEMα改良物(modification)中生长，并且每周传代(subculture)两次。
在5％CO2和37℃下，胰癌(adenocarcinomic)人类肺泡基底上皮细胞(A549ATCCNo.CCL185)，人类肝癌细胞(接收自VIDRL，Australia的HuH7Kindly)在补充有10％的胎牛血清、10mM的Hepes、2mM的谷氨酰胺、0.01％的青霉素和0.01％的链霉素的DMEM中生长，并且每周传代两次。
siRNA
从QIAGEN(USA)获得抗GFP和负对照siRNA。抗GFPsiRNA序列是正义5′gcaagcugacccugaaguucau3′和反义5′gaacuucagggucagcuugccg3′。作为DNA寡核苷酸的等效序列(equivalentsequence)用作非沉默对照。
siFAm是具有在正义链上具有5′FAM标记的抗GFPsiRNA处的相同的序列。
抗外被体蛋白复合物(anticoatomerproteincomplex)、子单元α(COPA)siRNA库购买自SigmaAldrich(USA)。四个siRNA序列是1；
5′ACUCAGAUCUGGUGUAAUA[dT][dT]3′2；5′
GCAAUAUGCUACACUAUGU[dT][dT]3′3；5′
GAUCAGACCAUCCGAGUGU[dT][dT]3′4；5′
GAGUUGAUCCUCAGCAAUU[dT][dT]3′。
结合
聚合物/siRNA复合物的形成
计算聚合物与50皮摩尔(pmol)的siRNA或siDNA的氮：磷酸盐(N:P)比例。通过添加OPTIMEM介质(Invitrogen，USA)至微量离心管(eppendorftube)中形成复合物。将在水中再悬浮的所需量的聚合物添加至管中并且涡旋(vortexed)混合物。然后，将50皮摩尔的si22或di22添加至管中并且涡旋样品。允许复合在室温下持续l小时。
琼脂糖凝胶
在100V下，在TBE中在2％琼脂糖凝胶上对含有50皮摩尔的siRNA的样品进行电泳，持续40分钟。用照相机在UV透射仪上，通过凝胶红(JomarBioscience)可视化siRNA，通过GeneSnap程序(Syngene,USA)记录图像。
根据实施例1中的过程制备的杂臂聚合物用于siRNA结合、毒性和沉默的评估。siRNA与杂臂聚合物结合(在实施例1中制备的)的结果在图7中示出。图7(I)示出了独自的聚合物，而图7(II)、(III)和(VI)分别示出了聚合物：siRNA(N:P)比例为2.5和10的结合。图7中的结果示出了即使在低N:P比例下，也可以观察到良好的siRNA结合，这表明少量的聚合物可以用于配制聚合物/siRNA复合物以实现良好的沉默。
通过二硫键切割的siRNA释放
使用脱氧水制备TCEP溶液(50mM)并且储存在～20℃。如前文描述的装配聚合物/si22复合物(50皮摩尔)。这些多聚复合物(polyplex)经历在0.3M的NaCl存在下在pH5的乙酸钠缓冲液中的50mM的TCEP还原。反应在37℃下孵育2h且通过前文描述的在2％琼脂糖凝胶上的电泳分析si22释放。图8示出了在杂臂星型聚合物S4-1和S4-5中二硫键的切割。
实施例5
单独的毒性聚合物
毒性试验
在96孔组织培养板中CHO-GFP细胞和A549细胞以1×104接种，而Huh7细胞以2×104细胞接种(一式三份)，并且在5％CO2和37℃下生长过夜。
将连续稀释的聚合物材料添加至用于每种样品的96孔培养板中的3个孔中，并且在37℃下在200μl的标准培养基中温育72h。根据制造商的说明，使用Alamar蓝试剂(InvitrogenUSA)测量毒性。简言之，去除培养基，使用PBS清洗细胞，并用包含10％的Alamar蓝试剂的100μl标准培养基替换，之后细胞在5％CO2和37℃下温育4h。在EL808吸光度酶标仪(BIOTEK，USA)上，在540nm和620nm下读取试验值。通过从540nm测量值减去620nm测量值确定细胞活力(cellviability)。使用MicrosoftExcel分析获得的数据。结果以未处理细胞的百分数显示，并且显示的数据表示三个单独的实验(一式三份)。
在96孔组织培养板中CHO-GFP细胞和A549细胞以1×104接种，且Huh7细胞以2×104细胞/孔接种(一式三份)，并且在5％CO2和37℃下生长过夜。对于阳性和阴性对照，根据制造商的说明书，使用Lipofectamine2000(InvitrogenUSA)将siRNA转染至细胞。简言之，将10皮摩尔的相关siRNA与0.1μl的Lipofectamine2000混合，两者均在50μl的OPTI-MEM(InvitrogenUSA)中稀释，且在室温下温育20分钟。将siNA：Lipofectamine混合物添加至细胞并温育4h。去除细胞培养基并温育72h。
对于聚合物/siRNA复合物，去除细胞培养基并用200μl的OPTI-MEM替换。将如前文描述制备聚合物/siRNA复合物添加至细胞并温育4h。培养基替换成标准生长培养基并温育另外72h。使用前文描述的Alamar蓝实验检测毒性。在MicrosoftExcel中分析获得的数据。结果以未处理细胞的百分数表示，并且表示的数据表示三个单独的实验(一式三份)。
作为聚合物浓度(单独聚合物)的函数的细胞活力描述于图9中(细胞系Huh7、A549和CHO-GPF)，而图10示出了在相同的三种细胞系中聚合物/siRNA复合物的细胞活力。
实施例6
siRNA沉默CHO-GFP
在96孔组织培养板中，一式三份以1×104细胞接种CHO-GFP细胞，并且在5％CO2和37℃下生长过夜。对于阳性和阴性对照，根据制造商的说明书，使用Lipofectamine2000(L2)(Invitrogen,USA)将siRNA转染至细胞中。简言之，将10皮摩尔的相关siRNA与0.1μlLipofectamine2000混合，两者均在50μlOPTI-MEM(lnvitrogen，USA)中稀释并且在室温下温育20分钟。将siNA:Lipofectamine混合物添加至细胞中，并且温育4h。替换细胞培养基并且温育72h。
去除聚合物/siRNA复合物细胞培养基并用200μlOPTI-MEM更换。将如前文描述制备的聚合物/siRNA复合物添加至细胞并且温育4h，将培养基替换为标准生长培养基并且温育另外72h。
在72温育后，使用PBSA清洗包含CHO-GFP细胞的96孔板，并且在516nm下在Synergy，HT(USA)中分析GFP荧光。在MicrosoftExcel中分析获得的数据。结果以聚合物/非特异性沉默DNA复合物的百分数表示，并且表示的数据表示三个单独的实验(一式三份)。
图11示出了用于通过实施例1中制备的杂臂聚合物产生绿色荧光蛋白(GFP)的基因的沉默(表2)。
沉默其他细胞系
在96孔组织培养板中，一式三份地以1×104细胞/孔接种A549细胞，以及以2×104细胞/孔接种Huh7细胞，并且在5％CO2和37℃下生长过夜。对于阳性和阴性对照，根据制造商的说明书，使用Lipofectamine2000(L2)(Invitrogen,USA)将siRNA转染至细胞中。简言之，将10皮摩尔的相关siRNA与0.1μlLipofectamine2000混合，两者均在50μlOPTI-MEM(lnvitrogen，USA)中稀释并且在室温下温育20分钟。将siNA:Lipofectamine混合物添加至细胞中，并且温育4h。替换细胞培养基并且温育72h。
对于聚合物/siRNA复合物，去除细胞培养基并用200μlOPTI-MEM更换。如前文描述制备聚合物/siRNA复合物并且添加至细胞并且温育4h，将培养基替换为标准生长培养基并且温育另外72h。由于COPA是必需基因，通过使用前文描述的Alamar蓝实验的毒性检测沉默。在MicrosoftExcel中分析获得的数据。结果以未处理的细胞的百分数表示，并且表示的数据表示三个单独的实验(一式三份)。
图12示出了Huh7和A549细胞中COPA沉默。
实施例7
癌症药物SN38的递送
测试具有通过RAFT试剂共价附接的SN38的聚合物递送SN38的能力。在96孔组织培养板中，一式三份地以1×104细胞接种A549细胞且以2×104细胞接种Huh7细胞，并且在5％CO2和37℃下生长过夜。计算聚合物浓度以递送10、1、0.1或0.01μM的SN38。对于每种样品，将这些添加至96孔培养板中的3个孔中，并且在37℃下在200μl的标准培养基中温育72h。根据制造商的说明书，使用Alamar蓝试剂(InvitrogenUSA)测量毒性。简言之，去除培养基，使用PBS清洗细胞，并用包含10％的Alamar蓝试剂的100μl标准培养基替换，之后细胞在5％CO2和37℃下温育4h。在EL808吸光度酶标仪(BIOTEK，USA)上，在540nm和620nm下读取试验值。通过从540nm测量值减去620nm测量值确定细胞活力。使用MicrosoftExcel分析获得的数据。结果以未处理细胞的百分数表示，并且表示的数据表示三个单独的实验(一式三份)。结果总结在图13中。
实施例8
根据前文的描述，使用[6FAM]标记的si22装配聚合物/si22-FAM复合物(50皮摩尔)，并且用于在共聚焦显微镜下的检查。
共聚焦显微术：在24孔板(Nunc,USA)上在13mm圆玻璃盖玻片(Menzel,Germany)上以1×105接种的Huh7细胞，并且在5％CO2和37℃下生长过夜。对于阳性对照，按照下文的描述，根据制造商的说明书，使用Lipofectamine2000(InvitrogenUSA)将[6FAM]标记的si22转染至细胞。根据前文的描述制造聚合物和标记的siRNA复合物并添加至细胞，保持5h。为了将细胞用于共聚焦显微术，在PBS中清洗细胞并在处于PBS中的4％的多聚甲醛(Sigma,USA)中固定1小时。将具有细胞的盖玻片安装在Vectashield(VectorLaboratories,USA)的载玻片上。在LeicaSP5共聚焦显微镜(Leica,Microsystems,Germany)上获得图像。图14示出了的通过共聚焦显微镜检查的标记的聚合物和FAM-标记的siRNA的吸收(uptake)。
实施例9
具有嵌段共聚物臂的4-臂星型物的制备(根据WO2013/113071的比较实施例)：
方法
甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯(DMAEMA)和低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯(OEGMA475，根据WO2013/113071中概述的方法通过RAFT聚合反应聚合的单体)来实现一系列由嵌段共聚物制造的4臂星型物。
表3：使用RAFT聚合制备的星型嵌段共聚物的分子量、分散性和组成
聚合物编码 Mn(kDa) 分散性 Mn(NMR)(kDa) 组成A:B或C*/臂 嵌段
TL38 PF 30.4 1.22 45.2 24:16 ABA
TL85 PF 26.6 1.35 39.2 24:16 ACA
*A：DMAEMA；B：OEGMA475；C：OEGMA475-BMA-DMAEMA(73.2:20:6.8)
通过实施例4相同的方法进行在CHO细胞中的GFP的沉默。
图15中显示沉默数据，示出了对于样品TL38-50(50％季铵化)、TL38-100(100％季铵化)、TL-84(100％季铵化，无PolyFluor)和TL-85(100％季铵化，有Polyfluore)的CHO-GFP沉默。TL-38聚合物表示使用与在WO2013/113071中描述的方法相似的方法制备的4-臂星型物。类似地制备TL-84，区别在于4-臂星型物的臂中包含阳离子区段，亲水性区段和疏水性区段。图15中的结果表明当星型物的臂在结构上是等效时，尽管具有表示根据本发明的三种均聚物臂的区段，沉默结果差于对于杂臂聚合物观察到的那些(参见图11中的S4-1，用于比较)。
实施例10
在这种动物研究中使用的杂臂聚合物S4-1和S4-10分别是在实施例1和实施例3中公开的那些。
在具有在632.8nm下操作的22mWHeNe激光、具有高量子效率的雪崩光电二极管检测器和ALV/LSE-5003多数字相关器电子系统的MalvernZetasizerNanoSeriesDLS检测器上，在37℃下检测在2、4和6的N/P比例下S4-1与siRNA的ζ电势。将24.2μL的杂臂聚合物S4-1(μg/μL)添加至42μL的水和5μL的GFPsiRNA(10μg/μL)。涡旋(vortexed)这种混合物并自发形成纳米颗粒。允许溶液在室温下平衡2小时，并且在测量之前立即使用10mM的NaCl稀释至1mL。分别具有2、4和6的N/P的纳米颗粒的ζ电势为～11.6、29.7和30.8。
C57/BLK6小鼠获得自根据动物伦理委员会(AEC)批准的澳大利亚动物健康实验室(AAHL)的小型动物部门。
在通过使用100μLPBS或在PBS中的100μL的治疗物的尾静脉静脉注射之前两天称重小鼠。
治疗组由以下组成：
组1对照：6PBS对照动物。
组2聚合物1-3：使用处于PBS中的3μg/g鼠重量靶向ssBmRNA的荧光杂臂星型(S4-10)/siRNA处理的6只动物
组3聚合物2-3：使用处于PBS中的3μg/g鼠重量靶向ssBmRNA的杂臂星型(S4-1)/siRNA处理的6只动物
组4聚合物3-9：使用处于PBS中的9μg/g鼠重量靶向ssBmRNA的荧光杂臂星型(S4-10)/siRNA处理的6只动物
组5聚合物1-9：使用处于PBS中的9μg/g鼠重量靶向ssBmRNA的杂臂星型(S4-1)/siRNA处理的6只动物
在48h之后，安乐死小鼠，收集肺、脾、肝和肾组织用于RNA提取。根据制造商的说明书，使用PromegaSimplyRNA组织试剂盒从10mg的组织中提取RNA。根据制造商的说明书，使用AppliedBiosystemsTaqman检测进行对于目标基因Sjogren综合症类型B抗原(ssB)(基因表达检测,SM目录#:4331182检测ID:Mm00447374_m1基因符号:Ssb,mCG12976)和看家基因GAPDH(基因表达检测,SM目录#:4331182检测ID:Mm99999915_gl基因符号：Gapdh)的定量实时PCR。数据分析为相对于PBS对照动物ssB表达的倍数变化。结果在图16中示出。
实施例11
单体的供应商和描述在这个实施例中描述的杂臂聚合物的合成中使用的单体、聚合物和其他材料的缩写在实施例1中进行了描述。
研究p(BMA)含量(TL8-1、2、3、4)影响的杂臂聚合物的合成，是分子量(TL8-5、6)，以及用于制备杂臂(TL8-7、8、9)的核芯的单体类型。
通过先臂方法合成杂臂聚合物
1)(OEGMA8-9)、DMAEMA和n-BMA远螯大分子RAFT试剂(telechelicmacroRAFTagent)的均聚物的合成和表征
在通常的聚合实验中，在Schlenk烧瓶中称重6g的OEGMA8-9单体(1.264×10-2mol)、7.716×10-3g的VAZO-88引发剂(3.159×10-5mol)、0.12748g的DTTCP试剂(5)(3.154×10- 4mol)和5.1063g的DMF。使用4个冷冻-抽空-解冻循环使溶液混合物脱气，并且在90℃下聚合4小时。
通过1H-NMR(在CDCl3中)检测单体至聚合物的转化率为84％。通过形成的聚合物的COOCH2的积分(integration)(4.1ppm)与未反应的单体的COOCH2的积分(4.3ppm)的比较，来计算转化率。基于1H-NMR计算的聚合物的分子量为16.4kDa对应于33.6的聚合度。通过凝胶渗透色谱(GPC)针对线性聚苯乙烯标准确定的聚合物的数均分子量(Mn)为15.8kDa(分散性为1.27)。结果总结在表4中。
浓缩获得的聚合物，使用甲基碘季铵化(quaternized)并透析。冻干回收的聚合物。
表4.OEGMA8-9、DMAEMA和n-BMA远螯大分子RAFT试剂的杂臂均聚物的分子量
a)由1H-NMR计算单体转化率；b)由单体转化率计算Mn(理论)；c)使用聚苯乙烯标准由DMAcGPC获得Mn(GPC)和D(GPC)。
2)杂臂聚合物的合成和表征
用于杂臂聚合物的合成的通用过程如下：
制备处于DMF中的Vazo88(1.0wt.％)、P(OEGMA8-9)(30.0wt.％)P(DMAEMA)(30.0wt.％)、P(n-BMA)(30.0wt.％)、DSDMA(20.0wt.％)的储备溶液。将特定量的每种单体([单体]:[聚合物]＝6:1)分别加入至聚合物溶液。在烧瓶中制备Vazo88溶液(247.3mgP(OEGMA8-9)溶液(539mg))、P(DMAEMA)溶液(517mg)、P(n-BMA)溶液(492mg)、DSDMA溶液(528.9mg)和DMF(18mg)的混合物。将储备溶液转移至安瓿瓶，其通过三个冷冻-抽空-解冻循环脱气并在真空下密封。安瓿瓶在90℃下加热20h。
根据这个过程制备六种星型聚合物，并且表5总结了每种均聚物大分子RAFT试剂和使用的其他试剂的相对量，以及杂臂聚合物和裂解的杂臂聚合物的分子量。
表5.用于根据实施例1中描述的过程制备的杂臂星型聚合物的组成、聚合时间、单体和臂转化率以及分子量数据(使用PMMA标准的DMAc)的总结
a)由GPC迹线计算的臂转化率：臂转化率＝面积星型/(面积星型+面积大分子-RAFT)；b)使用聚苯乙烯标准由DMAcGPC获得的Mn(GPC)和D(GPC)；c)核芯单体仅是OEGMA；d)核芯单体仅是DMAEMA；e)核芯单体仅是n-BMA
杂臂星型聚合物的季铵化
为了季铵化(quaternize)杂臂星型聚合物的P(DMAEMA)臂的叔胺基基团，使用DMF稀释前文提及的星型物的储备溶液，然后将过量的MeI加入到该溶液中，并且在室温下搅拌16h。最后，在旋转蒸发器上去除过量的MeI；在4天内通过星型聚合物对水的渗透去除DMF(分子量膜截止25,000Da)。在冷冻-干燥之后获得包含季铵化的P(DMAEMA)的星型聚合物。图6示出了季铵化的聚合物的1H-NMR谱。
使用三丁基膦还原裂解杂臂星型聚合物
将在其核芯中包含二硫键的杂臂聚合物(5mg)溶解于包含20mg的三丁基膦1mL的DMAc。在进行GPC分析前，在室温下在氮气氛下搅拌溶液30分钟。图3(IV)示出了星型聚合物和降解的聚合物的GPC迹线，证明了交联核芯的裂解产生具有与臂可比较的分子量的低分子量聚合物。
贯穿整个说明书和随后的权利要求书，除非上下文另外要求，否则单词“包括”和变体如“包含”以及“含有”，将理解为暗示包括规定的整数或步骤，或整数或步骤的组，但是不排除任何其他的整数或步骤，或整数或步骤的组。
在该说明书中，提及任何现有出版物(或获自其的信息)，或已知的任何事物，不是且不应当被视为接受或承认，或任何形式地表示现有出版物(或获自其的信息)或已知事物构成本说明书所涉及的领域中的公知常识的一部分。

Claims (20)

1.一种杂臂支化聚合物，包括支撑部分和各自共价连接至所述支撑部分并从所述支撑部分延伸的至少三种均聚物链，其中所述至少三种均聚物链包括阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链。
2.根据权利要求1所述的支化聚合物，其中所述至少三种均聚物链中的一种或多种通过可降解的官能团共价连接至所述支撑部分。
3.根据权利要求1或2所述的支化聚合物，具有共价连接至所述支撑部分的多于一种阳离子均聚物链、亲水性均聚物链或疏水性均聚物链。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的支化聚合物，为星型聚合物的形式。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的支化聚合物，其中所述支撑部分为交联聚合物支撑部分的形式。
6.根据权利要求5所述的支化聚合物，其中所述交联聚合物支撑部分包括选自以下的一种或多种多官能单体的聚合的残基：二硫化物二甲基丙烯酸酯、二(甲基)丙烯酸乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸三乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸四乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸1,3-丁二醇酯、三(甲基)丙烯酸三羟甲基丙烷酯、二(甲基)丙烯酸1,4-丁二醇酯、二(甲基)丙烯酸新戊二醇酯、二(甲基)丙烯酸1,6-己二醇酯、乙氧基化二丙烯酸1,6-己二醇酯(HEDA)、二(甲基)丙烯酸季戊四醇酯、三(甲基)丙烯酸季戊四醇酯、四(甲基)丙烯酸季戊四醇酯、二(甲基)丙烯酸丙三醇酯、烯丙氧基二(甲基)丙烯酸丙三醇酯、二(甲基)丙烯酸-1,l,l-三(羟基甲基)乙烷酯、三(甲基)丙烯酸-1,1,1-三(羟基甲基)乙烷酯、二(甲基)丙烯酸-1,1,1-三(羟基甲基)丙烷酯、三(甲基)丙烯酸-1,1,1-三(羟基甲基)丙烷酯、氰酸三烯丙基酯、异氰酸三烯丙基酯、三苯六甲酸三烯丙基酯、邻苯二甲酸二烯丙基酯、对苯二甲酸二烯丙基酯、二乙烯基苯、羟甲基(甲基)丙烯酰胺、三烯丙基胺、马来酸油烯基酯、三丙烯酸甘油烯基丙氧基酯、甲基丙烯酸烯丙基酯、甲基丙烯酸酐、亚甲基双(甲基)丙烯酰胺、丁-2-烯-1,4-二丙烯酸酯、双酚A乙氧基化二丙烯酸酯、Ν,Ν'-双(丙烯酰基)半胱亚胺、己二酸二乙烯基酯、4,4’-二乙烯基联苯和N,Ν'-亚甲基双丙烯酰胺。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的支化聚合物，其中所述阳离子均聚物链包括选自以下的一种或多种单体的聚合的残基：甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙基酯、甲基丙烯酸N,N-二乙基氨基乙基酯、丙烯酸N,N-二甲基氨基乙基酯、丙烯酸N,N-二乙基氨基乙基酯、甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐、N-[3-(N,N-二甲基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐、N-[3-(N,N-二甲基氨基)丙基]丙烯酰胺、N-[2-(N,N-二甲基氨基)乙基]甲基丙烯酰胺、丙烯酸2-N-吗啉代乙基酯、甲基丙烯酸-2-N-吗啉代乙基酯、丙烯酸2-(N,N-二甲基氨基)乙基酯、甲基丙烯酸2-(N,N-二甲基氨基)乙基酯、甲基丙烯酸2-(N,N-二乙基氨基)乙基酯、2-丙烯酰氧基乙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酰胺基丙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酸2-(叔-丁基氨基)乙基酯、烯丙基二甲基氯化铵、2-(二乙基氨基)乙基苯乙烯、2-乙烯基吡啶和4-乙烯基吡啶；所述亲水性均聚物链包括选自以下的一种或多种单体的聚合的残基：丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸羟基乙基酯、甲基丙烯酸羟基丙基酯、低聚(亚烷基二醇)甲基醚(甲基)丙烯酸酯(OAG(M)A)、丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺、丙烯酸羟基乙基酯、N-甲基丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙基酯、Ν,Ν-二甲基氨基丙基甲基丙烯酰胺、N-羟基丙基甲基丙烯酰胺、4-丙烯酰基吗啉、2-丙烯酰胺基-2-甲基-l-丙烷磺酸、磷酰胆碱甲基丙烯酸酯和N-乙烯基吡咯烷酮；并且所述疏水性均聚物链包括选自以下的一种或多种单体的聚合的残基：苯乙烯、α-甲基苯乙烯、丙烯酸丁基酯、甲基丙烯酸丁基酯、甲基丙烯酸戊基酯、甲基丙烯酸己基酯、甲基丙烯酸月桂基酯、甲基丙烯酸十八烷基酯、甲基丙烯酸乙基己基酯、甲基丙烯酸巴豆基酯、甲基丙烯酸肉桂基酯、甲基丙烯酸油烯基酯、甲基丙烯酸蓖麻油基酯、甲基丙烯酸胆固醇基酯、丙烯酸胆固醇基酯、乙烯基丁酸酯、乙烯基叔-丁酸酯、乙烯基硬脂酸酯和乙烯基月桂酸酯。
8.一种用于制备包括支撑部分和各自共价连接至所述部分且从所述部分延伸的至少三种均聚物链的杂臂支化聚合物的方法，其中所述至少三种均聚物链包括阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链，所述方法包括：
(i)提供阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链，每种均聚物链具有共价连接至其上的活性聚合部分；以及
(ii)在控制所述活性聚合部分的情况下，聚合一种或多种多烯不饱和单体从而形成所述阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链各自共价连接到其上的交联聚合物支撑部分。
9.一种包括杂臂支化聚合物和核酸分子的复合物，所述支化聚合物包括支撑部分和各自共价连接至所述部分且从所述部分延伸的至少三种均聚物链，其中所述至少三种均聚物链包括阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链。
10.根据权利要求9所述的复合物，其中所述至少三种均聚物链包括包含约10至约200个单体残基单元的阳离子均聚物链。
11.根据权利要求9或10所述的复合物，其中所述至少三种均聚物链包括包含约10至约150个单体残基单元的亲水性均聚物链。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的复合物，其中所述至少三种均聚物链包括包含约15至约150个单体残基单元的疏水性均聚物链。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的复合物，具有约10mV至约40mV范围内的ζ电势。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的复合物，其中所述核酸分子选自gDNA、cDNA、双或单链DNA寡核苷酸、正义RNA、反义RNA、mRNA、tRNA、rRNA、小/短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、短发卡状RNA(shRNA)、piwi-相互作用RNA(PiRNA)、微RNA/小时序RNA(miRNA/stRNA)、核仁小RNA(SnoRNA)、小核(SnRNA)核酶、适体、DNA酶、核糖核酸酶型复合物、发卡状双链RNA(发卡状dsRNA)、调节空间发展的miRNA(sdRNA)、应激反应RNA(srRNA)、细胞周期RNA(ccRNA)和双链RNA寡核苷酸或单链RNA寡核苷酸。
15.一种将核酸分子递送至细胞的方法，所述方法包括：
(a)提供包括杂臂支化聚合物和核酸分子的复合物，所述支化聚合物包括支撑部分和各自共价连接至所述部分且从所述部分延伸的至少三种均聚物链，其中所述至少三种均聚物链包括阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链；以及
(b)将所述复合物递送至所述细胞。
16.一种沉默基因表达的方法，所述方法包括使用包括杂臂支化聚合物和核酸分子的复合物转染细胞，所述支化聚合物包括支撑部分和各自共价连接至所述部分且从所述部分延伸的至少三种均聚物链，其中所述至少三种均聚物链包括阳离子均聚物链、亲水性均聚物链和疏水性均聚物链。
17.根据权利要求15或16所述的方法，在体内进行。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述支化聚合物为星型聚合物的形式。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其中所述至少三种均聚物链的至少一种与靶向配体、显影剂、生物活性物质或它们的组合结合。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中将所述复合物给予受试者。
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