CN105779351A - 一种酪丁酸梭菌及其培养方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酪丁酸梭菌及其培养方法与应用。所述酪丁酸梭菌从牛瘤胃中分离得到，其分类命名为酪丁酸梭菌（<i>Clostridium </i><i>tyrobutyricum</i>）W428，其保藏编号为CCTCC NO：M 2016090。本发明所提供的瘤胃酪丁酸梭菌（<i>Clostridium tyrobutyricum</i>）W428的培养效率高，该菌能够合成益生因子丁酸，产生果胶酶、纤维素酶、葡聚糖酶等物质，提高饲料利用率。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域中的一种酪丁酸梭菌及其培养方法与应用。
背景技术
近年来，抗生素的滥用，导致的各种危害已成为一个世界性难题。世界卫生组织宣称：人类将面临无有效抗生素可用的“后抗生素时代”。在饲料中添加抗生素已经成为中国人养殖的习惯，然而长期使用抗生素又会对畜禽造成严重的危害：第一，动物体内产生耐药性细菌，抑制细胞免疫和体液免疫，严重损害动物机体免疫细胞功能，降低动物免疫力和抗病力，甚至造成免疫失败；第二，饲料、添加剂、兽药中超量使用抗生素，会通过食物链进入人体，使人们间接接触抗生素，导致人体患病时用抗生素治疗的效果消失，同时抗生素破坏肠道微生物，影响动物对营养物质的消化能力和动物的生长性能；第三，某些抗生素本身存在毒害作用，如链霉素、卡那霉素、庆大霉素、多粘菌素等。鉴于滥用抗生素潜在的弊端和危机，使致病菌产生耐药性，造成动物肠道菌群失调，免疫力下降，许多国家和地区都禁止或限制在饲料中的添加。酪丁酸梭菌可以利用葡萄糖、木糖、纤维二糖、阿拉伯糖等多种底物，发酵生产丁酸、维生素、氨基酸等益生因子；其中，丁酸是肠道上皮组织细胞的再生和修复主要营养物质。将酪丁酸梭菌添加到动物饲料具有替代抗生素预防和治疗相关动物疾病的潜力，抑制内源性疾病的发生，且增强机体免疫和血液中白细胞（CD4+）的数量，以及改善动物的生产性能和产品质量，减少抗生物用量，提高经济效率。
瘤胃作为反刍动物的消化器官，是迄今已知的、降解转化纤维素类物质效率最高的天然体系，它依赖于瘤胃微生物群体的协同作用将天然纤维类物质快速降解转化成一系列动物营养和能源物质。可以认为瘤胃是一个完美的、天然的秸秆纤维降解消化加工厂和高效厌氧发酵罐。
目前报道的能产丁酸的菌有：丁酸梭菌（Clostridium butyricum）、酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）、柔嫩梭菌（Clostridium leptum）、球形梭菌（Clostridiumcoccoides）、人罗斯拜瑞氏菌（Roseburia hominis）、霍氏真杆菌（Eubacterium hallii）、直肠真杆菌（Eubacterium rectale）、普氏栖粪杆菌（Faecalibacterium prausnitzii）和粪厌氧棒状菌（Anaerostipes caccae）。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种酪丁酸梭菌，该菌能够产生多种氨基酸、B族维生素和维生素K，分泌淀粉酶、蛋白酶以及降解饲料的果胶酶、葡聚糖酶，合成益生因子丁酸。
本发明所提供的梭菌，被鉴定为酪丁酸梭菌，来源于牦牛瘤胃内容物。
所述酪丁酸梭菌，其分类命名为酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428，已保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏编号为：CCTCC NO：M 2016090，保藏日期为：2016年3月7日，保藏地址为：中国. 武汉. 武汉大学。
本发明所提供的酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428具有以下特征：
1）菌落特征：菌落直径为(0.5～1.7) × (2.4～7.6) μm，菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，凸起，白色或乳白色。
2）细胞形态特征：细胞为杆状，顶端圆钝；革兰氏染色阳性；细胞直径1.2-3.0mm。
3）生理生化特征：厌氧生长；不水解明胶，不消化血清蛋白，能够发酵葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖和纤维二糖等糖类产酸，一个显著的特征是产生淀粉酶，水解淀粉但不水解纤维素。水解淀粉和糖类的最终代谢产物为丁酸、乙酸和乳酸，还发现有少量的丙酸和甲酸，硝酸盐还原试验均为阴性。
4）酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428的16S rRNA基因序列长度为1,513 bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的另一个目的是提供一种培养酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428的方法。
本发明所提供的培养酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428的方法，是将酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428接种于RCM培养基，在35 ℃~37 ℃、pH6~8.5的条件下培养。
在1,000 mL上述RCM培养基中含有：胰蛋白胨，10 g；牛肉膏，10 g；葡萄糖，5 g；氯化钠，5 g；酵母膏，3 g；乙酸钠，3 g；可溶性淀粉，1 g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5 g；余量为水。
上述RCM培养基还包括氧化还原指示剂，具体可为刃天青，其含量为0.5 mg。
本发明培养方法中，所需的厌氧环境是通过85% N2、10% H2和5%CO2的混合气得到的，一般注入达到1个大气压的量。其中，最适培养温度为37 ℃，最适pH为7.0。
本发明所提供的酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428易培养，培养效率高，可达4.5×109 CFU/mL。
本发明的酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428是从牦牛的瘤胃中分离得到的，是一种能够利用葡萄糖、木糖、纤维二糖、阿拉伯糖等多种底物进行产酸发酵，主要发酵产物为丁酸和乙酸，是一种适合于木质纤维素同步糖化发酵生产丁酸的菌种。由于它具有耐热耐酸及对常用抗生素有抗性等特点，在临床上广泛用于预防由大肠杆菌等病原菌。因此本发明中的酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428在饲料添加剂产业和益生因子丁酸的生产中有广阔的应用前景。
本发明所述的生物材料，其分类命名为酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）W428，已保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏编号为：CCTCCNO：M 2016090，保藏日期为：2016年3月7日，保藏地址为：中国. 武汉. 武汉大学。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
实验中所使用的RCM液体培养基的基本组成为（/ 升）：
胰蛋白胨，10 g；牛肉膏，10 g；葡萄糖，5 g；氯化钠，5 g；酵母膏，3 g；乙酸钠，3 g；可溶性淀粉，1 g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5 g；刃天青，0.5 mg；蒸馏水定容至1000 mL。
实验中所使用的RCM固体培养基是向上述RCM液体培养基中加入15 g琼脂，使其终浓度为1.5%。
实施例1、菌株酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428的分离制备
取牦牛瘤胃内容物，将其接种于以滤纸纤维素为底物的RCM液体培养基中传代培养，得到富集物；用富集物作为接种源，将其接种于以葡萄糖为底物的RCM固体培养基，用Hungate滚管技术分离得到。
将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2016090。
实施例2、菌种鉴定
一、形态及生理生化特征
将菌株酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428接种于以葡萄糖为底物的RCM固体培养基（含质量百分含量为1.5%的琼脂），在pH为7.0，温度为37 ℃的条件下厌氧培养48 h。
观察菌落及细胞的形态特征，并进行如下生理生化实验：1 革兰氏染色试验；2 血清蛋白试验；3 液化明胶试验；4 还原硝酸盐试验；5 底物利用试验。
观察结果及实验结果如下：
1）菌落特征：菌落直径为(0.5～1.7) × (2.4～7.6) μm，菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，凸起，白色或乳白色。
2）细胞形态特征：细胞为杆状，顶端圆钝；革兰氏染色阳性；细胞直径1.2-3 mm。
3）生理生化特征：厌氧生长；革兰氏染色呈阳性；不水解明胶；不消化血清蛋白；，能够发酵葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖和纤维二糖等糖类产酸，一个显著的特征是产生淀粉酶，水解淀粉但不水解纤维素。水解淀粉和糖类的最终代谢产物为丁酸、乙酸和乳酸，还发现有少量的丙酸和甲酸；硝酸盐还原试验均为阴性。
二、菌株酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定
1）提取DNA（参照TAKARA提基因组试剂盒）
将酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428接种于RCM液体培养基培养；取生长至对数晚期的发酵液，12,000转/分钟离心5分钟，去除上清液；加入500 μL的Buffer BS重悬细胞，加入50 μL的Lysozyme（20 mg/mL），充分吸打混匀，于37 ℃水浴温育1小时（每隔20分钟颠倒混匀一次）；12,000 rpm离心5分钟，弃上清；加入180 μL的Buffer GL、20 μL的Proteinase K（20 mg/mL）和10 μL的RNase A（10 mg/mL），充分吸打混匀，于56 ℃水浴温育10分钟；加入200 μL的Buffer GB和200 μL的100%乙醇，充分混匀；将Spin Column安装在Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12,000 rpm离心2分钟，弃滤液；将500 μL的Buffer WA加入至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液；将700 μL的Buffer WB加入至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液，重复一次；将Spin Column安置在Collection Tube上，12,000 rpm离心2分钟；将Spin Column安置在新的1.5 mL离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50~200 μL的65℃灭菌蒸馏水，室温静置5分钟；12,000 rpm离心2分钟洗脱DNA
2）16S rRNA基因的PCR扩增及测序
用于PCR扩增的正向引物为5’-TTTAAATTGAGAGTTTGATCCTGGC-3’，反向引物为5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCAGG-3’。PCR反应体系（25 μL）为：Mix 25 μL；ddH2O 8.5 μL；正反向引物各1 μL；DNA模板2 μL。PCR反应条件为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。
PCR产物的测序送至金唯智公司完成
测序结果表明，菌株酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428的16S rRNA基因序列长度为1,513 bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
将16S rRNA基因序列在GenBank中进行同源比对分析，结果表明，其序列与Clostridium algifaecis的16S rRNA基因序列的相似性为97%。
参照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》（第二版），根据其形态特征和生理生化特征，以及根据其16S rRNA基因序列在GenBank中的搜索结果，菌株酪丁酸梭菌W428被鉴定为新种酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）。
实施例3、酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428的培养
1）将酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428以5%的比例接种于50 ml RCM液体培养基，在25 ℃，pH 6.0的条件下培养。
RCM液体培养基的组成（/ 升）如下：
胰蛋白胨，10 g；牛肉膏，10 g；葡萄糖，5 g；氯化钠，5 g；酵母膏，3 g；乙酸钠，3 g；可溶性淀粉，1 g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5 g；刃天青，0.5 mg；蒸馏水定容至1000 mL。
培养所需的厌氧环境是通过85% N2、10% H2和5%CO2的混合气得到的，一般注入达到1个大气压的量。
实验设三次重复，平均菌体浓度达（2.5±0.3）×109 CFU/mL。
2）将酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428以5%的比例接种于50 mlRCM液体培养基，在35 ℃，pH 6.5的条件下培养。
RCM液体培养基的组成（/ 升）如下：
胰蛋白胨，10 g；牛肉膏，10 g；果糖，5 g；氯化钠，5 g；酵母膏，3 g；乙酸钠，3 g；可溶性淀粉，1 g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5 g；刃天青，0.5 mg；蒸馏水定容至1000 mL。
培养所需的厌氧环境是通过85% N2、10% H2和5%CO2的混合气得到的，一般注入达到1个大气压的量。
实验设三次重复，平均菌体浓度达（3.4±0.2）×109 CFU/mL。
3）将酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428以5%的比例接种于50 mlRCM液体培养基，在38 ℃，pH 7.0的条件下培养。
RCM液体培养基的组成（/ 升）如下：
胰蛋白胨，10 g；牛肉膏，10 g；纤维二糖，5 g；氯化钠，5 g；酵母膏，3 g；乙酸钠，3 g；可溶性淀粉，1 g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5 g；刃天青，0.5 mg；蒸馏水定容至1000 mL。
培养所需的厌氧环境是通过上海跃进医疗器械有限公司生产的YQX-I厌氧培养箱得到的。
实验设三次重复，平均菌体浓度达（4.3±0.7）×109 CFU/mL。
4）将酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428以5%的比例接种于50 mlRCM液体培养基，在42 ℃，pH 7.5的条件下培养。
RCM液体培养基的组成（/ 升）如下：
胰蛋白胨，10 g；牛肉膏，10 g；木聚糖和木糖中一种或两种，5 g；氯化钠，5 g；酵母膏，3 g；乙酸钠，3 g；可溶性淀粉，1 g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5 g；刃天青，0.5 mg；蒸馏水定容至1000 mL。
培养所需的厌氧环境是通过85% N2、10% H2和5%CO2的混合气得到的，一般注入达到1个大气压的量。
实验设三次重复，平均菌体浓度达（3.8±0.2）×109 CFU/mL。
5）将酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428以5%的比例接种于50 mlRCM液体培养基，在45 ℃，pH 8.5的条件下培养。
RCM液体培养基的组成（/ 升）如下：
胰蛋白胨，10 g；牛肉膏，10 g；蔗糖，5 g；氯化钠，5 g；酵母膏，3 g；乙酸钠，3 g；可溶性淀粉，1 g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5 g；刃天青，0.5 mg；蒸馏水定容至1000 mL。
培养所需的厌氧环境是通过85% N2、10% H2和5%CO2的混合气得到的，一般注入达到1个大气压的量。
实验设三次重复，平均菌体浓度达（2.4±0.6）×109 CFU/mL。
6）将酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428以5%的比例接种于50 mlRCM液体培养基，在47 ℃，pH 7.0的条件下培养。
RCM液体培养基的组成（/ 升）如下：
胰蛋白胨，10 g；牛肉膏，10 g；葡萄糖，5 g；氯化钠，5 g；酵母膏，3 g；乙酸钠，3 g；可溶性淀粉，1 g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5 g；刃天青，0.5 mg；蒸馏水定容至1000 mL。
培养所需的厌氧环境是通过85% N2、10% H2和5%CO2的混合气得到的，一般注入达到1个大气压的量。
实验设三次重复，三次重复中菌体均不生长。
实验结果表明：菌株酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428厌氧生长，生长温度从25 ℃-42 ℃，47 ℃不生长，最适生长温度35 ℃-37 ℃；pH生长范围6-8.5，最适生长pH为6.5-7.0。在最适生长条件下，菌体浓度可达（4.3±0.7）×109 CFU/mL。
实施例4、酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428中淀粉酶、蛋白酶的酶活测定
一、制备酶液
将酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428接种于RCM液体培养基，pH为7.0，培养温度为37 ℃，培养2天后，离心收集细胞；将细胞沉淀悬浮于PBS缓冲液中作为酶液。
RCM培养基组成为（/ 升）：
胰蛋白胨，10 g；牛肉膏，10 g；葡萄糖，5 g；氯化钠，5 g；酵母膏，3 g；乙酸钠，3 g；可溶性淀粉，1 g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5 g；刃天青，0.5 mg；蒸馏水定容至1,000 mL。
培养所需的厌氧环境是通过85% N2、10% H2和5% CO2的混合气得到的，一般注入达到1个大气压的量。
二、酶活测定
1）酶活测定反应体系（1,000 mL）包括：反应底物溶于pH 7.0的PBS缓冲液中，800 μL；酶液，200 μL。反应温度为37 ℃，反应时间30 min，采用高效液相色谱法测定产生的还原糖量。
一个酶活力单位（1U）定义为每分钟释放出1 μmol还原糖的酶量。
2）用上述酶活测定反应体系分别测定不同酶活，每个实验设三次重复：
A、淀粉酶：底物为麦芽糖，反应时间30 min，三次重复平均测的酶活为2 515.43 U/mL。
B、蛋白酶：底物为酪蛋白，反应时间30 min，三次重复平均测的酶活为93.72 U/mL。
实施例5、酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428生产丁酸
一、制备发酵液
将酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428接种于RCM液体培养基，pH为7.0，培养温度为37 ℃，培养2天后，离心收集细胞；将细胞沉淀悬浮于PBS缓冲液中作为酶液。
RCM培养基组成为（/ 升）：
胰蛋白胨，10 g；牛肉膏，10 g；葡萄糖，5 g；氯化钠，5 g；酵母膏，3 g；乙酸钠，3 g；可溶性淀粉，1 g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5 g；刃天青，0.5 mg；蒸馏水定容至1,000 mL。
培养所需的厌氧环境是通过85% N2、10% H2和5% CO2的混合气得到的，一般注入达到1大气压的量。
二、纤维床固定化发酵产丁酸
连接好纤维床生物反应器系统装置后通30 min 无菌氮气以使系统达到厌氧状态。接入100 mL 发酵液，搅拌转速控制在150 r/min，温度设定37 ℃，用6 mol/L 的NaOH 和3mol/L 的稀H2SO4控制pH 在7.0。预培养48 h 后，菌体OD 值达到8.0 左右，打开蠕动泵，将培养基经由软管泵入纤维床反应器内，泵的转速为30 mL/min，维持循环36−48 h，进行菌体固定化培养，至发酵罐内的游离菌体浓度不再降低，取出所有的发酵液并更换新鲜的发酵培养基（2 L 体系），提高泵的转速至100 mL/min，开始进行固定化发酵动力学研究。
丁酸的终产量维持在45.4−53.92 g/L 之间。
序列表
<110>南京工业大学
<120>一种酪丁酸梭菌及其培养方法与应用
<160>1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1513
<212>RNA
<213>酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428
<400> 1
tttaaattga gagtttgatc ctggctcagg acgaacgctg gcggcgtgcc taacacatgc 60
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tggggttagt gattggggtg aagtcgtaac aaggtagccg taggagaacc tgcggctgga 1500
tcacctcctt tct 1513
Claims (7)
1.一种酪丁酸梭菌，其分类命名为酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428，其保藏编号为CCTCC NO：M 2016090。
2.权利要求1所述的酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428的培养方法，是将酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428接种于RCM培养基于35 ℃~37 ℃、pH6~8.5的条件下进行厌氧培养；所述RCM培养基，在1,000 mL中含有：胰蛋白胨，10 g；牛肉膏，10g；葡萄糖，5 g；氯化钠，5 g；酵母膏，3 g；乙酸钠，3 g；可溶性淀粉，1 g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5 g；余量为水。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于：所述RCM培养基中还含有0.5 mg/L刃天青。
4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于：培养温度为37℃。
5.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于：培养pH为7.0。
6.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于：厌氧环境是通过85% N2、10% H2和5%CO2的混合气得到的。
7.权利要求1所述酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）W428在饲料添加剂领域的应用，调节畜禽肠道微生态平衡，提高畜禽的生产性能和抗病能力。
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