CN105770889B - 特异性结合脑源性神经营养因子前体蛋白的结合分子的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及特异性结合脑源性神经营养因子前体蛋白(proBDNF)的结合分子的应用。本发明首次发现proBDNF是治疗自身免疫性疾病的重要靶点，特异性结合proBDNF的结合分子对于自身免疫性疾病具有显著的缓解或治疗作用。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，更具体地，本发明涉及特异性结合脑源性神经营养因子前体蛋白(proBDNF)的结合分子的应用。
背景技术
自身免疫性疾病(AID)是指自身免疫耐受被打破，激活免疫系统攻击自身抗原，引起组织器官损害的一类疾病。其病因和发病机制尚不清楚，目前认为是由自身抗体，自身反应性T淋巴细胞或者二者共同引起的针对自身抗原的超敏反应性疾病。AID可分为器官特异性和系统性两大类。器官特异性自身免疫病指的是组织器官的病理损害和功能障碍仅限于抗体或致敏淋巴细胞所针对的某一器官。主要有桥本甲状腺炎、毒性弥漫性甲状腺肿、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮等。而系统性自身免疫病(又称全身性自身免疫病)是由于抗原抗体复合物广泛沉积于血管壁等原因导致全身多器官损害，包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、冷球蛋白血症、多发性硬化症等。
由于机制不清楚，因此目前尚无根治药物，传统的糖皮质激素和免疫抑制剂适时应用能够控制病情，提高患者生存率。但长期使用会带来一系列副反应，严重时可影响患者生活质量，甚或威胁生命。而且，还有部分患者对糖皮质激素和免疫抑制剂治疗不敏感。近年来随着对AID分子机制的深入了解，新的治疗策略不断被提出，包括基因治疗、表观遗传干预、小分子Toll样受体抑制剂、抗炎症因子抗体、B细胞清除、干细胞和调节性T细胞自体回输、树突状细胞疫苗等。这些治疗药物或方法有些已经用于临床(如贝利木单抗、利妥昔单抗等)，有些还处于临床研究阶段(如干细胞自体回输治疗等)甚至动物实验阶段(如表观遗传调控等)。但是，这些药物无法取代糖皮质激素成为一线药物，因此迫切需要新的安全有效治疗药物和方法应用于临床。
脑源性神经营养因子BDNF(brain derived neurotrophic factor)是继神经生长因子之后被发现的神经营养因子，分子量为12.4kDa，主要分布于中枢神经系统中，但在周围神经系统也有BDNF的合成，在调节神经元存活、分化、突触可塑性以及损伤修复等方面具有重要功能。目前有证据显示BDNF不仅是调控神经系统发育和情感障碍的重要因子，同时也是重要的痛觉调质。
脑源性神经营养因子的前体proBDNF(precursor for brain-derivedneurotrophic factor)是由BDNF基因经过转录、翻译后在内质网内合成的，其肽链长度为247个氨基酸，氨基酸序列理论分子量为27.8KD，但是由于蛋白糖基化修饰程度不同，分子量可以在32-36kD的范围内。ProBDNF的分子氨基酸序列第1-18位点是信号肽序列，在分泌的过程中在这个位点产生2个片段，其中一个片段是包含序列第19-129位氨基酸即前体结构域的多肽片段，称为前体结构域(proBDNF pro-domain)，另一个片段则是氨基酸序列第130-247即成熟结构域所编码的片段，经加工后形成有生物活性的成体BDNF。
目前大量证据显示proBDNF不仅作为成熟BDNF合成的中间产物，也可作为配体与其高亲和力受体p75神经营养因子受体(P75neurotrophin receptor，p75NTR)结合发挥生物学功效。有研究神经营养因子前体(包括proNGF和proBDNF等)可以促进细胞凋亡及炎性反应，但对于proBDNF及其信号在自身免疫性疾病中的作用尚不清楚。
发明内容
本发明的目的在于提供特异性结合脑源性神经营养因子前体蛋白(proBDNF)的结合分子的应用。
在本发明的第一方面，提供特异性结合脑源性神经营养因子前体蛋白(proBDNF)的结合分子的用途，用于制备预防、缓解或治疗自身免疫性疾病的药物。
在一个优选例中，所述的特异性结合脑源性神经营养因子前体蛋白的结合分子是单克隆抗体，其重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的CDR1区域、SEQ ID NO:2所示的CDR2区域和SEQ ID NO:3所示的CDR3区域；其轻链可变区具有SEQ ID NO:4所示的CDR1区域、SEQID NO:5所示的CDR2区域和SEQ ID NO:6所示的CDR3区域。
在另一优选例中，所述的特异性结合脑源性神经营养因子前体蛋白的结合分子是单克隆抗体，且其特异性识别proBDNF蛋白前体结构域第19位至第128位氨基酸序列的多肽。
在另一优选例中，所述的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
在另一优选例中，所述的单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；或其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
在另一优选例中，所述的单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；或其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在另一优选例中，所述的单克隆抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；或其轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
在另一优选例中，所述的特异性结合脑源性神经营养因子前体蛋白的结合分子是多克隆抗体。
在另一优选例中，所述的多克隆抗体是通过以抗脑源性神经营养因子前体蛋白或其蛋白片段免疫动物而产生；较佳地，其蛋白片段是SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的片段。
在另一优选例中，所述的特异性结合脑源性神经营养因子前体蛋白的结合分子是抗体，包括(但不限于)：全人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、亲和力成熟的抗体、鼠源抗体、或其一种或多种的组合。
在另一优选例中，所述的结合脑源性神经营养因子前体蛋白是人结合脑源性神经营养因子前体蛋白。
在另一优选例中，所述的自身免疫性疾病是系统性自身免疫病(又称全身性自身免疫病)。
在另一优选例中，所述的自身免疫性疾病包括(但不限于)：类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病、系统性红斑狼疮，胰岛素依赖型糖尿病(如I型糖尿病)、多发性硬化症、再生不良性贫血、冷球蛋白血症，或其组合。
在另一优选例中，所述的药物通过静脉或腹腔注射方式给药。
在另一优选例中，所述的药物还用于：缓解神经功能缺陷；或抑制中枢神经系统炎症细胞因子浸润；或缓解脊髓白质内髓鞘缺失；或降低IL-1、IL-6、IL-17、IFN-γ或TNF-α的表达。
在本发明的另一方面，提供一种预防、缓解或治疗自身免疫性疾病的方法，该方法包括：给予需要的对象有效量的特异性结合脑源性神经营养因子前体蛋白的结合分子，该结合分子可以是单克隆抗体或多克隆抗体，例如可以是人源化抗体，嵌合抗体，鼠源抗体，亲和力成熟的抗体，或其一种或多种的组合。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、实施例1中宿主菌BL21(DE3)表达的人proBDNF蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳结果。1，纯化的人proBDNF蛋白；2，低分子量蛋白标记(Protein Molecular Weight Marker(Low)，购自TAKARA，货号：3450)。
图2、本发明实施例2中HEK293F细胞表达的人proBDNF前体结构域蛋白纯化后的SDA-PAGE电泳结果。1，纯化的人前体结构域蛋白；2，低分子量蛋白标记低分子量蛋白标记(Protein Molecular Weight Marker(Low)，购自TAKARA，货号：3450)。
图3、大鼠proBDNF前体结构域融合蛋白(大鼠proBDNF pro-domain-Fc)的SDSPAGE电结果泳。泳道1的目的条带的分子量在44.3kD左右(见箭头)。
图4、本发明实施例3中各杂交瘤细胞株产生的抗proBDNF单克隆抗体的与人proBDNF和人proBDNF前体结构域的特异性抗原结合区域实验结果。
图5、本发明实施例3中各杂交瘤细胞株产生的抗proBDNF单克隆抗体与人proBDNF和小鼠proBDNF的特异性抗原结合区域实验结果。
图6、本发明实施例3的抗proBDNF单克隆抗体2B11的亚型分析结果。
图7、本发明实施例6的人鼠嵌合抗体CH2B11与本发明实施例1的人proBDNF蛋白的在不同稀释条件下的结合活性实验结果。
图8、腹腔注射2B11相对于正常组对由胶原酶诱导的Balb/C小鼠自身免疫性关节炎(CAIA模型)的体重的影响。
图9、腹腔注射2B11相对于正常组对由胶原酶诱导的Balb/C小鼠自身免疫性关节炎(CAIA模型)的关节炎评分指数的影响。
图10、腹腔注射2B11相对于正常组对由胶原酶诱导的Balb/C小鼠自身免疫性关节炎(CAIA模型)的关节肿胀程度的影响。
图11、腹腔注射2B11相对于EAE组对CFA/结核杆菌注射诱发的实验性变态反应性脑脊髓炎小鼠神经功能的治疗作用。
图12、实验性自身免疫性脑脊髓炎发病早期分别给予NSS和proBDNF抗体治疗的EAE模型小鼠的临床评分比较。
图13、实验性自身免疫性脑脊髓炎发病早期分别给予NSS和proBDNF抗体治疗的EAE模型小鼠脊髓的HE染色。
图14、实验性自身免疫性脑脊髓炎发病早期分别给予NSS和proBDNF抗体治疗的EAE模型小鼠脊髓的LFB染色；
图15、实验性自身免疫性脑脊髓炎发病早期分别给予NSS和proBDNF抗体治疗的EAE模型小鼠脊髓内各炎性细胞因子mRNA的表达；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，与Normal组和EAE+NSS组比较。
图16、实验性自身免疫性脑脊髓炎发病高峰期分别给予NSS和proBDNF抗体治疗的EAE模型小鼠的临床评分比较；**p＜0.01，***p＜0.001，与EAE+NSS组比较。
图17、实验性自身免疫性脑脊髓炎发病高峰期分别给予NSS和proBDNF抗体治疗的EAE模型小鼠脊髓的HE染色。
图18、实验性自身免疫性脑脊髓炎发病高峰期分别给予NSS和proBDNF抗体治疗的EAE模型小鼠脊髓的LFB染色。
图19、实验性自身免疫性脑脊髓炎发病高峰期分别给予NSS和proBDNF抗体治疗的EAE模型小鼠脊髓内各炎性细胞因子mRNA的表达；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，与Normal组和EAE+NSS组比较。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，首次发现脑源性神经营养因子前体蛋白(proBDNF)是治疗自身免疫性疾病的重要靶点，特异性结合proBDNF的结合分子(包括抗proBDNF的单克隆抗体和多克隆抗体)对于自身免疫性疾病具有显著的缓解或治疗作用。基于此完成了本发明。
本发明提供了能特异性结合proBDNF的结合分子，其呈现对于proBDNF的中和活性或抑制活性。
本发明的结合分子可以是完整的免疫球蛋白分子例如多克隆或单克隆抗体或者所述结合分子可以是抗原结合片段，包括但不限于Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体以及至少含有足以赋予与proBDNF的特异性抗原结合的免疫球蛋白的片段的(多)肤或其片段。在优选实施方案中，本发明的结合分子是人单克隆抗体或多克隆抗体。
根据Kabat et al.(1991)所述，CDR区是免疫学感兴趣的蛋白质的序列。在本发明的实施方案中，结合分子可包含本文揭示的二、三、四、五或者所有六个CDR区。优选地，本发明的结合分子包含本文揭示的至少两个CDR。
本发明的另一方面包括本文所述结合分子的功能变体。如果变体能与亲代结合分子竞争特异性结合proBDNF或其蛋白片段，则认为该变体分子是本发明结合分子的功能变体。换句话说，所述功能变体仍能结合proBDNF或其片段。功能变体包括但不限于一级结构序列基本相似、但是含有例如在亲代结合分子中未发现的体外或体内化学和/或生物化学修饰的衍生物。这种修饰包括乙酞化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共价附着、脂质或者脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。换句话说，亲代结合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或者含有所述氨基酸序列的所述结合分子的结合特性，即所述结合分子仍能识别并结合其靶位。
所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机PCR介导的诱变，并且可包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。
保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族己经在本领域中限定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链氨基酸(例如天冬酞胺、谷氨酞胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半肤氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸残基家族分类方式。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换。相似的小变异也可包括氨基酸缺失或者插入，或者这二者。使用本领域熟知的计算机程序可以发现确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫学活性的指导。
此外，功能变体可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者这两端的截短体。本发明的功能变体与亲代结合分子相比可具有相同或不同的、更高或更低的结合亲和性，但是仍能结合proBDNF或其片段。例如，本发明的功能变体与亲代结合分子相比对于proBDNF或其片段可具有增加或降低的结合亲和性。在本发明范围内的功能变体与本文所述亲代结合分子具有至少大约50％至大约99％、优选至少大约60％至大约99％、更优选至少大约70％至大约99％、甚至更优选至少大约80％至大约99％、最优选至少大约90％至大约99％、特别是至少大约95％至大约99％，以及特别是至少大约97％至大约99％的氨基酸序列同源性。本领域技术人员已知的计算机算法如Gap或者Bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以进行对比以及明确相似或相同的氨基酸残基。功能变体可以通过使用本领域己知的普通分子生物学方法改变亲代结合分子或其一部分而获得，所述方法包括但不限于易错PCR、寡核苷酸指导的诱变、定点诱变以及重链和/或轻链改组法。在一个实施方案中，本发明的功能变体对于proBDNF具有中和活性。所述中和活性与亲代结合分子相比可以相同或者更高或更低。当使用术语(人)结合分子时，其也涵盖所述(人)结合分子的功能变体。
作为本发明的优选方式，所述的结合分子是单克隆抗体。本发明包括：具有所述单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体，具有所述单克隆抗体可变区链的单克隆抗体。本发明还包括具有含所述的互补决定区(CDR)的轻链和重链的任何抗体，以及CDR区与本发明的单克隆抗体的CDR具有90％以上(较佳地95％以上)的同源性的任何抗体。
单克隆抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为互补决定区(CDR)，所述的CDR区将可变区间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明使用的单克隆抗体或抗体片段可以是全人的、人源化的、嵌合的或鼠源的。此处所用的“人源化抗体”指的是具有对应于人所产生抗体的氨基酸序列的抗体，和/或通过本领域已知的和本申请公开的制备人源化抗体的技术制备的抗体。人源化抗体主要指鼠源(或其它非人源的)单克隆抗体以基因克隆及DNA重组技术改造，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，有利应用于人体。人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体(也称CDR植入抗体CDRgrafting antibody)、表面重塑抗体或全人源化抗体。人源化抗体还可以使用本领域已知的各种方法产生，例如人源化抗体选自一个噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体。人源化抗体还可以通过在转基因动物中引入人免疫球蛋白位点而制备，所述的转基因动物例如，内源性免疫球蛋白基因已经被部分或完全灭活的小鼠。此外，人源化抗体还可以通过使得产生针对特定抗原的抗体的人B淋巴细胞永生化而制备。
作为本发明的优选方式，提供了一种抗proBDNF的单克隆抗体，能够特异性识别proBDNF的前体结构域(pro-domain)第19位至第128位氨基酸，其包括包含如下氨基酸序列的重链可变区(a)如SEQ ID NO:1所示的CDR1区域，(b)如SEQ ID NO:2所示的CDR2区域，(c)如SEQ ID NO:3所示的CDR3区域，和/或包含如下氨基酸序列的轻链可变区：(d)如SEQ IDNO:4所示的CDR1区域，(e)如SEQ ID NO:5所示的CDR2区域，(f)如SEQ ID NO:6所示的CDR3区域。
本发明还提供了编码本发明的至少一种结合分子、其功能变体的核酸分子。这种核酸分子可以用作中间物以进行克隆，例如用于如上述的亲和力成熟方法中。在一个优选的实施方案中，所述核酸分子是分离或纯化的。DNA分子的序列可以用常规技术，或利用杂交瘤技术获得。这些核酸分子的功能变体也是本发明的一部分。功能变体是这样的核酸序列，通过使用标准遗传密码可以将其直接翻译以提供与从亲代核酸分子中翻译的序列相同的氨基酸序列。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列。
本发明还提供了包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。所述载体可以是真核细胞载体或原核细胞载体。
本发明还提供了包含有所述载体的宿主细胞，用于表达所需的多功能抗体多肽。“宿主细胞”包括单个的细胞或细胞培养物，其能够并且已经接受包含插入的多核苷酸的载体。与使用的载体相适应，本发明的宿主细胞可以是任意的原核宿主细胞或真核宿主细胞。真核宿主细胞，包括酵母、昆虫细胞、植物细胞，哺乳动物细胞等可以是优选的，因为真核细胞存在复杂的目的蛋白的翻译后修饰(例如糖基化)，越来越多的被用于规模化的培养。常用的宿主细胞系包括猴肾细胞(COS-7ATCC CRL 1651)、人胚胎肾细胞293及其亚克隆细胞系，幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等。优选地，本发明的真核宿主细胞是CHO细胞。
本发明的特异性结合proBDNF的结合分子还可以是特异性结合proBDNF的多克隆抗体。本发明中，所用的术语“多克隆抗体(多抗)”指一组与抗原有特异性结合能力的球蛋白，其是由抗原刺激机体，产生免疫学反应后，由机体的浆细胞合成并分泌的。抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。多克隆抗体的好处在于它们的效价高，特异性高，亲和力强，灵敏度好，便于人为处理和质量控制，此外，多克隆抗体制备相对容易，更为经济。
多克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来制得。所述的proBDNF或其片段可被施用于动物(如羊，兔，小鼠，大鼠等)以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达proBDNF或其片段的细胞也可用来免疫动物来生产抗体。多克隆抗体可以用淋巴结注射法，皮下多点注射法，多途径联合注射法等免疫方法制得。在本发明的具体实施例中，采用proBDNF片段(SEQ ID NO:37)作为抗原，与弗氏佐剂混合后，背部皮下多点注射，免疫绵羊；并进行加强免疫；最终获得高效价的多克隆抗体。
本发明的特异性结合proBDNF的结合分子对于自身免疫性疾病具有缓解或治疗的作用。所述的自身免疫性疾病包括：类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病、系统性红斑狼疮、混合性结缔组织病、自身免疫性糖尿病(I型糖尿病)、多发性硬化症、再生不良性贫血等。所述的结合分子的应用还包括：缓解神经功能缺陷；或抑制中枢神经系统炎症细胞因子浸润；或缓解脊髓白质内髓鞘缺失；或降低IL-1、IL-6、IL-17、IFN-γ或TNF-α的表达。
本发明还包括包含有效量的所述结合分子的药物组合物。该组合物还可以包含药学上可接受的载体。药物组合物可以通过常规途径给药，其中包括但不限于静脉内，腹腔内注射等。本发明的药物组合物还可以与其他的自身免疫性疾病的治疗制剂合并使用。
本发明所用的术语“药学上可接受的”是指当结合分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的结合分子相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低组合物的效果。
本发明所述的“有效量”是指足以产生有益的和所需的结果的量，所述结果包括减轻疾病进展或治愈的临床结果。可以通过一次或多次给药来达到“有效量”。具体的剂量应当考虑给药途径，病人状况等因素来决定，这些是熟练医师的技能范围之内的。
可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如
；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。
本发明的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。
本发明的结合分子可以以未分离的或者分离的形式使用。此外，本发明的结合分子可以单独应用或者于包含至少一种本发明的结合分子(或其变体或片段)的混合物中应用。换句话说，所述结合分子可以组合应用，例如作为包含两或更多种本发明的结合分子、其变体或片段的药物组合物。例如，具有不同但互补活性的结合分子可以组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、缓解或治疗作用，但是或者也可以将具有相同活性的结合分子组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、缓解或治疗作用。
可以调整给药方案以提供最佳的所需应答(例如治疗应答)。合适的剂量范围可例如是0.1-100mg/kg体重，优选0.5-15mg/kg体重。此外，例如可以给予一次推注、随时间给予多次分开剂量或者根据治疗情况的紧急性而可以按比例降低或增加剂量。本发明的结合分子和组合物优选是无菌的。使得这些分子和组合物无菌的方法为本领域所熟知。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、人proBDNF抗原的原核表达
1.1pET22b-proBDNF载体构建及鉴定
以人肿瘤细胞U87MG的cDNA(购自RAYGENE公司)为模板，以如下引物进行PCR扩增，
PROBDNF-F：5’GCGAATTCCCCATGAAAGAAGCAAACATCC 3’(SEQ ID NO:15)；
PROBDNF-R：5’CCGCTCGAGTTATCTTCCCCTTTTAATGGTCAATG 3’(SEQ ID NO:16)；
获得两端带有酶切位点EcoRI/XhoI的PRO BDNF基因片段(703bp)，用EcoRI/XhoI双酶切(购自NEB公司)，得到目的基因片段proBDNF。将载体质粒pET22b(购自Novogen公司)。用EcoRI/XhoI双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收载体片段，与前述目的基因片段proBDNF在T4连接酶(购自NEB公司)作用下连接，然后转化大肠杆菌TOP10(购自LIFE公司)，经氨苄青霉素抗性筛选，经EcoRI/XhoI酶切鉴定含插入片段的阳性克隆，并通过测序验证，得到含有正确的人proBDNF基因序列的原核表达质粒pET22b-proBDNF。
1.2人proBDNF蛋白的表达与纯化
将pET22b-proBDNF质粒转化于表达宿主菌BL21(DE3)(购自Novagen公司)，并平铺于氨苄青霉素抗性的平皿上37℃倒置培养过夜，挑取单克隆进行诱导表达，挑取单克隆后振荡培养至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为1mM IPTG，30℃诱导4h后收集菌液。通过离心收集沉淀，加入1/10体积的缓冲液A(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM咪唑，pH 8.0)重悬，加入PMSF(终浓度为1mM)置冰上超声(超声3秒，间隔10秒，一轮99次，共4轮)，离心(4℃，12000g)15min，离心收集上清，通过Ni-NTA Agarose(购自QIAGEN公司)亲和柱层析，纯化得到目的表达蛋白，然后对PBS溶液进行透析，再通过12％SDS-PAGE分析透析后的纯化蛋白的纯度，A280检测其含量，并取少量进行SDS PAGE电泳检测其分子量。如图1所示的SDS-PAGE结果显示第一栏中纯化得到的目的条带分子量在30kD附近，该分子量与proBDNF分子的理论分子量27.8kD基本符合。
实施例2、人proBDNF前体结构域(人proBDNF pro-domain)的真核表达
2.1人proBDNF前体结构域表达载体V5F-pro-domain的构建
以上述得到的质粒pET22b-proBDNF为模板，以下列引物进行PCR扩增，
BDNFproVF1(SEQ ID NO:17)：5’GCTGGCTAGCACCCATGAAAGAAGCAAACATCCGAG3’；
BDNFproVR1(SEQ ID NO:18)：5’CCGCTCGAGGTGGCGCCGGACCCTCATG 3’。
获得两端带有酶切位点NheI/XhoI的人proBDNF前体结构域基因片段(350bp)。将该PCR片段用限制性内切酶NheI/XhoI(购自NEB公司)进行双酶切，获得的前体结构域基因片段和经同样NheI/XhoI(购自NEB公司)双酶切的载体V5F(购自RAYGENE公司)通过T4DNA连接酶连接后，转化于宿主菌TOP10(购自LIFE公司)中，挑取阳性克隆进行PCR鉴定，并通过测序验证正确，成功构建V5F-pro-domain质粒。
2.2人proBDNF前体结构域蛋白的表达与纯化
将生长良好的HEK293F细胞(HEK293F，购自LIFE公司)以1×106细胞/毫升的密度接种于细胞三角培养瓶，37℃，5％CO2120rpm培养过夜备用；将上述步骤获得的V5F-pro-domain质粒与脂质体(293Fectin，购自LIFE公司)分别用DMEM稀释并温和混合，室温孵育20min，将孵育好的DNA-脂质体复合物加至HEK293F细胞中，37℃5％CO2120rpm培养72h。收集细胞培养液，4500g离心15min，除去细胞取上清。取1ml的FLAG抗体亲和填料(ANTI-FLAGAgarose Affinity Gel，购自Sigma-Aldrich公司)装柱，将FLAG亲和柱用裂解缓冲液(50mMPB，0.3M NaCl，5％甘油)平衡5-10个柱体积。将离心后的细胞培养液上清以1ml/min通过FLAG亲和柱收集流穿液4℃保存。用清洗缓冲液1(50mM PB，pH7.8，0.3M NaCl，5％甘油)洗5-10个柱体积，收集洗杂液1，于4℃保存。用清洗缓冲液2(50mM PB，pH7.8，0.5M NaCl，5％甘油)洗4-5个柱体积，收集洗杂液2，于4℃保存。用洗脱缓冲液(50mM Glycine.HCl，pH3.0，0.3M NaCl，5％甘油)洗4-5个柱体积，收集洗脱液加入中和缓冲液(1M Tris.HCl pH8.0)，在透析液(50mM PB，pH7.8，0.3M NaCl，5％甘油)中4℃透析过夜，保存，并取少量进行SDSPAGE电泳。如图2所示的电泳结果显示第一栏的目的条带的分子量在20kD左右，略大于人proBDNF前体结构域蛋白的理论分子量13kD相当。不限于理论所表示的，这可能与表达的目的蛋白在真核系统中的糖基化程度有关。
实施例3、大鼠proBDNF前体结构域融合蛋白(大鼠proBDNF pro-domain-Fc)的真核表达
3.1大鼠proBDNF前体结构域融合表达载体V5FC-rat-pro-domai-Fc的构建
以大鼠cDNA(购自RAYGENE公司)为模板，以下列引物进行PCR扩增：
RatproF1：5’GCTGGCTAGCGCGCCCATGAAAGAAGCAAAC 3’(SEQ ID NO:19)；
RatproR1：5’CCGCTCGAGGCGCCGAACCCTCATAGACATG 3’(SEQ ID NO:20)；
获得两端带有酶切位点NheI/BamHI的大鼠proBDNF前体结构域基因片段(356bp)。将该PCR片段用限制性内切酶NheI/BamHI(购自NEB公司)进行双酶切，获得的前体结构域基因片段和经同样NheI/BamHI(购自NEB公司)双酶切的Fc融合表达载体V5FC(购自RAYGENE公司)通过T4DNA连接酶连接后，转化于宿主菌TOP10(购自LIFE公司)中，挑取阳性克隆进行PCR鉴定，并通过测序验证正确，成功构建V5FC-rat-pro-domain质粒。
3.2大鼠proBDNF前体结构域融合蛋白的表达与纯化
将生长良好的HEK293F细胞(HEK293F，购自LIFE公司)以1×106细胞/毫升的密度接种于细胞三角培养瓶，37℃，5％CO2120rpm培养过夜备用；将上述步骤获得的V5FC-rat-pro-domain质粒与脂质体(293Fectin，购自LIFE公司)分别用DMEM稀释并温和混合，室温孵育20min，将孵育好的DNA-脂质体复合物加至HEK293F细胞中，37℃5％CO2120rpm培养72h。收集细胞培养液，4500g离心15min，除去细胞取上清。取1ml的proteinA亲和填料(proteinAAgarose，购自RAYGENE公司)装柱，将proteinA亲和柱用裂解缓冲液(50mM PB，0.3M NaCl，5％甘油)平衡5-10个柱体积。将离心后的细胞培养液上清以1ml/min通过proteinA亲和柱收集流穿液4℃保存。用PBS(20mM PB，pH7.8，0.15M NaCl)洗5-10个柱体积，收集洗杂液1，于4℃保存。用洗脱缓冲液(100mM Glycine.HCl，pH2.5)洗4-5个柱体积，收集洗脱液加入10％体积中和缓冲液(1M Tris.HCl pH8.0)，在透析液(50mM PB，pH7.8，0.3M NaCl，5％甘油)中4℃透析过夜，保存，并取少量进行SDS PAGE电泳。如图3所示的电泳结果显示第一栏目的条带的分子量在44.3kD左右(见箭头)，与大鼠proBDNF前体结构域融合蛋白(大鼠proBDNF pro-domain-Fc)的理论分子量相当。
实施例4、抗人proBDNF前体结构域单克隆抗体的制备和鉴定
4.1重组蛋白免疫
将上述实施例1中得到的纯化人1ml proBDNF蛋白(1.0mg/mL)作为抗原与1mL完全弗氏佐剂(购自Sigma-Aldrich公司)充分乳化混合皮下免疫6-8周龄BALB/c小鼠，每只小鼠免疫100μg人proBDNF抗原。4周后人proBDNF抗原与不完全弗氏佐剂乳化混合，腹腔注射免疫小鼠，50μg每只小鼠，其后间隔2周，继续腹腔50μg抗原加强免疫。在第4次加强免疫1周后，以上述实施例2中获得的纯化人proBDNF前体结构域蛋白进行包被，通过ELISA法检测小鼠抗血清效价，继续加强免疫，直至小鼠的抗血清效价达到>105。最后一次加强免疫3周后，脾内免疫上述人proBDNF前体结构域蛋白20μg，备用。
4.2人proBDNF杂交瘤细胞株建立
小鼠经脾内加强免疫后4天，在无菌情况下取脾，用100目滤网滤过分离淋巴细胞，与骨髓瘤细胞系SP2/0融合，经次黄嘌呤、氨基蝶呤与胸苷(hypoxathine，aminop terinand thymidine，HAT)选择性培养3天后，补加HT培养基，继续培养1周。以本发明上述实施例的人proBDNF抗原包被，ELISA筛选阳性克隆，以有限稀释法进行3次亚克隆，继续连续培养2个月，最后获得稳定杂交瘤细胞系，各克隆分别命名为：2B11，2C7，5C10，4C3，6F3，2F3，8E1，1G7。
4.3抗体的纯化
分别取上述杂交瘤细胞克隆，以5×105细胞/小鼠的量分别注射各组对应的小鼠腹腔以制备腹水，取腹水100ml用2倍体积的0.06M pH 4.0的乙酸钠缓冲液稀释，缓慢滴入4％辛酸，边滴边搅拌。搅拌30min然后将混浊液于10000g下离心30min。弃去沉淀，上清液0.01M，pH 7.4的磷酸缓冲液透析过夜。取出透析液，缓慢加入等体积的饱和硫铵，静置2小时。将混浊液于10000g离心10min。弃上清液，用0.01M，pH7.4的PBS溶解。将溶解后的溶液用0.01M，pH7.4的PBS透析，其间换液两次，两次换液时间的间隔不得少于5小时。将透析溶液于10000g离心10min，弃去沉淀，收集上清液。
取蛋白G亲和柱(购自GE公司。)回复室温，用PBS(0.01M PB，0.15M NaCl，pH 7.4)平衡5个柱体积。将前段所述收集的上清液上柱，用PBS洗5个柱体积。以pH2.3，0.1M甘氨酸盐酸溶液洗脱，洗脱液加入1/10体积1M磷酸氢二钠溶液pH9.0中和。将溶液用0.01M，pH7.4的PBS透析，其间换液两次，两次换液时间间隔大于5小时。将透析溶液于10000g离心10min，上清液通过0.22um滤膜过滤保存，得到纯化的对应各克隆产生的单克隆抗体。
4.4ELISA法鉴定单克隆抗体结合区域
实验组1：用PBS(0.01M PB，0.15M NaCl，pH 7.4)对实施例1中获得的纯化的人proBDNF蛋白进行稀释。每组包含8个孔，分别用于随后加入对应的8个纯化的单克隆抗体。
实验组2：用PBS(0.01M PB，0.15M NaCl，pH 7.4)对实施例2中获得的纯化的人proBDNF前体结构域蛋白进行稀释。每组包含8个孔，分别用于随后加入对应的8个纯化的单克隆抗体。
实验组1和2稀释的蛋白分别以50ul(50ng)的体积和质量在4℃进行包被过夜。然后弃去上清，各孔用PBS洗2次，用含5％奶粉的PBS在37℃封闭2小时。然后实验组1和28个孔分别加入前述实施例3.3中获得的8个纯化的单克隆抗体50ul(1ug/ml)，37℃结合1小时。用含0.5％Tween-20的PBST洗涤3次后，加入HRP标记的羊抗鼠二抗50ul，37℃结合1小时。用含0.5％Tween-20的PBST洗涤5次后，加入ABTS底物显色15分钟，酶标仪测定405nm吸光度值。实验重复2次，取两次测量吸光度值的平均值。以吸光度值大于阴性对照孔的读数三倍以上确定为阳性。
如图4所示，纯化的单克隆抗体2B11与人proBDNF和人proBDNF前体结构域均结合，显示该抗体2B11结合于两蛋白的共有区段，即人proBDNF的前体结构域区域。
4.5单克隆抗体2B11的辣根过氧化物酶标记
将10mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于1ml水中，加入1ml 0.5M NaIO4，在4℃反应30min。加1ml 0.16M乙二醇。4℃反应30min。将10mg 2B11抗体透析至0.05M PH 9.5碳酸缓冲液，将氧化的HRP与2B11抗体混匀，4℃透析过夜加入0.4ml 1mg/ml NaBH4，4℃搅拌2h，用低浓度的NaH2PO4溶液调PH至弱酸性，加入等体积甘油备用。
4.6ELISA法测定抗体2B11结合proBDNF的种属特异性
实验组1：用PBS(0.01M PB，0.15M NaCl，pH 7.4)对实施例1中获得纯化的人proBDNF蛋白进行稀释。
实验组2：用PBS(0.01M PB，0.15M NaCl，pH 7.4)对原核表达的小鼠proBDNF(购自Alomone labs公司)进行稀释。
实验组3：用PBS(0.01M PB，0.15M NaCl，pH 7.4)对实施例3中真核表达的大鼠proBDNF前体结构域进行稀释。
实验组1、2和3稀释的蛋白分别以50ul(50ng)的体积和质量在4℃进行包被过夜。然后弃去上清，各孔用PBS洗2次，然后用含5％奶粉的PBS在37℃封闭2小时。弃去上清，加入稀释的实施例4.5中辣根过氧化物酶标记的2B11抗体1ug/ml 50ul，37℃结合1小时。弃去上清，各孔用含0.5％Tween-20的PBST洗涤3次后，加入ABTS底物显色15分钟，酶标仪测定405nm吸光度值。以吸光度值大于阴性对照孔的读数三倍以上确定为阳性。
如图5所示，2B11克隆分泌的抗体与本发明中实施例1制备得到的人proBDNF蛋白和小鼠proBDNF蛋白以及实施例3中真核表达的大鼠proBDNF前体结构域均结合。
4.7ELISA法测定克隆2B11的抗体亚型
根据分型抗体的数目建立6个实验组，各实验组每孔加入稀释的原核表达的人proBDNF(50ng)蛋白，体积50ul，4℃包被过夜。弃去上清，各孔用PBS(0.01M PB，0.15MNaCl，pH 7.4)洗2次，用含5％奶粉的PBS在37℃封闭2小时。弃去上清，每孔加入稀释的上述纯化的2B11克隆的抗体1ug/ml 50ul，37℃结合1小时。然后弃去上清，各孔用含0.5％Tween-20的PBST洗涤3次后，对实验组1-6分别加入相应的6种分型抗体(购自Sigma-Aldrich公司)：羊抗鼠IgG1、羊抗鼠IgG2a、羊抗鼠IgG2b、羊抗鼠IgG3、羊抗鼠IgA及羊抗鼠IgM，37℃结合1小时。弃去上清，各孔然后用含0.5％Tween-20的PBST洗涤3次后，加入HRP标记的驴抗羊二抗50ul，37℃结合1小时。弃去上清，各孔用含0.5％Tween-20的PBST洗涤5次后，加入ABTS底物显色15分钟，酶标仪测定405nm吸光度值。以吸光度值大于阴性对照孔的读数三倍以上确定为阳性。如图6所示，克隆2B11经鉴定为IgG1型。
实施例5、单克隆抗体2B11的序列测定
用5’-RACE法克隆2B11的序列并测序确定(具体操作请参考Takara 5’-full RACEKit说明书)：用碱性磷酸酶(CIAP)对总RNA中暴露的5’磷酸基团进行去磷酸反应。总RNA用量为2ug，反应后酚氯仿抽提回收。用烟草酸焦磷酸酶(Tobacco Acid Pyrophosphatase，TAP)去掉mRNA的5’帽子结构，保留一个磷酸基团。用T4RNA连接酶把5’RACE Adaptor连接到mRNA上，反应后酚氯仿抽提回收。用逆转录酶进行逆转录反应，所用引物为Kit提供的Random 9mers。
以逆转录产物为模板，用高保真酶PCR扩增目的基因，所用引物为：
5’：5’RACE Outer Primer：CATGGCTACATGCTGACAGCCTA(SEQ ID NO:21)；
3’：
重链：mIgG1-out primer：CCAGAGTTCCAGGTCACTGTCACT(SEQ ID NO:22)；
轻链：mκ-out primer：AGGTGCTGTCTTTGCTGTCCTG(SEQ ID NO:23)；
以上述扩增所得PCR产物为模板，进行巢式PCR，所用引物为：
5’：5’RACE Inner Primer：CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG(SEQ ID NO:24)；
3’：重链：mIgG1-inner primer：CCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTT(SEQ ID NO:25)；
轻链：mκ-inner primer：GTTCAAGAAGCACACGACTGAGG(SEQ ID NO:26)。
将上述扩增所得PCR产物纯化，经TA克隆(pGEM-T Easy Vector Kit，购自Promega公司，方法参见该Kit操作步骤)，分别得到Teasy-2B11VH和Teasy-2B11Vκ载体，然后测序分析得到单克隆抗体2B11的重链和轻链序列。重链和轻链的序列分别如SEQ ID NO:9和SEQID NO:10所示。根据KabatMan确定重链可变区和轻链可变区的序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。根据Kabat编号规则确定重链可变区的CDR1，CDR2，CDR3的序列分别如SEQ ID NO:1-3所示，确定轻链可变区的CDR1，CDR2，CDR3的序列分别如SEQ ID NO:4-6所示。
实施例6、嵌合抗体载体pH-CH2B11和pK-CH2B11的构建及结合活性的初步鉴定
6.1载体pH-CH2B11的构建
以本发明实施例5中构建的载体Teasy-2B11VH为模板，通过以下引物进行PCR扩增：
2BVHF：5’-ggctgttcacagcctttcctggtttcctgtctgaggtgaaggtggtggag-3’(SEQ IDNO:27)；
2BVHR：5’-cgatgggcccttggtggaggctgaggagacggtgactg-3’(SEQ ID NO:28)；
得到2B11抗体的重链可变区。
同时以抗体载体pH-EGFRvIII(亦即pH-CH12，该载体的构建方法见PCT/CN2009/074090的实施例7.1)为模板，进行PCR扩增：
引物FcF：5’-gcctccaccaagggcccatcg gtcttccccctgg-3’(SEQ ID NO:29)；和
引物PIHR：5’-cgcttttgagagggagtactcac-3’(SEQ ID NO:30)；
得到人IgG1的恒定区。
上述两个PCR扩增片段回收后搭桥，再用如下引物进行PCR扩增：Nhe：5’-cctagctagccaccatgagagtgctgattcttttgt ggctgttcacagcctttcct-3’(SEQ ID NO:31)；和前述引物PIHR(SEQ ID NO:30)。产物琼脂糖胶回收后NheI和NotI(购自NEB公司)双酶切，连接于同样双酶切的载体pH中，得到包含嵌合的2B11重链的表达质粒pH-CH2B11，对其进行PCR鉴定及测序确认。
6.2载体pK-CH2B11的构建
以本发明实施例5构建Teasy-2B11Vκ为模板，以下述引物PCR扩增：
2BVκF：5’-cttgcattcttgttgctttggtttccaggtgcaagatgtgacatccagatgactc-3’(SEQ ID NO:32)；和
2BVκR：5’-agccaccgtacg ttttatttccaactttg-3’(SEQ ID NO:33)；
得到单克隆抗体2B11的轻链可变区，片段回收，然后再用如下引物对上述PCR扩增片段进行扩增：Eco：5’-gatcgatatccaccatggacatgatggtccttgctcagtttcttgcattcttgttg-3’(SEQ ID NO:34)，和2BVκR(SEQ ID NO:31)。所得扩增产物经琼脂糖胶回收后EcoRV和BsiWI(购自NEB公司)双酶切，连接于同样双酶切的载体pK中，得到包含嵌合的2B11轻链的表达质粒pK-CH2B11，对其进行PCR鉴定及测序确认。
实施例7、嵌合抗体CH2B11的构建及结合活性鉴定
将上述构建的表达载体pH-CH2B11和pK-CH2B11共转染于悬浮细胞CHO中表达，3天后收集培养的细胞上清。培养的CHO细胞上清中所包含的表达的嵌合抗体CH2B11。
取培养的细胞上清进行ELISA结合实验。实验方法基本与本发明实施例4.4的方法相同，除了只包含包被的本发明实施例1制备的人proBDNF蛋白的实验组1，以及随后各孔加入本实施例中的细胞上清的梯度稀释液，而非对应的8个单克隆抗体克隆。同样以吸光度值大于阴性对照孔的读数三倍以上确定为阳性。
实验结果如图7所示，嵌合抗体CH2B11的培养的CHO细胞上清液经1:32稀释后，仍显示具有结合人proBDNF的活性，可见该抗体的结合性能非常理想。
实施例8、单克隆抗体2B11减轻类风湿性关节炎小鼠模型的临床症状
类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种病因不明的全身性自身免疫性病，好发生于中老年女性，病变主要侵及关节。关节症状一般反复发作，随着发作次数的增多，关节破坏日益严重，最后导致程度不等的功能障碍和畸形。每年因RA就诊人数超过900万次，住院人数超过25万次。RA造成的劳动能力丧失导致巨大的经济损失并给家庭带来沉重的负担。RA小鼠模型最主要采用的是胶原酶注射导致的关节炎模型(CAIA模型)。本实例采用CAIA模型评价2B11对RA的治疗效果。
1、实验动物
本实验采用SPF级6-8周Balb/C雌性小鼠，体重18-20g(由中南大学实验动物学部提供)。饲养条件为清洁级，5-6只/笼，任意供水与饲料；鼠粮用饲水浸软后喂给；实验动物完全随机法分组。
实验随机分为四组：
(1)正常对照组：正常小鼠，不建模；
(2)CAIA组：建立自身免疫性关节炎模型，但给予PBS作为对照治疗；
(3)CAIA+2B11预处理组：在造模当天至造模后7天，腹腔注射单克隆抗体2B11，
500ug/kg，每天一次，总疗程1周；
(4)CAIA+2B11治疗组：建模后17天给予单克隆抗体2B11。
2.CAIA造模制备
采用荷兰Modiquest公司胶原酶抗体复合物(由7种抗体复合物组成)腹腔注射方法进行建立CAIA模型(造模0天)。2.8mg抗体复合物溶于200ulPBS直接腹腔注射。在造模第3天，再次腹腔注射LPS25ug(Sigma公司)促进炎症反应。正常对照组则在建模0天机第3天给予相同体积的PBS。预处理组从造模第7天开始，每日腹腔注射2B11单克隆抗体500ug/kg(2B11预处理组组)，疗程一周。治疗组在造模成功后17天，给予腹腔注射2B11单克隆抗体500ug/kg，疗程一周。
3.观察指标
(1)动物体重测量：自身免疫性关节炎造模(即腹腔注射多种抗体复合物)后可导致动物体重下降。动物体重测量成为评价药物疗效一个非常重要的指标；
(2)采用关节炎严重程评分：关节炎发病程度可根据累及的关节数目进行评分，这是评价药物对自身免疫性关节炎治疗效果的最重要指标；
(3)关节肿胀程度：采用游标卡尺测量足掌的厚度作为评价关节肿胀程度。而关节肿胀程度也是评价关节炎进程及药物疗效的重要指标。
4.实验结果
(1)2B11对自身免疫性关节炎小鼠体重的影响如图8所示，与正常组相比，CAIA组在腹腔注射胶原酶抗体复合物后小鼠体重呈持续性下降。(*，p<0.05，与正常组相比；*，p<0.01，与正常组相比)。而CAIA+2B11预处理组或CAIA+2B11治疗组小鼠体重下降程度较对照组明显减轻，具有统计学差异(#，p<0.05，2B11组与对照组相比)(采用重复测量的单因素方差分析，Tukey post-hoc检验作为事后检验分析)。这说明无论是2B11预处理，还是在发病后给予2B11均可以显著减轻关节炎小鼠体重的下降程度。
(2)2B11对自身免疫性关节炎小鼠关节炎严重程度的影响：造模后，小鼠的小关节可出现红肿等症状，采用通用的关节炎严重程度评分方法(见表1)，评价2B11对自身免疫性关节炎的预防(预处理)和治疗(治疗组)的效果。
表1
如图9所示，正常组小鼠关节在整个实验过程中没有任何红肿，关节炎症评分几为0分。而在CAIA组，造模第7天开始，就出现各种小关节及踝关节肿胀关节炎评分显著增加，最高峰达到4.8分(造模后第10天)。无论在CAIA+2B11预处理还是CAIA+2B11治疗组，小鼠关节炎评分显著低于对照组，尽管仍高于正组(采用重复测量的单因素方差分析，Tukeypost-hoc检验作为事后检验分析)。这说明2B11不管是预处理还是作为治疗均能有效减轻自身免疫性关节炎小鼠的症状。
(3)2B11对自身免疫性关节炎小鼠关节肿胀度的影响：采用游标卡尺测量不同组小鼠的足掌借以评价小鼠关节肿胀程度。如图10所示，与正常组相比，对照组小鼠足掌厚度显著增加，CAIA+2B11预处理组及CAIA+2B11治疗组小鼠足掌厚度较对照组相比显著减小(*p<0.05，与正常组相比；*p<0.01，与正常组相比；#p<0.05，与实验组相比)。
实施例9、单克隆抗体2B11减轻实验性变态反应性脑脊髓炎小鼠的临床症状
实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)是临床上多发性硬化症的小鼠模型，后者被认为一种以特异性致敏的CD4+T细胞介导为主的，以中枢神经系统内小血管周围出现单个核细胞浸润及髓鞘脱失为特征的自身免疫性疾病。
1、实验动物
本实验采用SPF级6-8周雌性C57BL/6小鼠，体重18-20g(由中南大学实验动物学部提供)。饲养条件为清洁级，5-6只/笼，任意供水与饲料；实验期间3级以上瘫痪和濒危小鼠单笼饲养，鼠粮用饲水浸软后喂给；实验动物完全随机法分组。
2、EAE模型制备
七氟醚麻醉小鼠后，将MOG35-55(3mg/ml)/IFA(H37RA 4mg/ml)完全乳化后，于小鼠上背部左右两侧及左侧尾根部进行皮下注射，剂量为150μl/小鼠。同时予以腹腔注射百日咳毒素PTX(0.5μg/100μl)，剂量为50μl/小鼠，48小时后再次注射同剂量的PTX。于第7天给予MOG35-55(3mg/ml)/IFA(H37RA 2mg/ml)免疫小鼠下背部左右两侧及右侧尾根部进行皮下注射，剂量为150μl/小鼠。
3、动物分组和给药
随机分为三组，每组10只：
(1)正常组(Normal)；
(2)模型组(EAE+NSS)：造模后第8天，每天腹腔注射等体积正常羊血清，连续7天，0.2ml/只小鼠；
(3)模型+proBDNF抗体治疗组(EAE+anti-proBDNF)：造模后第9天，当EAE模型小鼠处于发病早期时，开始给予腹腔注射proBDNF多克隆抗体治疗，每天一次，连续7天(2.5mg/kg，0.2ml/只小鼠/天)。
4、观察指标
EAE模型临床评分：造模后每天进行临床评分，评分标准如下：0分，无临床症状；0.5分，尾部无力；1分，尾部瘫痪；2分，协调性运动消失；2.5分，单侧后肢瘫痪；3分，双侧后肢瘫痪；3.5分，双侧后肢瘫痪伴前肢无力；4分，前肢瘫痪；5分，濒死或者死亡。死亡鼠在发现死亡当日记为5分，次日起不再记分。
5.实验结果
如图11所示，EAE组小鼠造模后7天开始临床评分显著增加，持续至造模后32天。而EAE+2B11预处理组在造模后7天至25天，评分显著低于相同时间点的EAE组。这说明发病前给予2B11可以预防和减轻EAE导致的脊髓功能损伤。EAE+2B11治疗组则在造模后17天至29天，评分显著低于EAE组。进一步说明即便在发病后，给予2B11具有良好的治疗效果。
实施例10、抗proBDNF多克隆抗体的制备
利用如下氨基酸序列的人proBDNF抗原制备多克隆抗体：
APMKEANIRGQGGLAYPGVRTHGTLESVNGPKAGSRGLTSLADTFEHVIEELLDEDQKVRPNEENNKDADLYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKNYLDAANMSMRVRR(SEQ ID NO:37)
具体如下：
(1)采用PCR扩人proBDNF片段(反向引物5’CTAGCGCCGAACCCTCATAGA-3’(SEQ IDNO:35)；正向引物5’-TTAGCGCCGAACCCTCATAGA-3’(SEQ ID NO:36))，并把其克隆到载体pET100/D-TOPO(Invitrogen)的多克隆位点内，把质粒转染到大肠杆菌BL21内培养，细菌群生长在含100μg/ml的氨苄青霉素的1000ml LB中；在300rpm，37℃条件下进行摇荡，测培养液在580nm处的OD值0.8，然后添加IPTG至终浓度为0.5mM后，30℃条件下过夜孵化，4℃11000g离心，20分钟后收集细菌；菌斑悬浮在40ml的缓冲液中，缓冲液为50mM的磷酸化钾盐缓冲液，其中含有0.3M氯化钠，10％甘油，0.005％Triton-X 100，10mM imidazole和1mMDTT和1mM的PMSF；加入Lysozyme到溶液中至终浓度为0.2mg/ml，将该溶液置于冰上25分钟，溶解细胞；然后将该溶液进行超声裂解10次，每次30s，功率为50W，反应全程置于冰上；再次11000g，4℃离心20分钟；得到的沉淀物置于50ml的缓冲液I(由20mM pH 8.0的Tris，加入0.2M的氯化钠和1％脱氧胆酸钠盐组成)中；在冰上混匀30分钟，得到的悬浊液再次3000g离心10分钟；离心得到的沉淀物再放入冰的50ml缓冲液II(由10mM pH＝8.0的Tris，加入1mMEDTA和0.25％脱氧胆酸钠盐组成)，得到的缓解液再次3000g离心10分钟；离心得到的沉淀用40ml缓冲液II洗3遍，洗完后，溶解在40ml的8M尿素溶液中；把溶解的蛋白溶液11000g 4℃离心25分钟；获得的上清液加入镍柱内，当所有上清液都滤过后，用含有8M尿素，5mM咪唑和0.5M氯化钠的洗液清洗镍柱；再测洗出液的OD值，直到其OD值降到接近于洗液后停止清洗；含有8M尿素，1M咪唑和0.5M氯化钠唑的洗脱缓冲液加入镍柱内以洗脱目的蛋白，所收集到的蛋白通过凝胶电泳分离后进行考马斯亮蓝染色；含目的蛋白的洗脱液再用0.75M左旋精氨酸，5mM GSH(R)，0.5mM GSSH(O)，5mM EDTA和0.1M Tris(pH＝9.5)组成的溶液，来稳定蛋白质和中和PH值；蛋白溶液用2L的PBS 4℃条件下透析4小时，再换5L PBS透析4小时，再用10L PBS透析过夜；
(2)0.5mg步骤(1)得到的脑源性神经营养因子前体蛋白加入2ml含有0.4％戊二醛的PBS再加入2ml弗氏完全佐剂形成乳剂；将其皮下注射到成年绵羊背部和腹股沟的多个注射位点；随后每两周注射一次，注射抗原剂量减半，同时改用不完全弗氏佐剂，直到抗体滴度达到1/10000。
实施例11、抗proBDNF多克隆抗体用于实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)发病早期的实验
1、实验动物
本实验采用SPF级6-8周雌性C57BL/6小鼠，体重18-20g(由中南大学实验动物学部提供)。饲养条件为清洁级，5-6只/笼，任意供水与饲料；实验期间3级以上瘫痪和濒危小鼠单笼饲养，鼠粮用饲水浸软后喂给；实验动物完全随机法分组。
2、EAE模型制备
七氟醚麻醉小鼠后，将MOG35-55(3mg/ml)/IFA(H37RA 4mg/ml)完全乳化后，于小鼠上背部左右两侧及左侧尾根部进行皮下注射，剂量为150μl/小鼠。同时予以腹腔注射百日咳毒素PTX(0.5μg/100μl)，剂量为50μl/小鼠，48小时后再次注射同剂量的PTX。于第7天给予MOG35-55(3mg/ml)/IFA(H37RA 2mg/ml)免疫小鼠下背部左右两侧及右侧尾根部进行皮下注射，剂量为150μl/小鼠。
3、动物分组和给药
30只小鼠随机分为三组，每组10只：
(1)正常组(Normal)；
(2)模型组(EAE+NSS)：造模后第8天，每天腹腔注射等体积正常羊血清，连续7天，0.2ml/只小鼠；
(3)模型+proBDNF抗体治疗组(EAE+anti-proBDNF)：造模后第9天，当EAE模型小鼠处于发病早期时，开始给予腹腔注射proBDNF多克隆抗体治疗，每天一次，连续7天(2.5mg/kg，0.2ml/只小鼠/天)。
4、实验后处理
(1)EAE模型临床评分：造模后每天进行临床评分，评分标准如下：0分，无临床症状；0.5分，尾部无力；1分，尾部瘫痪；2分，协调性运动消失；2.5分，单侧后肢瘫痪；3分，双侧后肢瘫痪；3.5分，双侧后肢瘫痪伴前肢无力；4分，前肢瘫痪；5分，濒死或者死亡。死亡鼠在发现死亡当日记为5分，次日起不再记分。
(2)HE染色制片与病理评分
选取造模后35天的小鼠(每组5只)，灌流后处死，取脊髓，按常规方法脱水、透明、浸蜡、制成蜡块，切片(4μm)作HE染色，观察炎性细胞浸润。
(3)LFB染色：切片行常规LFB染色观察脱髓鞘情况。
(4)检测脊髓疾病相关基因表达：取造模后35天的小鼠脊髓(每组5只)，用Real-Time PCR检测脊髓内促炎症细胞因子IL-1、IL-6、IL-17、IFN-γ和TNF-α等基因的表达水平。
5、数据分析：
采用Graphpad prism 5.0软件进行分析，若p＜0.05认为差异有显著性。
6、结果
(1)模型小鼠发病情况：给予proBDNF抗体治疗的EAE模型小鼠的神经功能缺陷明显减少，治疗结束后的临床评分基本稳定在1分左右(图12)。
(2)病理切片及病理损伤评分：光镜结果显示模型组小鼠炎症细胞密集分布在脊髓实质内，proBDNF抗体治疗组炎症细胞浸润程度减轻，仅有少量炎症细胞浸润(图13)；LFB染色发现模型组小鼠脊髓白质内髓鞘有明显缺失，而proBDNF抗体治疗组小鼠脊髓白质内髓鞘缺失区域减少(图14)。
(3)脊髓内炎性细胞因子表达：Real-Time PCR结果如图15所示，模型小鼠脊髓内炎性细胞因子IL-1、IL-6、IL-17、IFN-γ和TNF-α表达大量增加，proBDNF抗体治疗组能显著降低IL-1、IL-6、IL-17、IFN-γ和TNF-α表达。
结果表明，疾病早期抗proBDNF多克隆抗体给药能显著改善模型小鼠神经功能评分，抑制模型小鼠的脊髓炎症细胞浸润与脱髓鞘以及炎性介质释放。
实施例12、proBDNF多克隆抗体用于EAE发病高峰期的实验
1、实验动物
本实验采用SPF级6-8周雌性C57BL/6小鼠，体重18-20g(由中南大学实验动物学部提供)。饲养条件为清洁级，5-6只/笼，任意供水与饲料；实验期间3级以上瘫痪和频危小鼠单笼饲养，鼠粮用饲水浸软后喂给；实验动物完全随机法分组。
2、EAE模型制备
七弗醚麻醉小鼠后，将MOG35-55(3mg/ml)/IFA(H37RA 4mg/ml)完全乳化后，于小鼠上背部左右两侧及左侧尾根部进行皮下注射，剂量为150μl/小鼠。同时予以腹腔注射百日咳毒素PTX(0.5μg\100ul)，剂量为50μl/小鼠，48小时后再次注射同剂量的PTX。于第七天给予MOG35-55(3mg/ml)/IFA(H37RA 2mg/ml)免疫小鼠下背部左右两侧及右侧尾根部进行皮下注射，剂量为150μl/小鼠。
3、动物分组和给药
30只小鼠随机分为三组，每组10只：
(1)正常组(Normal)；
(2)模型组(EAE+NSS)：造模后第17天，每天腹腔注射等体积正常羊血清，连续7天，0.2ml/只小鼠；
(3)模型+proBDNF抗体治疗组(EAE+anti-proBDNF)：造模后第17天,当EAE模型小鼠处于疾病高峰期时，开始给与腹腔注射proBDNF多克隆抗体治疗，每天一次，连续7天(2.5mg/kg，0.2ml/只小鼠/天)。
4、实验后处理
(1)EAE模型临床评分：造模后每天进行临床评分，评分标准如下：0分，无临床症状；0.5分，尾部无力；1分，尾部瘫痪；2分，协调性运动消失；2.5分，单侧后肢瘫痪；3分，双侧后肢瘫痪；3.5分，双侧后肢瘫痪伴前肢无力；4分，前肢瘫痪；5分，频死或者死亡。死亡鼠在发现死亡当日记为5分，次日起不再记分。
(2)HE染色制片与病理评分
选取造模后35天的小鼠(每组5只)，灌流后处死，取脊髓，按常规方法脱水、透明、浸蜡、制成蜡块，切片(4μm)作HE染色，观察炎性细胞浸润。
(3)LFB染色：切片行常规LFB染色观察脱髓鞘情况。
(4)检测脊髓疾病相关基因表达：
取造模后35天的小鼠脊髓(每组5只)，用Real-Time PCR检测脊髓内促炎症细胞因子IL-1、IL-6、IL-17、IFN-γ和TNF-α等基因的表达水平。
5、数据分析
采用Graphpad prism 5.0软件进行分析，若p＜0.05认为差异有显著性。
6、结果
(1)模型小鼠发病情况：给予proBDNF多克隆抗体治疗的EAE模型小鼠的神经功能缺陷明显减少，治疗结束后的临床评分基本稳定在1分左右(图16)。
(2)病理切片及病理损伤评分：光镜结果显示模型组小鼠炎症细胞密集分布在脊髓实质内，proBDNF抗体治疗组炎症细胞浸润程度减轻，仅有少量炎症细胞浸润(图17)；LFB染色发现模型组小鼠脊髓白质内髓鞘有明显缺失，而proBDNF抗体治疗组小鼠脊髓白质内髓鞘缺失区域减少(图18)。
(3)脊髓内炎性细胞因子表达：Real-Time PCR结果如图19所示，模型小鼠脊髓内炎性细胞因子IL-1、IL-6、IL-17、IFN-γ和TNF-α表达大量增加，proBDNF抗体治疗组能显著降低IL-1、IL-6、IL-17、IFN-γ和TNF-α表达。
结果表明，疾病高峰期proBDNF抗体给药能显著改善模型小鼠神经功能评分，抑制模型小鼠的脊髓炎症细胞浸润与脱髓鞘以及炎性介质释放。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.特异性结合脑源性神经营养因子前体蛋白的抗体的用途，用于制备预防、缓解或治疗类风湿性关节炎和多发性硬化症的药物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体，其重链可变区具有SEQ ID NO: 1所示的CDR1区域、SEQ ID NO: 2所示的CDR2区域和SEQ ID NO: 3所示的CDR3区域；
其轻链可变区具有SEQ ID NO: 4所示的CDR1区域、SEQ ID NO: 5所示的CDR2区域和SEQ ID NO: 6所示的CDR3区域。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示；其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示；或其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示。
5.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示；或其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的单克隆抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO: 13所示；或其轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO: 14所示。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗体是多克隆抗体。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的多克隆抗体是通过以脑源性神经营养因子前体蛋白或其蛋白片段免疫动物而产生。
9.如权利要求8所述的用途，其中，所述的脑源性神经营养因子前体蛋白的蛋白片段是SEQ ID NO: 37所示氨基酸序列的片段。
10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物还用于：缓解神经功能缺陷；或抑制中枢神经系统炎症细胞因子浸润；或缓解脊髓白质内髓鞘缺失；或降低IL-1、IL-6、IL-17、IFN-γ或TNF-α的表达。
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| Role of inflammatory cytokines in peripheral nerve injury;Federica Fregnan et al.;《Neural Regen Res.》;20121031;第7卷(第29期);第2259-2266页 * |
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