[go: up one dir, main page]

CN105793284A - 针对顺式RGMa/再生蛋白相互作用或脂筏的试剂及其在治疗方法中的应用 - Google Patents

针对顺式RGMa/再生蛋白相互作用或脂筏的试剂及其在治疗方法中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105793284A
CN105793284A CN201480062905.XA CN201480062905A CN105793284A CN 105793284 A CN105793284 A CN 105793284A CN 201480062905 A CN201480062905 A CN 201480062905A CN 105793284 A CN105793284 A CN 105793284A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
peptide
acid sequence
sequence shown
reagent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480062905.XA
Other languages
English (en)
Inventor
菲利普·P·莫尼耶
纳多斯·G·塔塞乌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University Health Network
Original Assignee
University Health Network
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University Health Network filed Critical University Health Network
Publication of CN105793284A publication Critical patent/CN105793284A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A61K38/443—Oxidoreductases (1) acting on CH-OH groups as donors, e.g. glucose oxidase, lactate dehydrogenase (1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/137—Arylalkylamines, e.g. amphetamine, epinephrine, salbutamol, ephedrine or methadone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/716—Glucans
    • A61K31/724—Cyclodextrins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
    • C12Y101/03006—Cholesterol oxidase (1.1.3.6)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5058—Neurological cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)

Abstract

本文公开了调节反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间顺式相互作用或者脂筏的试剂。所述试剂的调节可以包括阻断RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用和/或破坏脂筏。这种作用反过来促进了神经元细胞存活以及轴突生长和/或再生。本文还公开了治疗对其有需要的受试者中疾病的方法。所述方法可以包括向所述受试者施用所述试剂。本文还公开了鉴别调节RGMa和再生蛋白之间顺式相互作用的试剂的方法。

Description

针对顺式RGMa/再生蛋白相互作用或脂筏的试剂及其在治疗方法中的应用
相关申请的引证
本申请要求2013年9月17日提交的美国临时专利申请No.61/878,827的优先权，该申请的全部内容作为参考并入本文。
技术领域
本发明涉及阻断反义导向分子A(排斥导向分子A，repulsiveguidancemoleculeA)(RGMa)和再生蛋白(neogenin)之间顺式相互作用或破坏脂筏(lipidrafts)的试剂，用于调控这种顺式相互作用或脂筏以促进细胞存活和轴突生长和/或再生的方法，和治疗其中这种顺式相互作用或脂筏对受试者有害的疾病(例如，色素性视网膜炎、多发性硬化、缺血(例如，中风)、视神经损伤和脊髓损伤)的方法。
背景技术
考虑到成人神经元再生轴突能力较差，中枢神经系统(CNS)损伤可以导致永久性功能丧失。另外，一旦损伤，成人神经元对细胞凋亡敏感。对损伤起反应后，CNS中反义导向分子A(RGMa)的水平升高。RGMa水平的这种升高抑制了轴突生长和/或再生并促进了神经元细胞存活。照此，RGMa对受损CNS起积极和消极作用。这些作用还发生在CNS发育期间。
RGMa通过与再生蛋白的反式相互作用调节这种轴突生长和/或再生的抑制以及细胞存活的促进。这种反式相互作用在位于神经元表面上的胞外RGMa和再生蛋白之间发生。
因此，仍需要鉴别和发展在CNS损伤或患病的情况下，促进神经元细胞存活和轴突生长和/或再生两者的疗法。
发明内容
本发明涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以破坏脂筏。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以破坏反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，并且其中所述试剂可以是肽试剂。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是肽试剂，并且其中所述肽试剂可以包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列以及它们的任意组合。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是肽试剂，并且其中所述肽试剂可以包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列以及它们的任意组合，并且其中所述肽试剂可以包含以下氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是肽试剂，并且其中所述肽试剂可以包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列以及它们的任意组合，并且其中所述肽试剂可以包含以下氨基酸序列：SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是肽试剂，并且其中所述肽试剂可以包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列以及它们的任意组合，并且其中所述肽试剂可以包含以下氨基酸序列：SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是肽试剂，并且其中所述肽试剂可以包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列以及它们的任意组合，并且其中所述肽试剂可以包含以下氨基酸序列：SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是肽试剂，并且其中所述肽试剂可以包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列以及它们的任意组合，并且其中所述肽试剂可以包含以下氨基酸序列：SEQIDNO:7所示的氨基酸序列。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是肽试剂，并且其中所述肽试剂可以包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列以及它们的任意组合，并且其中所述肽试剂可以包含以下氨基酸序列：SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是肽试剂，并且其中所述肽试剂可以包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列以及它们的任意组合，并且其中所述肽试剂可以包含以下氨基酸序列：SEQIDNO:9所示的氨基酸序列。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是肽试剂，并且其中所述肽试剂可以包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列以及它们的任意组合，并且其中所述肽试剂可以包含以下氨基酸序列：SEQIDNO:10所示的氨基酸序列。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是肽试剂，并且其中所述肽试剂可以包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列以及它们的任意组合，并且其中所述肽试剂可以破坏反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用，借此阻断再生蛋白向脂筏的招募(募集，recruitment)。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，并且其中所述试剂可以是抗体。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是抗体，其中抗体可以特异地结合选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是抗体，其中抗体可以特异地结合选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，并且其中所述抗体可以特异地结合包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是抗体，其中抗体可以特异地结合选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，并且其中所述抗体可以特异地结合以下氨基酸序列：SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是抗体，其中抗体可以特异地结合选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，并且其中所述抗体可以特异地结合以下氨基酸序列：SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是抗体，其中抗体可以特异地结合选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，并且其中所述抗体可以特异地结合以下氨基酸序列：SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是抗体，其中抗体可以特异地结合选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，并且其中所述抗体可以特异地结合以下氨基酸序列：SEQIDNO:7所示的氨基酸序列。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是抗体，其中抗体可以特异地结合选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，并且其中所述抗体可以特异地结合以下氨基酸序列：SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是抗体，其中抗体可以特异地结合选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，并且其中所述抗体可以特异地结合以下氨基酸序列：SEQIDNO:9所示的氨基酸序列。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是抗体，其中抗体可以特异地结合选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，并且其中所述抗体可以特异地结合以下氨基酸序列：SEQIDNO:10所示的氨基酸序列。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是抗体，其中抗体可以特异地结合选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，并且其中所述抗体可以破坏反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用，借此阻断再生蛋白向脂筏的招募。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，并且其中所述试剂可以是降胆固醇试剂。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是降胆固醇试剂，并且其中所述降胆固醇试剂可以选自：甲基-β-环糊精(MβCD)、胆固醇氧化酶(CO)、AY-9944、抑制素(他汀，statin)、枯草溶菌素9(subtisilin/kexintype9，PCK9)抑制剂、制霉菌素(nystatin)、非律平(律平菌素，filipin)、前蛋白转化酶、BM15.766、烷基磷脂类似物及其任意组合。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是降胆固醇试剂，并且其中所述降胆固醇试剂可以选自：甲基-β-环糊精(MβCD)、胆固醇氧化酶(CO)、AY-9944、抑制素、枯草溶菌素9(subtisilin/kexintype9，PCK9)抑制剂、制霉菌素、非律平、前蛋白转化酶、BM15.766、烷基磷脂类似物及其任意组合，并且其中所述降胆固醇试剂可以破坏脂筏，借此破坏再生蛋白向脂筏的招募。
本发明还涉及治疗对其有需要的受试者中疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用(给予、给药，administer)促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂。
本发明还涉及治疗对其有需要的受试者中疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述疾病可以选自：色素性视网膜炎、缺血、多发性硬化、脊髓损伤和视神经损伤。
本发明还涉及治疗对其有需要的受试者中疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述疾病可以选自：色素性视网膜炎、缺血、多发性硬化、脊髓损伤和视神经损伤，并且其中所述缺血可以是中风。
本发明还涉及治疗对其有需要的受试者中疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合。
本发明还涉及治疗对其有需要的受试者中疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是肽试剂，并且其中所述肽试剂可以包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列及其任意组合。
本发明还涉及治疗对其有需要的受试者中疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是降胆固醇试剂，并且其中所述降胆固醇试剂可以选自甲基-β-环糊精(MβCD)、胆固醇氧化酶(CO)、AY-9944、抑制素、枯草溶菌素9(subtisilin/kexintype9，PCK9)抑制剂、制霉菌素、非律平、前蛋白转化酶、BM15.766、烷基磷脂类似物及其任意组合。
本发明还涉及治疗对其有需要的受试者中疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是抗体，并且其中所述抗体可以特异地结合选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列和SEQIDNO:7所示的氨基酸序列。
本发明还涉及治疗对其有需要的受试者中疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，并且还包括破坏RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用。
本发明还涉及治疗对其有需要的受试者中疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，并且还包括破坏脂筏。
本发明还涉及治疗对其有需要的受试者中疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述疾病可以选自：色素性视网膜炎、缺血、多发性硬化、脊髓损伤和视神经损伤，其中所述疾病可以是脊髓损伤，并且其中所述方法还可以包括使所述受试者中的运动功能恢复。
本发明还涉及治疗对其有需要的受试者中疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述疾病可以选自：色素性视网膜炎、缺血、多发性硬化、脊髓损伤和视神经损伤，其中所述疾病可以是色素性视网膜炎，并且其中所述方法还可以包括促进所述受试者中的感光细胞存活。
本发明还涉及治疗对其有需要的受试者中疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述疾病可以选自：色素性视网膜炎、缺血、多发性硬化、脊髓损伤和视神经损伤，其中所述缺血可以是中风，并且其中所述方法还可以包括减轻所述受试者中梗死体积、脑水肿或它们的组合中的至少一种。
本发明还涉及鉴别调节反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间顺式相互作用的试剂的方法，所述方法包括：(a)形成包含RGM肽和再生蛋白肽的混合物，其中所述RGM肽包含选自下列的氨基酸序列：SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列和SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，并且其中所述再生蛋白肽包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列；(b)在存在所述试剂的情况下，温育(孵育，incubate)所述混合物；和(c)在步骤(b)的温育的混合物中，检测RGM肽和再生蛋白肽之间特异性结合的水平，其中在存在所述试剂的情况下检测的RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平相对于不存在所述试剂的情况下RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平的差异表明所述试剂调节顺式相互作用。
本发明还涉及鉴别调节反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间顺式相互作用的试剂的方法，所述方法包括：(a)形成包含RGM肽和再生蛋白肽的混合物，其中所述RGM肽包含选自下列的氨基酸序列：SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列和SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，并且其中所述再生蛋白肽包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列；(b)在存在所述试剂的情况下，温育所述混合物；和(c)在步骤(b)的温育的混合物中，检测RGM肽和再生蛋白肽之间特异性结合的水平，其中在存在所述试剂的情况下检测的RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平相对于不存在所述试剂的情况下RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平的差异表明所述试剂调节顺式相互作用，其中所述试剂可以是抗体或抗体片段。
本发明还涉及鉴别调节反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间顺式相互作用的试剂的方法，所述方法包括：(a)形成包含RGM肽和再生蛋白肽的混合物，其中所述RGM肽包含选自下列的氨基酸序列：SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列和SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，并且其中所述再生蛋白肽包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列；(b)在存在所述试剂的情况下，温育所述混合物；和(c)在步骤(b)的温育的混合物中，检测RGM肽和再生蛋白肽之间特异性结合的水平，其中在存在所述试剂的情况下检测的RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平相对于不存在所述试剂的情况下RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平的差异表明所述试剂调节顺式相互作用，其中所述RGM肽可以是RGMa肽并且可以是SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
本发明还涉及鉴别调节反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间顺式相互作用的试剂的方法，所述方法包括：(a)形成包含RGM肽和再生蛋白肽的混合物，其中所述RGM肽包含选自下列的氨基酸序列：SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列和SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，并且其中所述再生蛋白肽包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列；(b)在存在所述试剂的情况下，温育所述混合物；和(c)在步骤(b)的温育的混合物中，检测RGM肽和再生蛋白肽之间特异性结合的水平，其中在存在所述试剂的情况下检测的RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平相对于不存在所述试剂的情况下RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平的差异表明所述试剂调节顺式相互作用，其中所述RGM肽可以是RGMa肽且可以是SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。
本发明还涉及鉴别调节反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间顺式相互作用的试剂的方法，所述方法包括：(a)形成包含RGM肽和再生蛋白肽的混合物，其中所述RGM肽包含选自下列的氨基酸序列：SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列和SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，并且其中所述再生蛋白肽包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列；(b)在存在所述试剂的情况下，温育所述混合物；和(c)在步骤(b)的温育的混合物中，检测RGM肽和再生蛋白肽之间特异性结合的水平，其中在存在所述试剂的情况下检测的RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平相对于不存在所述试剂的情况下RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平的差异表明所述试剂调节顺式相互作用，其中所述RGM肽可以是RGMa肽并且可以是SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。
本发明还涉及鉴别调节反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间顺式相互作用的试剂的方法，所述方法包括：(a)形成包含RGM肽和再生蛋白肽的混合物，其中所述RGM肽包含选自下列的氨基酸序列：SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列和SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，并且其中所述再生蛋白肽包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列；(b)在存在所述试剂的情况下，温育所述混合物；和(c)在步骤(b)的温育的混合物中，检测RGM肽和再生蛋白肽之间特异性结合的水平，其中在存在所述试剂的情况下检测的RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平相对于不存在所述试剂的情况下RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平的差异表明所述试剂调节顺式相互作用，其中所述RGM肽可以是RGMa肽并且可以是SEQIDNO:7所示的氨基酸序列。
本发明还涉及鉴别调节反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间顺式相互作用的试剂的方法，所述方法包括：(a)形成包含RGM肽和再生蛋白肽的混合物，其中所述RGM肽包含选自下列的氨基酸序列：SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列和SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，并且其中所述再生蛋白肽包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列；(b)在存在所述试剂的情况下，温育所述混合物；和(c)在步骤(b)的温育的混合物中，检测RGM肽和再生蛋白肽之间特异性结合的水平，其中在存在所述试剂的情况下检测的RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平相对于不存在所述试剂的情况下RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平的差异表明所述试剂调节顺式相互作用，其中所述RGM肽可以是RGMc肽且可以是SEQIDNO:9所示的氨基酸序列。
本发明还涉及鉴别调节反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间顺式相互作用的试剂的方法，所述方法包括：(a)形成包含RGM肽和再生蛋白肽的混合物，其中所述RGM肽包含选自下列的氨基酸序列：SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列和SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，并且其中所述再生蛋白肽包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列；(b)在存在所述试剂的情况下，温育所述混合物；和(c)在步骤(b)的温育的混合物中，检测RGM肽和再生蛋白肽之间特异性结合的水平，其中在存在所述试剂的情况下检测的RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平相对于不存在所述试剂的情况下RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平的差异表明所述试剂调节顺式相互作用，其中所述RGM肽可以是RGMa肽且可以是SEQIDNO:10所示的氨基酸序列。
本发明还涉及鉴别调节反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间顺式相互作用的试剂的方法，所述方法包括：(a)形成包含RGM肽和再生蛋白肽的混合物，其中所述RGM肽包含选自下列的氨基酸序列：SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列和SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，并且其中所述再生蛋白肽包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列；(b)在存在所述试剂的情况下，温育所述混合物；和(c)在步骤(b)的温育的混合物中，检测RGM肽和再生蛋白肽之间特异性结合的水平，其中在存在所述试剂的情况下检测的RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平相对于不存在所述试剂的情况下RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平的差异表明所述试剂调节顺式相互作用，其中所述再生蛋白肽可以是SEQIDNO:1的氨基酸1至383。
本发明还涉及鉴别调节反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间顺式相互作用的试剂的方法，所述方法包括：(a)形成包含RGM肽和再生蛋白肽的混合物，其中所述RGM肽包含选自下列的氨基酸序列：SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列和SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，并且其中所述再生蛋白肽包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列；(b)在存在所述试剂的情况下，温育所述混合物；和(c)在步骤(b)的温育的混合物中，检测RGM肽和再生蛋白肽之间特异性结合的水平，其中在存在所述试剂的情况下检测的RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平相对于不存在所述试剂的情况下RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平的差异表明所述试剂调节顺式相互作用，其中所述再生蛋白肽可以是SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。
本发明还涉及鉴别调节反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间顺式相互作用的试剂的方法，所述方法包括：(a)形成包含RGM肽和再生蛋白肽的混合物，其中所述RGM肽包含选自下列的氨基酸序列：SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列和SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，并且其中所述再生蛋白肽包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列；(b)在存在所述试剂的情况下，温育所述混合物；和(c)在步骤(b)的温育的混合物中，检测RGM肽和再生蛋白肽之间特异性结合的水平，其中在存在所述试剂的情况下检测的RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平相对于不存在所述试剂的情况下RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平的差异表明所述试剂调节顺式相互作用，其中调节可以包括破坏RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用。
本发明还涉及鉴别调节反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间顺式相互作用的试剂的方法，所述方法包括：(a)形成包含RGM肽和再生蛋白肽的混合物，其中所述RGM肽包含选自下列的氨基酸序列：SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列和SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，并且其中所述再生蛋白肽包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列；(b)在存在所述试剂的情况下，温育所述混合物；和(c)在步骤(b)的温育的混合物中，检测RGM肽和再生蛋白肽之间特异性结合的水平，其中在存在所述试剂的情况下检测的RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平相对于不存在所述试剂的情况下RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平的差异表明所述试剂调节顺式相互作用，其中调节可以包括破坏RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用，并且其中如果在存在所述试剂的情况下所检测的RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平低于不存在所述试剂的情况下RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平，则所述试剂破坏顺式相互作用。
本发明还涉及包含与包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列具有至少约95％的同一性的氨基酸序列的肽，其中所述肽破坏反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用
本发明还涉及包含与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少约95％的同一性的氨基酸序列的肽，其中所述肽破坏反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用
本发明还涉及包含与SEQIDNO:3所示的氨基酸序列具有至少约95％的同一性的氨基酸序列的肽，其中所述肽破坏反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用
本发明还涉及包含与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列具有至少约95％的同一性的氨基酸序列的肽，其中所述肽破坏反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用。
本发明还涉及包含与SEQIDNO:7所示的氨基酸序列具有至少约95％的同一性的氨基酸序列的肽，其中所述肽破坏反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用。
本发明还涉及包含与SEQIDNO:8所示的氨基酸序列具有至少约95％的同一性的氨基酸序列的肽，其中所述肽破坏反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用。
本发明还涉及包含与SEQIDNO:9所示的氨基酸序列具有至少约95％的同一性的氨基酸序列的肽，其中所述肽破坏反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用。
本发明还涉及包含与SEQIDNO:10所示的氨基酸序列具有至少约95％的同一性的氨基酸序列的肽，其中所述肽破坏反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是肽试剂，并且其中所述肽试剂可以包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列以及它们的任意组合，并且其中所述肽试剂可以包含以下氨基酸序列：包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列。
本发明还涉及促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂，其中所述试剂可以是肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合，其中所述试剂可以是抗体，其中抗体可以特异地结合选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，并且其中所述抗体可以特异地结合包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列。
本发明还涉及鉴别调节反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间顺式相互作用的试剂的方法，所述方法包括：(a)形成包含RGM肽和再生蛋白肽的混合物，其中所述RGM肽包含选自下列的氨基酸序列：SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列和SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，并且其中所述再生蛋白肽包含选自下列的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列；(b)在存在所述试剂的情况下，温育所述混合物；和(c)在步骤(b)的温育的混合物中，检测RGM肽和再生蛋白肽之间特异性结合的水平，其中在存在所述试剂的情况下检测的RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平相对于不存在所述试剂的情况下RGM肽和再生蛋白肽的特异性结合水平的差异表明所述试剂调节顺式相互作用，其中所述再生蛋白肽可以是SEQIDNO:11的氨基酸1至417。
本发明还涉及包含与包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列具有至少约95％的同一性的氨基酸序列的肽，其中所述肽破坏反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用。
附图说明
图1显示了存在于脂筏中的再生蛋白。(A)用于产生抗再生蛋白的N-20和AF1079抗体的序列的示意图。(B)脑裂解液的免疫印迹分析，其显示N-20检测到了一个180kDa的条带，而AF1079识别180kDa条带以及在约150kDa的再生蛋白的N末端缺失。(C)F-肌动蛋白(Alexa毒伞素)和(D)再生蛋白的视网膜生长锥的免疫荧光图像。比例尺，30μm。(E)再生蛋白染色的合成图象、筏标志物霍乱毒素亚基B(CTB)和合并图像，其中虚线轮廓所示(并放大)的指明区域表示颜色变化(颜色未显示)，其表示再生蛋白和CTB的共定位。计算了12个生长锥中定量再生蛋白和CTB之间共定位的强度相关商(ICQ，intensitycorrelationquotient)。ICQ反映正或负(Ai-a)(Bi-b)值的数目与像素总数的比值减0.5以获得-0.5至+0.5的范围。本发明中，计算的平均ICQ为0.27，这表明再生蛋白和CTB之间的强共定位。比例尺，30μm。(F)再生蛋白(AF1079)的合成图象、RGMa和合并图像，其中指明区域如彩色所示(颜色未显示)，其表明再生蛋白和RGMa的共定位。计算的平均ICQ为0.32，这表明再生蛋白和RGMa之间的强共定位。比例尺，30μm。(G)小鸡脑梯度分离，其显示再生蛋白(箭头所示)与RGMa和筏标志物脂阀结构蛋白(Flotillin)的定位。转铁蛋白受体(TfR)用作重组分的标志物。
图2显示再生蛋白中4Ig结构域和RGMa的N末端部分之间的顺式相互作用将再生蛋白招募至脂筏。(A)将RGMa蛋白在涂覆了4Ig-或6FNIII-AP的板上温育。(结合：-，基线；++>5×基线；图9显示了该实验的定量分析)。一个C-和一个N-RGMa结构域(N-RGMa77-113)与6FNIII相互作用。一个N-RGMa结构域(N-筏)与4Ig相互作用。(B)用涂覆了N-筏、N-RGMa50-99和N-inh的珠使来自表达His-6FNIII或者His-4Ig的细胞的上清液(Sup)沉降(IP)。然后，用抗-His抗体进行免疫印迹以显示His-6FNIII或者His-4Ig是否与涂覆的珠相互作用。这表明N-inh使His-6FNIII沉降，而N-筏使His-4Ig沉降。对细胞上清液进行免疫印迹以表明相同量的His-FNIII和His-4Ig用于进行沉降。层粘连蛋白(lam.)和层粘连蛋白加N-RGMa或N-RGMa蛋白结构域上视网膜外植体长出的(C)图像和(D)定量显示仅N-RGMa和N-in.抑制轴突生长。数据为平均值±SEM(n＝3次独立实验)，*p<0.0001。比例尺，100μm。(E)在制备膜分离组分前1天，对小鸡脑注射对照肽(Ctrl；N-RGMa50-99)、4Ig、N-筏或诺金。在对照实验中，再生蛋白定位至含脂阀结构蛋白/RGMa的脂筏组分(如实线框所示)。4Ig、N-筏或诺金将再生蛋白迁移至重组分。
图3显示RGMa抑制需要再生蛋白与脂筏的结合。(A)N-RGMa上培养并用4Ig(1μg/ml)、N-筏(1μg/ml)、RGMaShRNAs(shRNA21和shRNA37)、MβCD(10mM)、CO(2U/ml)和诺金(100nM)处理的颞颥外植体(Temporalexplants)。(B-F)在层粘连蛋白(Ctrl)、层粘连蛋白加-N-RGMa、-C-RGMa或-RGMaΔ上生长并用(B)RGMashRNA21和shRNA37、(C)4Ig、(D)N-筏、(E)MβCD和CO和(F)诺金(Nog.)处理的外植体。数据为平均值±SEM(n＝3次独立实验)，*p<0.005。(G)小鸡视通路中体内实验的示意图。用表达RGMa/再生蛋白构建体的质粒以E2对右眼电穿孔，并且从眼至视顶盖进行E17示踪(tracing)。插图表示部分(小图)h-k中存在的区域。(H)使用N-RGMa50-99的对照实验，其不与再生蛋白相互作用。轴突途径完整，并且所有纤维建立了进入末端区(TZ)的终末丛。(I)RGMa-shRNA、(J)N-筏或(K)4Ig的电穿孔干扰轴突途径，其中多个纤维在预测TZ(箭头)外建立末端丛。比例尺，100μm。(L)以上提供的治疗作用的示意图。再生蛋白中的4Ig结构域与RGMa(N-筏)中的N末端部分相互作用，以允许将再生蛋白BMP-依赖性招募至脂筏。一旦进入脂筏，再生蛋白转导轴突抑制。防止再生蛋白与脂筏结合的处理消除了轴突抑制。这些处理为(1)用诺金螯合BMP；(2)通过加入N-筏肽掩蔽再生蛋白上的4Ig位点；(3)通过加入4Ig肽掩蔽RGMa上的N-筏位点；(4)用shRNA(shRNA21和ShRNA37)沉默RGMa，和(5)使用胆固醇减少(MβCD和CO)破坏脂筏。
图4显示再生蛋白需要脂筏来诱导细胞死亡。(A)用空质粒(Ctrl)或再生蛋白(Neo)转染稳定表达RGMa的HEK293细胞(图11A)。与对照相比，再生蛋白诱导细胞死亡(箭头)。(B)在BSA(Neo+Ctrl)、4Ig(1μg/ml)、N-筏(1μg/ml)、诺金(100nM)或MβCD(10mM)中温育的再生蛋白转染细胞中细胞死亡的定量。防止再生蛋白与脂筏结合的治疗显著挽救了再生蛋白诱导的细胞死亡。数据为平均值±SEM(n＝3次独立实验)，*p<0.0001。用GFP-和再生蛋白-表达质粒电穿孔，然后注射N-RGMa50-99(Ctrl；1μg/ml)、4Ig(1μg/ml)或N-筏(1μg/ml)并进行TUNEL测定的小鸡E5顶盖中细胞死亡的(C)代表性图像和(D)定量。4Ig或N-筏显著降低再生蛋白所造成的TUNEL阳性细胞的数目。数据为来自3个不同顶盖/条件的平均值±SEM(*p<0.001)。比例尺，100μm。与对照肽(1μg/ml)、4Ig(1μg/ml)、N-筏(1μg/ml)或MβCD(10mM)温育4天的视网膜全标本包埋和用碘化丙啶(PI)染色的死细胞的(E)代表性图像和(F)定量。在使用ImageJ测量的相同强度和荧光采集来自于3个独立实验的每个条件的9个全标本包埋的图像。4Ig、N-筏或MβCD显著降低视网膜全标本包埋中细胞的死亡。比例尺，500μm。(G)显示轴突切断术后14天受损视网膜中荧光金-标记的视网膜神经节细胞(RGC)的平置视网膜的荧光显微照片。对照视网膜(Ctrl)具有少量存活的RGC。4Ig、N-筏或MβCD提高了细胞的存活。比例尺，200μm。(H)我们的分析中所选的视网膜区域的图示。轴突切断术后14天存活的RGC密度的定量，其显示(I)4Ig或N-筏和(J)MβCD显著提高RGC的存活。数据为平均值±SEM(n＝6只眼)，*p<0.01。
图5显示改变脂筏中再生蛋白的存在促进脊髓损伤后的功能恢复和神经元存活。与对照相比，使用BBB(A、D)、运动分项分数(B、E)和平均步数(C、F)的行为评价显示使用4Ig(IV)或MβCD(IP)的全身治疗导致脊髓损伤大鼠功能显著改善。数据为平均值±SEM(对照：n＝7；4Ig：n＝8；MβCD：n＝8)(*p<0.005)。与对照相比，使用BBB(G)和平均步数(H)的(G、H)行为评价显示4Ig的鞘内施用导致脊髓损伤大鼠功能显著改善。数据为平均值±SEM(对照：n＝10；4Ig：n＝10)(*p<0.005)。(I-M)神经元标志物，NeuN染色的受损脊髓的纵向切片。插图显示用(I)媒介物对照、(J)4Ig和(K)MβCD全身治疗后，来自大鼠的受损脊髓中病变周围的神经元。箭头指出4Ig和MβCD治疗后的神经元。虚线表示白质和灰质之间的边界。I-K显示的实验定量表明在SCI后用(L)4Ig和(M)MβCD的治疗导致未受伤害的神经元数目显著提高。对于每只动物，通过包含相同灰质组织的每个脊髓的厚度，以相同的前后距离，从5个切片定量神经元的绝对数目。(N-O)4Ig的鞘内治疗后，受损脊髓的截面的Neu-N染色。插图显示来自用(N)媒介物和(O)4Ig处理的大鼠的脊髓。箭头指示神经元。(P)N-O显示的实验定量表明在SCI后使用4Ig的鞘内治疗导致神经元数目显著提高。图12D显示了距病变位点不同距离的定量。比例尺，100μM。数据为平均值±SEM(n＝8只动物/条件)，*p<0.001。比例尺，100μm。
图6显示改变脂筏中再生蛋白的存在促进有髓鞘脊髓中轴突的再生。为了使来自皮质脊髓束的轴突显象，在SCI后6周使用生物素葡聚糖胺(BDA)进行顺向轴突示踪(anterogradeaxonaltracing)。(A)上部分显示了损伤后的对照脊髓。插图代表更高的放大倍数。病变腔存在于左侧。(B)用4Ig处理的受损脊髓。用BDA示踪显示在4Ig实验中纤维在所述腔的尾端(后端，caudal)，但在对照中没有。最长的再生轴突延伸超出所述腔的尾端几mm。箭头表示纤维。插图中的箭头表示弯转的纤维。比例尺，100μm。(C、D)SCI后，(C)4Ig和(D)MβCD治疗后，平均最大长度提高。数据为平均值±SEM(n＝4只独立的大鼠/条件；3-4个切片/大鼠)，*p<0.001。测量了再生轴突/切片的平均数，其显示用(E)4Ig和(F)MβCD处理的受损大鼠中再生轴突的数目更多。数据为平均值±SEM(n＝4只独立的大鼠/条件；3-4个切片/大鼠)，*p<0.005。(G、H)在处死动物并测量轴突长度前，用4Ig处理受损脊髓4或6周(w)。(G)与4周相比，6周时平均轴突长度显著更大。(H)测量再生轴突/切片的平均数，其显示与4周相比，对脊髓处理6周时，3-4mm的轴突数目较多。数据为平均值±SEM(n＝5只单独的大鼠/条件；3-4个切片/大鼠)，*p<0.005。
图7显示改变脂筏中再生蛋白的存在促进视神经损伤后轴突的再生。(A-D)在视神经挤压和多种治疗后21天，视神经纵向切片中的GAP-43免疫染色。与对照(A)相比，用(B)4Ig和(C)N-筏改变脂筏中再生蛋白的存在或者(D)用MβCD破坏脂筏会提高通过挤压位点(最易于如(C)中虚线所示)和进入远端有髓视神经的轴突再生。箭头区分每个神经切片中的一些再生轴突。插图是相应切片的再生轴突的高倍放大视图。(E)轴突长度的定量，其显示视神经损伤后，4Ig、N-筏和MβCD显著提高轴突再生。数据为平均值±SEM(n＝7个视神经/条件)，*p<0.001。比例尺，200μm。
图8显示了共定位实验的对照。(A)视网膜生长锥的CTB和F-肌动蛋白染色。筏标志物霍乱毒素亚基B(CTB)、F-肌动蛋白标志物Alexa-毒伞素的合成图象和合并的图像，其在图的主干和四周中显示了CTB和F-肌动蛋白(颜色未显示)的共定位重叠；比例尺，30μm。(B)CTB和F-肌动蛋白显示在视网膜生长锥中的随机染色。如10生长锥中所述，计算定量CTB和Alexa-毒伞素之间共定位的强度相关商(ICQ)。ICQ反映了正或负(Ai-a)(Bi-b)值的数目与像素总数的比值减0.5以获得-0.5至+0.5的范围。在本文中，计算平均ICQ为0.05，这表明CTB和F-肌动蛋白之间的随机定位。(C)小鸡脑的MβCD处理将再生蛋白共定位改变至较重组分。在制备膜分离物前1天，对小鸡脑注射MβCD(10mM)以消除胆固醇。在这些实验中，再生蛋白与转铁蛋白受体(TfR)共定位。因此，用MβCD预处理改变了再生蛋白的定位，表明它不再处于脂筏部分中。
图9显示了与不同再生蛋白区域相互作用的不同RGMa结构域的鉴别。(A)将不同的RGMa-AP蛋白在涂覆了4Ig6FNIII或BSA的孔上温育。通过加入显色底物p-硝基苯基磷酸酯来显示结合，其显示了AP标签的存在，并且使用酶标仪(读板仪)测量405nm的吸光值。数据为平均值±SEM(n＝3次独立实验)，*p<0.005。(B)结合测定的定量，其中在涂覆了来自不同RGMa区的蛋白的孔上测定了4Ig-AP和6FNIII-AP蛋白。在(a)中显示相互作用的片段，其中在该测定中确认。因此，鉴别了两个N-RGMa片段(N-筏和N-RGMa77-113)，其分别结合再生蛋白中的4Ig和6FNIII结构域。C-RGMa蛋白和全长RGMa仅结合6FNIII。数据为平均值±SEM(n＝3次独立实验)，*p<0.005。(C)DCC的4Ig结构域不与N-筏(N-RGMa28-73)相互作用。结合测定定量，其中在涂覆了蛋白质DCC-4Ig和再生蛋白-4Ig的孔上测定N-RGMa-AP。在这些实验中，再生蛋白-4Ig而不是DCC-4Ig与N-筏-AP相互作用。数据为平均值±SEM(n＝4次独立实验)，*p<0.005。(D)再生蛋白在脂筏中的定位需要再生蛋白的4Ig结构域和N-筏之间的顺式相互作用。用再生蛋白和RGMa构建体转染HEK-293细胞。在收集细胞前1小时，将BMP2(100nM)加入至培养基中。脂筏分离后，进行免疫印迹。将脂筏结构蛋白用作脂筏分离的标志物，而转铁蛋白受体(TfR)用作膜重组分的标志物。每个实验重复两次。使用识别两种同工型的抗体AF1079进行再生蛋白的免疫印迹。在第一组实验中，仅用再生蛋白转染细胞。在来自该研究的细胞膜中，再生蛋白与重膜TfR的标志物共定位，并且未观察到与脂筏标志物脂阀结构蛋白的共定位。在第二组中，转染全长再生蛋白和RGMa，并且180kDa再生蛋白条带定位至含有脂阀结构蛋白的脂筏部分。在第三和第四组中，当转染再生蛋白4Ig截短(Neo(4Igdel))或RGMa的N-RGMa28-73(N-筏)截短(RGMa(28-73del)时，再生蛋白不再存在于含有脂阀结构蛋白的筏部分中。这表明脂筏中再生蛋白的存在需要4Ig和N-RGMa28-73(N-筏)之间的相互作用。
图10显示了使用shRNA的RGMa沉默的评价。(A)使用RGMa-shRNA(shRNA#21和shRNA#37)的小鸡和小鼠RGMa沉默的免疫印迹分析。用小鸡或小鼠RGMa和shRNA共转染HEK-293细胞。转染后2天，进行膜制备并且使用抗RGMa抗体在免疫印迹中分析RGMa表达。当用小鸡RGMa转染HEK-293细胞时，免疫印迹分析显示RGMa-shRNA(shRNA#21和shRNA#37)而不是对照ShRNA(ShRNA-Crl)沉默RGMa表达。当用小鼠RGMa转染HEK-293细胞时，免疫印迹分析显示RGMa-shRNA#21沉默其表达。然而，shRNA#37不沉默小鼠RGMa表达。因此，在挽救实验中可以使用小鼠RGMa，其中用RGMashRNA#37沉默小鸡RGMa。考马斯亮蓝染色显示相同蛋白加载量。(B)用多种构建体转染分离的视网膜神经节细胞并在N-RGMa上培养。用红色荧光蛋白共转染以鉴别转染的细胞。对βIII微管蛋白染色以鉴别神经元细胞。用对照shRNA转染的RGC的代表性图显示涂覆N-RGMa的盖玻片上轴突长出的抑制。在存在使小鸡RGMa沉默的shRNA37时，这种抑制受到抑制。当shRNA37与小鼠RGMa共转染时，恢复了轴突生长的N-RGMa抑制。(C)实验定量，其中用多种质粒转染视网膜神经节细胞并在层粘连蛋白和层粘连蛋白加N-RGMa、C-RGMa和RGMaΔ上生长。在RGMa蛋白上，与层粘连蛋白相比，视网膜轴突较短。通过shRNA37转染抑制这些抑制，并且当小鼠RGMa与shRNA37共转染时恢复。因此，shRNA37的影响来自RGMa的特异性沉默。所有数据为平均轴突长度±SEM(n＝6次独立实验)。数据为平均值±SEM(n＝6次独立实验)，*p<0.01。(D)视网膜外植体的MβCD处理将再生蛋白共定位改变至较重组分。在制备膜组分前，用MβCD(10mM)处理小鸡外植体1小时以消除胆固醇。在这些实验中，再生蛋白与转铁蛋白受体(TfR)共定位。因此，使用MβCD的预处理改变了再生蛋白的定位，表明它不再处于脂筏组分中。
图11显示了评价细胞死亡的对照实验。(A)稳定HEK-293中RGMa的表达。在HEK-293细胞中产生了稳定表达RGMa的细胞系。制备来自对照和表达RGMa的稳定系的膜用于分析。对不存在DTT(以保持二硫键)时加载的样品进行免疫印迹分析。抗RGMa抗体显示稳定细胞系中预期55kDa条带的存在。该条带在对照中不存在。(B)绿色荧光蛋白(GFP)电穿孔不会在小鸡顶盖中导致细胞凋亡。用表达GFP的质粒电穿孔E5顶盖，并且1天后，除去顶盖并对切片使用TUNEL分析以确定凋亡细胞死亡。GFP染色表明电穿孔顶盖成功。TUNEL染色显示GFP电穿孔不会引起细胞凋亡。因此，GFP的电穿孔不会引起凋亡死亡。
图12显示用MβCD和4Ig处理对GFAP和NeuN染色的影响：(A)代表性图，其显示来自MβCD、4Ig和对照PBS处理的大鼠的脊髓向后至用星形细胞标志物GFAP染色的病变位点的区域。插图显示了GFAP阳性星形细胞的高倍放大图像。(B，C)对于每只动物，在通过每个脊髓厚度的前后距离相等的3个切片中，在距病变前后边缘0.45mm和1.8mm确定3个区域(1.1×106um2面积)的总免疫荧光强度。将每只动物的每个区域的平均值归一化为未受损对照的平均强度值，并求平均值。组间无显著性差异。数据为平均值±SEM(n＝5只动物/条件)。(D)MBCD或4Ig处理不影响病变体积。用LFB/H&E染色旁矢状面切片，并且在每个脊髓中计算病变体积，并求平均值。组间病变体积无显著性差异。(E)宿主神经元计数：损伤后6周内，进行4Ig的鞘内施用，并用NeuN对脊髓横截面染色。在包含病变位点的整个脊髓的5mm前后部分中，在320um距离分开的横截面中对NeuN+细胞计数；上图显示所有计数的神经元的总数和每组的平均值；下图显示了包含病变位点的前后间隔：-3mm前至0(中心)至3mm后中计数的神经元的平均#；单因素ANOVA，事后Bonferonni分析。
图13显示了使用4Ig和MβCD的处理改善了脊髓损伤后的功能性结局。损伤和处理后的行为评价。(A、B)慢动作分析记录；记录每条后肢的步数并对每只大鼠每周计算平均值。对后肢跛行的受损大鼠打分，最大脚步得分12。未受损大鼠每次交叉具有0或偶尔1的脚步得分。计算测试的相对成功率并在本文中提供。与对照相比，用4Ig或MβCD处理导致脊髓受损大鼠中功能性显著改善。数据为平均值±SEM(对照：n＝8；4Ig：n＝8；MβCD：n＝8)(*p<0.005)。(C)从前到后的脊髓横截面的H/E&LFB染色，其显示在大鼠中夹子挤压脊髓损伤后，在中心处的典型空洞和皮质脊髓束的完全除去(T8级20g损伤)。在完整的第一前切片中，通过方框标记皮层脊髓束(CST)。(D)部分图显示4周时注射BDA的4Ig大鼠中距病变往后～1000um的BDA标记纤维。方框显示了BDA标记的纤维(箭头)的弯曲形态的高倍放大图像。在4周时注射BDA的4Ig大鼠中距病变位点往后更远的距离处，标记的纤维不明显。(E)距4Ig处理大鼠和未受损对照的病变位点(T8)往前2mm和往后5mm的脊髓的横截面的BDA染色，其显示了皮层脊髓束轴突。在横截面中，在4Ig和未受损对照中距病变位点往前2mm的CST(圆形)中，BDA轴突轮廓明显。在未受损对照大鼠的病变位点往后5mm处也显示了BDA标记的CST轴突，其显示了CST的连续性。相反，在4Ig处理的大鼠中，在病变位点往后5mm的切片中，BDA标记的轴突不明显，其显示CST的破环和无轴突未受损。(F)用MβCD处理的年老大鼠的行为评价：使年老大鼠(>7个月)受损并用MβCD处理4周。与对照相比，BBB评价显示MβCD处理导致脊髓受损大鼠中功能性显著改善。观察受损后7天的影响，其符合MβCD处理还促进存活的观点。数据为平均值±SEM(对照：n＝4；MβCD：n＝4)(*p<0.05)。
图14显示在受损视神经中，用4Ig、N-筏和MβCD的治疗。使视神经受到挤压伤，并用DMSO(对照)、4Ig、N-筏和MβCD处理直至损伤后21天处死。将视神经固定，切片并用标记星形神经胶质细胞的抗GFAP抗体分析。(A)用DMSO(对照)、4Ig、N-筏和MβCD处理的视神经的代表性图。图片部分显示GFAP染色、DAPI染色和合并的染色。右上图显示已用于GFAP染色定量的区域。(B)对于每只动物，在(A)中提供的4个区域中，使用ImageJ程序(NIH)确定免疫荧光强度。提供了每个区域的相对平均强度。组间无显著性差异。数据为平均值±SEM(n＝8只动物/条件)。(C)落射荧光显微照片，其显示视神经挤压后21天，平置视网膜中霍乱毒素B(FITC结合的)的顺行标记。每幅图来自特定处理后的中外周(mid-periphery)。细胞体(箭头)和沿其轴突主动顺行输送CTB-FITC的RGC轴突是可见。与对照相比，在视神经挤压后，MBCD、4Ig或N-筏处理i)保持了神经纤维层中RGC轴突胞体(axonsoma)的完整性。在视网膜的整个表面(从中外周至外层视网膜)上观察到了这些影响。
图15显示了RGMa对再生蛋白的作用的模型。RGMa和再生蛋白建立两类相互作用以控制神经元死亡和轴突生长/再生。A)RGMa的N末端部分与再生蛋白中的4Ig结构域之间的顺式相互作用将再生蛋白招募至脂筏。一旦在脂筏中招募，再生蛋白将在不存在来自环境的RGMa分泌源的情况下诱导细胞死亡。B)具有RGMa的C末端和N末端部分的两个不同的结构域和再生蛋白中的FNIII结构域之间发生反式相互作用，RGMa和再生蛋白之间的相互作用调节轴突生长/再生抑制。细胞将反式相互作用的RGMa肽直接分泌到神经元周围。为了阻止轴突生长/再生，需要在脂筏中存在再生蛋白。C)由于再生蛋白需要脂筏结合以引起细胞死亡和阻断轴突生长/再生，因此改变再生蛋白向这些区室的招募可以用于防止其功能。这可以使用包括肽(如(本文所述的)4Ig肽、N-筏肽)在内的试剂或脂筏破环来进行。防止再生蛋白与脂筏的结合促进细胞存活和轴突生长/再生。
图16显示了小鸡RGMa的氨基酸28-73的序列。小鸡RGMa序列为登录号No.NP_989868.1(SEQIDNO:6)。
图17显示(A)免疫印迹及其相应的考马斯染色凝胶；(B)RGMa肽的简图；和(C)对450nm吸光值作图的肽。从原鸡(Gallusgallus)产生在本研究中使用的所有构建体。为了鉴别N-RGMa与再生蛋白的4Ig结构域的结合位点，将N-RGMa(28-73aa)分成4个重叠片段：1)N-RGMa(28-54aa)；2)N-RGMa(40-62aa)；3)N-RGMa(55-73aa)和4)N-RGMa(54-62aa)。将序列克隆至Psectag2B-AP质粒，其使得能够作为可溶性蛋白分泌融合碱性磷酸酶标签的肽。使用96孔微量滴定板(CorningIncorporated)，将孔用100μl(10μg/mL)聚-L-赖氨酸涂覆并在4℃过夜。然后，用100μlPBST(+0.02％吐温)将孔清洗3次。50μl(2.5μg/mL)His-标签：将全长再生蛋白；4Ig再生蛋白；和FNIII再生蛋白涂覆到每个孔中，在37℃保持1h。100μlPBST清洗3次后，在37℃用300μl3％的BSA在PBST中的溶液封闭每个孔1小时。然后，将50μl(1.0μg/mL)AP-标签：N-RGMa(28-73)；N-RGMa(28-54)；N-RGMa(40-62)；N-RGMa(54-73)；N-RGMa(54-62)在1％BSA+PBST中的溶液加入到每个孔中，并在37℃温育1小时。将每个孔用100μlPBST彻底清洗三次，然后用碱性磷酸酶(AP)显影缓冲液(100mMNaHCO3，1mMMgCl2)平衡每个孔。使用添加有p-硝基苯磷酸酯(pNPP)(Sigma-Aldrich)的AP显影缓冲液使反应显色，并使其显色直至出现颜色。加入50μl(0.1M)NaOH终止反应。使用自动酶标仪(BIO-TEKInstrumentsInc.)在450纳米(nm)波长测量每个反应的吸光值。为了进一步鉴定N-筏内对再生蛋白4Ig-结构域的结合位点，将N-筏分成4个重叠片段：N-RGMa(28-54aa)；N-RGMa(40-62aa)；N-RGMa(55-73aa)和N-RGMa(54-62aa)。纯化这4个片段并测试与全长再生蛋白、再生蛋白的4Ig-结构域和再生蛋白的6FNIII-结构域的结合(图17A-17C)。这些研究表明N-RGMa(40-62aa)和N-RGMa(54-73aa)特异性结合至再生蛋白的4Ig-结构域(图17C)。
图18显示在成年鼠光受体上表达再生蛋白：用抗再生蛋白抗体对成年视网膜染色，其显示在含有光受体的外核层(ONL)中表达该蛋白。
图19显示再生蛋白4Ig结构域防止rd1小鼠中光受体死亡：A)在P9，用PBS(对照)或用再生蛋白的4Ig片段注射Rd1小鼠。在P21，将动物处死，并进行DAPI或H&E染色以使光受体显像。在4Ig注射的动物中，与对照相比，外核层(ONL)更厚。B)(A)中实验的定量。与对照相比，4Ig处理的动物中细胞数目以及ONL的平均厚度显著增加。
图20显示胆固醇消耗/抑制促进光受体存活：(A)在P9，用PBS(对照)或者MBCD或AY-9944注射rd1小鼠。在P21，处死动物并进行DAPI染色以使光受体显像。在MBCD和AY-9944注射的动物中，与对照相比，外核层更厚。B)(A)中实验的定量。与对照相比，MBCD和AY-9944处理的动物中，ONL中的细胞数目显著增加。
图21显示胆固醇消耗/抑制促进视杆存活：在P9，用PBS(对照)或者MBCD或AY-9944注射rd1小鼠。在P21，处死动物并用抗视紫红质抗体对视杆染色。在MBCD和AY-9944注射动物中，我们可以观察到外核层内视杆数目显著增加。
图22显示在中风模型中RGMa通过再生蛋白促进细胞存活：(A)作为中风模型，对视网膜全样载片进行糖氧剥脱(OGD)，并进行碘化丙啶染色(红色，颜色未显示)以评价细胞死亡。在对照(无OGD)中，大部分细胞存活。在OGD后，染色增加显示了较多的死细胞个数。向培养基中加入RGMa(OGD+RGMa)减少了细胞死亡。再生蛋白阻断抗体的存在消除了RGMa的促存活作用，表明RGMa对细胞存活的影响是再生蛋白介导的(OGD+RGMa+再生蛋白抗体)。(B)A中提供了4次独立实验的定量。
图23显示RGMa注射促进体内中风模型中细胞的存活。(A、B、C)对眼进行的实验的示意图。A)对大动脉结扎以停止血流15分钟。b)结扎后，将RGMa注射到眼睛玻璃体中。C)结扎2周后，实施逆行标记以评价细胞存活。D)用于定量的视网膜区域的图示。E)对于每个条件，对8只大鼠进行的细胞存活定量。这表明在该体内中风模型中，RGMa注射将存活促进了2倍。
图24显示在OGD(糖氧剥脱)后，在视网膜全样载片中，4Ig提高存活：A)在视网膜全样载片中评价4Ig对细胞存活的影响。培养2天后，实施碘化丙啶染色以使死细胞显象。在存在对照或4Ig的情况下，实施OGD(1h)。在OGD后1天，通过PI染色评价细胞存活。B)A中观察到的行为的定量。在4Ig处理培养中，细胞存活显著改善。
图25显示改变再生蛋白与脂筏(4Ig)的结合预防中风后的脑损伤：将血凝块注入大脑中动脉以产生中风，并用4Ig(每日)和动物或对照肽尾静脉注射处理动物。将动物饲养1周，对脑染色(2％2,3,5-三苯基氯化四唑溶液)以使损伤显象。然后，在白色区域(箭头)的玻璃体中注射霍乱毒素以表明损伤。在4Ig处理的动物中，与对照相比，损害减少。
图26显示改变再生蛋白与脂筏(4Ig)的结合预防中风后的脑损伤：将血凝块注入大脑中动脉以产生中风，并用4Ig(每日)和动物或对照肽尾静脉注射处理动物。将动物饲养1周，对脑染色(2％2,3,5-三苯基氯化四唑溶液)以使损伤显象。A)在4Ig和对照动物中测量梗死体积。这表明4Ig处理的动物中梗死尺寸显著减少。B)在4Ig和对照动物中测量脑水肿尺寸。这表明4Ig处理的动物中水肿尺寸显著减小。(*p<0.05)
图27显示改变再生蛋白与脂筏(4Ig)的结合有助于中风后脑功能的恢复：将血凝块注入大脑中动脉以产生中风，并用4Ig(每日)或对照肽尾静脉注射处理动物。将动物饲养1周，并使用Bederson测试评价功能行为。与对照相比，4Ig处理的动物显示脑功能显著改善(p<0.05)。
图28显示了实验设计的图示。在小鼠中进行的EAE实验的示意图。
图29显示4Ig肽减轻EAE中的瘫痪：在10只小鼠中引起EAE，每个处理组5只。在箭头所指当天，对小鼠施用4Ig肽(3μg的PBS溶液)或作为对照的PBS。在第17天，对照小鼠严重瘫痪，而4Ig强烈降低了瘫痪的严重程度。
图30显示使用AY-9944和BM15.766抑制胆固醇生物合成促进髓鞘质上视网膜神经节细胞神经突的生长。从E7鸡胚制备视网膜外植体并在涂覆了层粘连蛋白或髓鞘质的盖玻片上培养，并用对照(DMSO)或者AY-9944(1μM)或BM15.766(4μM)处理。培养18小时后，用4％PFA固定外植体并用Alexa488-毒伞素染色。使用Cellsens软件测量轴突。在层粘连蛋白(对照)或者髓鞘质(CNS的抑制化合物)上培养视网膜外植体。在层粘连蛋白上，与髓鞘质相比，轴突生长正常，这是因为髓鞘质抑制长出。当将胆固醇抑制剂加入至培养基中时，它们不影响在层粘连蛋白上长出。然而，它们在髓鞘质上恢复长出，这表明它们抑制髓鞘质的抑制活性。
具体实施方式
本发明涉及调节对其有需要的受试者中反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间顺式相互作用的方法，和调节脂筏内再生蛋白的招募(即，破坏再生蛋白的招募和/或维持)的方法。神经元细胞表面上的胞外RGMa和再生蛋白之间发生反式相互作用，而位于神经元细胞的相同质膜内的RGMa和再生蛋白之间意外地发生顺式相互作用。
阻断顺式相互作用和破坏脂筏(其发现如本文所述)两者能够抵消对CNS损伤或疾病起反应的两个消极影响：(a)细胞死亡和(b)轴突抑制。一旦招募至脂筏，在不存在与RGMa的反式相互作用的情况下，再生蛋白发出信号以引起神经元细胞死亡(例如，细胞凋亡)。通过破环脂筏本身或通过防止RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用来抑制再生蛋白向脂筏的招募，这会导致神经元细胞存活的提高和轴突生长和/或再生的增加。
通过再生蛋白的四个免疫球蛋白样结构域(4Ig结构域)和RGMa的N末端部分(即，在本文中描述为N-筏或RGMa的氨基酸28至73)介导这种顺式相互作用。N-筏内的图谱实验(如下文中更详细地描述的并且如图2A、9和17所示)表明RGMa的氨基酸40至73含有结合再生蛋白4Ig结构域所必需的氨基酸和/或二级结构。另外，全长RGMa不能结合4Ig结构域，表明对于与再生蛋白发生顺式相互作用来说，这些所需的氨基酸和/或二级结构可能需要在RGMa中暴露(例如，通过构象变化)。
如以下更详细地描述的，调节方法包括阻断或破坏RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用和/或破坏脂筏。这些方法改变了再生蛋白向脂筏的招募，借此防止再生蛋白发出信号以引起细胞死亡和抑制轴突生长和/或再生。
调节方法还包括施用阻断或破坏RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用和/或破坏脂筏的试剂。该试剂可以是如下文更详细地描述的肽试剂、降胆固醇试剂或抗体。
本发明还涉及鉴别调节RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用的试剂的方法。所述试剂可以是抗体或抗体片段。所述抗体或抗体片段可以特异地识别并选择性结合RGMa和再生蛋白之间发生顺式相互作用所需的氨基酸和/或二级结构。照此，所述抗体或抗体片段可以抑制顺式相互作用，调节再生蛋白向脂筏的招募并促进神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。
本发明还涉及治疗对其有需要的受试者中疾病的方法。治疗方法可以应用促进受试者中神经元细胞存活和轴突生长和/或再生的调节方法。所述疾病可以是色素性视网膜炎、缺血、多发性硬化、脊髓损伤或视神经损伤。
1.定义
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学名词的含义与本领域技术人员通常理解的含义相同。在矛盾的情况下，将以本文档(包括定义)为准。以下描述了优选的方法和材料，但是可以在本发明的实践和测试中使用与本文所述那些相似或等同的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利及其它参考文献以其全部内容作为参考并入本文。本文所公开的材料、方法和实施例仅是说明性的并且不意欲限制。
如本文所使用的，术语“包含”、“包括”、“具有”(“having，”“has，”)、“可以”、“含有”及其变化形式旨在是开放型连接短语、术语或单词，其不排除其它行为或结构的可能性。除非在上下文中明确说明，否则单数形式的“一个”和“所述”包括复数对象。无论是否明确说明，本发明公开还考虑了“包含本文所提供的实施方式或元素”、“由本文所提供的实施方式或元素组成”和“基本由本文所提供的实施方式或元素组成”的其它实施方式。
“受体”和“受体抗体”在本文中用于表示提供或编码至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的一种或多种框架区的氨基酸序列的抗体或核酸序列。术语“受体”涵盖了提供或编码恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。该术语还涵盖了提供或编码一个或多个框架区和恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。例如，术语“受体”可以表示提供或编码至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的一种或多种框架区的氨基酸序列的人抗体氨基酸或核酸序列。这种受体可以含有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少10个在人抗体的一个或多个特定位置不存在的氨基酸残基。受体框架区和/或受体恒定区可以(例如)来源于或得自胚系抗体基因(germlineantibodygene)、成熟抗体基因或功能性抗体(例如，本领域熟知的抗体，开发中的抗体或可商购的抗体)。
“亲和成熟抗体(亲和力成熟的抗体，affinitymaturedantibody)”在本文中用于表示在一个或多个CDR中具有一个或多个变化的抗体，其导致与不具有所述变化的亲本抗体相比，所述抗体对靶标抗原的亲和力(即KD、kd或ka)的改善。示例性亲和成熟抗体将对靶标抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。产生亲和成熟抗体的多种程序在本领域中是已知的，其包括使用生物展示(bio-display)制备的组合抗体文库的筛选。例如，Marks等人,BioTechnology,10:779-783(1992)描述了通过VH和VL域改组的亲和力成熟。在以下文献中描述了CDR和/或框架残基的随机突变：Barbas等人,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,91:3809-3813(1994)；Schier等人,Gene,169:147-155(1995)；Yelton等人,J.Immunol.,155:1994-2004(1995)；Jackson等人,J.Immunol.,154(7):3310-3319(1995)；和Hawkins等人,J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)。美国专利No.6,914,128B1描述了在选择性突变位置以及在具有提高活性的氨基酸残基的接触或高变位置的选择性突变。
如本文所使用的“抗体”是指单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体(完全或部分人源化)、动物抗体，如(但不限于)禽类(例如，鸭或鹅)、鲨鱼、鲸和哺乳动物，包括非灵长类(例如：牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠等)或非人灵长类(例如，猴子、黑猩猩等)、重组抗体、嵌合抗体、单链Fvs(“scFv”)、单链抗体、单域抗体、Fab片段、F(ab')片段、F(ab')2片段、二硫键连接的Fvs(“sdFv”)和抗独特型(“抗-Id”)抗体、双域抗体、双可变域(DVD)或三可变域(TVD)抗体(双可变域免疫球蛋白和制备它们的方法在以下文献中有所描述，Wu,C.等人,NatureBiotechnology,25(11):1290-1297(2007)和PCT国际专利申请WO2001/058956，以上每篇文献的内容作为参考并入本文)以及任何上述抗体的功能活性表位结合片段。具体地，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有分析物结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或分类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。为简单起见，抗分析物的抗体在本文中通常被称为“抗分析物抗体”或仅称为“分析物抗体”。
如本文所使用的“抗体片段”是指包含抗原结合位点或可变区的完整抗体的一部分。所述部分不包括完整抗体的Fc区的重链恒定域(即CH2、CH3或CH4，根据抗体同种型(同型，isotype)的不同)。抗体片段的实例包括(但不限于)Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、双抗体(双体，diabodies)、单链Fv(scFv)分子、仅含一个轻链可变域的单链多肽、含有轻链可变域的3个CDR的单链多肽、仅含一个重链可变区的单链多肽和含有重链可变区的3个CDR的单链多肽。
“双特异性抗体”在本文中用于表示通过四源杂交瘤技术(四体杂交瘤技术，quadromatechnology)(参见Milstein等人,Nature,305(5934):537-540(1983))，通过两个不同单克隆抗体的化学结合(参见，Staerz等人,Nature,314(6012):628-631(1985))或通过在Fc区中引入突变的“杵臼法”(knob-into-hole)或类似方法(参见Holliger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90(14):6444-6448(1993))(其导致产生了多种不同的免疫球蛋白，但其中仅有一个是功能双特异性抗体)产生的全长抗体。双特异性抗体结合其两个结合臂(一对HC/LC)之一上的一个抗原(或表位)，并结合其第二臂(不同的一对HC/LC)上的不同抗原(或表位)。通过该定义，双特异性抗体具有两个不同的抗原结合臂(在特异性和CDR序列两者中)，并且对它所结合的每个抗原是一价的。
“CDR”在本文中用于表示抗体可变序列内的“互补决定区”。在重链和轻链可变区的每一个中存在3个CDR，其对每个可变区表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。如本文所使用的术语“CDR组”是指结合抗原的单个可变区中存在的一组3个CDR。根据不同系统，不同地定义了这些CDR的确切界限。Kabat所述的系统(Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1987)and(1991))不仅提供了适用于抗体任何可变区的明确残基编号系统，而且还提供了限定3个CDR的确切残基界限。这些CDR可以称为“KabatCDR”。Chothia及同事(ChothiaandLesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)；和Chothia等人,Nature,342:877-883(1989))发现在KabatCDR内的某些亚部分采用几乎等同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上具有极大多样性。这些亚部分称为“L1”、“L2”和“L3”，或“H1”、“H2”和“H3”，其中“L”和“H”分别表示轻链和重链区。这些区域可以称为“ChothiaCDR”，其具有与KabatCDR重叠的界限。定义与KabatCDR重叠的CDR的其它界限已由Padlan,FASEBJ.,9:133-139(1995)和MacCallum,J.Mol.Biol.,262(5):732-745(1996)描述。另外其它的CDR界限定义可能不严格遵循本文的系统之一，但仍将与KabatCDR重叠，尽管它们依照特定残基或残基组或甚至整个CDR不显著影响抗原结合的预测或实验发现可以是缩短或加长的。本文使用的方法可以利用根据这些系统中的任何一种定义的CDR，尽管某些实施方式使用Kabat或Chothia定义的CDR。
“CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)”在本文中用于表示包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列，但其中VH和/或VL的一个或多个CDR区的序列被另一物种的CDR序列替换的抗体，如具有鼠重链和轻链可变区的抗体，其中一个或多个鼠CDR(例如，CDR3)已被人CDR序列取代。
“嵌合抗体”在本文中用于表示包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列以及来自另一个物种的恒定区序列的抗体，如具有与人、狗、马或猫恒定区连接的鼠重链和轻链可变区的抗体。嵌合抗体包括与来源于特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列等同或同源的部分重链和/或轻链，而所述链的其余部分与来源于另一物种或属于另一种抗体种类或亚类的抗体，以及这些抗体的片段中的相应序列等同或同源，它们显示出了所需的生物活性(参见，例如，美国专利No.4,816,567和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。
“双抗体”在本文中用于表示具有两个抗原结合位点的小抗体片段，这些片段包括连接到相同多肽链中的轻链可变域(VL)的重链可变域(VH)(VH-VL)。通过使用短而允许在相同链的两个结构域间配对的接头，所述结构域不得不与另一条链的互补域配对并产生两个抗原结合位点。
“供体”和“供体抗体”在本文中用于表示提供一个或多个CDR的抗体。供体抗体可以是来自与框架区所获得或所来源的抗体不同的物种的抗体。在人源化抗体的背景中，术语“供体抗体”是指提供一个或多个CDR的非人抗体。在牛源化抗体的背景中，术语“供体抗体”是指提供一个或多个CDR的非牛抗体。在猪源化抗体的背景中，术语“供体抗体”是指提供一个或多个CDR的非猪抗体。在狗源化抗体的背景中，术语“供体抗体”是指提供一个或多个CDR的非狗抗体。在猫源化抗体的背景中，术语“供体抗体”是指提供一个或多个CDR的非猫抗体。在马源化抗体的背景中，术语“供体抗体”是指提供一个或多个CDR的非马抗体。
“双特异性抗体”在本文中用于表示可以在其2个结合臂的每一个中(一对HC/LC)结合2种不同抗原(或表位)的全长抗体(参见PCT专利公开WO02/02773)。因此，双特异性结合蛋白具有2个相同的抗原结合臂，其具有相同的特异性和相同的CDR序列，且对于其结合的每一个抗原是二价的。
“双重可变结构域”在本文中用于表示结合蛋白上的两种或更多种抗原结合位点，其可以是二价(两个抗原结合位点)、四价(四个抗原结合位点)或多价结合蛋白。DVD可以是单特异性的，即能够结合一个抗原(或一个特异性表位)，或多特异性的，即能够结合两个或更多个抗原(即相同靶标抗原分子的两个或更多个表位或不同靶标抗原的两个或更多个表位)。优选的DVD结合蛋白包含两个重链DVD多肽和两个轻链DVD多肽，并被称为“DVD免疫球蛋白”或“DVD-Ig”。因此，这种DVD-Ig结合蛋白是四聚体，并使人想起IgG分子，但是提供了比IgG分子更多的抗原结合位点。因此，四聚体DVD-Ig分子的每一半使人想到了IgG分子的一半，并且包含重链DVD多肽和轻链DVD多肽，但是与提供单个抗原结合域的IgG分子的一对重链和轻链不同，DVD-Ig的一对重链和轻链提供了两个或更多个抗原结合位点。
DVD-Ig结合蛋白的每个抗原结合位点可以来源于供体(“亲代”)单克隆抗体，并因此包含重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)，其中每个抗原结合位点有总计6个CDR参与抗原结合。因此，结合两个不同表位(即两个不同抗原分子的两个不同表位或相同抗原分子的两个不同表位)的DVD-Ig结合蛋白包含来源于第一亲代单克隆抗体的抗原结合位点和第二亲代单克隆抗体的抗原结合位点。
以下文献提供了DVD-Ig结合分子的设计、表达和鉴定的描述：PCT专利公开No.WO2007/024715、美国专利No.7,612,181和Wu等人,NatureBiotech.,25:1290-1297(2007)。这些DVD-Ig分子的优选实例包括：包含结构式VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n的重链，其中VD1是第一重链可变域，VD2是第二重链可变域，C是重链恒定域，X1是接头，但前提条件是它不是CH1，X2是Fc区，并且n为0或1，但优选1；和包含结构式VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n的轻链，其中VD1是第一轻链可变域，VD2是第二轻链可变域，C是轻链恒定域，X1是接头，但前提条件是它不是CH1，并且X2不包括Fc区；并且n为0或1，但优选1。这种DVD-Ig可以包含两条这种重链和两条这种轻链，其中每条链包含串联的可变域，并且在可变区之间没有插入恒定区，其中重链和轻链结合以形成串联的功能性抗原结合位点，并且一对重链和轻链可以与另一对重链和轻链结合以形成具有四个功能性抗原结合位点的四聚体结合蛋白。在另一个实例中，DVD-Ig分子可以包含重链和轻链，其分别包含串联连接的3个可变域(VD1、VD2、VD3)，并且在可变域之间没有插入恒定区，其中一对重链和轻链可以结合以形成3个抗原结合位点，并且其中一对重链和轻链可以与另一对重链和轻链结合以形成具有6个抗原结合位点的四聚体结合蛋白。
在优选的实施方式中，根据本发明的DVD-Ig结合蛋白不但结合其亲代单克隆抗体所结合的相同靶标分子，而且还具有其一个或多个其亲代单克隆抗体的一种或多种所期望的性质。优选地，这种其它性质是一个或多个亲代单克隆抗体的抗体参数。可以有助于来自其一个或多个亲代单克隆抗体的DVD-Ig结合蛋白的抗体参数包括(但不限于)抗原特异性、抗原亲和力、效力、生物学功能、表位识别、蛋白稳定性、蛋白溶解度、产生效率、免疫原性、药物动力学、生物利用率、组织交叉反应性和直系同源抗原结合。
DVD-Ig结合蛋白结合RGMa肽或再生蛋白肽的至少一个表位。DVD-Ig结合蛋白的非限制性实例包括结合RGMa肽或再生蛋白肽的一个或多个表位的DVD-Ig结合蛋白，结合人RGMa肽或再生蛋白肽的表位和另一物种(例如，小鼠)的RGMa肽或再生蛋白肽的表位的DVD-Ig结合蛋白，和结合RGMa肽或再生蛋白肽的表位和另一靶标分子的表位的DVD-Ig结合蛋白。
“表位”或“所关心的表位”表示被识别并且可以结合至其特异性结合伴侣上的互补位点的任何分子上的位点。所述分子和特异性结合伴侣是特异性结合对的一部分。例如，表位可以在多肽、蛋白质、半抗原、糖抗原(如(但不限于)糖脂、糖蛋白或脂多糖)或多糖上。其特异性结合伴侣可以是(但不限于)抗体。
“Fab”在本文中用于表示抗体片段。抗体的木瓜蛋白酶消化产生了称为“Fab”片段的两个相同的抗原结合片段，其分别具有单个抗原结合位点，和残余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理获得了结合交联抗原。Fab片段还含有轻链的恒定域和重链的第一结构域(CH1)。Fab'片段通过在重链CH1域的羧基末端添加一些残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而不同于Fab片段。在本文中，Fab'-SH是指其中恒定域的半胱氨酸具有游离巯基的Fab'。F(ab')2抗体片段最初作为在它们之间具有铰链半胱氨酸的一对Fab'片段产生。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
如本文所使用的“F(ab')2片段”是指通过整个IgG抗体的胃蛋白酶消化以除去大部分Fc区同时保留完整的一些铰链区所产生的抗体。F(ab')2片段具有通过二硫键连接的两个抗原结合F(ab)部分，并因此是二价的，具有约110kDa的分子量。二价抗体片段(F(ab')2片段)小于整个IgG分子，并使得能够更好地渗透到组织中，因此在免疫组织化学中有利于更好的抗原识别。F(ab')2片段的使用还避免了与活细胞上Fc受体或与蛋白A/G的非特异性结合。F(ab')2片段可以结合和沉淀抗原。
如本文所使用的“框架”(FR)或“框架序列”可以表示减去CDR的可变区的剩余序列。由于可以通过不同系统(例如，参见上文)确定CDR序列的确切定义，因此框架序列的含义受到相应不同的理解。6个CDR(轻链的CDR-L1、-L2和-L3和重链的CDR-H1、-H2和-H3)还将轻链和重链上的框架区划分为每条链上的4个亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，并且CDR3位于FR3和FR4之间。未将特定亚区指定为FR1、FR2、FR3或FR4，如其他人所提及的框架区表示单个天然存在的免疫球蛋白链的可变区内的合并的FR。如本文所使用的，单数FR代表4个亚区之一，并且复数FR代表构成框架区的4个亚区中的两个或更多个。
使用本领域中已知的技术，可以用作重链和轻链“受体”框架序列(或简单地，“受体”序列)使非人抗体人源化的人重链和轻链FR序列在本领域是已知的。在一个实施方式中，人重链和轻链受体序列选自公共可用的数据库中所列的框架序列，如V-base(hypertexttransferprotocol://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)或international 信息系统(hypertexttransferprotocol://imgt.cines.fr/texts/IMGTrepertoire/LocusGenes/)。
“Fv”在本文中用于表示含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由一条重链和一条轻链可变域的二聚体组成。
“人抗体”在本文中用于表示具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明公开的人抗体可以在(例如)CDR中包括非人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点突变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，术语“人抗体”不意欲包括其中来源于另一哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已移植到人框架序列的抗体。
“人源化抗体”在本文中用于描述包含来自非人物种(例如，小鼠)的重链和轻链可变区序列，但其中至少部分VH和/或VL序列已改变地更“像人”(即更类似于人种系可变序列)的抗体。“人源化抗体”是抗体或其变体、衍生物、类似物或其片段，其免疫特异性地结合至所关心的抗原并且其包含基本具有人抗体的氨基酸序列的框架(FR)区和基本具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。如本文所使用的，术语“基本”在CDR的背景中是指具有与非人抗体CDR的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的氨基酸序列的CDR。人源化抗体基本包含至少一个，并且通常两个可变域(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)的所有，其中所有或基本所有CDR区对应于非人免疫球蛋白(即，供体抗体)的那些并且所有或基本所有框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。在一个实施方式中，人源化抗体还包含至少部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。在一些实施方式中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变域。抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一些实施方式中，人源化抗体仅含有人源化轻链。在一些实施方式中，人源化抗体仅含有人源化重链。在具体的实施方式中，人源化抗体仅含有人源化轻链的可变域和/或人源化重链。
人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，和任何同种型，无限制地包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可以包含来自不只一个种类或同种型的序列，并且可以使用本领域熟知的技术选择具体的恒定域以优化所需的效应因子功能。
人源化抗体的框架区和CDR不必准确对应于亲代序列，例如，可以通过至少一种氨基酸残基的取代、插入和/或缺失使供体抗体CDR或共有框架突变，从而该位点的CDR或框架残基不对应于供体抗体或共有框架中的任一个。在优选的实施方式中，然而，这种突变不是广泛的。通常，至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％，并且最优选地至少95％的人源化抗体残基将对应于亲代FR和CDR序列的那些。如本文所使用的，术语“共有序列”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。如本文所使用的，术语“共有免疫球蛋白序列”是指由相关免疫球蛋白序列家族中最常出现的氨基酸(或者核苷酸)所形成的序列(参见，例如，Winnaker,FromGenestoClones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,1987))。因此，“共有免疫球蛋白序列”可以包含“共有框架区”和/或“共有CDR”。在免疫球蛋白家族中，该家族中在该位置最常出现的氨基酸占据共有序列中的每个位置。如果两个氨基酸同样常见，则可以在共有序列中包含任一个。
“高变区”在本文中用于表示导致抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自轻链可变域和重链可变域中的“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基，如Kabat等人,第5版.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991)所定义的和/或ChothiaandLesk,Mol.Biol.196:901-917(1987)所定义的和/或Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:9268-9272(1989)作为“AbM环”所定义的和/或Lefranc等人,NucleicAcidsRes.,27:209-212(1999)所定义的，在国际ImMunoGeneTics信息系统数据库中。“框架”或“FR”残基是除本文中所定义的高变区残基之外的那些可变域残基。
如本文所使用的，在两条或更多条多肽或多核苷酸序列的背景中，“同一的”或“同一性”可以表示与指定区域相比，序列具有指定的相同残基的百分比。可以通过以下方法计算百分比：最优比对两条序列，将两条序列于指定区域相比较，确定两个序列中存在相同残基的位置数以获得匹配位置数，将匹配位置数除以指定区域中的位置总数，并将结果乘以100以获得序列同一性百分比。如果两条序列具有不同长度或者比对产生了一个或多个交错末端并且指定比较区域仅包含单一序列，则单一序列的残基包含在计算的分母而不是分子中。
“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中可互换使用。本领域承认的这些术语是指编号氨基酸残基的系统，其比抗体重链和轻链可变区或其抗原结合部分中其它氨基酸残基更可变(即高变)(Kabat等人,Ann.NYAcad.Sci.,190:382-391(1971)和Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242(1991))。对于重链可变区，高变区对于CDR1为氨基酸位置31至35，对于CDR2为氨基酸位置50至65，对于CDR3为氨基酸位置95至102。对于轻链可变区，高变区对于CDR1为氨基酸位置24至34，对于CDR2为氨基酸位置50至56，对于CDR3为氨基酸位置89至97。
如本文所使用的“脂筏”是指含有富集量的胆固醇(例如，与膜其它区域相比)的细胞膜的微域。在一些实施方式中，富集是大于2倍。在其它实施方式中，富集是大于3倍。在其它实施方式中，富集是大于4倍。在其它实施方式中，富集是与膜的其他区域相比，大于5倍更多的胆固醇。
如本文所使用的“单克隆抗体”是指得自基本均一的抗体群体的抗体，即除了可以少量存在的可能的天然突变之外，组成所述群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异的，并且针对单个抗原。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。在本文中，单克隆抗体具体包括其中部分重链和/或轻链与来源于特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的其余部分与来源于另一物种或属于另一种抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源的“嵌合”抗体，以及这些抗体的片段，只要它们显示出所需的生物活性。
如本文所使用的，“药物可用的载体”包括任何和所有生理学相容的溶剂、分散媒介、涂层、抗菌剂(抗细菌剂)和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药物可用的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合中的一种或多种。在多数情况下，优选地在组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇，如甘露糖醇、山梨糖醇，或氯化钠。药物可用的载体还可以包括少量的助剂物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其提高抗体或抗体部分的货架期(保质期，shelflife)或有效性。
如本文所使用的“多核苷酸”是指两个或更多个核苷酸的多聚形式，所述核苷酸是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，或者任一种类型的核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的DNA。术语“分离的多核苷酸”应表示根据其来源，所述“分离的多核苷酸”不与所述“分离的多核苷酸”在自然界中一起存在的全部或部分多核苷酸结合；与在自然界中不连接的多核苷酸操作性地连接；或者在自然界中不作为较大序列的一部分存在的(例如，基因组、cDNA或合成来源或它们的一些组合)的多核苷酸。
如本文所使用的“多肽”是指氨基酸的任何聚合链。术语“肽”和“蛋白质”是与术语多肽可互换地使用的，并且也表示氨基酸的聚合链。术语“多肽”涵盖了天然或人造蛋白、蛋白片段和蛋白序列的多肽类似物。多肽可以是单体或聚合物。
“重组抗体”表示通过一个或多个步骤制备的抗体，其包括通过重组技术将编码一个或多个单克隆抗体的全部或部分的核酸序列克隆到适当的表达载体中，并随后在适当的宿主细胞中表达所述抗体。该术语包括(但不限于)重组产生的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体(完全或部分人源化)、从抗体片段形成的多特异性或多价结构、双功能抗体、异源结合Ab、DVD-及如(i)本文中所述的其它抗体。(在Wu,C.等人,NatureBiotechnology,25:1290-1297(2007)中描述了双可变域免疫球蛋白及其制备方法)。如本文所使用的术语“双功能抗体”是指包含对一个抗原性位点具有特异性的第一臂和对不同抗原性位点具有特异性的第二臂的抗体，即所述双功能抗体具有双特异性。
如本文所使用的“单链Fv”或“scFv”是指包含抗体VH和VL域的抗体片段，其中这些域以单多肽链存在。一般地，Fv多肽还包含VH和VL域之间的多肽接头，它使得scFv能够形成抗原结合所需的结构。对于scFv的综述，参见，PluckthunintheThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113,RosenburgandMooreeds.Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)。
如本文所使用的“受试者”和“患者”可互换地表示任何脊椎动物，其包括(但不限于)哺乳动物(例如，牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠，非人灵长类(例如，猴，如食蟹猴或恒河猴、黑猩猩等)和人)。在一些实施方式中，所述受试者可以是人或非人。所述受试者或患者可以经历其它治疗形式。
如本文所使用的“治疗有效量”是指以所必需的剂量和时间段，对实现所期望的治疗结果有效的量。治疗有效量可以是足以降低或改善病症或其一种或多种症状的严重性和/或持续时间，防止疾病发展，导致疾病消退、预防与病症有关的一种或多种症状的复发、发展、发病或进展，检测病症或者提高或改善另一种疗法(例如，预防或治疗剂)的预防或治疗效果的疗法的量和/或持续时间。本领域技术人员可以确定抗体或抗体部分的治疗有效量，并且治疗有效量可以根据以下因素改变，如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及抗体或抗体部分在个体中引起所期望的反应的能力。治疗有效量还是其中与治疗有益作用相比，抗体或抗体部分的任何毒性或不利作用是微不足道的量。
“治疗”用于描述应用该术语的疾病的发病或发展的逆转、减轻或抑制，或者这种疾病的一种或多种症状的逆转、减轻或抑制。根据受试者的状况，该术语还表示预防疾病，并且包括预防疾病的发病或预防与疾病有关的一种或多种症状。可以以急性或慢性方式进行治疗。该术语还表示在经受疾病或其症状之前，减轻疾病或与该疾病有关的症状的严重性。在经受病痛之前的预防或减轻疾病或其症状的严重性是指向施用时未经受所述疾病或其症状的受试者施用本发明的试剂或药物组合物。“预防”还表示预防疾病或与这种疾病有关的一种或多种症状的复发。由于以上定义了“治疗”，因此“治疗”和“治疗性地”是指治疗操作。
“变体”在本文中用于描述通过氨基酸的插入、缺失或保守取代而具有不同氨基酸序列，但保留了至少一种生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性实例包括被特异性抗体结合或促进免疫应答的能力。变体在本文中还用于描述氨基酸序列与具有保留了至少一种生物活性的氨基酸序列的参考蛋白基本相同的蛋白。在本领域中，认为氨基酸的保守取代(即用具有类似性质(例如，亲水性、程度和带电区域分布)的不同氨基酸替换氨基酸)通常包括微小改变。如本领域所理解的，可以(部分地)通过考虑氨基酸的亲水性指数来鉴别这些微小改变。Kyte等人,J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲水性指数基于其疏水性和电荷的考虑。在本领域中，已知可以取代具有类似亲水性指数的氨基酸并仍保留蛋白质功能。在一个方面，取代亲水性指数为±2的氨基酸。氨基酸的亲水性还可以用于揭示将导致蛋白质保留生物学功能的取代。在肽的背景中，氨基酸亲水性的考虑使得能够计算肽的最大局部平均亲水性，这是已报道与抗原性和免疫原性很好相关的有用量度。美国专利No.4,554,101，其作为参考完全并入本文。具有类似亲水性值的氨基酸的取代可以导致产生保留生物活性，例如，免疫原性的肽，如本领域所理解的。可以用彼此的亲水性值在±2的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值两者受氨基酸特定侧链的影响。与观察结果一致，应理解与生物学功能相容的氨基酸取代依赖于氨基酸的相对相似性，并且具体地，那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小及其它性质所揭示的。“变体”还可以用于描述已差异处理，如通过蛋白水解、磷酸化或其它翻译后修饰，但仍保留其抗原反应性的多肽或其片段。
如本文所使用的“游标区(vernierzone)”是指可以调节CDR结构并微调对抗原的适合度的框架残基的亚型，如FooteandWinter所述(1992,J.Mol.Biol.224:487-499，该文献作为参考并入本文)。游标区残基在CDR下方形成层，并可以影响CDR的结构和抗体的亲和力。
对于本文中数值范围的列举，明确考虑了在它们之间具有相同精度的每个居间数值。例如，对于6-9的范围，除了6和9之外，还考虑了数值7和8，并且对于范围6.0-7.0，明确考虑了数值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
2.调节神经元细胞存活和轴突生长和/或再生的方法
本文提供了调节神经元细胞存活和轴突生长和/或再生的方法。调节可以包括改变(例如，阻断或破坏)反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用和/或破坏脂筏的完整性。
在一个实施方式中，所调节的为对其有需要的受试者中RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用。以下更详细地描述了所述RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用。调节方法可以破坏这种顺式相互作用。调节方法可以阻断这种顺式相互作用。
破坏或阻断顺式相互作用可以促进神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。破坏或阻断顺式相互作用可以通过调节再生蛋白受体的招募来促进神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。神经元细胞可以是(但不限于)视网膜神经节细胞(RGC)、运动神经元、海马细胞、皮质细胞、感光细胞和脊柱神经元。
调节方法可以包括向受试者施用试剂。这种试剂可以破坏顺式相互作用。这种试剂可以阻断顺式相互作用。因此，通过破坏或阻断顺式相互作用，所述试剂可以促进神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。
在另一个实施方式中，所调节的是脂筏的完整性。调节方法可以破坏脂筏。调节方法可以降低脂筏内胆固醇的水平，这可以破坏脂筏。破坏脂筏或降低脂筏内的胆固醇水平可以影响招募，这反过来可以促进神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。
调节脂筏完整性的方法可以包括向受试者施用试剂。这种试剂可以破坏脂筏和/或降低脂筏内的胆固醇水平。因此，破坏脂筏和/或降低脂筏内胆固醇水平可以影响RGMa和再生蛋白之间顺式相互作用的能力。另外，破坏脂筏和/或降低脂筏内胆固醇水平还可以影响RGMa和再生蛋白之间反式相互作用的能力和/或影响RGMa和再生蛋白之间反式相互作用的能力以抑制轴突生长。通过这些试剂破坏脂筏和/或降低脂筏内的胆固醇水平可以促进神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。
这些调节方法可以在治疗对其有需要的受试者的方法中使用，如下文更详细地描述的。
a.RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用和脂筏破环
所述方法可以调节RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用和/或脂筏。
RGMa是33kDa的糖基磷脂酰肌醇(GPI)-连接的膜糖蛋白。全长RGMa蛋白含有N末端信号肽、RGD基序、部分血管性血友病因子(vWF)D型结构域(partialvonWillebrandfactortypeDdomain)、疏水性区和C末端GPI-锚着点。切割RGMa以产生多个RGMa肽，其中一些是膜结合的，其中一些是可溶性的，并且其中一些是通过二硫键连接的。例如，切割可以包括自溶，其中所产生的N末端(N-RGMa)和C末端(C-RGMa)结构域可以通过二硫键连接。切割还可以包括酶弗林蛋白酶-1(Furin-1)，其从RGMa释放可溶性N末端肽并使切割位点脱落。
开始，RGMa被鉴别为结合再生蛋白的视网膜轴突的化学排斥分子(chemorepulsivemolecule)。再生蛋白是免疫球蛋白跨膜受体超家族的成员，并且包含4个N末端免疫球蛋白样结构域，6个纤连蛋白结构域、跨膜结构域和C末端结构域。
RGMa和再生蛋白一起在视觉系统发育中调节轴突导向并且在脑发育中调节轴突束导向。具体地，RGMa和再生蛋白之间的反式相互作用在中枢神经系统(CNS)发育和受损CNS中抑制轴突生长和/或再生。在这种反式相互作用中，通过神经元周围的细胞分泌RGMa肽并且所分泌的RGMa肽与表面神经元上的再生蛋白相互作用。RGMa和再生蛋白之间的这种反式相互作用还促进细胞存活。在不存在这种反式相互作用的情况下，再生蛋白诱导细胞死亡，即细胞凋亡。因此，再生蛋白是依赖性受体，其在存在所述反式相互作用的情况下发出信号以促进细胞存活，但是在不存在所述反式相互作用的情况下发出信号以诱导细胞死亡。
如本文所表明的，通过RGMa和再生蛋白之间发生的顺式相互作用介导发出信号诱导细胞死亡的再生蛋白。这种顺式相互作用发生在RGMa和与相同神经元细胞质膜结合的再生蛋白之间。具体地，这种顺式相互作用有利于再生蛋白向神经元细胞膜中的脂筏招募。脂筏是膜内的微域，其富含胆固醇。破坏脂筏和/或阻断或破坏所述顺式相互作用调节再生蛋白向脂筏的招募，借此防止或降低由于再生蛋白发出信号所导致的细胞死亡。
本文还表明除了RGMa和再生蛋白之间的反式相互作用之外，需要这种RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用来抑制轴突生长和/或再生。因此，即使发生反式相互作用，阻断或破坏顺式相互作用能防止再生蛋白向脂筏的招募和/或能从脂筏除去再生蛋白，借此防止或降低对由于再生蛋白发出信号所造成的轴突生长和/或再生的抑制。
如本文进一步表明的，如下文更详细地描述的，通过用降胆固醇试剂除去胆固醇来破环脂筏防止或减少(1)细胞死亡和(2)对由于再生蛋白发出信号所导致的轴突生长和/或再生的抑制。假定由于脂筏中需要存在再生蛋白来发出信号，因此发生了这种防止或降低。
照此，本文表明可以通过以下方式抑制或阻断再生蛋白发出信号：(1)用降胆固醇试剂破环脂筏和/或(2)阻断或破坏RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用。
本文还表明通过不同部分的RGMa和再生蛋白调节反式和顺式相互作用。通过再生蛋白的6个纤连蛋白结构域(本文还称为“再生蛋白的6FNIII结构域”或“6FNIII结构域”)调节RGMa和再生蛋白之间的反式相互作用。通过RGMa的氨基酸28至73(本文还称为“N-筏”)和再生蛋白的4个免疫球蛋白样结构域(本文还称为“再生蛋白的4Ig结构域”或“4Ig”)调节RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用。骨形态发生蛋白(BMP)也有利于RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用，并因此再生蛋白向脂筏的招募还需要BMP。
本文还表明N-筏部分足以满足顺式相互作用。这些部分为RGMa的氨基酸54至73和40至62，但不是RGMa的氨基酸28至54或54至62。这种谱图表明RGMa的氨基酸40至73可以足以满足顺式相互作用。相反，全长RGMa不能与再生蛋白的6FNIII结构域相互作用。总地来说，这表明顺式相互作用可能取决于RGMa的折叠结构。对于RGMa和再生蛋白之间发生顺式相互作用来说，全长RGMa可能需要其它因子，如BMP，以暴露RGMa上的4Ig结合位点(即，被RGMa的氨基酸28至73、54至73、40至62和40至73所包含)。
b.试剂
如上所述，所述方法可以通过向受试者施用试剂来调节RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用和/或破坏脂筏。所述试剂可以破坏或阻断顺式相互作用，并因此促进神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。所述试剂还可以破坏脂筏，包括降低脂筏内的胆固醇水平，这反过来促进了神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。所述试剂可以是抗体、肽试剂、降胆固醇试剂或它们的任意组合。以下更详细地描述了抗体、肽试剂和降胆固醇试剂。
(1)肽试剂
所述方法可以通过向受试者施用肽试剂来调节RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用。所述肽试剂可以破坏或阻断顺式相互作用，并因此促进神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。所述肽试剂可以是RGMa肽、再生蛋白肽、诺金肽(Nogginpeptide)、它们的片段、它们的变体或它们的任意组合。以下更详细地描述了RGMa肽、再生蛋白肽和诺金肽。
(a)再生蛋白肽
所述方法可以通过向受试者施用再生蛋白肽来调节RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用。所述再生蛋白肽可以破坏或阻断顺式相互作用，并因此促进神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。
所述再生蛋白肽可以包括再生蛋白片段、再生蛋白变体或它们的任意组合。所述再生蛋白肽可以包括再生蛋白的2个免疫球蛋白样结构域、它们的片段、它们的变体或它们的任意组合。再生蛋白肽可以包括再生蛋白的3个免疫球蛋白样结构域、它们的片段、它们的变体或它们的任意组合。再生蛋白肽可以包括再生蛋白的4个免疫球蛋白样结构域、它们的片段、它们的变体或它们的任意组合。再生蛋白的4个免疫球蛋白样结构域在本文中还可以称为再生蛋白的4Ig结构域。因此，再生蛋白肽可以包括4Ig结构域、它们的片段、它们的变体或它们的任意组合。
再生蛋白肽可以包括包含登录号No.AAC59662(SEQIDNO:1)的氨基酸1至383的氨基酸序列。再生蛋白肽可以包括与包含登录号No.AAC59662(SEQIDNO:1)的氨基酸1至383的氨基酸序列具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的氨基酸序列。再生蛋白肽可以是登录号No.AAC59662(SEQIDNO:1)的氨基酸1至383、其片段、其变体或它们的任意组合。
再生蛋白肽可以包括包含登录号No.AAI43272(SEQIDNO:11)的氨基酸1至417的氨基酸序列。再生蛋白肽可以包括与包含登录号No.AAI43272(SEQIDNO:11)的氨基酸1至417的氨基酸序列具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的氨基酸序列。再生蛋白肽可以是登录号No.AAI43272(SEQIDNO:11)的氨基酸1至417、其片段、其变体或它们的任意组合。
再生蛋白肽可以包括SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、其片段、其变体或它们的任意组合。再生蛋白肽可以包括与SEQIDNO:8所示的氨基酸序列具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的氨基酸序列。再生蛋白肽可以是SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。
(b)RGMa肽
所述方法可以通过向受试者施用RGMa肽来调节RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用。所述RGMa肽可以破坏或阻断顺式相互作用，并因此促进神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。
所述RGMa肽可以包括RGMa片段、RGMa变体或它们的任意组合。RGMa肽可以是与再生蛋白的4Ig结构域相互作用的任何RGMa片段。RGMa肽可以含有RGMa和再生蛋白之间发生顺式相互作用可能需要的任何二级结构。
RGMa肽可以包括SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、其片段、其变体或它们的任意组合。RGMa肽可以包括与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的氨基酸序列。RGMa肽可以是SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。SEQIDNO:2所示的氨基酸序列在本文中还可以称为“N-筏”。图16显示了SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，并且是RGMa的氨基酸28至73。
RGMa肽可以包括SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、其片段、其变体或它们的任意组合。RGMa肽可以包括与SEQIDNO:3所示的氨基酸序列具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的氨基酸序列。RGMa肽可以是SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。SEQIDNO:3所示的氨基酸序列可以是RGMa的氨基酸54至73。
RGMa肽可以包括SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、其片段、其变体或它们的任意组合。RGMa肽可以包括与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的氨基酸序列。RGMa肽可以是SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。SEQIDNO:4所示的氨基酸序列可以是RGMa的氨基酸40至62。
RGMa肽可以包括SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、其片段、其变体或它们的任意组合。RGMa肽可以包括与SEQIDNO:7所示的氨基酸序列具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的氨基酸序列。RGMa肽可以是SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。SEQIDNO:7所示的氨基酸序列可以是RGMa的氨基酸40至73。
RGMa肽可以包括SEQIDNO:10所示的氨基酸序列、其片段、其变体或它们的任意组合。RGMa肽可以包括与SEQIDNO:10所示的氨基酸序列具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的氨基酸序列。RGMa肽可以是SEQIDNO:10所示的氨基酸序列。
与RGMa肽作用类似(即阻断或破坏RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用)的肽可以包括来自RGMc的肽。这种RGMc肽可以包括SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、其片段、其变体或它们的任意组合。RGMc肽可以包括与SEQIDNO:9所示的氨基酸序列具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的氨基酸序列。RGMc肽可以是SEQIDNO:9所示的氨基酸序列。
(c)诺金(Noggin)
所述方法可以通过向受试者施用诺金肽来调节RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用。所述诺金肽可以破坏或阻断顺式相互作用，并因此促进神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。
诺金肽可以包括诺金片段、诺金变体或它们的任意组合。诺金肽可以包括登录号No.AAA83259所示的氨基酸序列(SEQIDNO:5)。诺金肽可以包括与登录号No.AAA83259所示的氨基酸序列(SEQIDNO:5)具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的氨基酸序列。诺金肽可以是登录号No.AAA83259所示的氨基酸序列(SEQIDNO:5)。
(2)降胆固醇试剂
所述方法可以通过向受试者施用降胆固醇试剂来调节RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用。所述降胆固醇试剂可以破坏脂筏和/或防止或阻断顺式相互作用，并因此促进神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。
降胆固醇试剂可以是(但不限于)甲基-β-环糊精(MβCD)、胆固醇氧化酶(CO)、AY-9944、抑制素、枯草溶菌素9(subtisilin/kexintype9，PCK9)抑制剂、制霉菌素、非律平、前蛋白转化酶、BM15.766、烷基磷脂类似物(例如，米替福新、依地福新和哌立福新)或它们的任意组合。
(3)抗体
所述方法可以通过向受试者施用抗体来调节RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用。所述抗体可以破坏或阻断顺式相互作用，并因此促进神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。
所述抗体可以抗如上所述的RGMa肽。该RGMa肽含有RGMa和再生蛋白之间发生顺式相互作用可能需要的任何二级结构。因此，抗RGMa肽抗体可以特异性识别并选择性结合这种二级结构。
在一些实施方式中，抗体可以特异性识别并选择性结合SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，SEQIDNO:3所示的氨基酸序列，SEQIDNO:4所示的氨基酸序列，SEQIDNO:7所示的氨基酸序列，SEQIDNO:9所示的氨基酸序列和/或SEQIDNO:10所示的氨基酸序列。所述抗体可以特异性识别并选择性结合RGMa的氨基酸28至73，40至62，54至73和/或40至73。
在其它实施方式中，抗体可以抗如上所述的再生蛋白肽，例如，再生蛋白的4Ig结构域或者再生蛋白的胞外部分。抗体可以特异性识别并选择性结合再生蛋白的4Ig结构域。抗体可以特异性识别并选择性结合登录号No.AAC59662(SEQIDNO:1)的氨基酸1至383，登录号No.AAI43272(SEQIDNO:11)的氨基酸1至417和/或SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。
(a)抗体制备/生产
可以通过任何多种技术制备抗体。一般说来，可以通过细胞培养技术产生抗体，其包括通过常规方法或通过抗体基因、重链和/或轻链转染到适合的细菌或哺乳动物细胞宿主中以允许抗体产生来产生单克隆抗体，其中所述抗体可以是重组的。术语“转染”的多种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的多种技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管有可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是真核细胞中抗体的表达是优选的，并且哺乳动物宿主细胞中的表达是最优选，因为这种真核细胞(并且具体地，哺乳动物细胞)比原核细胞更可能组装并分泌适当折叠且具有免疫活性的抗体。
表达本发明的重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括与DHFR可选择标志物一起使用(例如，如KaufmanandSharp,J.Mol.Biol.,159:601-621(1982)中所述)的中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，在UrlaubandChasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216-4220(1980)中有描述)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以在宿主细胞中表达抗体的一段时间，或者更优选地，足以使抗体分泌到宿主细胞所生长的培养基中的一段时间来产生抗体。可以使用标准蛋白纯化方法从培养基回收抗体。
宿主细胞还可以用于产生功能性抗体片段，如Fab片段或scFv分子。将理解上述程序的改变是在本发明的范围内的。例如，可以期望用编码本发明抗体的轻链和/或重链的功能性片段的DNA转染宿主细胞。DNA重组技术还可以用于除去一些或全部编码不是结合所关心的抗原所必需的轻链和重链之一或两者的DNA。从这种截短的DNA分子表达的分子也涵盖在本发明的抗体之内。另外，通过标准化学交联方法，可以将本发明的抗体交联至第二抗体来产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体(即，结合RGMa肽或再生蛋白肽)，并且另一条重链和轻链对RGMa肽或再生蛋白肽之外的抗原是特异的。
在本发明优选的抗体或其抗原结合部分的重组表达系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链两者的重组表达载体引入到dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体内，抗体重链和轻链基因分别操作性连接至CMV增强子/AdMLP启动子调控元件以驱动基因高水平转录。重组表达载体还具有DHFR基因，其使得能够使用甲氨蝶呤选择/扩增来筛选已被载体转染的CHO细胞。培养所选的转化体宿主细胞以使其表达抗体重链和轻链，并从培养基回收完整的抗体。使用标准分子生物学技术制备重组表达载体，转染宿主细胞，筛选转化体，培养宿主细胞并从培养基回收抗体。更进一步，本发明提供了通过在适合的培养基中培养本发明的宿主细胞直至合成了本发明的重组抗体为止来合成本发明的重组抗体的方法。所述方法还可以包括从培养基分离重组抗体。
制备单克隆抗体的方法包括制备能够产生具有所需特异性的抗体的永生细胞系。这些细胞系可以从得自免疫动物的脾细胞产生。可以使用RGMa肽或再生蛋白肽或其片段和/或变体免疫动物。用于免疫动物的肽可以包括编码人Fc的氨基酸，例如，人抗体的可结晶片段区或尾区。然后，可以通过(例如)与骨髓瘤细胞融合伴侣融合使脾细胞永生。可以使用多种融合技术。例如，可以将脾细胞和骨髓瘤细胞与非离子型洗涤剂混合几分钟，然后以低密度在支持杂交细胞生长但不支持骨髓瘤细胞生长的选择培养基上铺板。一种这种技术使用了次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷(HAT)选择。另一种技术包括电融合。在足够的时间后，通常约1至2周，观察到杂交集落(杂合体集落，coloniesofhybrids)。选择单个集落，并测试它们的培养上清液对多肽的结合活性。可以使用具有高反应性和特异性的杂交瘤。
单克隆抗体可以分离自生长杂交瘤集落的上清液。另外，可以使用多种技术以提高得率，如将杂交瘤细胞系注射到适合的脊椎动物宿主(如小鼠)的腹膜腔中。然后，可以从腹水液或血液收获单克隆抗体。可以通过常规方法，如色谱法、凝胶过滤、沉淀和提取从抗体除去污染物。亲和色谱法是可以在抗体纯化方法中使用的方法的实例。
蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子以获得一些片段，其中两个(F(ab)片段)分别包含含有完整抗原结合位点的共价杂二聚物。酶胃蛋白酶能够切割IgG分子以提供一些片段，其包含含有两个抗原结合位点的F(ab')2片段。
可以通过IgM的优选蛋白水解切割，并且偶尔对IgG或IgA免疫球蛋白分子水解切割来产生Fv片段。可以使用重组技术获得Fv片段。Fv片段包括非共价VH::VL杂二聚物，其包含保留了天然抗体分子的大部分抗原识别和结合能力的抗原结合位点。
抗体、抗体片段或衍生物可以包括重链和轻链互补决定区(“CDR”)组，其分别插入对CDR提供支持并且限定CDR彼此之间空间关系的重链和轻链框架(“FR”)组之间。DR组可以含有重链或轻链V区的3个高变区。从重链或轻链的N-末端出发，这些区域分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点可以包含6个CDR，其包含来自每个重链和轻链V区的CDR组。包含单个CDR(例如，CDR1、CDR2或CDR3)的多肽可以称为“分子识别单元”。抗原抗体复合物的晶体分析表明CDR的氨基酸残基与结合的抗原形成广泛接触，其中最广泛的抗原触点是与重链CDR3的接触。因此，分子识别单元可以主要负责抗原结合位点的特异性。一般说来，CDR残基直接并且最显著地参与影响抗原结合。
可以使用产生或分离具有必要特异性的抗体的其它适合方法，其包括(但不限于)，使用本领域已知的方法，从肽或蛋白质文库(例如，但不限于，噬菌体、核糖体、寡核苷酸、RNA、cDNA、酵母等展示文库)选择重组抗体的方法；例如，如从多个商品化厂家可获得的文库，所述厂家如CambridgeAntibodyTechnologies(Cambridgeshire,UK)、MorphoSys(Martinsreid/Planegg,Del.)、Biovation(Aberdeen,Scotland,UK)、BioInvent(Lund,Sweden)。参见美国专利No.4,704,692；5,723,323；5,763,192；5,814,476；5,817,483；5,824,514；5,976,862。替代方法依赖于能够产生人抗体全部集合的转基因动物(例如，SCID小鼠，Nguyen等人(1997)Microbiol.Immunol.41:901-907；Sandhu等人(1996)Crit.Rev.Biotechnol.16:95-118；Eren等人(1998)Immunol.93:154-161)的免疫，如本领域中已知的和/或如本文所述的。这些技术包括(但不限于)核糖体展示(Hanes等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:4937-4942；Hanes等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:14130-14135)；单细胞抗体产生技术(例如，选定的淋巴细胞抗体法(selectedlymphocyteantibodymethod，“SLAM”))(美国专利No.5,627,052,Wen等人(1987)J.Immunol.17:887-892；Babcook等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:7843-7848)；凝胶微滴和流式细胞术(Powell等人(1990)Biotechnol.8:333-337)；单细胞系统(OneCellSystems)(Cambridge,Mass)；Gray等人(1995)J.Imm.Meth.182:155-163；Kenny等人(1995)Bio/Technol.13:787-790)；B细胞选择(Steenbakkers等人(1994)Molec.Biol.Reports19:125-134(1994))。
可以通过本领域中已知的一些程序中的任一种产生亲和成熟抗体。例如，参见Marks等人,BioTechnology,10:779-783(1992)描述了通过VH和VL域基因改组(shuffling)的亲和力成熟。在以下文献中描述了CDR和/或框架残基的随机突变：Barbas等人,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,91:3809-3813(1994)；Schier等人,Gene,169:147-155(1995)；Yelton等人,J.Immunol.,155:1994-2004(1995)；Jackson等人,J.Immunol.,154(7):3310-3319(1995)；Hawkins等人,J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)。美国专利No.6,914,128B1描述了在选择性突变位置以及在具有提高活性的氨基酸残基的接触或高变位置的选择性突变。
还可以使用将编码本发明的抗体的多核苷酸递送至适合的宿主，从而提供在它们的乳汁中产生这些抗体的转基因动物或哺乳动物，如山羊、牛、马、绵羊等来制备本发明的抗体变体。这些方法在本领域中是已知的并且，例如，在美国专利No.5,827,690；5,849,992；4,873,316；5,849,992；5,994,616；5,565,362；和5,304,489中描述。
还可以通过递送本发明的多核苷酸来制备抗体变体以提供在植物部分或从中所培养的细胞中产生该类抗体、指定部分或变体的转基因植物和培养的植物细胞(例如，但不限于烟草、玉米和浮萍)。例如：Cramer等人(1999)Curr.Top.Microbol.Immunol.240:95-118和其中引用的参考文献描述了(例如)使用诱导型启动子表达大量重组蛋白的转基因烟草叶片的产生。转基因玉米已用于以大规模生产水平表达哺乳动物蛋白，其生物活性相当于其它重组系统中产生的或从天然来源纯化的那些。参见，例如，Hood等人,Adv.Exp.Med.Biol.(1999)464:127-147和其中引用的参考文献。还从转基因植物种子中大量生产了抗体变体，其包括抗体片段，如单链抗体(scFv)，包括烟草种子和马铃薯块茎。参见，例如，Conrad等人(1998)PlantMol.Biol.38:101-109和其中引用的参考文献。因此，根据已知方法，还可以使用转基因植物生产本发明的抗体。
可以(例如)通过加入外源序列来产生抗体衍生物以改变免疫原性或降低、提高或改变结合、亲和力、结合速率(on-rate)、解离速率(off-rate)、亲和性(avidity)、特异性、半衰期或任何其它适合的特性。通常，维持部分或全部非人或人CDR序列，同时可变区和恒定区的非人序列被人或其它氨基酸取代。
小抗体片段可以是具有两个抗原结合位点的双抗体，其中这些片段包括连接到相同多肽链中的轻链可变域(VL)的重链可变域(VH)(VHVL)。参见，例如，EP404,097；WO93/11161；和Hollinger等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448。通过使用太短了以至于不允许在相同链的两个结构域间配对的接头，所述结构域不得不与另一条链的互补域配对并产生两个抗原结合位点。也参见，美国专利No.6,632,926(Chen等人)，该专利以其全部内容作为参考并入本文，并且该专利公开了抗体变体，其具有在亲本抗体高变区中插入的一个或多个氨基酸并且对靶标抗原的结合亲和力比亲本抗体对所述抗原的结合亲和力至少约两倍更强。
所述抗体可以是线性抗体。制备线性抗体的程序在本领域中是已知的并在Zapata等人(1995)ProteinEng.8(10):1057-1062中有描述。简要地，这些抗体包含一对串联的Fd部分(VH-CH1-VH-CH1)，其形成了一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。
可以通过已知方法从重组细胞培养物中回收和纯化抗体，所述方法包括(但不限于)蛋白A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水性相互作用色谱法、亲和色谱法、羟基磷灰石色谱法和凝集素色谱法。高效液相色谱法(“HPLC”)也可以用于纯化。
它对于检测或治疗性标记抗体是有用的。将抗体结合至这些试剂的方法在本领域中是已知的。仅出于说明的目的，可以用可检测部分标记抗体，如放射性原子、发色团、荧光团等。这些标记的抗体可以用于体内或对分离的测试样品的诊断技术。抗体还可以结合至(例如)药物试剂，如化学治疗药物或毒素。它们可以连接至细胞因子、配体、另一种抗体。适合于偶联至抗体以实现抗肿瘤作用的试剂包括细胞因子，如白介素2(IL-2)和肿瘤坏死因子(TNF)；光敏剂，用于在光动力学疗法中使用，包括四磺酸酞菁铝(III)、血卟啉和酞菁；放射性核素，如碘-131(131I)、钇-90(90Y)、铋-212(212Bi)、铋-213(213Bi)、锝-99m(99mTc)、铼-186(186Re)和铼-188(188Re)；抗生素，如多柔比星、亚德里亚霉素、柔红霉素、甲氨蝶呤、道诺霉素、新制癌菌素和卡铂；细菌、植物及其它毒素，如白喉毒素、假单胞菌属外毒素A、葡萄球菌肠毒素A、相思豆毒蛋白-A毒素、蓖麻毒A(去糖基化的蓖麻毒A和天然蓖麻毒A)、TGF-α毒素、来自中华眼镜蛇(najanajaatra)的细胞毒素和白树毒素(植物毒素)；来自植物、细菌和真菌的核糖体失活蛋白，如局限曲菌素(通过局限曲霉(Aspergillusrestrictus)产生的核糖体失活蛋白)、肥皂草素(来自肥皂草(Saponariaofficinalis)的核糖体失活蛋白)和RNA酶；酪氨酸激酶抑制剂；ly207702(二氟化嘌呤核苷)；含有抗囊性试剂(anticysticagents)的脂质体(例如，反义寡核苷酸、质粒，其编码毒素、甲氨蝶呤等)；和其它抗体或抗体片段，如F(ab)。
可以通过重组或合成方法对抗体测序和重复。还可以对它们进一步测序至编码它们的核苷酸线性序列。因此，本发明单独或与如上所述的载体(carrier)、载体(vector)或宿主细胞组合提供了这些多核苷酸，其编码了本发明的抗体的序列。
以下更详细地描述了通过使用杂交瘤技术、选定的淋巴细胞抗体法(SLAM)、转基因动物和重组抗体文库的抗体产生。
(a)使用杂交瘤技术的抗RGMa肽或再生蛋白肽抗体
可以使用本领域中已知的多种技术制备单克隆抗体，包括杂交瘤技术、重组技术和噬菌体展示技术或它们的组合的使用。例如，可以使用杂交瘤技术产生单克隆抗体，所述技术包括本领域中已知的并在例如以下文献中教导的那些：Harlow等人,Antibodies:ALaboratoryManual,第2版(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,1988)；Hammerling等人,InMonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas(Elsevier,N.Y.,1981)。还应注意如本文所使用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指来源于单个克隆的抗体，包括任何真核、原核或噬菌体克隆，但不包括产生它的方法。
在一个实施方式中，本发明提供了产生单克隆抗体的方法以及通过所述方法产生的抗体。所述方法可以包括培养分泌本发明的抗体的杂交瘤细胞，其中，优选地，所述杂交瘤是通过以下方式产生的：将分离自RGMa肽或再生蛋白肽免疫的动物(例如，大鼠或小鼠)的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后对由融合所产生的杂交瘤筛选分泌能够结合本发明的多肽的抗体的杂交瘤克隆。简要地，可以用RGMa肽或再生蛋白肽免疫大鼠。在优选的实施方式中，将RGMa肽或再生蛋白肽与佐剂一起施用来刺激免疫应答。这种佐剂包括完全或弗氏不完全佐剂，RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合物)。这类佐剂可以通过将其隔离在局部沉积物中来保护多肽不会快速分散，或者它们可以含有刺激宿主分泌对巨噬细胞及免疫系统的其它成分具有趋化性的因子的物质。优选地，如果施用多肽，则免疫时间表将包括持续数周的多肽的两次或更多次施用；然而，还可以使用多肽的单次施用。
在用RGMa肽或再生蛋白肽的动物免疫后，可以从动物获得抗体和/或产生抗体的细胞。通过从动物抽血或处死动物，从动物获得含有抗RGMa肽或抗再生蛋白肽抗体的血清。血清可以如从动物所获得时的样子使用，可以从血清获得免疫球蛋白部分，或可以从血清纯化抗RGMa肽或抗再生蛋白肽抗体。以这种方式获得的血清或免疫球蛋白是多克隆的，因此具有一系列非均一的性质。
一旦检测到免疫应答，例如，在大鼠血清中检测到对RGMa肽或再生蛋白肽特异的抗体，则收获大鼠脾脏并分离脾细胞。然后，通过熟知的技术，将脾细胞融合至任何适合的骨髓瘤细胞，例如，得自细胞系SP20的细胞，所述细胞系SP20可得自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,Va.,US)。通过限度稀释选择和克隆杂交瘤。然后，通过本领域中已知的方法测定杂交瘤克隆中分泌能够结合RGMa肽或再生蛋白肽的抗体的细胞。可以通过用阳性杂交瘤克隆免疫大鼠来产生通常含有高水平抗体的腹水液。
在另一个实施方式中，可以从免疫动物制备产生抗体的永生杂交瘤。免疫后，处死动物并将脾脏B细胞融合至永生骨髓瘤细胞，如本领域熟知的。参见，例如，HarlowandLane，如上。在优选的实施方式中，骨髓瘤细胞不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌细胞系)。在融合和抗生素选择后，使用RGMa肽或再生蛋白肽或其部分或表达RGMa肽或再生蛋白肽的细胞筛选杂交瘤。在优选的实施方式中，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)，优选地，使用ELISA进行初始筛选。在PCT专利公开No.WO00/37504中提供了ELISA筛选的实例。
筛选、克隆产生抗RGMa肽或抗再生蛋白肽抗体的杂交瘤，并对其进一步筛选所期望的特征，包括稳健的杂交瘤生长、高抗体产生和所期望的抗体特征。可以在同系基因动物、缺少免疫系统的动物(例如，裸鼠)中体内或在细胞培养中体外培养和扩增杂交瘤。筛选、克隆和扩增杂交瘤的方法对本领域那些技术人员是熟知的。
在优选的实施方式中，杂交瘤是大鼠杂交瘤。在另一个实施方式中，杂交瘤是在非人，非大鼠物种，如小鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马中产生的。在另一个优选的实施方式中，所述杂交瘤是人杂交瘤，其中人非分泌骨髓瘤与表达抗RGMa肽或抗再生蛋白肽抗体的人细胞融合。
可以通过已知技术产生识别特异性表位的抗体片段。例如，可以使用酶，如木瓜蛋白酶(产生两个相同的Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab')2片段)，通过免疫球蛋白分子的蛋白水解切割产生本发明的Fab和F(ab')2片段。IgG分子的F(ab')2片段保留了较大的(“亲代”)IgG分子的两个抗原结合位点，包括亲代IgG分子的两条轻链(含有轻链可变区和轻链恒定区)、重链的CH1结构域和形成二硫键的铰链区。因此，F(ab')2片段仍能够交联抗原分子，如亲代IgG分子。
(b)使用SLAM的抗RGMa肽或抗再生蛋白肽单克隆抗体
在本发明的另一个方面，使用在本领域称为选定的淋巴细胞抗体法(SLAM，selectedlymphocyteantibodymethod)的程序从单个分离的淋巴细胞中产生重组抗体，如美国专利No.5,627,052；PCT专利公开No.WO92/02551；和Babcook等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:7843-7848(1996)中所述。在该方法中，使用抗原特异性溶血空斑测定筛选来源于任一个免疫动物的分泌所关心抗体的单细胞，例如，淋巴细胞，在溶血空斑测定中，使用接头(如生物素)将RGMa肽或再生蛋白肽或其片段与绵羊红细胞偶联并用于鉴别分泌对RGMa肽或再生蛋白肽具有特异性的抗体的单细胞。鉴别所关心的分泌抗体的细胞后，通过反转录酶-PCR(RT-PCR)从细胞获得重链和轻链可变区cDNA，然后在适当的免疫球蛋白恒定区(例如，人、牛、狗、马、猫或猪恒定区)的背景中，可以在哺乳动物宿主细胞，如COS或CHO细胞中表达这些可变区。然后，可以对用来源于体内筛选的淋巴细胞的扩增的免疫球蛋白序列转染的宿主细胞进行进一步分析和体外筛选，例如，通过淘选转染细胞以分离表达抗RGMa肽或再生蛋白肽的抗体的细胞。还可以体外调控扩增的免疫球蛋白序列，如通过体外亲和力成熟法。参见，例如，PCT专利公开No.97/29131和PCT专利公开No.00/56772。
(c)使用转基因动物的抗RGMa肽或抗再生蛋白肽单克隆抗体
在本发明的另一个实施方式中，通过用RGMa肽或再生蛋白肽免疫包含一些或全部人免疫球蛋白位点的非人动物来产生抗体。在一个实施方式中，所述非人动物是转基因小鼠，它是包含人免疫球蛋白位点的大片段并且在小鼠抗体生产中存在缺陷的基因工程小鼠系。参见，例如，Green等人,NatureGenetics,7:13-21(1994)和美国专利No.5,916,771；5,939,598；5,985,615；5,998,209；6,075,181；6,091,001；6,114,598和6,130,364。还参见PCT专利公开No.WO91/10741；WO94/02602；WO96/34096；WO96/33735；WO98/16654；WO98/24893；WO98/50433；WO99/45031；WO99/53049；WO00/09560和WO00/37504。转基因小鼠产生完全人抗体的成人样的人全部集合，并产生抗原特异性人单克隆抗体。通过引入人重链位点和x轻链位点的百万碱基大小、种系构型YAC片段，转基因小鼠含有约80％的人抗体全部集合。参见Mendez等人，NatureGenetics,15:146-156(1997)；GreenandJakobovits,J.Exp.Med.,188:483-495(1998)，以上文献的公开内容作为参考并入本文。
(d)使用重组抗体文库的抗RGMa肽或抗再生蛋白肽的单克隆抗体
体外方法还可以用于制备本发明的抗体，其中筛选抗体文库以鉴别具有所需RGMa肽-或再生蛋白肽-结合特异性的抗体。这种重组抗体文库筛选的方法在本领域中是熟知的并且包括以下文献中所述的方法，例如，美国专利No.5,223,409(Ladner等人)；PCT专利公开No.WO92/18619(Kang等人)；PCT专利公开No.WO91/17271(Dower等人)；PCT专利公开No.WO92/20791(Winter等人)；PCT专利公开No.WO92/15679(Markland等人)；PCT专利公开No.WO93/01288(Breitling等人)；PCT专利公开No.WO92/01047(McCafferty等人)；PCT专利公开No.WO92/09690(Garrard等人)；Fuchs等人,Bio/Technology,9:1369-1372(1991)；Hay等人,Hum.Antibod.Hybridomas,3:81-85(1992)；Huse等人,Science,246:1275-1281(1989)；McCafferty等人,Nature,348:552-554(1990)；Griffiths等人,EMBOJ.,12:725-734(1993)；Hawkins等人,J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)；Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)；Gram等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:3576-3580(1992)；Garrard等人,Bio/Technology,9:1373-1377(1991)；Hoogenboom等人,Nucl.AcidsRes.,19:4133-4137(1991)；Barbas等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7978-7982(1991)；美国专利申请公开No.2003/0186374；和PCT专利公开No.WO97/29131，以上每篇文献的内容作为参考并入本文。
重组抗体文库可以来自RGMa肽或再生蛋白肽，或者RGMa肽或再生蛋白肽的一部分免疫的受试者。作为另外一种选择，重组抗体文库可以来自未免疫的受试者，即未用RGMa肽或再生蛋白肽免疫的受试者，如来自未用RGMa肽或再生蛋白肽免疫的人受试者的人抗体文库。通过用包含RGMa肽或再生蛋白肽的肽筛选重组抗体文库来选择本发明的抗体，以借此选择识别RGMa肽或再生蛋白肽的那些抗体。进行这种筛选和选择的方法在本领域中是熟知的，如前段参考文献中所述的。为了选择对RGMa肽或再生蛋白肽具有特定结合亲和力的本发明的抗体，如以特定Koff速率常数从RGMa肽或再生蛋白肽解离的那些，本领域已知的表面等离子体共振方法可以用于选择具有所需Koff速率常数的抗体。为了选择对RGMa肽或再生蛋白肽具有特定中和活性的本发明的抗体，如具有特定IC50的那些，可以使用本领域中已知的用于评价RGMa或再生蛋白活性抑制的标准方法。
在一个方面，本发明涉及分离的抗体，或其抗原结合部分，其结合RGMa肽或再生蛋白肽。优选地，所述抗体为中和抗体。在多个实施方式中，所述抗体为重组抗体或单克隆抗体。
例如，还可以使用本领域中已知的多种噬菌体展示方法产生本发明的抗体。在噬菌体展示方法中，在具有编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面上展示功能性抗体结构域。可以使用这种噬菌体以展示从全部集合或组合抗体文库(例如，人或鼠或牛、狗、马、猫或猪)表达的抗原结合域。可以使用抗原，例如，标记的抗原或者结合或捕获至固体表面或珠上的抗原选择或鉴别表达结合所关心的抗原的抗原结合域的噬菌体。在这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，其包括从具有重组融合至噬菌体基因III或者基因VIII蛋白的Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体域的噬菌体表达的fd和M13结合域。可以用于制备本发明的抗体的噬菌体展示方法的实例包括以下文献中公开的那些：Brinkman等人,J.Immunol.Methods,182:41-50(1995)；Ames等人,J.Immunol.Methods,184:177-186(1995)；Kettleborough等人,Eur.J.Immunol.,24:952-958(1994)；Persic等人,Gene,187:9-18(1997)；Burton等人,AdvancesinImmunology,57:191-280(1994)；PCT专利公开No.WO92/01047；PCT专利公开No.WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401和美国转No.5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108。
如以上参考文献中所述，在噬菌体选择之后，可以分离来自噬菌体的抗体编码区并用于产生完整抗体，包括人抗体，或任何其它所需的抗原结合片段，并在任何所需的宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如，如以下详细描述的。例如，使用本领域中已知的方法，还可以使用重组产生Fab、Fab'和F(ab')2片段的技术，如以下文献中公开的那些：PCT专利公开No.WO92/22324；Mullinax等人,BioTechniques,12(6):864-869(1992)；Sawai等人,Am.J.Reprod.Immunol.,34:26-34(1995)；和Better等人,Science,240:1041-1043(1988)。可以用于产生单链Fvs和抗体的技术的实例包括以下文献中所述的那些：美国专利No.4,946,778和5,258,498；Huston等人,MethodsinEnzymology,203:46-88(1991)；Shu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7995-7999(1993)；和Skerra等人,Science,240:1038-1041(1988)。
作为通过噬菌体展示筛选重组抗体文库的替代，本领域中已知的用于筛选大组合文库的其它方法可以用于鉴别本发明的抗体。替代表达系统的一种类型是其中作为RNA-蛋白质融合表达的重组抗体文库，如以下文献中所述：PCT专利公开No.WO98/31700(SzostakandRoberts)和RobertsandSzostak,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:12297-12302(1997)。在该系统中，通过在它们3'端具有嘌呤霉素(肽基受体抗生素)的合成mRNA的体外翻译，在mRNA和它所编码的肽或蛋白质之间产生共价融合。因此，基于所编码的肽或蛋白质，例如，抗体或其部分的特性，如抗体或其部分与双特异性抗原的结合，可以从mRNA的复杂混合物(例如，组合文库)中富集特异性mRNA。可以通过上述重组方式表达从这类文库筛选获得的编码抗体或其部分的核酸序列(例如，在哺乳动物宿主细胞中)，并且此外，可以通过额外轮次的mRNA-肽融合筛选(其中突变已引入最初选择的序列)或通过如上所述的体外重组抗体亲和力成熟的其它方法，进行进一步的亲和力成熟。该方法的优选实例是PROfusion展示技术。
在另一种方法中，还可以使用本领域中已知的酵母展示方法产生本发明的抗体。在酵母展示方法中，使用基因方法将抗体域链接至酵母细胞壁并在酵母表面上展示。具体地，可以使用这种酵母来展示从全部集合或组合抗体文库(例如，人或鼠或牛、狗、马、猫或猪)表达的抗原结合域。可以用于制备本发明抗体的酵母展示方法的实例包括美国专利No.6,699,658(Wittrup等人)中公开的那些，该专利作为参考并入本文。
(b)重组RGMa肽或再生蛋白肽抗体的生产
可以通过本领域中已知的任何一些技术生产本发明的抗体。例如，从宿主细胞表达，其中通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞。术语“转染”的多种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的多种技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管有可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是真核细胞中抗体的表达是优选的，并且哺乳动物宿主细胞中的表达是最优选，因为这种真核细胞(并且具体地，哺乳动物细胞)比原核细胞更可能组装并分泌适当折叠且具有免疫活性的抗体。
表达本发明的重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括与DHFR可选择标志物一起使用(例如，如KaufmanandSharp,J.Mol.Biol.,159:601-621(1982)中所述)的中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，在UrlaubandChasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216-4220(1980)中有描述)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以在宿主细胞中表达抗体的一段时间，或者更优选地，足以使抗体分泌到宿主细胞所生长的培养基中的一段时间来产生抗体。可以使用标准蛋白纯化方法从培养基回收抗体。
宿主细胞还可以用于产生功能性抗体片段，如Fab片段或scFv分子。将理解上述程序的改变是在本发明的范围内的。例如，可以期望用编码本发明抗体的轻链和/或重链的功能性片段的DNA转染宿主细胞。DNA重组技术还可以用于除去一些或全部不是结合编码所关心的抗原所必需的轻链和重链之一或两者的DNA。从这种截短的DNA分子表达的分子也涵盖在本发明的抗体之内。另外，通过标准化学交联方法，可以将本发明的抗体交联至第二抗体来产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体(即，结合RGMa肽或再生蛋白肽)，并且另一条重链和轻链对RGMa肽或再生蛋白肽之外的抗原是特异的。
在本发明优选的抗体或其抗原结合部分的重组表达系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链两者的重组表达载体引入到dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体内，抗体重链和轻链基因分别操作性连接至CMV增强子/AdMLP启动子调控元件以驱动基因高水平转录。重组表达载体还具有DHFR基因，其使得能够使用甲氨蝶呤选择/扩增来筛选已被载体转染的CHO细胞。培养所选的转化体宿主细胞以使其表达抗体重链和轻链，并从培养基回收完整的抗体。使用标准分子生物学技术制备重组表达载体，转染宿主细胞，筛选转化体，培养宿主细胞并从培养基回收抗体。更进一步，本发明提供了通过在适合的培养基中培养本发明的宿主细胞直至合成了本发明的重组抗体为止来合成本发明的重组抗体的方法。所述方法还可以包括从培养基分离重组抗体。
(a)人源化抗体
人源化抗体可以是免疫特异性结合至所关心的抗原并且包含基本具有人抗体氨基酸序列的框架(FR)区和基本具有非人抗体氨基酸序列的互补决定区(CDR)的抗体或其变体、衍生物、类似物或部分。人源化抗体可以来自非人物种抗体，所述抗体结合具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区的所期望的抗原。
如本文所使用的，术语“基本上”在CDR的背景中是指具有与非人抗体CDR的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的氨基酸序列的CDR。人源化抗体基本包含至少一个，并且通常两个可变域(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)的全部，其中所有或基本所有CDR区对应于非人免疫球蛋白(即，供体抗体)的那些并且所有或基本所有框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。根据一个方面，人源化抗体还包含至少部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。在一些实施方式中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变域两者。抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一些实施方式中，人源化抗体仅含有人源化轻链。在一些实施方式中，人源化抗体仅含有人源化重链。在具体的实施方式中，人源化抗体仅含轻链和/或重链的人源化可变域。
可以从任何类的免疫球蛋白选择人源化抗体，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，和从任何同种型中选择，无限制地包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可以包含来自不只一类或一种同种型的序列，并且可以使用本领域熟知的技术选择特定恒定域以优化所需的效应子功能。
人源化抗体的框架区和CDR区不必准确对应于亲代序列，例如，可以通过至少一种氨基酸残基的取代、插入和/或缺失使供体抗体CDR或共有框架突变，从而该位点的CDR或框架残基不对应于供体抗体或共有框架中的任一个。在一个实施方式中，然而，这种突变不是广泛的。通常，至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的人源化抗体残基将对应于亲代FR和CDR序列的那些。如本文所使用的，术语“共有序列”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。如本文所使用的，术语“共有免疫球蛋白序列”是指由相关免疫球蛋白序列家族中最常出现的氨基酸(或者核苷酸)所形成的序列(参见，例如Winnaker,FromGenestoClones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany1987))。在免疫球蛋白家族中，该家族中在该位置最常出现的氨基酸占据共有序列中的每个位置。如果两个氨基酸同样常见，则可以在共有序列中包含任一个。
可以设计人源化抗体以最大程度减小对啮齿类抗人抗体的不希望的免疫学反应，其限制了人受体中那些部分的治疗应用的持续时间和有效性。人源化抗体可以具有来自非人来源的引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人残基通常称作“输入”残基，所述残基通常取自可变区。可以通过用高变区序列取代人抗体相应序列来进行人源化。因此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体，其中来自非人物种的相应序列取代了基本小于完整的人可变域。例如，参见美国专利No.4,816,567，该专利内容作为参考并入本文。人源化抗体可以是其中一些高变区残基和可能的一些FR残基被来自啮齿类抗体中类似位点的残基取代的人抗体。可以使用任何已知的方法进行本发明的抗体的人源化或工程设计，如(但不限于)以下专利中所述的那些：美国专利No.5,723,323；5,976,862；5,824,514；5,817,483；5,814,476；5,763,192；5,723,323；5,766,886；5,714,352；6,204,023；6,180,370；5,693,762；5,530,101；5,585,089；5,225,539和4,816,567。
人源化抗体可以保留对RGMa肽或再生蛋白肽的高亲和力以及其它良好的生物性质。可以通过亲代序列分析方法以及使用亲代且人源化的序列的三维模型的多种概念性人源化产物来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可用的。说明和显示所选候选免疫球蛋白序列的大致三维构型结构的计算机程序是可用的。对这些显示图案的检查使得能够分析所述残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能所起的作用，即对影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基的分析。以这种方式，可以从受体和输入序列选择FR残基并合并，从而实现所需的抗体特性，如对RGMa肽或再生蛋白肽提高的亲和力。一般地，高变区残基可以直接并且最基本地参与影响抗原结合。
作为人源化的替代，可以产生人抗体(在本文中还称为“完全人抗体”)。例如，有可能通过PROfusion和/或酵母相关技术从文库分离人抗体。还可能产生一旦免疫，能够在不存在内源免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体的全部集合的转基因动物(例如，小鼠)。例如，在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。通过抗原激发，这种种系突变小鼠中人种系免疫球蛋白基因阵列的转移将导致人抗体的产生。可以根据美国专利中所述的方法制备人源化或完全人抗体：美国专利No.5,770,429；5,833,985；5,837,243；5,922,845；6,017,517；6,096,311；6,111,166；6,270,765；6,303,755；6,365,116；6,410,690；6,682,928和6,984,720，以上每篇专利的内容作为参考并入本文。
c.神经元细胞存活
如上所述，调节方法可以促进受试者中的神经元细胞存活。可以通过破坏或阻断RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用，和/或破坏脂筏，和/或降低脂筏内胆固醇的水平来促进神经元细胞存活。上述试剂可以破坏或阻断RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用，和/或破坏脂筏，和/或降低脂筏内胆固醇的水平。
在视神经损伤、脊髓损伤或它们的组合后，调节方法可以促进神经元细胞存活。调节方法可以在患有色素性视网膜炎、缺血(例如，中风)或多发性硬化的受试者中促进神经元细胞存活。以下更详细地描述了治疗视神经损伤、脊髓损伤、色素性视网膜炎、缺血(例如，中风)或多发性硬的方法。
调节方法可以包括将受试者中的神经元细胞存活促进至少约1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、6.5倍、7.0倍、7.5倍、8.0倍、8.5倍、9.0倍或约10.0倍。调节方法可以包括将受试者中的神经元细胞存活促进至少约2.0倍或3.0倍。
调节方法可以包括与未施用所述试剂的受试者中的神经元细胞存活相比，提高受试者中的神经元细胞存活。调节方法可以包括与未施用所述试剂的受试者中的神经元细胞存活相比，将受试者中的神经元细胞存活提高至少约1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、6.5倍、7.0倍、7.5倍、8.0倍、8.5倍、9.0倍或约10.0倍。调节方法可以包括与未施用所述试剂的受试者中的神经元细胞存活相比，将受试者中的神经元细胞存活提高至少约2.0倍或3.0倍。
d.轴突生长和/或再生的促进
调节方法可以促进受试者中的轴突生长和/或再生。可以通过破坏或阻断RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用，和/或破坏脂筏，和/或降低脂筏内胆固醇的水平来促进轴突生长和/或再生。上述试剂可以破坏或阻断RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用，和/或破坏脂筏，和/或降低脂筏内胆固醇的水平。
在视神经损伤、脊髓损伤或它们的组合后，调节方法可以促进轴突生长和/或再生。调节方法可以在患有色素性视网膜炎、缺血(例如，中风)或多发性硬化的受试者中促进轴突生长和/或再生。以下更详细地描述了治疗视神经损伤、脊髓损伤、色素性视网膜炎、缺血(例如，中风)或多发性硬的方法。
3.治疗方法
本文还提供了治疗对其有需要的受试者中疾病的方法。治疗方法可以应用如上所述的调节RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用，和/或破坏脂筏，和/或降低脂筏内胆固醇的水平的方法。治疗方法可以包括向受试者施用如上所述的试剂。
调节RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用，和/或破坏脂筏，和/或降低脂筏内胆固醇的水平可以对疾病有益。所述疾病可以包括(但不限于)色素性视网膜炎、缺血(例如，中风)、多发性硬化、脊髓损伤和视神经损伤，以下更详细地描述了每一种疾病。
a.色素性视网膜炎
所述治疗方法可以包括治疗受试者中的色素性视网膜炎。治疗色素性视网膜炎的方法可以包括向受试者施用试剂。所述试剂可以调节RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用和/或破坏脂筏，和/或降低脂筏内胆固醇的水平。调节可以包括破坏或阻断RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用，和/或破坏脂筏，和/或降低脂筏内胆固醇的水平。破坏或阻断顺式相互作用，和/或破坏脂筏，和/或降低脂筏内胆固醇的水平可以促进受试者中神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。因此，所述治疗方法可以促进患有色素性视网膜炎的受试者中神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。
所述神经元细胞可以是感光细胞。因此，治疗色素性视网膜炎的方法可以促进施用试剂的受试者中感光细胞的存活。
与不施用试剂的受试者中的外核层(outernuclearlayer)相比，所述治疗方法可以将受试者中的外核层提高至少约1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍或6.0倍。
b.缺血
所述治疗方法可以包括治疗受试者中的缺血。治疗缺血的方法可以包括向受试者施用试剂。所述试剂可以调节RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用，和/或破坏脂筏，和/或降低脂筏内胆固醇的水平。调节可以包括破坏或阻断RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用，和/或破坏脂筏，和/或降低脂筏内胆固醇的水平。破坏或阻断顺式相互作用，和/或破坏脂筏，和/或降低脂筏内胆固醇的水平可以促进受试者中神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。因此，所述治疗方法可以促进缺血性损伤后受试者中神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。
缺血可以包括(但不限于)中风。所述缺血可以是中风。因此，所述方法可以包括通过向受试者施用试剂来治疗中风。
与患有中风且未施用试剂的受试者的脑水肿相比，治疗中风的方法可以减少受试者中的脑水肿。与患有中风且未施用试剂的受试者的梗死体积相比，治疗中风的方法可以减少受试者中的梗死体积。与患有中风且未施用试剂的受试者中的行为缺陷相比，治疗中风的方法可以减少受试者中由中风引起的行为缺陷。
c.多发性硬化
治疗方法可以包括治疗受试者中的多发性硬化。治疗多发性硬化的方法可以包括向受试者施用所述试剂。所述试剂可以调节RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用，和/或破坏脂筏，和/或降低脂筏内胆固醇的水平。调节可以包括破坏或阻断RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用，和/或破坏脂筏，和/或降低脂筏内胆固醇的水平。破坏或阻断顺式相互作用，和/或破坏脂筏，和/或降低脂筏内胆固醇的水平可以促进受试者中神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。因此，所述治疗方法可以促进患有多发性硬化的受试者中神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。
与患有多发性硬化且未施用所述试剂的受试者中的神经变性相比，治疗方法可以降低受试者中的神经变性。
d.脊髓损伤
治疗方法可以包括治疗受试者中的脊髓损伤。治疗脊髓损伤的方法可以包括向受试者施用所述试剂。所述试剂可以调节RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用，和/或破坏脂筏，和/或降低脂筏内胆固醇的水平。调节可以包括破坏或阻断RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用，和/或破坏脂筏，和/或降低脂筏内胆固醇的水平。破坏或阻断顺式相互作用，和/或破坏脂筏，和/或降低脂筏内胆固醇的水平可以促进受试者中神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。因此，所述治疗方法可以促进脊髓损伤后受试者中神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。通过促进受试者中的轴突生长和/或再生，所述治疗方法可以恢复受试者中的行动活动。治疗方法可以部分或完全恢复脊髓损伤后受试者中的行动活动(运动活性、运动行为，locomoteractivity)。
e.视神经损伤
治疗方法可以包括治疗受试者中的视神经损伤。治疗视神经损伤的方法可以包括向受试者施用所述试剂。所述试剂可以调节RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用，和/或破坏脂筏，和/或降低脂筏内胆固醇的水平。调节可以包括破坏或阻断RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用，和/或破坏脂筏，和/或降低脂筏内胆固醇的水平。破坏或阻断顺式相互作用，和/或破坏脂筏，和/或降低脂筏内胆固醇的水平可以促进受试者中神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。因此，所述治疗方法可以促进视神经损伤后受试者中神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。
本发明具有多个方面，以下通过非限制性实施例进行说明。
4.药物组合物
上述试剂可以是药物组合物中的成分。所述药物组合物还可以含有药物可用的载体。包含本发明试剂的药物组合物用于在(但不限于)诊断、检测或监控病症，预防、治疗、控制或改善病症或其一种或多种症状和/或在研究中使用。在具体的实施方式中，组合物包含一种或多种本发明的试剂。在另一个实施方式中，所述药物组合物包含一种或多种本发明的试剂和除本发明的试剂以外的一种或多种预防或治疗剂以用于治疗病症，其中调节RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用，和/或破坏脂筏，和/或降低脂筏中胆固醇的水平可以是有益的。在其它实施方式中，已知预防或治疗剂对病症或其一种或多种症状的预防、治疗、控制或改善是有用的，或者已用于或目前正用于病症或其一种或多种症状的预防、治疗、控制或改善。根据这些实施方式，所述组合物还可以包括载体、稀释剂或赋形剂。
可以将本发明的试剂引入适合于向受试者施用的药物组合物。通常，所述药物组合物包含本发明的试剂和药物可用的载体。如本文所使用的，“药物可用的载体”包括任何和所有生理学相容的溶剂、分散媒介、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药物可用的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合中的一种或多种。在多数情况下，优选地在组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇，如甘露糖醇、山梨糖醇，或氯化钠。药物可用的载体还可以包括少量的助剂物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其提高试剂的货架期或有效性。
多种递送系统是已知的并且可以用于施用一种或多种本发明的试剂或一种或多种本发明的试剂和用于预防、控制、治疗或改善病症或其一种或多种症状的预防剂或治疗剂的组合，例如，脂质体、微粒、微胶囊中的封装、能够表达所述试剂的重组细胞、受体介导的胞吞(参见，例如，WuandWu,J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987))，作为反转录病毒或其它载体的一部分的核酸的构建。施用本发明的预防或治疗剂的方法包括(但不限于)肠胃外施用(例如，皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬脑膜外施用、肿瘤内施用和粘膜施用(例如，鼻内和口服途径)。另外，可以(例如)通过使用吸入器或喷雾器以及具有雾化剂的制剂来使用肺部施用。参见，例如，美国专利No.6,019,968；5,985,320；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540和4,880,078；和PCT专利公开No.WO92/19244；WO97/32572；WO97/44013；WO98/31346和WO99/66903以上每篇专利以其全部内容作为参考并入本文。在一个实施方式中，使用Alkermes肺部药物递送技术(Alkermes,Inc.,Cambridge,Mass.)施用本发明的试剂或者本发明的组合物。在具体的实施方式中，肌内、静脉内、瘤内、口服、鼻内、肺部或皮下施用本发明的预防或治疗剂。可以通过任何适合的途径，例如，通过输注或弹丸注射，通过上皮细胞或皮肤粘膜内层吸收(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)施用预防或治疗剂，并且可以与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。
在具体的实施方式中，可以期望将本发明的试剂局部施用至需要治疗的区域；这可以通过以下方式实现，例如，但不限于：局部输注、通过注射或通过植入物，所述植入物是多孔或无孔材料，包括膜和基质，如硅胶膜(sialasticmembranes)、聚合物、纤维基质(例如，)或胶原蛋白基质。在一个实施方式中，将有效量的本发明的一种或多种试剂局部施用于受试者受影响的区域以预防、治疗、控制和/或改善病症或其症状。
在另一个实施方式中，试剂可以在控释或缓释(持续释放，sustainedrelease)系统中递送。在一个实施方式中，可以使用泵来实现控释或缓释(参见Langer，如上；Sefton,1987,CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:20；Buchwald等人,1980,Surgery88:507；Saudek等人,1989,N.Engl.J.Med.321:574)。在另一个实施方式中，可以使用聚合物材料来实现本发明疗法的控释或缓释(参见，例如MedicalApplicationsofControlledRelease,LangerandWise(主编),CRCPres.,BocaRaton,Fla.(1974)；ControlledDrugBioavailability,DrugProductDesignandPerformance,SmolenandBall(主编),Wiley,NewYork(1984)；RangerandPeppas,1983,J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；还参见Levy等人,1985,Science228:190；During等人,1989,Ann.Neurol.25:351；Howard等人,1989,J.Neurosurg.71:105)；美国专利No.5,679,377；美国专利No.5,916,597；美国专利No.5,912,015；美国专利No.5,989,463；美国专利No.5,128,326；PCT专利公开No.WO99/15154；和PCT专利公开No.WO99/20253。缓释制剂中使用的聚合物的实例包括(但不限于)聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-醋酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在具体的实施方式中，缓释制剂中使用的聚合物是惰性的，不含可浸出杂质，储存时稳定、无菌并且生物可降解。在另一个实施方式中，可以将控释或缓释系统放置在预防或治疗靶标附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见，例如，Goodson,inMedicalApplicationsofControlledRelease,supra,vol.2,pp.115-138(1984))。
在Langer的综述(1990,Science249:1527-1533)中讨论了控释系统。本领域技术人员已知的任何技术可以用于产生包含一种或多种本发明的试剂的缓释制剂。参见，例如，美国专利No.4,526,938、PCT专利公开WO91/05548、PCT专利公开WO96/20698、Ning等人,1996,"IntratumoralRadioimmunotheraphyofaHumanColonCancerXenograftUsingaSustained-ReleaseGel,"Radiotherapy&Oncology39:179-189；Song等人,1995,"AntibodyMediatedLungTargetingofLong-CirculatingEmulsions,"PDAJournalofPharmaceuticalScience&Technology50:372-397；Cleek等人,1997,"BiodegradablePolymericCarriersforabFGFAntibodyforCardiovascularApplication,"Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854；和Lam等人,1997,"MicroencapsulationofRecombinantHumanizedMonoclonalAntibodyforLocalDelivery,"Proc.Int'l.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.24:759-760，以上每篇文献以其全部内容作为参考并入本文。
在具体的实施方式中，当本发明的组合物是编码上述试剂的核酸时，可以通过将其构建为适合的核酸表达载体的一部分并施用它从而使其成为胞内的来体内施用核酸以促进其编码抗体的表达，例如，通过使用反转录病毒载体(参见美国专利No.4,980,286)或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)或用脂肪或细胞表面受体或转染试剂涂覆，或通过与已知进入核的同源框样肽结合施用。(参见，例如，Joliot等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:1864-1868)。作为另外一种选择，可以胞内引入核酸并掺入宿主细胞DNA内以用于通过同源重组表达。
本发明的药物组合物被配制成适于其预定施用途径。施用途径的实例包括(但不限于)肠胃外施用，例如，静脉内、皮内、皮下、口服、鼻内(例如，吸入)、透皮(例如，局部)、经粘膜和直肠施用。在一些实施方式中，吸入可以包括雾化器的使用以将所述药物组合物施用至受试者。在具体的实施方式中，根据常规程序，将所述组合物配制成适合于静脉内、皮下、肌内、口服、鼻内或局部施用于人的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗缓冲水溶液中的溶液。必要时，所述组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂(如利多卡因)以减轻注射位点的疼痛。
如果局部施用本发明的组合物，则可以将所述组合物配制成软膏剂、乳膏剂、透皮贴片、洗剂、凝胶、香波、喷雾、气溶胶、溶液、乳液形式或本领域技术人员熟知的其它形式。参见，例如，Remington'sPharmaceuticalSciencesandIntroductiontoPharmaceuticalDosageForms,第19版,MackPub.Co.,Easton,Pa.(1995)。对于不可喷雾的局部剂量形式，通常使用包含与局部施用相容并且动态粘度大于水的载体或一种或多种赋形剂的粘稠至半固体或固体形式。适合的制剂无限制地包括溶液、混悬液、乳液、乳膏剂、软膏剂、粉剂、擦剂、油膏剂等，如果需要，将其灭菌或与影响多种性质，如，例如，渗透压的助剂(例如，防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲剂或盐)混合。其它适合的局部剂量形式包括可喷雾气溶胶制剂，其中活性成分，例如，与固体或液体惰性载体结合，与加压挥发性物质(例如，气体推进剂，如氟利昂)混合包装或包装到塑料挤瓶中。如果需要，也可以向药物组合物和剂量形式中加入增湿剂或润湿剂。这些其它成分的实例在本领域中是熟知的。
如果本发明所述的方法包括组合物的鼻内施用，则可以将所述组合物配制成气溶胶形式、喷雾、雾或滴剂形式。具体地，可以通过使用适合的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适合的气体)以气溶胶喷雾呈现的形式从加压包装或雾化器中方便地递送用于根据本发明的用途的预防或治疗剂。就加压气雾剂来说，可以通过设置阀门以递送计量的量来确定剂量单元。可以将在吸入器或吹药器中使用的(例如，由明胶组成的)胶囊和药筒配制成含有化合物和适合的粉末基剂(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
如果本发明所述的方法包括口服施用，则可以将组合物口服配制成片剂、胶囊、扁囊剂、软明胶胶囊(gelcaps)、溶液、混悬液等形式。可以使用药物可用的赋形剂通过传统方法制备片剂或胶囊，所述赋形剂如粘结剂(例如，预胶凝的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或淀粉羟基乙酸钠)；或者润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)。可以通过本领域熟知的方法涂覆片剂。用于口服的液体制剂可以采取(但不限于)以下形式：溶液、糖浆或混悬液，或者可以作为使用前用水或其它适合的媒介物复原的干燥产物提供。可以使用药物可用的添加剂通过传统方法制备这类液体制剂，所述添加剂如助悬剂(例如，葡萄糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水媒介物(例如，杏仁油、油酯、乙醇或分馏植物油)；和防腐剂(例如，甲基或丙基-p-羟基苯酸酯或山梨酸)。在适合情况下，所述制剂还可以含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。可以适合地配制用于口服施用的制剂以用于预防或治疗剂的缓慢释放、控释或缓释。
本发明所述的方法可以包括与雾化剂一起配制的组合物的肺部施用，例如，通过使用吸入器或喷雾器。参见，例如，美国专利No.6,019,968；5,985,320；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540和4,880,078；和PCT专利公开No.WO92/19244；WO97/32572；WO97/44013；WO98/31346；和99/66903，以上每篇专利以其全部内容作为参考并入本文。在具体的实施方式中，使用AlkermesAIR肺部药物递送技术(Alkermes,Inc.,Cambridge,Mass.)施用本发明的抗体和/或本发明的组合物。
本发明所述的方法可以包括配制用于通过注射(例如，通过弹丸注射或连续输注)来肠胃外施用的组合物的施用。用于注射的制剂可以与添加的防腐剂以单元剂量形式存在(例如，在安瓿瓶或在多剂量容器中)。组合物可以采取这些形式，如在油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳液，并且可以含有配制试剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。作为另外一种选择，活性成分可以处于使用前用适合的媒介物(例如，无菌无热原的水)复原的粉末形式。本发明所述的方法另外可以包括作为贮备制剂配制的组合物的施用。可以通过植入法(例如，皮下或肌内)或者通过肌肉注射施用这些长效制剂。因此，例如，组合物可以与适合的聚合材料或疏水性材料(例如，作为可用油剂中的乳液)或离子交换树脂配制，或作为微溶衍生物(例如，作为微溶盐)配制。
本发明所述的方法包括作为中性或盐形式配制的组合物的施用。药物可用的盐包括与阴离子所形成的那些，如来源于盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等的那些，以及与阳离子所形成的那些，如来源于钠、钾、铵、钙、铁氢氧化物(氢氧化铁)、异丙胺、三乙胺、2-乙胺基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些。
通常，以单位剂量形式将组合物成分单独或混合在一起提供，例如，作为保存在密闭容器(如安瓿瓶或指示活性剂的量的囊袋)中的冻干粉末或无水浓缩物。当施用形式为输注时，组合物可以用含有无菌医药级水或盐水的输液瓶配制。当施用形式是通过注射时，可以提供灭菌注射水或盐水的安瓿瓶从而使得成分可以在施用之前混合。
具体地，本发明还提供了在密闭容器(如安瓿瓶或指示抗体的量的囊袋)中包装的本发明的一种或多种试剂或药物组合物。在一个实施方式中，作为密闭容器中的干燥无菌冻干粉或无水浓缩物提供一种或多种试剂或本发明的药物组合物，并且可以将其复原(例如，用水或盐水)至适合的浓度以用于向受试者施用。在一个实施方式中，以至少5mg的单位剂量，例如至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、至少75mg或至少100mg，在密闭容器中作为干燥无菌冻干粉提供本发明的一种或多种试剂或药物组合物。本发明的冻干剂或药物组合物应在2℃至8℃之间储存。在其原始容器中，本发明的试剂或药物组合物应在复原后1周内施用，例如，5天内、72小时内、48小时内、24小时内、12小时内、6小时内、5小时内、3小时内或1小时内。在替代实施方式中，在指明抗体的量和浓度的密闭容器中以液体形式提供本发明的一种或多种试剂或药物组合物。在其它实施方式中，在密闭容器中，以至少0.25mg/ml，例如至少0.5mg/ml、至少1mg/ml、至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml或至少100mg/ml提供所施用组合物的液体形式。液体形式应在其原始容器内在2℃至8℃之间储存。
可以将本发明的试剂引入适合于肠胃外施用的药物组合物。在一个方面，将试剂制备成含有0.1-250mg/ml抗体的可注射溶液。可注射溶液可以由处于玻璃(flint)或琥珀色小瓶、安瓿或预填充注射器中的液体或冷冻干燥剂量形式组成。缓冲液可以是L-组氨酸(1-50mM)，最佳地5-10mM，pH5.0至7.0(最佳地pH6.0)。其它适合的缓冲剂包括(但不限于)丁二酸钠(琥珀酸钠)、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。浓度0-300mM(最佳地，对于液体剂量形式为150mM)的氯化钠可以用于改变溶液的渗度。冷冻干燥剂量形式可以包含冷冻保护剂，主要地0-10％的蔗糖(最佳地0.5-1.0％)。其它适合的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。冷冻干燥剂量形式可以包含膨胀剂，主要地1-10％的甘露糖醇(最佳地2-4％)。可以在液体和冷冻干燥剂量形式中使用稳定剂，主要地1-50mML-蛋氨酸(最佳地5-10mM)。其它适合的膨胀剂包括甘氨酸、精氨酸，并且可以作为0-0.05％的聚山梨酯-80(最佳地0.005-0.01％)包含在内。其它表面活性剂包括(但不限于)聚山梨酯20和BRIJ表面活性剂。作为肠胃外施用的可注射溶液制备的包含本发明的抗体的药物组合物还可以包含作为佐剂有用的试剂，如用于提高抗体吸收或分散的那些。特别有用的佐剂是透明质酸酶，如(重组人透明质酸酶)。可注射溶液中透明质酸酶的加入改善肠胃外施用，具体地皮下施用后的人生物利用率。它还允许更大的注射位点体积(即大于1ml)，并且具有较少的疼痛和不适，以及最低的注射位点反应发生率(参见国际专利申请公开No.WO04/078140和美国专利申请公开No.US2006104968，其作为参考并入本文)。
本发明的组合物可以处于多种形式。这些包括(例如)液体、半固体和固体剂量形式，如液体溶液(例如，可注射和可输注溶液)、分散剂或混悬液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选形式取决于预期施用形式和治疗应用。组合物可以处于可注射或可输注溶液形式，如与用于使用其它抗体的人或哺乳动物(例如，牛、狗、马、猫和猪)的被动免疫的那些类似的组合物。在一个实施方式中，通过静脉内输注或注射施用抗体。在另一个实施方式中，通过肌内或皮下注射施用抗体。
治疗组合物通常在生产和储存条件下必须是无菌的和稳定的。可以将所述组合物配制成溶液、微乳剂、分散剂、脂质体或适合于高药物浓度的其它有序结构。根据需要，可以通过将处于适当溶剂中的所需量的活性化合物(即，本发明的结合蛋白，例如，试剂)与上述列举的一种成分或成分的组合混合随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将所述活性化合物合并进无菌载体来制备分散体系，所述载体含有基本的分散介质和所需的其它上文列举的成分。就用于制备无菌可注射溶液的无菌冻干粉剂来说，制备方法包括真空干燥和喷雾干燥，其获得了活性成分粉剂以及来自其先前无菌过滤溶液的任何其它所需成分。可以(例如)通过使用涂层(如卵磷脂)，在分散系的情况下通过保持所需粒度以及通过使用表面活性剂来保持溶液适当的流动性。可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如，一硬脂酸盐和明胶来导致可注射用组合物的延长吸收。
本发明所述的试剂可以通过本领域中已知的多种方法施用。对于多种治疗应用，施用途径/方式可以是皮下注射、静脉注射、吸入或输注。如技术人员所理解的，施用途径和/或形式将基于所期望的结果而改变。在某些实施方式中，可以用将保护化合物抵抗快速释放的载体制备活性化合物，如控释制剂，其包括植入物、透皮贴剂和微囊密封的递送系统。可使用生物可降解生物相容聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这类制剂的多种方法已授权专利或通常是本领域技术人员所知的。参见，例如，SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems,J.R.Robinson,ed.,MarcelDekker,Inc.,NewYork,1978。
在某些实施方式中，可以与(例如)惰性稀释剂或可吸收的可食用载体一起口服施用本发明的试剂。试剂(及其它成分，如果需要)还可以封装在硬壳或软壳明胶胶囊中，压缩成片剂或直接掺入到受试者的饮食中。对于口服治疗施用，所述试剂可以与赋形剂混合并且以可吞服片剂(ingestibletablet)、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆、薄片等形式使用。为了通过肠胃外施用之外的方式施用本发明的试剂，用防止其失活的材料涂覆所述试剂或与所述材料共施用所述试剂可能是必需的。
在某些实施方式中，将本发明的试剂连接到本领域中已知的延长半衰期的媒介物(媒剂，vehicle)。这类媒介物包括(但不限于)Fc结构域、聚乙二醇和葡聚糖。例如，在美国专利申请序列号No.09/428,082和公开的PCT专利申请No.WO99/25044中描述了这类媒介物，以上专利出于任何目的作为参考并入本文。
在具体的实施方式中，通过基因疗法施用包含编码本发明试剂的核苷酸序列的核酸序列以治疗、预防、控制或改善病症或其一种或多种症状。基因疗法是指通过向受试者施用表达的或可表达的核酸来进行的疗法。在本发明的这种实施方式中，核酸产生了介导预防或治疗效果的本发明的它们的编码试剂。
根据本发明，可以使用在本领域中可用的用于基因疗法的任何方法。对于基因疗法方法的一般综述，参见Goldspiel等人，1993,ClinicalPharmacy12:488-505；WuandWu,1991,Biotherapy3:87-95；Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan,Science260:926-932(1993)；和MorganandAnderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191-217；May,1993,TIBTECH11(5):155-215。在以下文献中描述了可以使用的DNA重组技术的本领域通常已知的方法：Ausubel等人(主编),CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NY(1993)；和Kriegler,GeneTransferandExpression,ALaboratoryManual,StocktonPress,NY(1990)。在US20050042664A1中公开了多种基因疗法方法的详细说明，该专利作为参考并入本文。
可以单独或组合使用本发明的试剂以治疗与疼痛有关的疾病或病况或与RGMa或再生蛋白有关的任何其它疾病或病况。还应理解所述组合是用于其预期目的的那些组合。
所述药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的试剂。“治疗有效量”是指以所需剂量和时间段来实现所需治疗结果的有效的量。本领域技术人员可以确定所述试剂的治疗有效量，并且治疗有效量可以根据以下因素改变，如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及抗体在个体中引起所期望的反应的能力。治疗有效量还是其中与治疗有益作用相比，试剂的毒性或不利作用(如果有)是微不足道的量。“预防有效量”是指以所需剂量和时间段对于实现所需预防结果有效的量。通常，由于在受试者中预防剂量在疾病之前或在疾病早期使用，因此预防有效量将小于治疗有效量。
可以调节给药方案以提供最佳的所需反应(例如，治疗或预防反应)。例如，可以施用单个丸剂，可以随时间施用几个划分剂量，或者可以如治疗情况紧急需要所指示的，按比例降低或提高剂量。将胃肠外组合物配制成剂量单位形式是尤其有利的，以便于施用和剂量均匀性。如本文所使用的剂量单位形式是指适用于待治疗的哺乳动物受试者的单一剂量的物理上离散的单元；每个单元含有与所需药物载体相关联的经计算产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。剂量单位形式的规格由(a)活性化合物和待实现的具体治疗或预防效果的独特特性，以及(b)配制这种活性化合物以用于患者中敏感性治疗的本领域中固有的限制所决定，并且直接取决于它们。
试剂的治疗或预防有效量的示例性非限制范围为0.1至200mg/kg之间的剂量，例如，0.1至10mg/kg之间。试剂的治疗或预防有效量可以在1至200mg/kg、10至200mg/kg、20至200mg/kg、50至200mg/kg、75至200mg/kg、100至200mg/kg、150至200mg/kg、50至100mg/kg、5至10mg/kg或1至10mg/kg之间。应注意剂量值可能随要减轻的病况的类型和严重程度而变。此外，本领域技术人员可以确定试剂剂量，并且所述剂量可以根据以下因素改变，如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及试剂在个体中引起所期望的反应的能力。所述剂量还是其中与治疗有益作用相比，试剂的毒性或不利作用(如果有)是微不足道的量。还应理解对于任何特定受试者，应根据个体需要以及施用或监督化合物施用的人的专业判断而随时间调整具体剂量方案，并且本文所说明的剂量范围仅是示例性的并且不意欲限制所主张的组合物的范围或实践。
实施例
实施例1
实施例2-11的材料和方法
本文在实施例1中提供了在实施例2-11中如下所述的实验中使用的材料和方法。
视网膜外植体长出(retinalexplantsoutgrowth)测定和免疫共定位。用层粘连蛋白(Invitrogen；10μg/ml)和RGMa蛋白质(5μg/ml)处理聚L-赖氨酸(SIGMA；10μg/ml)涂覆的玻璃盖玻片并在室温下温育3小时。在蛋白涂覆的表面上培养颞侧视网膜外植体(移植神经细胞，explant)18小时。要破坏脂筏，则用10mM甲基-β-环糊精(MβCD)预处理外植体12分钟，或用2U/ml胆固醇氧化酶(CO)在37℃处理1小时。用4％多聚甲醛(PFA)固定外植体并用Alexa488-毒伞素染色。使用ImagePro5.0定量纤维长度。对于免疫定位，用霍乱毒素B-FITC(C1655；Sigma；10mg/ml)处理外植体，并贴片、固定并用再生蛋白抗体染色。用RGMa-His对视网膜神经节细胞(RGC)电穿孔，并培养18小时。将细胞固定并用再生蛋白和His-标签抗体染色。
细胞和顶盖(tecta)的脂筏分离。24h后收集注射的小鸡E8顶盖(4Ig，2mg/ml；N-筏，1mg/ml；甲基-β-环糊精(10mM))或转染细胞(再生蛋白和RGMa)，将其裂解并置于蔗糖密度梯度(0.9-0.8-0.75-0.7-0.6-0.5-0.4-0.2M))的底部，在SW60转子(BeckmanInstrumentsInc.)中以38,000rpm离心16小时。
脊髓损伤(SCI)。通过在脊髓T8级用20g力夹子挤压(clipcompression)使脊髓受伤。SCI后立即脊柱内注射4Ig或媒介物。在邻近于中线静脉的病变位点前端1mm和尾端1mm处进行2次注射(250ng/μl，3μL每次注射)。SCI后立即使4Ig处理的大鼠通过颈静脉内的静脉内(i.v.)接受1mg/kg剂量的4Ig，并且后续每周i.v.注射，再注射2周。SCI后立即使MβCD组中大鼠接受1000mg/kg/周的MβCD腹膜内(i.p.)注射，然后每天i.p.注射直至处死。对照大鼠接受如上所述的等体积的媒介物。
鞘内输注。为了评价4Ig的局部递送，使19只成年雌性Wistar大鼠受伤，并用4Ig或PBS在病变位点前端(rostal)和尾端(caudal)注射。脊柱内注射后立即鞘内递送4Ig或PBS，然后通过导管和泵系统连续递送14天(0.5μL/小时)。
功能分析。在损伤前，第1天，然后在SCI后每周进行功能测试，持续6周。使用BBB运动评分量表评价运动功能。0分表示无后肢运动，21分表示运动未受损，如在对照中所观察到的。确定运动分项得分以评价趾部间隙(clearance)、主要爪位置(predominantpawposition)和无不稳定性。最大运动分项得分为7，表示正常运动。
进行爬梯行走分析(Ladder-walkanalysis)以评价精细运动功能。SCI后1周以及此后每周，将BBB得分大于10的大鼠置于水平梯行走装置，并记录3轮测试。慢动作分析记录；记录每条后肢的步数并对每只大鼠每周计算平均值。
克隆和蛋白纯化。在N-末端具有6-His标签的pSectag2B载体(Invitrogen)中克隆再生蛋白的Ig结构域(4Ig)以及DCC的Ig结构域(4Ig)，并且其在C-末端与载体的myc和6-His标签同框。除N-RGMa77-113外，克隆在N-末端均具有6-His标签的N-RGMa构建体、N-RGMa28 -73(N-筏)、N-RGMa50-99和N-RGMa77-113(N-inh.)，其在C-末端还含有myc标签和6-His标签。转染细胞，在48h后收集培养基，并根据生产商的规程(Qiagen)在Ni-NTA珠上纯化。在所有测定中，使用前在PBS中透析蛋白。
视网膜外植体长出测定。用层粘连蛋白(10μg/ml；Invitrogen)和RGMa蛋白(5μg)处理聚-L-赖氨酸(PLL；SIGMA；10μg/ml)涂覆的玻璃盖玻片，并在室温下温育3h。用髓鞘质涂覆PLL处理的盖玻片过夜(6μg/cm2)，然后用层粘连蛋白涂覆。在髓鞘质或蛋白质-涂覆的表面上在DMEMF-12培养基(2％小鸡血清，10％FBS)中培养颞侧视网膜外植体18h。为了破坏筏，用10mMMβCD预处理外植体12min，或者用2U/mlCO在37℃处理1h，清洗并在蛋白质涂覆的盖玻片上培养。然后，用4％PFA固定外植体并用Alexa488-氟-毒伞素(1:50；MolecularProbes)染色。使用ImagePro5.0定量纤维长度。
结合沉降测定(Pull-downassay)。根据供应商的说明，将蛋白质偶联至活化的CNBr琼脂糖珠(Pharmacia)上。将来自转染细胞的上清液加入偶联珠中，在室温下(RT)保持2h。然后，用PBS加0.02％吐温20清洗珠6×，并加入SDS加样缓冲液。将样品煮沸，并进行Western印迹(免疫印迹)。
HEK细胞和顶盖的脂筏分离。在小鸡E8视顶盖中注射蛋白(4Ig，2mg/ml；N-筏，1mg/ml；RGMaΔ，5mg/ml；甲基-β-环糊精(10mM))，并在24h后收集顶盖。用再生蛋白和不同的RGMa构建体转染HEK细胞，并在48h后收集。对于使用RGMaΔ的处理，用RGMaΔ(2mg/ml)和BMP-2(100nM)处理再生蛋白转染的细胞，并在37℃继续温育1h。将顶盖(每组实验3个顶盖)和/或细胞溶解在冷藏的缓冲液(25mMTris-HCl，pH7.4，150mmNaCl，5mMEDTA和蛋白酶抑制剂混合物)中，分别通过G25和G30针，并以800g在4℃离心10min。将冷的TritonX-100加入核后上清液至1％的最终浓度，并在冰上温育1小时。加入2×体积的2M蔗糖，将样品置于蔗糖密度梯度底部(0.9-0.8-0.75-0.7-0.6-0.5-0.4-0.2M)，并在SW60转子(BeckmanInstrumentsInc.)中以38,000rpm离心16h。从顶部(顶部编号为1，并且随后8个馏分以此编号)收集400μl馏分，并在-80℃储存。
卵内电穿孔和DiI示踪。在38℃，在高湿度室内温育鸡蛋(白色来航鸡)。将少量病毒溶液(1×108IU/ml病毒滴度)与1/10体积的0.25％固绿溶液(fastgreensolution)(MolecularProbes)混合，并在E1.5在顶盖中注射。当将小DiI晶体(MolecularProbes)置于右眼颞-背侧部分时，将鸡蛋进一步温育直至E15。E17时，处死胚胎并将顶盖固定在4％PFA中。将顶盖切成一半后，在显微镜下(OlympusBX61)观察DiI示踪。采集并使用Photoshop(Adobe)处理顶盖数字图像。作为另外一种选择，将质粒构建体电穿孔到视泡(眼泡)中以限制对眼的表达，并如上进行示踪。
统计分析。使用Excel(Microsoft)，使用学生氏双尾t检验视进行视网膜长出测定的统计分析。结果表示为平均值±SEM(n＝至少3次独立实验；每次独立实验2次重复，每次重复>10外植体)。
免疫共定位规程。将视网膜外植体在层粘连蛋白上在37℃培养18小时，用霍乱毒素B-FITC(C1655；Sigma；10mg/ml)处理，随后用抗霍乱毒素B抗体(ab35988；abcam；1:1000)贴片，并在4％PFA中固定。对于使用再生蛋白的共定位染色，用5％FBS/PBS封闭外植体，并与再生蛋白抗体(H-175；SantaCruz；1:200)一起温育，然后与抗兔Alexa555第二抗体(molecularprobes；1:250)一起温育。对于霍乱毒素和F-肌动蛋白的共定位，如上所述，用霍乱毒素处理外植体并贴片，并用Alexa555-氟-毒伞素染色。对于再生蛋白和RGMa-His的共定位，从小鸡E8胚胎制备DRG神经元，使用AmaxaNucleofector试剂盒(Lonza)用RGMa-His电穿孔，在层粘连蛋白涂覆的盖玻片上铺板并培养18h。将细胞固定、清洗、在5％FBS中封闭并用再生蛋白(H-175；SantaCruz；1:200)和His抗体(abm；1:1000)共染色。将DRG与抗兔Alexa555和抗小鼠Alexa488抗体(molecularprobes；1:250)温育。
图像分析。在OlympusBX61显微镜上，使视网膜神经节细胞和DRG神经元的生长锥成像。在红色(再生蛋白)和绿色(霍乱毒素B或RGMa)通道采集Z堆叠图像，并通过使用该程序的“相对于z的最大投影”特征合并成单个图层。使用“具有强度相关分析插件的ImageJ”定量两种颜色的共定位程度。强度相关分析(ICA)测量双通道强度是否同步(依赖于染色)或异步(单独于染色)变化。
定量共定位分析。使用具有强度相关分析(ICA)插件(WCIFImageJ)的ImageJ软件进行定量共定位分析。ICQ值在-0.5至+0.5的范围内。随机染色：ICQ约0；独立于染色：0>ICQ>-0.5；依赖于染色：0<ICQ<+0.5。通过符号检验(P符号检验)的正态近似进行显著性测试。
细胞死亡测定。在该测定中使用稳定表达RGMa的HEK293细胞。使用lipofectamin2000进行再生蛋白表达质粒(1μg/μl)的瞬时转染。转染后，将细胞在5％CO2中温育24h，并进行台盼蓝(SIGMA)染色以评价细胞死亡。
分离的视网膜神经节细胞的挽救测定。从E7小鸡胚胎中制备分离的视网膜神经节细胞。将视网膜在HBSS中切开，胰蛋白酶化并在具有10％小牛血清和N2补充剂的DMEM/F12培养基中培养。使用nuclefector试剂盒(AmaxaChickenNeuronNucleofectorkit，Lonza)用pRFP对照shRNA、抗小鸡RGMa的shRNA37以及shRNA37和小鼠RGMa两者核转染细胞。将细胞(500,000个细胞/孔)在涂覆层粘连蛋白(10μg/ml)或层粘连蛋白和N-RGMa(10μg)、C-RGMa(10μg)或RGMaΔ(20μg)蛋白涂覆的盖玻片上铺板，并生长18h。在4％多聚甲醛中固定细胞，在RT用β-微管蛋白抗体染色(Covance；1:1000)1h，然后在RT使用Alexafluor488山羊抗小鼠第二抗体(1:500)1h。使用Olympus荧光显微镜(BX61)采集转染细胞的图像。使用cellSens(Olympus)测量每个条件(至少40个细胞/条件/实验)的转染细胞的轴突长度。
分离的视网膜神经节细胞的生长锥中RGMa的染色。为了观察生长锥中RGMa的沉默，如上所述制备分离的视网膜神经节细胞并用均表达RFP的shRNA37和21以及对照shRNA核转染。将核转染细胞在涂覆了层粘连蛋白(10μg/ml)的盖玻片上铺板，培养并在18h后用4％多聚甲醛固定，使用RGMa抗体(7A2：来自靶向RGMaC末端部分的杂交瘤细胞的上清液)在4℃染色过夜。在RT，将细胞与Alexa-氟488抗小鼠第二抗体再温育1h。使用Olympus荧光显微镜(BX61)对来自核转染视网膜神经节细胞的生长锥成像。
RGMa下调的免疫印迹分析。将HEK细胞与通过PEI(PolysciencesInc.)用HIS抗体和对照shRNA、shRNA37、shRNA21标签的小鸡RGMa或小鼠RGMa共转染。将细胞温育72小时，并使用RIPA缓冲液和蛋白酶抑制剂混合物裂解。对细胞裂解液进行免疫印迹，并在RT用HIS抗体(abm1:1000)检测1h。在RT，使用Odyssey山羊抗小鼠第二抗体(1:4000；LI-COR)1h。进行考马斯亮蓝染色以确定对每个条件相同的总蛋白加载量。
视神经挤压。动物均为250-300g重的雌性斯普拉-道来氏大鼠，其在无病原体的环境中饲养。简要地，神经挤压前7天，动物接受立体定位注射到RGC上丘靶标的2％荧光金。使用连接到立体定位臂的Foredoom微型电钻在上丘上方的颅骨两侧钻孔。使用通过电脑控制的皮升泵(WorldPrecisionInstruments)驱动的10μlHamilton注射器进行注射。以500nl/min的注射速率，将分别包含3μl荧光金溶液的两个注射剂在上丘内不同深度递送。每次注射后，将针头保持原位10分钟，并缓慢撤回以防止注射溶液向上回流至针道。
另外，对于挤压神经手术程序，将动物置于立体定位框架中，并通过气体麻醉掩具(mask)通入异氟烷(2％；0.8L/minO2)。通过眼眶上缘中的切口接触神经，然后收缩覆盖的直肌。使用精细自闭合钳挤压视神经6秒。最终，使眼眶内容物轻轻地返回到它们最初的位置并闭合初始切口。手术后，在热灯下，将动物保持在37℃的正常温度条件下，并对它们施用酮洛芬(5mg/mL，大鼠剂量：0.1mL/100g体重)和无菌盐水以辅助手术后恢复。
注射规程和药物治疗。为了评价4Ig、N-筏和MβCD对视神经挤压后RGC存活和再生的影响，在损伤后3和10天递送4μL4Ig(250ng/μl)和N-筏(150ng/μl)溶液的眼球内注射剂。另外，在挤压后3和10天，这两组通过颈静脉内静脉以1mg/kg的剂量接受4Ig和N-筏。单独地，神经挤压后，MβCD组中的动物以每天一次的计划，以1000mg/kg/周接受MβCD的腹膜内注射，持续3周。
眼球内注射。简要地，开始用与O2混合的2％异氟烷麻醉大鼠，然后在眼球内注射前使用Alcaine滴眼剂(Alcon)麻醉角膜。使用通过水力联轴器通过PEEK管连接到10μlHamilton注射器的拉开的玻璃微量移液器，将4Ig和N-筏溶液递送到角膜缘后方的眼的玻璃体腔中。注射后，将移液器固定就位5s，并从眼中缓慢取出以防止回流。注射后，用眼用软膏剂覆盖角膜以防止干燥，并将动物返回到它们正常的笼中。
损伤后RGC存活的定量。神经挤压后21天将动物安乐死，并摘出眼球，除去角膜和晶状体，并将含有视网膜的剩余眼杯(eyecup)在4％多聚甲醛中固定1h。然后除去视网膜，平置，并使用50:50甘油/PBS盖片。使用连接到LeicaDMLFSA显微镜的AndoriXon885+电子倍增电荷耦合装置照相机使RGC中的荧光金染色显像。此外，将具有液体光导的SutterLambdaXL(QuorumTechnologies,Guelph,Canada)用作光源。在平置(限定距视网膜中心的距离)的每个象限的内视网膜(1/6视网膜离心率)、视网膜赤道部(midperiphery)(1/2视网膜离心率)或外视网膜(5/6视网膜离心率)测量RGC密度。将该细胞计数除以因数0.08以获得外推的单位面积的RGC密度(细胞/mm2)。
RGC再生的定量、视网膜内部完整性和GAP-43免疫组织化学。首先，在视神经挤压后21天检查RGC轴突再生和视网膜内部完整性。在神经移除和固定前2天，进行RGC顺行标记，并将顺行示踪剂FITC-结合的B型霍乱毒素(CTB-FITC)注射到眼的玻璃体腔中以主动对轴突示踪。将CTB-FITC在轴突内顺行输送以到达突触膜。
在视神经挤压后21天检查RGC轴突再生。通过升主动脉对动物灌注4％多聚甲醛，同时夹住降主动脉，并移除视神经。将神经在相同固定液中后固定过夜，并在30％蔗糖的PBS溶液中在40℃固定7天。用LeicaCM1950低温恒温切片机，将固定的神经以14μm的厚度连续切片。将载玻片先在4℃在抗生长相关蛋白-43(GAP-43)(新生儿和成体RGC中再生视网膜神经节细胞轴突的标志物)的第一抗血清中温育过夜。在含有0.3％TritonX-100和3％正常山羊血清的PBS中稀释第一抗血清(兔多克隆，1:250，CellSignalingTechnology/NEB)。第一抗体温育后，将切片在PBS中清洗3次，15分钟，然后在室温下与FITC标记的第二抗体温育3h。
然后用50:50甘油/PBS覆盖前，用PBS漂洗载玻片3次，15分钟。对从挤压位点前开始并向远处发展的视神经网络(binsoftheopticnerve)内的再生轴突生长锥的总数定量。所述箱如下所示：0-250，250-500和>500μm。通过应用EMgain，使用具有AndoriXon885+照相机的LeicaDMLFSA显微镜(20×物镜)检查和定量通过每个视神经宽度的总计4个等距切片。
统计分析。RGC密度和再生轴突数目表示为平均值±SEM，并用单因素方差分析，然后通过Tukey检验进行分析。通过视网膜离心率(内、中、外)对RGC密度分组。当p<0.05时，认为差异显著。
脊髓损伤。手术前，驯化并训练32只成年雌性Wistar大鼠(CharlesRiver,St.Constant,QC,200-300g)用于基线行为评价。将大鼠分成4组(n＝8只/组)：1)MBCD(i.p.)；2)媒介物对照(i.p.)；3)4Ig(i.v.和脊柱内)；4)媒介物对照(i.v.和脊柱内)。通过吸入与一氧化二氮和氧气的混合物(1:2，v/v)混合的2％的异氟烷，使大鼠麻醉。通过椎板切除术暴露脊髓，并在脊髓T8级用20g力造成夹子挤压损伤。这是反映人体病理学的临床相关SCI模型。在4Ig和对应对照组中，SCI后立即脊柱内注射4Ig或媒介物。在邻近于中静脉的病变位点前端1mm和尾端1mm处进行总计2次注射(250ng/μL，每次3μL)。借助于手术显微镜，使用机械化微量注射器，通过10μlHamilton注射器和定制的32G针头，以1.5μl/min的速率进行立体定位注射。注射后，将针头另外保持就位2min以防止渗漏。用3-0号薇乔缝合线(vicrylsutures)(JohnsonandJohnson,PeterboroughON,Canada)缝合覆盖的肌肉和皮肤。
SCI后立即使4Ig处理的大鼠通过颈静脉内静脉i.v.接受1mg/kg剂量的4Ig，并且后续每周i.v.注射，再注射2周。SCI后立即使MβCD组中大鼠接受1000mg/kg/周的MβCD腹膜内注射，然后每天i.p.注射直至处死。对照大鼠接受上述相等的体积。每天手动排空膀胱3次直至建立自发排泄，用Clavomax(62.5mgPOBID，7天)治疗血尿症或尿路感染。将大鼠单独饲养在温度控制在26℃的房间中，使用12小时光/暗循环。任意提供水和食物。
鞘内输注。在评价4Ig局部递送的单独实验中，使19只成年雌性Wistar大鼠受伤，并用4Ig或上述磷酸盐缓冲盐水(PBS)在病变位点前端和尾端注射。脊柱内注射后立即通过连接到迷你渗透泵(Alzet型No.2002)的聚氨脂导管(Alzet型No.0007741；Alzet渗透泵，Cupertino,CA)鞘内递送4Ig。将233uL4Ig(1ug/uL)注射到迷你渗透泵。在未接受4Ig的动物中，使用等体积的PBS作为对照。在37℃，用无菌盐水灌泵过夜。在T9进行小型中线硬脊膜切开，通过它将导管插入鞘内空间。将导管尖头向前导向T7级，它位于4Ig前注射位点前方约1mm。将导管和泵深入缝合至皮下组织。然后，通过导管和泵系统，鞘内连续递送4Ig或PBS14天(0.5uL/hr)。
功能分析。在损伤前，第1天，然后在SCI后每周进行功能测试，持续6周。使用BBB运动评分量表评价运动功能。将大鼠分别置于表面不光滑的开放场地，并且对治疗未知的2个独立检查员观察并视频记录后肢运动4min，评价动物功能，包括关节运动、踏步能力、协调性、爪的放置和趾部间隙。0分表示无后肢运动，21分表示运动未受损，如在对照中所观察到的。确定运动分项得分以评价趾部间隙、主要爪位置和无不稳定性。最大运动分项得分为7，表示正常运动。
通过装置进行爬梯行走分析(Ladder-walkanalysis)以评价精细运动功能。SCI前，训练大鼠1周来通过水平梯。SCI后1周以及此后每周，将BBB得分>10的大鼠置于水平梯行走装置，并记录3轮测试。慢动作分析记录；记录每条后肢的步数并对每只大鼠每周计算平均值。对后肢跛行的受损大鼠打分，最大脚步得分12。未受损大鼠每次交叉具有0或偶尔1的脚步得分。计算测试的相对成功率。
组织制备、免疫染色和定量分析。每周行为评价后，在SCI后6周处死大鼠。用腹膜内戊巴比妥钠使大鼠深度麻醉，并穿心灌注(transcardiallyperfused)4％多聚甲醛在0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH7.4中的溶液。切下1.5cm包含T8病变位点的组织部分，并在30％蔗糖在0.1MPBS中的溶液中冷冻保护至少24小时。将组织包埋在ShandonCryomatrix(VWRLaboratories,Mississauga,ON,Canada)中并旁矢状面(parasagittally)低温切割成20μm连续切片。
为了定量保留的宿主神经元，将切片与NeuN免疫反应。用10％(v/v)正常山羊血清在0.1MPBS中的溶液封闭切片1小时，与对于神经元的小鼠抗NeuN(1:500；Chemicon)温育过夜，在PBS中清洗，与生物素化抗小鼠第二抗体(VectorLaboratories)温育1小时，用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(VectastainEliteABCKitStandard,VectorLaboratories)清洗并温育1小时。将二氨基联苯胺(DAB，diaminobenzidine)(VectastainEliteABCKitStandard,VectorLaboratories)用作发色团。对每个脊髓，采集通过脊髓厚度以相等前后距离相隔280至420um的5个切片以包含相同的灰质区域和避免细胞重复计数。使用NikonNISElementsBRv.3.1软件，在病变中心前端和尾端2.7mm对所有NeuN阳性神经元计数。数据表示为未对整个脊髓厚度归一化的总计数的组平均值。
为了定量宿主星形胶质细胞和少突神经胶质细胞(少突细胞，oligodendrocyte)，如上所述封闭切片并与以下第一抗体温育过夜：对于星形胶质细胞的小鼠抗GFAP(1:200；Chemicon,Temecula,CA)和对于少突神经胶质细胞的小鼠抗CC1/APC(1:1000；Calbiochem,SanDiego,CA)。用0.1MPBS清洗组织切片，并与荧光-结合第二抗体在室温下温育1小时，用PBS清洗，然后用含有4',6-二脒基-2-苯基-吲哚(DAPI)的Vectashield封固剂(VectorLaboratories,Burlington,ON,Canada)盖片。将第一抗体的种特异性非免疫IgG和缺失用作阴性对照。为了定量损伤位点附近的宿主少突神经胶质细胞的存活，使用NikonEclipseTE300显微镜和NISElementsBRv.3.1软件，对CC1免疫染色的切片以相同设置和暴露时间采集图像。每只动物检验3个具有最大空腔和类似腹背(dorsal-ventral)距离的切片。在每个切片中，对病变边缘前后600um内的视野(2.9×105um2区域)中的CC1+细胞数目计数。为了定量GFAP免疫反应性，使用NikonEclipseTE300显微镜和NISElementsBRv.3.1软件，对免疫染色的切片以相同设置和暴露时间采集图像。每只大鼠检验3个具有最大空腔和类似腹背距离的切片。对于每个切片，确定病变边缘前后0.45mm和1.8mm的3个区域(1.1×106um2区域)的总强度值。对每个区域，对每组计算平均强度值。
为了定量病变体积，处理每个第八旁矢状面切片进行固蓝(监牢蓝，luxolfastblue)和苏木精&伊红(LFB/H&E)染色用于组织形态观察。使用NikonEclipseTE300显微镜采集切片图像，并使用NikonNISElementsv.3.1软件追踪每个切片的空腔区域。将空腔内任何坏死组织算作病变部分。通过将每个切片的测量面积之和乘以切片间距离来计算总空腔体积。
使用生物素葡聚糖胺(BDA)的皮层脊髓束(CST)顺向轴突示踪。为了使来自CST的轴突显象，在功能评价完成后，在SCI之后6周使用BDA进行顺向轴突示踪。随机选择每组动物(n＝3-4)进行BDA注射。在用与1:2NO:O2混合的2％的异氟烷深度麻醉下，将大鼠置于立体定位框架中并进行两侧颅骨切开术以暴露感觉运动皮层。将BDA(10％，10,000MW；Invitrogen(LifeTechnologies))溶于0.01MPBS，并使用相对于前囱的下列坐标在每个感觉运动皮层中的6个位点注射：1)后方0.5mm和侧方1mm；2)后方0.5mm和侧方2mm；3)后方1mm和侧方1mm；4)后方1mm和侧方2mm；5)后方1.5mm和侧方1mm；6)后方1.5mm和侧方2mm。在每个位点，在皮层表面1.2mm注射1μlBDA。借助于手术显微镜，使用机械化微量注射器，通过10μlHamilton注射器和32号针头，以0.5μl/min的速率进行立体定位注射。注射后，将针头另外保持就位2分钟以防止渗漏，用6-0号薇乔线闭合皮肤。使动物再存活3周，然后穿心灌注4％多聚甲醛在0.1MPBS中的溶液。切下包含病变位点的1.5cm组织部分的BDA组织，并通过在载玻片上20μm低温切割或自由浮动30μm切片来处理。在含有PBS的24孔板中收集自由浮动切片。RT下，用1％H2O2的甲醇溶液预处理切片10min，用含有0.5％TritonX的PBS清洗30min，并在RT下在抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶复合物(VectostainEliteABCKitStandard,VectorLaboratories,Burlington,ON,Canada)中温育1h。用PBS清洗载玻片，然后在RT与荧光Alexa-488山羊抗小鼠第二抗体(1:500；Invitrogen(LifeTechnologies))温育1h，并用含有DAPI(4',6-二脒基-2-苯基-吲哚)的Vectashield封固剂(VectorLaboratories,Burlington,Ontario,Canada)盖片进行核复染。
统计分析。通过比较组相对于时间点的两因素重复测量ANOVA，然后使用Bonferroni法通过事后成对多重比较分析功能测试。使用单因素ANOVA，然后使用Bonferroni检验通过成对多重比较分析细胞计数差异。数据表示为平均值±标准偏差。当p<0.05时，认为差异显著。
脊髓切片的半胱天冬氨酸酶-3和NeuN染色。切下来自对照(n＝4)和4Ig(n＝4)处理大鼠的包含T8处病变位点的1.5cm组织部分，并在30％蔗糖中冷冻保护。将组织旁矢状面切成20μm连续切片。为了与半胱天冬氨酸酶-3共标记保留的神经元，封闭切片并在4℃与兔抗半胱天冬氨酸酶-3(1:750；CellSignaling)温育过夜。第2天，清洗切片并与小鼠抗NeuN(1:500；Chemicon)RT下温育4h，然后与Alexa488抗小鼠和Alexa555抗兔第二抗体(1:500；MolecularProbes)以及DAPI/PBS在RT温育1h。对于每个脊髓，采集通过脊髓厚度相隔160um的5个切片以避免细胞重复计数。使用cellSens软件(Olympus)，对病变中心前后1.5mm的所有NeuN阳性神经元和NeuN/半胱天冬氨酸酶-3双重标记的细胞以及半胱天冬氨酸酶-3标记的细胞和DAPI染色细胞的总数计数。
实施例2
生长锥脂筏中再生蛋白的存在
为了研究再生蛋白在中枢神经系统(CNS)发育中的作用，通过免疫印迹检验了脑膜(E8)中再生蛋白的表达。在本研究中使用了以下抗体：抗再生蛋白整个胞外域的抗体AF1079，和抗再生蛋白N-末端的抗体N-20。AF1079在180kDa和150kDa检测到两条带，而N-20在180kDa检测到1条带(图1A和1B)。该结果表明脑膜含有全长再生蛋白(即180kDa)和缺少一些4Ig重复的再生蛋白的N末端截短(即150kDa)。
为了进一步研究再生蛋白的表达，通过共聚焦成像检测了再生蛋白的膜定位。具体地，用抗再生蛋白N末端部分的抗体进行染色。该染色在视网膜神经节细胞(RGC，E8，图1A-1D)的生长锥中显示出点状染色图案。这些点状结构与筏标志物：霍乱毒素(CTB)和RGMa(图1E和1F)共定位，其计算强度相关商分别为0.27和0.32。该结果表明再生蛋白与RGMa(P符号＝0.005)和脂筏(P符号＝0.0002)显著相关。作为对照，对于CTB和F-肌动蛋白，对轴突染色。在该对照实验中，计算的相关商为0.05，其表明对于CTB和F-肌动蛋白的染色分离(图8)。
为了进一步检验脂筏中再生蛋白的定位，检验了从小鸡脑膜分离的脂筏中再生蛋白的丰度。在富含脂筏标志物脂阀结构蛋白和RGMa的组分2-4中回收再生蛋白(图1G)。不从含有重组分标志物转铁蛋白受体的非脂筏组分回收再生蛋白(图1G)。
另外，用甲基-β-环糊精(MβCD)处理胚胎以消除破坏脂筏的膜胆固醇，并分离脑样品。在存在MβCD的情况下，从非脂筏组分与转铁蛋白受体一起回收再生蛋白(图8C)。
总之，以上结果表明在发育的CNS中，再生蛋白定位在脑膜中，并且更具体地，再生蛋白定位在这些脑膜内的脂筏中。
实施例3
N-筏和再生蛋白-4Ig之间的相互作用调节脂筏中再生蛋白的存在
如上所述，再生蛋白与脂筏和RGMa有关。为了确定再生蛋白和RGMa之间的相互作用是否参与再生蛋白向脂筏的招募，实施结合研究以检验再生蛋白不同区域与RGMa之间的相互作用。
具体地，将再生蛋白的4Ig结构域与6FNIII结构域分别融合至碱性磷酸酶(AP)。在再生蛋白的胞外部分中发现再生蛋白的4Ig结构域和6FNIII结构域。登录号No.AAC59662(SEQIDNO:1)是再生蛋白的氨基酸序列。4Ig结构域是登录号No.AAC59662(SEQIDNO:1)的氨基酸1至383。6FNIII结构域是登录号No.AAC59662(SEQIDNO:1)的氨基酸429至1036。
在ELISA测定中分析了与多种RGMa肽的这些融合的结合(图2A)。再生蛋白的6FNIII结构域与全长RGMa相互作用，但是再生蛋白的4Ig结构域不与全长RGMa相互作用(图2A)。该数据表明RGMa与再生蛋白的体内结合可能需要其它因子以有利于RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用，以下将对此进行更详细地描述。
另外，再生蛋白的4Ig结构域与RGMa的N末端部分相互作用(图2A)。再生蛋白的6FNIII结构域(本文中还称为“纤连蛋白结构域”)也与RGMa的N末端部分相互作用。
为了确定RGMa的不同N末端区域是否结合再生蛋白的4Ig和6FNIII结构域，产生跨过RGMa的N末端区域的肽。RGMa的氨基酸序列为登录号No.NP_989868.1(SEQIDNO:6)。这些肽是RGMa的氨基酸28-73(本文中还称为“N-筏“)之间的肽和RGMa的氨基酸77-113(本文中还称为“N-inh”)之间的肽。N-筏肽与再生蛋白的4Ig结构域相互作用，但是不与再生蛋白的6FNIII结构域相互作用。N-inh肽与再生蛋白的6FNIII结构域相互作用，但是不与再生蛋白的4Ig结构域相互作用。在补充实验中，其中RGMa的N-筏和N-inh肽与AP融合，而不是与再生蛋白的4Ig和6FNIII结构域融合，N-筏结合至4Ig结构域而非6FNIII结构域，而N-inh结合至6FNIII结构域而非4Ig结构域(图9)。另外，N-inh和N-筏涂覆的珠分别结合沉降6FNIII结构域和4Ig结构域，这与上述ELISA结果一致(图2B)。
为了评价再生蛋白的4Ig结构域和N-筏之间相互作用的特异性，检验了最接近的再生蛋白同系物DCC以确定DCC是否与N-筏相互作用。观察到DCC的4Ig结构域与N-筏之间无显著相互作用(图9C)。
为了确定上述再生蛋白-RGMa相互作用是否是生物学相关的，使用RGMa肽作为底物进行长出实验(图2C)。与对照相比，全长N-RGMa和N-inh片段导致轴突生长减少3-4倍(51.5.5±3.0μm和88.1±13.3μm相对于238.1±9.3μm；图2C和2D)。这些数据表明N-RGMa和N-inh与再生蛋白的6FNIII结构域之间的相互作用抑制视网膜轴突生长。当N-筏肽用作底物时，观察到对轴突长出无影响(图2C-D)。这些数据表明RGMa的N-筏和再生蛋白的4Ig结构域之间的相互作用不会反式抑制轴突长出。因此，为了反式抑制轴突长出，RGMa与再生蛋白的6FNIII结构域相互作用，但不与再生蛋白的4Ig结构域相互作用。
为了评价N-筏和4Ig相互作用是否将再生蛋白招募到脂筏中，分别从RGMa和再生蛋白上去除N-筏和4Ig结构域，然后检验再生蛋白与脂筏的结合(图9)。具体地，将HEK293细胞与再生蛋白和RGMa共转染，并用BMP2处理。BMP2促进再生蛋白向脂筏招募。在这些HEK293细胞中，在脂筏组分中发现再生蛋白。
相反，再生蛋白的缺失突变体(即缺失4Ig结构域并在本文中称为“4Ig-del”)和RGMa的缺失突变体(即缺失N-筏结构域并在本文中称为“N-筏-del”)通常靶向细胞表面(数据未显示)，但是任一种缺失突变体不会被招募至脂筏组分(图9)。这些数据表明脂筏中再生蛋白的存在需要N-筏和4Ig之间的相互作用。
照此，检验过表达重组4Ig和N-筏是否与内源4Ig和N-筏结构域竞争将再生蛋白从脂筏组分替换至非脂筏组分。具体地，将N-筏、4Ig结构域或对照肽(RGMa的氨基酸残基50-99，在本文中还称为“N-RGMa50-99”)在E8注射到视顶盖。1天后收集顶盖进行分组分离分析。
对照(N-RGMa50-99)中，全长再生蛋白仅定位至筏组分。在存在N-筏或4Ig的情况下，再生蛋白从脂筏组分重定位至不含脂筏蛋白的重组分(图2E)。
脂筏中再生蛋白的存在还依赖于BMP。因此，检验在存在BMP-螯合剂诺金的情况下，再生蛋白是否从脂筏组分重定位至重组分。具体地，对于本研究，将诺金注射到小鸡脑中，并且观察到在存在诺金的情况下，脂筏中不存在再生蛋白(图2E)。因此，以上数据表明诺金、N-筏和4Ig分别防止再生蛋白与脂筏结合。
总之，以上体外和体内结果表明再生蛋白向脂筏的招募需要再生蛋白中4Ig结构域和RGMa中N-筏结构域之间的相互作用。
实施例4
敲减(敲低、敲除，knockdown)分析显示RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用
CNS含有3个RGMa同工型(同种型，isoform)，即N-RGMa、C-RGMa和RGMaΔ。N-RGMa和C-RGMa如图2A所示。RGMaΔ是全长RGMa。
N-RGMa、C-RGMa和RGMaΔ分别反式抑制轴突长出，并因此，当作为生长底物提供时，N-RGMa、C-RGMa和RGMaΔ中的每一个阻断轴突生长。另外，N-RGMa、C-RGMa和RGMaΔ中的每一个通过与再生蛋白的纤连蛋白结构域的相互作用来反式阻断轴突生长(图2A-2D)。
如上所述和如图2E和9中所示，再生蛋白的4Ig结构域和N-RGMa23-73之间的相互作用将再生蛋白招募到脂筏。RGMa通过其GPI锚点定位至脂筏。另外，还如上所述，再生蛋白和RGMa在生长锥中共定位(图1F)并且当作为生长底物提供N-筏时(即反式)，N-筏不阻断轴突长出(图2D)。总地来说，这些结果表明通过与RGMa的顺式相互作用将再生蛋白招募至脂筏。
为了进一步确定RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用将再生蛋白招募至脂筏，使用短发夹RNA(shRNA)使生长锥中RGMa沉默。具体地，将shRNA递送至E2小鸡眼部，并且使用转染的E7视网膜的外植体测量每个RGMa蛋白(即，N-RGMa、C-RGMa和RGMaΔ)上的长出。眼中shRNA的转导仅破坏视网膜神经节细胞(RGC)中RGMa与再生蛋白的顺式相互作用，并且不影响生长锥和作为生长底物外源提供的RGMa之间的反式相互作用。
相对于对照shRNA，抑制内源RGMa的两个不同的shRNA(shRNA-21和shRNA-37；图12)分别将N-RGMa底物上的视网膜外植体长出提高了3.1和2.8倍(图3A和3B)。另外，RGMa沉默提供了C-RGMa和RGMaΔ上轴突生长的2.8-3.4倍增加(图3A和3B)。
在挽救实验中，与耐受shRNA37的小鼠RGMa共转染恢复了shRNA37处理的分离的RGC中的RGMa蛋白的抑制活性(图10)。因此，通过RGMashRNA获得的结果不是脱靶效应。总的来说，以上数据表明除反式相互作用之外，需要将再生蛋白招募至脂筏的RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用来抑制轴突长出。
为了进一步确定4Ig和N-筏之间发生的RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用，进行研究以检验在RGMa蛋白上生长的视网膜外植体中，4Ig和/或N-筏是否用作阻断肽和恢复轴突生长。在这些研究中，向培养基加入5μg/ml的4Ig(图3A和3C)或N-筏(图3A和3D)阻断了RGMa蛋白的抑制作用并恢复了长出。总的来说，这些数据表明需要再生蛋白的4Ig结构域和N-筏之间的顺式相互作用来抑制轴突生长。
实施例5
RGMa抑制需要再生蛋白与脂筏和BMP结合
如上所述，4Ig和N-筏之间的相互作用调节再生蛋白与脂筏的结合(图2E)并且表明再生蛋白必须存在于脂筏中以抑制轴突生长。为了进一步研究再生蛋白是否必须存在于脂筏中以抑制轴突生长，当在RGMa蛋白上培养轴突时，使用试剂甲基-β-环糊精(MβCD)和胆固醇氧化酶(CO)破坏脂筏。具体地，当在存在10mMMβCD或2U/mlCO的情况下，在RGMa蛋白上培养轴突时，轴突长出恢复至对照值(图3A、3E、S3D)。这些数据表明通过转运到脂筏的再生蛋白引发了以反式提供的轴突对RGMa的反应。这种再生蛋白向脂筏的转运受再生蛋白和RGMa(即，再生蛋白的4Ig结构域和RGMa的N-筏)之间的顺式相互作用的介导。
图2E中的数据表明发育的CNS中，再生蛋白向脂筏的招募取决于BMP。为了确定与BMP相互作用的蛋白诺金是否影响轴突对RGMa蛋白的反应，在存在和不存在诺金的情况下测量了轴突长出。在这些研究中，轴突长出不受单独的诺金的影响，但是被N-RGMa、C-RGMa或RGMaΔ显著降低(图3A和3F)。诺金将暴露于各个RGMa的视网膜外植体(E8)中的长出恢复至对照值(图3A和3F)。这些数据表明了依赖于BMP的类似机制，其是再生蛋白介导的对所有3种RMGa蛋白，即N-RGMa、C-RGMa或RGMaΔ的应答的基础。
总地来说，以上结果表明RGMa与BMP一起调节再生蛋白向脂筏的转运，并且需要这种转运来介导RGMa对轴突生长的抑制。
实施例6
再生蛋白需要脂筏来修正轴突寻路(AxonalPathfinding)
为了研究4Ig和N-筏之间相互作用对体内轴突路径(axonalpaths)的影响，将对照4Ig、N-筏和NRGMa50-99异位表达，并检验轴突寻路。为了确保处理影响轴突生长而不是它们的环境影响，进行电穿孔时，将电场的应用集中在E2处的视泡，借此限制对眼和视网膜轴突的表达(图3G)。
在对照实验中，在明确限定的末端区域内，所有视网膜轴突建立树状分枝(图3H)。作为阳性对照，将沉默RGMa并因此干扰轴突路径的shRNA电穿孔(图3I)。100％(8/8)的4Ig和85.7％(6/7)的N-筏电穿孔导致异常路径(图3J和3K)。
因此，这些数据表明体内轴突寻路也需要4Ig和N-筏之间的相互作用，该相互作用是再生蛋白定位至脂筏所需的。总地来说，通过长出实验(图3A-3F)，这些数据表明BMP辅助的顺式结合再生蛋白的RGMa将再生蛋白移位至脂筏，并且这种移位是抑制轴突生长的后续反式RGMa-再生蛋白相互作用所需的(图3L)。考虑上述内容，通过诺金、N-筏、4Ig或生长锥中RGMa敲减或胆固醇减少阻断再生蛋白向脂筏的移位提供了5种刺激轴突生长的策略(图3L)。
实施例7
再生蛋白需要脂筏来诱导细胞死亡。
中和RGMa来抑制反式相互作用会提高轴突生长，但是反过来这激活了再生蛋白的促死亡功能。为了确定再生蛋白是否需要脂筏来诱导细胞凋亡，用再生蛋白转染HEK293细胞并通过台盼蓝拒染测定测量细胞死亡。在该测定中，HEK293细胞稳定表达RGMa(图11)。
再生蛋白使细胞死亡比空白对照细胞(Mock-cells)中所观察到的高2倍(图4A)。当将诺金、4Ig、N-筏或MβCD加入至再生蛋白-转染的细胞的培养基中时，细胞活力改善约2-3倍，表明再生蛋白诱导死亡需要脂筏(图4B)。
因此，这些数据与以上数据一起表明当与RGMa一起起作用抑制轴突生长时并且当不与RGMa一起起作用诱导细胞凋亡时，再生蛋白需要脂筏。照此，防止再生蛋白向脂筏输送同时促进轴突生长和细胞存活。
在发育的小鸡神经管中表达RGMa，并因此来确定对于体内促死亡功能来说，再生蛋白是否需要脂筏，在鸡胚神经管中检验细胞凋亡(E2)。具体地，用表达空白对照(Mock)或再生蛋白的质粒电穿孔GFP-构建体并通过TUNEL染色测定细胞凋亡。
与不诱导细胞凋亡的空白对照表达(图11A)相反，在GFP-再生蛋白转染的细胞中观察到多个TUNEL+细胞(图4C和4D)。当在再生蛋白电穿孔后，将4Ig或N-筏注射到顶盖中时，再生蛋白的促凋亡作用消除。4Ig和N-筏分别将TUNEL+细胞数目降低约18倍(从432±23至23±4)和约4倍(432±23至103±8)(图4D)。这些数据表明对于发育的脑中发生的细胞凋亡来说，脂筏中需要存在再生蛋白。此外，以上数据表明再生蛋白需要脂筏来诱导细胞凋亡，并因此通过4Ig或N-筏或胆固醇减少(由于MβCD阻断细胞凋亡的诱导)防止再生蛋白向脂筏的招募或定位。
实施例8
在受损的视网膜神经元中再生蛋白需要脂筏来诱导细胞凋亡
以上数据表明在脑发育期间，RGMa/再生蛋白途径起作用需要脂筏。受损中枢神经系统(CNS)中，RGMa/再生蛋白途径介导神经元死亡。因此，检验再生蛋白的病理生理作用是否需要脂筏中再生蛋白的定位。
对于该研究，使用视网膜器官型培养，其中视网膜神经节细胞(RGC)的轴突切断术使细胞失去向性因子(tropicfactor)并引起细胞凋亡。使用碘化丙啶(PI)检测细胞死亡，并且以相同强度对RGC层对焦采集所有图片。通过测量全样载片的相对PI强度来测定细胞死亡。培养基中4Ig或N-筏的存在显著减少细胞死亡(减少约40％)(图4E和4F)。相对于对照，用MβCD或CO干扰脂筏类似地将细胞存活提高约50％(图4E和4F)。
因此，这些数据表明在受损神经元中再生蛋白需要再生蛋白在脂筏中的定位来引起细胞凋亡。在存在4Ig或N-筏的情况下，受损神经元中的这种细胞凋亡显著减少，这通过阻断RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用或者减少胆固醇和破坏脂筏的MβCD或CO防止再生蛋白向脂筏的招募。照此，通过阻断再生蛋白诱导细胞凋亡，4Ig、N-筏或通过MβCD或CO的胆固醇减少促进细胞存活。
损伤后，在视网膜中观察到再生蛋白和RGMa两者较高的水平。另外，轴突切断术后，RGMa和再生蛋白导致体内视网膜神经节细胞(RGC)的凋亡死亡。为了确定损伤后再生蛋白是否需要脂筏来体内诱导细胞凋亡，眼内注射4Ig或N-筏，并在轴突切断术后14天测量细胞存活。与对照(361±19个细胞/mm2)相比，4Ig(682±21个细胞/mm2)和N-筏(652±24个细胞/mm2)将RGC存活提高约2倍(图4G和4I)。MβCD的全身应用(腹膜内，IP)也将RGC存活提高约2倍(图4G和4J)。CO体内不稳定，并因此未测试。这些数据还表明受损CNS中再生蛋白-诱导的细胞凋亡需要再生蛋白与脂筏结合。这种结合依赖于再生蛋白的4Ig结构域和RGMa的N-筏之间的顺式相互作用。
实施例9
脊髓损伤后再生蛋白需要脂筏来抑制轴突再生
如上所述并且如图3和4所示，在发育的CNS中从脂筏分离再生蛋白支持轴突长出并且终止神经元死亡。另外，如图4G-4J所示，观察到体内轴突切断术后RGC存活的改善。发育期间，放射状胶质细胞表达RGMa并且起到导向分子的作用。在受损的CNS中，反应性星形胶质细胞和少突神经胶质细胞表达RGMa。在发育和再生的CNS中，RGMa起到轴突生长抑制剂的作用。
由于以上数据表明防止再生蛋白与脂筏结合抑制发育的RGC中RGMa/再生蛋白途径的抑制功能，因此在其中RGMa/再生蛋白途径阻止再生的损伤模型中进行研究以确定再生蛋白与脂筏的结合是否是RGMa/再生蛋白途径阻止受损CNS再生所需的。
大鼠脊髓压迫模型中，脊髓损伤(SCI)后的再生密切模拟人SCI。具体地，使用BBB运动评分量表、运动分项得分和爬梯行走测试，每周监控功能恢复。
与对照相比，4Ig(静脉内，IV)或MβCD(IP)的处理显示了早在SCI后2-3周时显著的功能恢复，如通过较高的BBB得分和运动分项得分所证实的(图5A、5B、5D和5E)。
使用爬梯行走测试评价后肢调协性，其中认为脚步错误，并因此较高的得分反映较差的协调性。与对照相比，注射4Ig的大鼠具有较少的脚步(图5C)。在注射MβCD的大鼠中还观察到了类似的功能改善类型(图5D-5F)。
另外，星形胶质细胞染色显示4Ig和MβCD处理不影响这些细胞群体。因此，运动功能中观察到的改善是由神经元存活或轴突再生的改善造成的(图12)。
为了确定对4Ig观察到的影响仅是由这种肽在损伤位点的作用引起的，使用Alzet迷你渗透泵进行局部鞘内应用。为了降低自发恢复，使用更强的夹子进行挤压(26vs20)。与上述全身应用类似，4Ig的局部应用显示了早在SCI后2-3周时的显著功能恢复，如通过较高的BBB得分所证实的(图5G)。另外，在本文中后肢调协性得到显著改善，并且局部注射4Ig的大鼠具有较少的脚步(图6H)。
SCI后，在较大的动物(大于7个月，n＝4)中测试MβCD对运动恢复的影响。与年轻动物的结果类似，MβCD处理提供了明显的改善(+6.8BBB得分vs对照；图13C)。
因此，以上结果表明通过4Ig或MβCD阻碍再生蛋白与脂筏结合刺激了SCI后功能性运动恢复。
实施例10
神经元保留(neuronalsparing)和运动轴突再生
SCI后神经元丧失导致丧失肌肉控制，并最终瘫痪。在受损CNS中，RGMa/再生蛋白途径引起神经元细胞死亡。因此，进行研究以检验阻断再生蛋白与脂筏的结合是否终止神经元丧失并加速SCI后的轴突再生以及随后的功能恢复。
在本研究中，受损大鼠接受6周的4Ig或MβCD全身应用，并且使用神经元标志物NeuN定量病变周围的神经元。与对照相比，4Ig或MβCD处理将病变周围的神经元数目提高了约2倍(图5I-5M)。鞘内应用4Ig6周导致脊髓横截面中NeuN阳性细胞的类似提高(约2倍)(图5N-5P和图12E)。测量显示与对照相比，4Ig和MβCD处理的动物的病变体积未显著改变(图12D)。因此，这些数据还表明阻断再生蛋白与脂筏的结合减轻了SCI后神经元的损失。
CNS轴突不能再生很大程度上是由于无益于再生的髓鞘质中存在的抑制剂。为了确定改善的行为结局是否是由轴突再生造成的，通过向皮层运动区(运动皮层，motorcortex)注射生物素葡聚糖胺(BDA)对皮质脊髓束顺行示踪(图6)。
仅有1个对照动物显示出延伸到损伤位点(腔)外的单个再生纤维。相反，所有4Ig和MβCD处理的动物具有伸出腔外的纤维，并且一些延伸到该位点外几毫米(图6A和6B)。与各自对照(18±7μm和128±118μm)相比，在4Ig(2875±228μm)或者MβCD(2195±335μm)处理的动物中，最长轴突的平均长度增加(图6C、D)。尽管在对照中很难观察到超出病变位点之外的轴突，但是4Ig或MβCD组中多个纤维跨越了3000μm的病变位点(图6E和6F)。
在进一步的研究中使用了SCI冲击/挤压损伤模型，其中同时挤压脊髓的背面和腹面。所使用的SCI的严重程度导致灰质中央空腔以及隔断所有CST轴突的相邻白质，并留下软膜下白质保留的边缘(图13C)。在4Ig和MβCD动物中，观察到显示异常途径的纤维(图S6D)，并且它是轴突再生的指示。
为了确定BDA-纤维是再生轴突，在不同时间点(对于每个时间点，n＝5)检测4Ig(IV注射)处理动物的脊髓，并且观察到当与损伤后4周相比时，6周时的纤维显著更长(图6G)。具体地，相比于4周动物，6周时观察到病变往后2至3mm之间的纤维数显著更高(图6H)。
还检验了病变往前3mm并且往后5mm的脊髓横截面。在假(模拟，sham)动物中，在两个位置处保留的纤维明显，其显示了未受损脊髓中CST的连续性。相反，在4Ig(IV)处理的动物中，病变往前观察到纤维，但是病变往后5mm未观察到，表明缺少未受损纤维。在4IG(IV)或MBCD(IP)处理的大鼠中，在病变位点往后约4mm的最大距离处检测到标记的纤维，表明这些纤维再生并且不是保留的。
总地来说，以上结果表明通过4Ig或MβCD从脂筏排除再生蛋白促进SCI后轴突再生和相伴的功能恢复。
实施例11
视神经挤压后再生蛋白需要脂筏来阻碍轴突再生
为了进一步检验再生纤维，与仅染色再生纤维的GAP-43一起使用视神经挤压模型。本研究表明通过阻断再生蛋白向脂筏的招募，4Ig或N-筏的处理促进视神经损伤后轴突再生，如上述脊髓损伤后所观察到的。
损伤后，动物接受4Ig或N-筏的IV注射，并在21天后检查轴突再生(图7)。通过GAP-43免疫染色使再生显象，其定位至神经近残端和远残端的再生成年RGC轴突。
对照中，少数轴突穿过视神经内的病变位点，并且在挤压位点生长锥突然停止(图7A)。对照中再生轴突限于长度小于250μm并且对每个视神经观察到平均约408个再生轴突超出病变位点之外(图7A和7E；小于250μm：224±36；250-500μm：108±12；和大于500μm：76±24)。
相反，4Ig处理的动物显示了超出病变位点的增加的再生以及神经邻近部分中更明显的轴突出芽(图7B和7E)。相对于对照，通过长度定量轴突数显示4Ig将再生轴突数显著提高了5.7倍(图7B、E；小于250μm：1134±68；250-500μm：640±128和大于500μm：410±64)。接受N-筏的动物还显示与4Ig相当程度的超出病变位点之外的再生(图7C和7E)。因此，这些数据表明4Ig和N-筏两者均改善有髓鞘的成年CNS中轴突的再生。
在这些研究中，还检验了胆固醇减少是否促进视神经挤压后的轴突再生。测量了MβCD处理28天的一段时间内的大鼠中的轴突长度(图7D和7E)。对于所有测量的距离，MβCD处理的动物中每个截面的平均轴突数比对照显著提高7.1倍(图7D和7E；小于250μm：23.7±1.2；250-500μm：10.7±0.9；和大于500μm：8.4±1.4)。
视神经挤压后，对于损伤后用4Ig、N-筏和MβCD处理4周的提高的轴突/体细胞保存，检验RGC轴突的视网膜内部完整性。用CTB-FITC可视化标记具有完整轴突的存活的RGC细胞体(图14C)。4Ig、N-筏和MβCD处理导致(1)整个视网膜中更厚的轴突束和(2)RGC体细胞标记的提高，这与这些治疗在细胞存活和轴突再生中的作用一致。
总地来说，这些数据显示再生蛋白介导了视神经损伤后的轴突再生障碍以及通过4Ig、N-筏或MβCD防止再生蛋白与脂筏结合导致轴突再生。
由于星形神经胶质细胞不受4Ig、N-筏或MβCD处理的影响，因此这些处理的促再生作用是由对再生轴突的作用所产生的(图14)。因此，这些数据表明改变脂筏中再生蛋白的存在促进了CNS-损伤后轴突的再生。
实施例12
实施例13的材料和方法
本文在实施例12中提供了在实施例13中如下所述的实验中使用的材料和方法。
构建体。除非另作说明，否则从原鸡(普通家鸡，Gallusgallus)产生在本研究中使用的所有构建体。具体地，将N-RGMa(即氨基酸28-73；在本文中还称为“N-筏”)分成4个重叠片段：(1)氨基酸28-54，在本文中称为“N-RGMa(28-54aa)”；(2)氨基酸40-62，在本文中称为“N-RGMa(40-62aa)”；(3)氨基酸55-73，在本文中称为“N-RGMa(55-73aa)”；和(4)氨基酸64-62，在本文中称为“N-RGMa(54-62aa)”。将这些序列克隆至Psectag2B-AP质粒，其使得能够作为与碱性磷酸酶标签融合的可溶性蛋白的肽分泌。
结合测定。在96孔微量滴定板(CorningIncoporated)中进行测定。将孔用100μl(10μg/mL)的聚-L-赖氨酸在4℃涂覆过夜。然后，将孔用100μlPBST(+0.02％吐温)清洗3次。
50μl(2.5μg/mL)的His-标签：将全长再生蛋白；再生蛋白的4Ig结构域；和再生蛋白的6FNIII结构域在37℃涂覆到每个孔中1h。100μlPBST清洗3次后，然后在37℃用300μl3％BSA在PBST中的溶液封闭每个孔1小时。
50μl(1.0μg/mL)AP-标签：然后将N-RGMa(28-73)；N-RGMa(28-54)；N-RGMa(40-62)；N-RGMa(54-73)；N-RGMa(54-62)在1％BSA+PBST中的溶液加入到每个孔中并在37℃温育1小时。将每个孔用100μlPBST彻底清洗三次，然后用碱性磷酸酶(AP)显影缓冲液(100mMNaHCO3，1mMMgCl2)平衡每个孔。使用添加有p-硝基苯磷酸酯(pNPP)(Sigma-Aldrich)的AP显影缓冲液使反应显色，并使其显影直至出现颜色。加入50μl(0.1M)NaOH终止反应。使用自动酶标仪(BIO-TEKInstrumentsInc.)在405纳米(nm)波长测量每个反应的吸光值。
实施例13
如上所述，RGMa的N-筏结合至再生蛋白4Ig结构域以介导再生蛋白定位至脂筏所需的RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用。N-筏为RGMa的残基28-73。为了进一步鉴定N-筏内对再生蛋白4Ig-结构域的结合位点，将N-筏分成4个重叠片段：N-RGMa(28-54aa)；N-RGMa(40-62aa)；N-RGMa(55-73aa)和N-RGMa(54-62aa)。纯化这4个片段并测试与全长再生蛋白、再生蛋白的4Ig-结构域和再生蛋白的6FNIII-结构域的结合(图17A-17C)。
这些研究表明N-RGMa(40-62aa)和N-RGMa(54-73aa)特异性结合至再生蛋白的4Ig-结构域(图17C)。还如上所述，全长RGMa不结合再生蛋白的4Ig结构域。另外，N-RGMa(28-54aa)不结合再生蛋白的4Ig结构域。
与结合4Ig的片段(即N-RGMa(40-62aa)和N-RGMa(55-73aa))重叠的N-RGMa(54-62aa)不结合再生蛋白的4Ig结构域。该结果表明结合再生蛋白4Ig结构域所需的氨基酸和/或结构定位在RGMa的残基40-73之间。
结合研究显示两个重叠片段：N-RGMa(40-62aa)和N-RGMa(55-73aa)特异性结合至再生蛋白的4Ig结构域，而全长RGMa蛋白以及N-RGMa(28-54aa)片段不结合。还测试了来自小鼠的N-RGMa(SEQIDNO:10)和N-RGMc(SEQIDNO:9)，并且表明了与再生蛋白的4Ig结构域的结合，如来自人再生蛋白的N-RGMa部分一样(数据未显示)。为了进一步分离N-RGMa的结合结构域，研究了与以上提及的结合研究中鉴别的所关心的特定区域重叠的第4重叠片段N-RGMa(54-62aa)对再生蛋白的结合性质。N-RGMa(54-62aa)片段不结合再生蛋白的4Ig结构域。这表明在40-73aa区域中N-RGMa与再生蛋白的4Ig的结合需要关键折叠组合物。
实施例14
视网膜变性
视杆(rod)的不可逆丧失是色素性视网膜炎(RP)患者中进行性和永久性功能缺陷的主要决定因素。由于细胞凋亡丧失视杆，这是由遗传突变造成的。然而，RP中还存在进行性视锥丧失。当存在氧胁迫时，阻断再生蛋白向脂筏的招募促进神经元体内和体外存活。RP中氧胁迫有助于视锥死亡。因此，进行研究以确定在视网膜变性中阻断再生蛋白向脂筏的招募是否抑制感光细胞死亡和促进视锥和视杆存活。
具体地，这些研究表明成年视杆和视锥中表达再生蛋白(图18)。使用rd1小鼠确定再生蛋白是否参与视杆死亡。rd1小鼠模型是人RP的模型并且在编码视杆光受体cGMP磷酸二酯酶-6.2的β-亚基的基因中具有功能丧失突变。该功能丧失突变导致cGMP积累，其导致光受体细胞死亡。具体地，rd1小鼠在出生后9天(P9)和在P21显示出细胞凋亡，超过90％的光受体细胞死亡。
在这些研究中，在P9和P15眼球内注射4Ig(2μg/μl)肽，并在P21处死动物以检查细胞存活。与不接受4Ig肽处理的对照动物相比，4Ig肽处理显著改善视网膜内光受体的数目。另外，在注射PBS而不是4Ig肽的对照动物中，光受体层的厚度为平均约2个细胞。注射4Ig将外核层(ONL)厚度提高至约6个细胞(图19)。该测量为ONL的平均厚度。因此，这些数据表明与对照小鼠相比，用如上所述阻断再生蛋白定位至脂筏的4Ig肽处理将ONL的厚度提高了超过3倍。
为了确定破坏脂筏是否促进rd1小鼠中细胞的存活，检验了胆固醇减少对光受体细胞存活的影响。如上所述，胆固醇减少除去了脂筏。具体地，从P9至P21，每天皮下(IP)注射MβCD治疗小鼠。在这些治疗的小鼠中，改善了光受体的存活(图21和22)。MβCD促进细胞存活的程度与4Ig处理所观察到的类似，即ONL平均厚度增加3倍，并且平均深度为约6个细胞。因此，这些数据表明消除胆固醇促进光受体细胞存活。
为了检查降低胆固醇合成对细胞存活的影响，在rd1小鼠中检查了AY-9944(图20和21)。在P9和P15使用AY-9944的两次腹膜内注射治疗rd1小鼠，并在P21处死。与MβCD类似，AY-9944促进rd1小鼠中光受体存活。因此，这些数据表明降低胆固醇合成促进rd1小鼠中光受体存活。
总地来说，以上数据表明在作为人色素性视网膜炎模型的rd1小鼠中阻断再生蛋白向脂筏的招募降低了光受体细胞的死亡并促进了光受体细胞的存活。
实施例15
用AY-9944和BM15.766抑制胆固醇生物合成促进髓鞘质上视网膜神经节神经突(细胞轴突，neuritis)的生长
如上所示，降低胆固醇合成的AY-9944促进神经元细胞存活。为了进一步检验降低胆固醇合成的作用，实施研究以检验降低胆固醇合成是否促进髓鞘质上视网膜神经节细胞轴突的生长。
具体地，从E7鸡胚制备视网膜外植体并在涂覆了层粘连蛋白或髓鞘质的盖玻片上培养，并用对照(DMSO)或者AY-9944(1μM)或BM15.766(4μM)处理，其中AY-9944和BM15.766是胆固醇生物合成的两个抑制剂。培养18小时后，用4％PFA固定外植体并用Alexa488-毒伞素染色。使用Cellsens软件测量神经突。在层粘连蛋白(对照)或者髓鞘质(CNS的抑制化合物)上培养视网膜外植体。在层粘连蛋白上，与髓鞘质相比，轴突生长正常，这是因为髓鞘质抑制长出。当将胆固醇抑制剂加入至培养基中时，它们不影响在层粘连蛋白上长出。然而，它们在髓鞘质上恢复长出，这表明它们抑制髓鞘质的抑制活性。
实施例16
实施例17的材料和方法例
本文在实施例15中提供了在实施例16中如下所述的实验中使用的材料和方法。
局灶性脑缺血模型(cerebralfocalischemiamodel)。在所有实验中，使用了体重200-250g的雌性斯普拉-道来氏大鼠。简要地，通过将预先形成的凝块注射到MCA中引起局灶性脑缺血。开始用3.0％异氟烷麻醉大鼠，然后手术期间使用面具(facemask)通过在30:70O2和NO2混合物中的1.5％异氟烷维持。手术期间以及手术后立即用加热板将体温正常的大鼠的体温维持在37℃直至动物完全从麻醉中恢复。
在腹侧颈部皮肤中线切开1.5cm纵向切口。暴露右侧颈总动脉(CCA)、右侧颈内动脉(ICA)和右侧颈外动脉(ECA)。结扎并切开ECA远端部分。将填充了牛凝血酶(Thrombostat,TMWarner-LambertCo.)的改造的聚乙烯-10导管通过小型穿刺引入右侧ECA腔内。将10微升血液吸入导管，并保留15min以允许形成凝块。一旦形成凝块，将导管向前17mm进入颈内动脉直至其尖部距MCA起点1-2mm。然后注射在导管中预形成的凝块，然后除去导管。手术通常在15min内完成，并闭合伤口。然后，将动物返回其笼中。在返回笼中后，监控动物的正常恢复。
脑梗死体积和水肿的定量。梗死体积表示为同侧半球总体积的百分比。通过计算2半球之间体积差异并除以左半球的体积来确定脑水肿。
简要地，MCA闭塞(occlusion)后7天，将麻醉大鼠处死。从颅骨除去脑，并在冰冷盐水中冷却约5分钟。对于形态测定检查，使用大鼠脑基质切割2mm厚的冠状面。采集总计8个冠状面，并使用2％的2,3,5-三苯基氯化四唑溶液染色切片。在正常红色脑背景上，梗死显示出苍白色。用ScanJet(HewlettPackard)平板扫描仪扫描染色的脑切片。分析图像并且梗死体积和水肿的确定是不知情的。使用下式计算梗死体积：
梗死体积＝[左半球体积-(右半球体积-测量的梗死体积)]/左半球体积。
使用下式确定脑肿胀：
肿胀(水肿)＝(右半球体积-左半球体积)/左半球体积。
梗死体积和脑肿胀用百分比表示。
神经学缺陷和癫痫发作(seizureactivity)。在缺血性损伤后，由不了解已进行程序的观察员在2、8、24、48、72小时和1周(每只大鼠6次)时小心地评价每只大鼠的神经学缺陷和癫痫发作。
简要地，使用改良的Bederson氏评分系统确定神经学缺陷。在改良系统中，使用0-4的评分尺度来代替先前的标准分级(尺度0-3)系统以评价行为。与未改良的评分系统相比，改良的评分系统在临床上更相关，并且评价行为的能力更强。用拉辛得分(Racinescale)对癫痫发作分类。还记录了死亡率。
实施例17
中风
中风后，人成年神经系统(髓鞘质中)和半影区(penumbra)中高度表达RGMa。人脑中局灶性脑缺血后，在病变位点以及梗死周围区域中，RGMa上调。病变位点和梗死周围区域再生受限。如上所述，RGMa抑制轴突生长，并因此，抑制损伤区域中的再生。因此，进行进一步研究来检验缺血性损伤(如中风)后的RGMa/再生蛋白途径。
RGMa促进缺血性损伤后的神经元存活。为了评价中风中RGMa/再生蛋白途径的作用，使用体外中风模型(糖氧剥脱(oxygenglucosedeprivation)；OGD)研究中风引起的细胞死亡。
具体地，对视网膜全样载片(全标本，wholemount)进行OGD1小时。缺血后，将全样载片温育24小时，并使用碘化丙啶(PI)染色鉴别死细胞。使用这种方法，观察到培养基中加入RGMa促进细胞存活(图22)。这种方法还显示再生蛋白介导细胞存活中的这种促进，这是因为抗再生蛋白抗体恢复细胞死亡。
为了拓展本研究，测试了结扎主要眼动脉后，向眼中注射RGMa是否影响细胞存活以引起眼缺血。与对照相比时，这种注射治疗将存活提高了多至2倍(图23)，进一步表明缺血性损伤后，再生蛋白/RGMa途径参与细胞死亡。
破坏再生蛋白与脂筏的结合促进OGD后的细胞存活。为了确定再生蛋白是否需要结合脂筏以引起细胞死亡，在存在4Ig的情况下，对视网膜全样载片进行OGD，如上所述这防止再生蛋白定位至脂筏。这些研究表明与对照相比，4Ig肽提高细胞存活并将死神经元数目降低2倍(图24)。
破坏再生蛋白与脂筏的结合体内降低了脑损伤。为了确定再生蛋白是否需要脂筏结合以引起细胞死亡，使用血凝块进行脑中动脉阻塞(middlecerebralarteryocclusion)。通过每天注射肽对照或4Ig处理动物。在这些研究中，进行动物功能评价并检验脑损伤。这些研究表明与对照相比，存在4Ig时脑水肿和梗死体积显著降低(图25和26)。另外，与对照相比，4Ig处理的动物中行为缺陷也显著降低(图27)。
总地来说，这些数据表明缺血性事件(如中风)后，阻断再生蛋白与脂筏的结合促进细胞存活并减少脑水肿、梗死体积和行为缺陷。
实施例18
多发性硬化
以上数据表明在脊髓损伤和视神经损伤模型中4Ig肽促进神经元细胞存活和轴突再生，上述模型是多发性硬化的相关模型。为了确定调节RGMa/再生蛋白途径是否减少多发性硬化，用4Ig肽处理EAE小鼠模型，如上所述，其阻断了再生蛋白向脂筏的定位。
具体地，测试了4Ig是否减少EAE模型中的瘫痪。为了引起EAE，向C57BL6/J小鼠注射与完全弗氏佐剂(CFA)混合的MOGp35-55肽(50μg，第0天)的乳液。第2天，所述动物还腹膜内接受了400ng的百日咳毒素(PTX)以产生严重且可靠的EAE，然后在17天的一段时间内，检查临床症状(图28)。
在引起EAE后的第3、6和9天，用3μg4Ig在PBS中的溶液(IV注射)或PBS(对照)处理动物。17天后，对照小鼠显示出接近5的临床得分，表明它们严重瘫痪(图29)。相反，4Ig注射的小鼠具有显著更低的得分(1.4)，表明在这些小鼠中免疫介导的瘫痪需要在脂筏中存在再生蛋白，这是因为如上所述4Ig阻断脂筏中再生蛋白的存在。
总地来说，这些数据表明阻断再生蛋白通过4Ig肽向脂筏的招募减少了EAE模型中的瘫痪。
实施例19
阻断RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用的抗体的制备
如上所述，以下RGMa部分结合再生蛋白的4Ig结构域：氨基酸28至73(即N-筏和SEQIDNO:2)、氨基酸40至62(即SEQIDNO:4)和氨基酸54至73(即SEQIDNO:3)。如上所述，再生蛋白的4Ig结构域是登录号No.AAC59662(SEQIDNO:1)的氨基酸1至383。其它片段可以包括小鼠再生蛋白的4Ig结构域(SEQIDNO:8)、小鼠N-RGMc(SEQIDNO:9)、小鼠N-RGMa(SEQIDNO:10)或登录号No.AAI43272(人再生蛋白；SEQIDNO:11)的氨基酸1至417。
不同于这些RGMa肽，全长RGMa不能结合再生蛋白的4Ig结构域，如图2A所示。另外，图17C中的数据表明RGMa的氨基酸40至73还可以结合再生蛋白的4Ig结构域。SEQIDNO:7中显示了RGMa的氨基酸40至73。总的来说，这些数据表明可能需要RGMa的氨基酸40至73内包含的RGMa的特定结构来结合4Ig，并因此介导RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用和再生蛋白向脂筏的招募。在全长RGMa中，该结构可以闭塞(occluded)，因此防止全长RGMa与再生蛋白的4Ig结构域结合。可以通过另一因素(例如，BMP)除去这种闭塞，如上所述，这是再生蛋白向脂筏招募所需的。闭塞(咬合，occlusion)的去除可以包括RGMa中构象的变化。
因此，结合4Ig结构域或RGMa氨基酸40至73内包含的这种结构的抗体可以阻断RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用，并因此阻断再生蛋白向脂筏的招募，促进神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。
这些RGMa肽和4Ig肽将用于产生和鉴别阻断RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用的抗体，并因此阻断再生蛋白向脂筏的招募。预期通过阻断再生蛋白向脂筏的招募，这些抗体将促进神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。
具体地，将通过用一种或多种RGMa肽或4Ig肽免疫动物来产生这些抗体。将从动物收集血清，并结合图2A、图9和图17使用所述结合测定，对血清筛选破坏N-筏和4Ig之间相互作用的那些血清，即在存在血清的情况下，N-筏和4Ig之间的结合降低或不可测。然后，从破坏N-筏和4Ig之间相互作用的那些血清纯化抗体。预期这些纯化的抗体将阻断再生蛋白向脂筏的招募，并因此促进神经元细胞存活和轴突生长和/或再生。
应理解上述详细说明和所附实施例仅是说明性的并且不应视为对本发明范围的限制，本发明的范围仅由所附权利要求以及它们的等价形式限定。
所公开的实施方式的多种改变和修改对于本领域技术人员是显而易见的。在不背离其精神和范围的情况下，可以做出这些改变和修改，其无限制地包括与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成体、组合物、制剂或使用方法有关的那些。

Claims (65)

1.一种促进(i)神经元细胞存活和(ii)轴突生长和/或轴突再生两者的试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂，其中所述试剂破坏脂筏。
3.根据权利要求1所述的试剂，其中所述试剂破坏反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用。
4.根据权利要求1所述的试剂，其中所述试剂为肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合。
5.根据权利要求4所述的试剂，其中所述试剂为肽试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂，其中所述肽试剂包含选自下列所组成的组的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列以及它们的任意组合。
7.根据权利要求6所述的试剂，其中所述肽试剂包含以下氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列。
8.根据权利要求6所述的试剂，其中所述肽试剂包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
9.根据权利要求6所述的试剂，其中所述肽试剂包含SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。
10.根据权利要求6所述的试剂，其中所述肽试剂包含SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。
11.根据权利要求6所述的试剂，其中所述肽试剂包含SEQIDNO:7所示的氨基酸序列。
12.根据权利要求6所述的试剂，其中所述肽试剂包含SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。
13.根据权利要求6所述的试剂，其中所述肽试剂包含SEQIDNO:9所示的氨基酸序列。
14.根据权利要求6所述的试剂，其中所述肽试剂包含SEQIDNO:10所示的氨基酸序列。
15.根据权利要求6所述的试剂，其中所述肽试剂破坏反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用，借此阻断再生蛋白向脂筏的招募。
16.根据权利要求4所述的试剂，其中所述试剂为抗体。
17.根据权利要求16所述的试剂，其中抗体特异地结合选自下列所组成的组的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、以及SEQIDNO:10所示的氨基酸序列。
18.根据权利要求17所述的试剂，其中所述抗体特异地结合以下氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列。
19.根据权利要求17所述的试剂，其中所述抗体特异地结合SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
20.根据权利要求17所述的试剂，其中所述抗体特异地结合SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。
21.根据权利要求17所述的试剂，其中所述抗体特异地结合SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。
22.根据权利要求17所述的试剂，其中所述抗体特异地结合SEQIDNO:7所示的氨基酸序列。
23.根据权利要求17所述的试剂，其中所述抗体特异地结合SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。
24.根据权利要求17所述的试剂，其中所述抗体特异地结合SEQIDNO:9所示的氨基酸序列。
25.根据权利要求17所述的试剂，其中所述抗体特异地结合SEQIDNO:10所示的氨基酸序列。
26.根据权利要求17所述的试剂，其中所述抗体破坏反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用，借此阻断再生蛋白向脂筏的招募。
27.根据权利要求4所述的试剂，其中所述试剂为降胆固醇试剂。
28.根据权利要求27所述的试剂，其中所述降胆固醇试剂选自下列所组成的组：甲基-β-环糊精(MβCD)、胆固醇氧化酶(CO)、AY-9944、抑制素、枯草溶菌素9(PCK9)抑制剂、制霉菌素、非律平、前蛋白转化酶、BM15.766、烷基磷脂类似物及其任意组合。
29.根据权利要求28所述的试剂，其中所述降胆固醇试剂破坏脂筏，借此破坏再生蛋白向脂筏的招募。
30.一种治疗对其有需要的受试者中疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1所述的试剂。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述疾病选自下列所组成的组：色素性视网膜炎、缺血、多发性硬化、脊髓损伤和视神经损伤。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述缺血为中风。
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述试剂为肽试剂、抗体、降胆固醇试剂或它们的任意组合。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述试剂为所述肽试剂，并且其中所述肽试剂包含选自下列所组成的组的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、SEQIDNO:10所示的氨基酸序列以及它们的任意组合。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述试剂为所述降胆固醇试剂，并且其中所述降胆固醇试剂选自下列所组成的组：甲基-β-环糊精(MβCD)、胆固醇氧化酶(CO)、AY-9944、抑制素、枯草溶菌素9(PCK9)抑制剂、制霉菌素、非律平、前蛋白转化酶、BM15.766、烷基磷脂类似物及其任意组合。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述试剂为所述抗体，并且其中所述抗体特异地结合选自下列所组成的组的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列、SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列。
37.根据权利要求30所述的方法，还包括破坏RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用。
38.根据权利要求30所述的方法，还包括破坏脂筏。
39.根据权利要求31所述的方法，其中所述疾病为脊髓损伤并且其中所述方法还包括使所述受试者的运动功能恢复。
40.根据权利要求31所述的方法，其中所述疾病为色素性视网膜炎并且其中所述方法还包括促进所述受试者中感光细胞的存活。
41.根据权利要求32所述的方法，其中所述方法还包括减轻所述受试者中梗死体积、脑水肿或它们的组合中的至少一种。
42.一种鉴别调节反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间顺式相互作用的试剂的方法，所述方法包括：
(a)形成包含RGM肽和再生蛋白肽的混合物，其中所述RGM肽包含选自下列所组成的组的氨基酸序列：SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、SEQIDNO:9所示的氨基酸序列和SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，并且其中所述再生蛋白肽包含选自下列所组成的组的氨基酸序列：包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列、包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列；
(b)在存在所述试剂的情况下，温育所述混合物；和
(c)在步骤(b)的温育的混合物中，检测所述RGM肽和所述再生蛋白肽之间特异性结合的水平，其中在存在所述试剂的情况下所检测的所述RGM肽和所述再生蛋白肽的特异性结合水平相对于不存在所述试剂的情况下所述RGM肽和所述再生蛋白肽的特异性结合水平的差异表明所述试剂调节所述顺式相互作用。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述试剂是抗体或抗体片段。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述RGM肽是RGMa肽并且是SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
45.根据权利要求42所述的方法，其中所述RGM肽是RGMa肽并且是SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。
46.根据权利要求42所述的方法，其中所述RGM肽是RGMa肽并且是SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。
47.根据权利要求42所述的方法，其中所述RGM肽是RGMa肽并且是SEQIDNO:7所示的氨基酸序列。
48.根据权利要求42所述的方法，其中所述RGM肽是RGMc肽并且是SEQIDNO:9所示的氨基酸序列。
49.根据权利要求42所述的方法，其中所述RGM肽是RGMa肽并且是SEQIDNO:10所示的氨基酸序列。
50.根据权利要求42所述的方法，其中所述再生蛋白肽是SEQIDNO:1的氨基酸1至383。
51.根据权利要求42所述的方法，其中所述再生蛋白肽是SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。
52.根据权利要求42所述的方法，其中调节包括破坏RGMa和再生蛋白之间的顺式相互作用。
53.根据权利要求52所述的方法，其中如果在存在所述试剂的情况下所检测的所述RGM肽和所述再生蛋白肽的特异性结合水平低于不存在所述试剂的情况下所述RGM肽和所述再生蛋白肽的特异性结合水平，则所述试剂破坏所述顺式相互作用。
54.一种包含与包含SEQIDNO:1的氨基酸1至383的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的肽，其中所述肽破坏反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用。
55.一种包含与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的肽，其中所述肽破坏反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用。
56.一种包含与SEQIDNO:3所示的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的肽，其中所述肽破坏反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用。
57.一种包含与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的肽，其中所述肽破坏反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用。
58.一种包含与SEQIDNO:7所示的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的肽，其中所述肽破坏反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用。
59.一种包含与SEQIDNO:8所示的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的肽，其中所述肽破坏反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用。
60.一种包含与SEQIDNO:9所示的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的肽，其中所述肽破坏反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用。
61.一种包含与SEQIDNO:10所示的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的肽，其中所述肽破坏反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用。
62.根据权利要求6所述的试剂，其中所述肽试剂包含以下氨基酸序列：包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列。
63.根据权利要求17所述的试剂，其中所述抗体特异地结合以下氨基酸序列：包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列。
64.根据权利要求42所述的方法，其中所述再生蛋白肽是SEQIDNO:11的氨基酸1至417。
65.一种包含与包含SEQIDNO:11的氨基酸1至417的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的肽，其中所述肽破坏反义导向分子A(RGMa)和再生蛋白之间的顺式相互作用。
CN201480062905.XA 2013-09-17 2014-08-06 针对顺式RGMa/再生蛋白相互作用或脂筏的试剂及其在治疗方法中的应用 Pending CN105793284A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361878827P 2013-09-17 2013-09-17
US61/878,827 2013-09-17
PCT/CA2014/000614 WO2015039212A1 (en) 2013-09-17 2014-08-06 Agents directed against a cis rgma/neogenin interaction or lipid rafts and use of the same in methods of treatment

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105793284A true CN105793284A (zh) 2016-07-20

Family

ID=52688031

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480062905.XA Pending CN105793284A (zh) 2013-09-17 2014-08-06 针对顺式RGMa/再生蛋白相互作用或脂筏的试剂及其在治疗方法中的应用

Country Status (9)

Country Link
US (3) US20160271230A1 (zh)
EP (1) EP3046935B1 (zh)
JP (1) JP2016533318A (zh)
KR (1) KR20160055275A (zh)
CN (1) CN105793284A (zh)
AU (1) AU2014324043B2 (zh)
CA (1) CA2923772A1 (zh)
MX (1) MX2016003525A (zh)
WO (1) WO2015039212A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8883494B2 (en) * 2003-11-14 2014-11-11 Adil A. KHAN In vitro model for neuronal death
IL287291B (en) 2015-04-28 2022-09-01 Univ Osaka Rgma binding protein and use thereof
CA3169224A1 (en) 2015-09-23 2017-03-30 University Health Network Methods, compounds and compositions for modulating blood brain barrier integrity and re-myelination
KR102683861B1 (ko) * 2023-04-05 2024-07-11 주식회사 씨지헬스테크 역노화 효과를 나타내는 야마나카 인자의 유전자 전달 효율을 높이는 신규 융합펩타이드 및 이의 용도

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002072794A2 (en) * 2001-03-12 2002-09-19 Incyte Genomics, Inc. Immunoglobulin superfamily proteins
WO2007039256A3 (de) * 2005-09-30 2007-07-05 Abbott Gmbh & Co Kg Bindungsdomänen von proteinen der repulsive guidance molecule (rgm) proteinfamilie und funktionale fragmente davon sowie deren verwendung
US20110135664A1 (en) * 2009-12-08 2011-06-09 Abbott Gmbh & Co. Kg Monoclonal antibodies against the rgm a protein for use in the treatment of retinal nerve fiber layer degeneration

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US968A (en) 1838-10-08 Jedutha
US5985A (en) 1848-12-26 Pianoforte-action
US4526A (en) 1846-05-16 Improvement in the mode o
US320A (en) 1837-07-31 John dainty
US6019A (en) 1849-01-09 Cast-iron car-wheel
US938A (en) 1838-09-22 Improvement in paddle-wheels for propelling boats
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
AU6430190A (en) 1989-10-10 1991-05-16 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
EP0550436A1 (en) 1989-11-06 1993-07-14 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Protein microspheres and methods of using them
DE69232706T2 (de) 1991-05-01 2002-11-28 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Rockville Verfahren zur behandlung infektiöser respiratorischer erkrankungen
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
CA2207961A1 (en) 1995-01-05 1996-07-11 Robert J. Levy Surface-modified nanoparticles and method of making and using same
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
US6127977A (en) 1996-11-08 2000-10-03 Cohen; Nathan Microstrip patch antenna with fractal structure
US5916597A (en) 1995-08-31 1999-06-29 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Composition and method using solid-phase particles for sustained in vivo release of a biologically active agent
WO1997032572A2 (en) 1996-03-04 1997-09-12 The Penn State Research Foundation Materials and methods for enhancing cellular internalization
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
ATE287257T1 (de) 1997-01-16 2005-02-15 Massachusetts Inst Technology Zubereitung von partikelhaltigen arzneimitteln zur inhalation
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
ES2198922T3 (es) 1998-06-24 2004-02-01 Advanced Inhalation Research, Inc. Particulas porosas grandes emitadas por un inhalador.
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
KR101111103B1 (ko) 2000-02-10 2012-02-13 아보트 러보러터리즈 사람 인터류킨-18에 결합하는 항체 및 이를 제조하고 사용하는 방법
CN101525384A (zh) 2000-06-29 2009-09-09 艾博特公司 双特异性抗体及其制备方法和用途
ES2390425T3 (es) * 2000-12-22 2012-11-12 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Uso de moléculas de orientación repulsivas (RGM) y sus moduladores
AU2003280420A1 (en) * 2002-06-26 2004-01-19 Yale University Modulators and modulation of the interacton between rgm and neogenin
WO2007024715A2 (en) 2005-08-19 2007-03-01 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US8962803B2 (en) * 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002072794A2 (en) * 2001-03-12 2002-09-19 Incyte Genomics, Inc. Immunoglobulin superfamily proteins
WO2007039256A3 (de) * 2005-09-30 2007-07-05 Abbott Gmbh & Co Kg Bindungsdomänen von proteinen der repulsive guidance molecule (rgm) proteinfamilie und funktionale fragmente davon sowie deren verwendung
US20110135664A1 (en) * 2009-12-08 2011-06-09 Abbott Gmbh & Co. Kg Monoclonal antibodies against the rgm a protein for use in the treatment of retinal nerve fiber layer degeneration

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HATA KATSUHIKO 等: "RGMa inhibition promotes axonal growth and recovery after spinal cord injury", 《THE JOURNAL OF CELL BIOLOGY》 *
ITOKAZU等: "Identification of the Neogenin-Binding Site on the Repulsive Guidance Molecule A", 《PLOS ONE》 *
RETRIEVED FROM THE INTERNET: URL:HTTPA/WWW.UNIPROT.ORG/UNIPARC/U: "Anonymous:"UPI000012 FF2 F"", 《UNIPROT》 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160055275A (ko) 2016-05-17
US11497796B2 (en) 2022-11-15
MX2016003525A (es) 2017-01-06
US20160271230A1 (en) 2016-09-22
EP3046935A1 (en) 2016-07-27
AU2014324043B2 (en) 2019-05-09
CA2923772A1 (en) 2015-03-26
JP2016533318A (ja) 2016-10-27
US20230302096A1 (en) 2023-09-28
EP3046935A4 (en) 2017-08-02
AU2014324043A1 (en) 2016-03-17
EP3046935B1 (en) 2020-12-16
US20190275118A1 (en) 2019-09-12
WO2015039212A1 (en) 2015-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6514762B2 (ja) 神経突起変性に関連する疾患を診断および治療するための組成物および方法
CN1961003B (zh) 人源化抗TGF-β抗体
JP5989299B2 (ja) リゾホスファチジン酸結合のための組成物と方法
CN104650225B (zh) 用于结合鞘氨醇-1-磷酸的组合物和方法
US20230302096A1 (en) Agents directed against a cis rgma/neogenin interaction or lipid rafts and use of the same in methods of treatment
CN107929731A (zh) 利用补体途径抑制剂治疗眼部疾病
RU2662933C2 (ru) Антитела против cd26 и их применение
CN104245737B (zh) 抗adamts‑5抗体，其衍生物和用途
KR20060133049A (ko) 항-마이오스타틴 항체
CN108424451A (zh) 对TGF-β具有特异性的抗体
JP2002539076A (ja) 新脈管形成抑制のための方法および組成物
CN103405768A (zh) 用于治疗IL-1β相关疾病的方法
CN101277974A (zh) 排斥性引导分子(rgm)蛋白质家族的蛋白质的结合结构域及其功能性片段和它们的用途
JP2021520393A (ja) コネキシン４３抗体およびその使用
CN107613974A (zh) 抗‑met抗体及其使用方法
CN112384244B (zh) 连接蛋白43抗体及其用途
JP2022091967A (ja) 脊髄損傷及び疼痛を処置するための抗ＲＧＭａ（Ｒｅｐｕｌｓｉｖｅ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａ）アンタゴニスト抗体
TW202019481A (zh) 末稍神經障礙或伴隨著觀察到末稍神經障礙或星狀細胞障礙之疾病的疼痛之預防或治療方法
AU2015201676B2 (en) Anti-C5a antibodies and methods for using the antibodies
WO2010062857A1 (en) Klk-13 antibody inhibitor for treating dry eye
US20130202586A1 (en) Stem cell therapy using inhibitors of lysophosphatidic acid
US20190315848A1 (en) Anti-secretogranin iii (scg3) antibodies and uses thereof
KR102619943B1 (ko) 중증열성혈소판감소 증후군 동물모델 및 이의 제조방법
CN101616690B (zh) 用于治疗IL-1β相关疾病的方法
US20160075775A1 (en) Treatment of traumatic brain injury using antibodies to lysophosphatidic acid

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160720

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication