CN105753965A

CN105753965A - 用于受控药物递送的基于缀合物的系统

Info

Publication number: CN105753965A
Application number: CN201610103747.9A
Authority: CN
Inventors: T.C.锡安; T.M.兰卡斯特
Original assignee: SmartCells Inc
Current assignee: SmartCells Inc
Priority date: 2009-01-28
Filing date: 2010-01-27
Publication date: 2016-07-13
Also published as: KR20110104081A; KR20140012219A; SG193837A1; US10398781B2; DOP2011000244A; AU2015202872A1; BRPI1007457A2; SG2014006597A; JP5508438B2; AU2015202872B2; CA2932926C; MA33064B1; AU2015202871B2; AU2010208313A1; JP5834103B2; US9050370B2; US20140274888A1; JP2016065072A; EP2391218B1; AU2015202871A1

Abstract

本发明涉及用于受控药物递送的基于缀合物的系统。本申请涉及缀合物，其包含药物和配体，所述配体包括第一种糖；其中所述缀合物的特征在于：当将所述缀合物施用给哺乳动物时，所述缀合物的至少一种药代动力学或药效动力学性质对第二种糖的血清浓度是敏感的。提供了示例性的缀合物和持续释放制剂以及使用和制备方法。

Description

用于受控药物递送的基于缀合物的系统

本申请是申请号为201080015055.X、国际申日为2010年01月27日、国际申请号为PCT/US2010/022268、进入中国国家阶段日期为2011年09月28日的发明专利申请的分案申请。

相关申请

本申请要求2009年1月28日提交的美国临时申请号61/147,878、2009年3月12日提交的美国临时申请号61/159,643、2009年3月20日提交的美国临时申请号61/162,107、2009年3月25日提交的美国临时申请号61/163,084、2009年6月24日提交的美国临时申请号61/219,897、2009年7月7日提交的美国临时申请号61/223,572、和2009年10月19日提交的美国临时申请号61/252,857的优先权，它们各自的内容通过引用整体并入本文。

背景技术

在现有技术中已知的大多数“控释”药物递送系统(例如，Sears的美国专利号4,145,410，它描述了来自酶不稳定的胶囊的药物释放)不能以与人体中存在的分子指示剂(例如，代谢物)的量成正比的间隔和浓度给患者提供药物。在这些现有技术系统中的药物因而不是精确“受控的”，而是简单地以独立于外部或内部因素的缓释形式提供。

用注射型胰岛素治疗糖尿病是一个众所周知且经过研究的实例，其中胰岛素的失控的缓释是不希望的。实际上，显而易见，简单的激素置换不足以预防与该疾病有关的病理学结局。认为这些结局的发展反映出不能提供与患者经历的不同血糖浓度成比例的外源性胰岛素。为了解决该问题，已经提出了开发更接近生理学的胰岛素递送系统的几个生物学和生物工程方案(例如，参见：Brownlee等人的美国专利号4,348,387;Taylor等人的美国专利号5,830,506、5,902,603,和6,410,053，和Zion等人的美国专利申请公开号2004-0202719)。

这些系统中的每一个依赖于多价葡萄糖结合分子(例如，凝集素ConA)和被该多价葡萄糖结合分子可逆地结合的基于糖的组分的组合。不幸的是，ConA和许多其它的可容易得到的凝集素具有淋巴细胞增殖的潜力。通过结合在某些类型的淋巴细胞的表面上的碳水化合物受体，这些所谓的“促有丝分裂的”凝集素可以潜在地诱导淋巴细胞的有丝分裂，并从而造成它们增殖。包括ConA在内的大多数促有丝分裂的凝集素是选择性的T-细胞有丝分裂原。少数凝集素的选择性更低，刺激T-细胞和B-细胞。局部的或全身的促有丝分裂的凝集素体内暴露，可以导致炎症、细胞毒性、巨噬细胞消化和包括过敏反应在内的变态反应。另外，已知植物凝集素是特别免疫原性的，引起高效价的抗-凝集素特异性的抗体的生成。应当理解，促有丝分裂的凝集素因此不能以它们的天然形式用于体内方法和装置中，除非尽极大注意来防止它们的释放。例如，在美国专利号5,830,506中，Taylor突出了使用ConA所涉及的中毒风险，并强调了在药物递送装置内包含ConA的重要性和困难，所述装置也要求葡萄糖和胰岛素分子自由地扩散进出该装置。

如果能够提供不需要凝集素的替代性的受控的药物递送系统，可以显著减少这些和其它体内凝集素使用所涉及的风险和困难。

发明内容

发明概述

在一个方面，本公开内容提供了以响应于糖（诸如葡萄糖）的全身浓度的方式控制诸如胰岛素等药物的药代动力学(PK)和/或药效动力学(PD)特性的方法。如在实施例中所讨论的，所述方法部分地基于下述发现，即当将某些胰岛素-缀合物修饰成包括高亲和力糖配体时，甚至在没有外源性多价糖-结合分子（诸如ConA）存在下，可以使它们表现出响应于糖浓度变化的PK/PD特性。该发现是意外的，并提供了史无前例的制备简单的不含凝集素的糖-响应性的药物系统的机会。在另一个方面，本公开内容提供了示例性缀合物和制备它们的方法。一般而言，这些缀合物包括药物和一个或多个单独的配体，所述配体各自包括糖。在某些实施方案中，所述配体能够与糖(例如，葡萄糖或甘露糖)竞争结合内源性糖结合分子。在某些实施方案中，所述配体能够与葡萄糖或甘露糖竞争结合ConA。如下面更详细地讨论的，在某些实施方案中，所述配体和药物可以共价地或非共价地连接到缀合物框架上。在某些实施方案中，所述框架是非聚合的。在某些实施方案中，缀合物可以具有1的多分散性指数和小于约20,000Da的分子量。在某些实施方案中，所述缀合物是长效的(即，表现出比可溶的重组人胰岛素或RHI更持久的PK特性)。

如下面更详细地讨论的，应当理解，本文所述的方法、缀合物和制剂绝不限于胰岛素的递送，它们可以用于递送任意药物。还应当理解，所述方法可以用于响应于葡萄糖以外的糖来递送药物。具体地，如在实施例中所讨论的，已经证实，示例性缀合物会对外源糖（诸如α-甲基甘露糖和L-岩藻糖）做出响应。在某些实施方案中，这可以用于制备缀合物，所述缀合物可以通过施用这些外源糖之一来控制(即，作为通过内源葡萄糖波动来控制的替代方法或额外方法)。

定义

下面更详细地描述了在本说明书中使用的具体官能团、化学术语和一般术语的定义。为了本发明的目的，根据元素周期表（CAS版,HandbookofChemistryandPhysics,第75版,内封面），鉴别化学元素，并如其中所述，一般地定义具体官能团。另外，有机化学的一般原理、以及具体官能部分和反应性，描述在：OrganicChemistry,ThomasSorrell,UniversityScienceBooks,Sausalito,1999;SmithandMarchMarch’sAdvancedOrganicChemistry,第5版,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,2001;Larock,ComprehensiveOrganicTransformations,VCHPublishers,Inc.,NewYork,1989;Carruthers,SomeModernMethodsofOrganicSynthesis,第3版,CambridgeUniversityPress,Cambridge,1987。

酰基–本文使用的术语“酰基”表示具有下述通式的基团：–C(=O)R^X1、–C(=O)OR^X1、–C(=O)–O–C(=O)R^X1、–C(=O)SR^X1、–C(=O)N(R^X1)₂、–C(=S)R^X1、–C(=S)N(R^X1)₂和–C(=S)S(R^X1)、–C(=NR^X1)R^X1、–C(=NR^X1)OR^X1、–C(=NR^X1)SR^X1和–C(=NR^X1)N(R^X1)₂，其中R^X1是氢；卤素；取代的或未取代的羟基；取代的或未取代的硫醇；取代的或未取代的氨基；取代的或未取代的酰基；环状的或无环的、取代的或未取代的、分支的或未分支的脂族；环状的或无环的、取代的或未取代的、分支的或未分支的杂脂族；环状的或无环的、取代的或未取代的、分支的或未分支的烷基；环状的或无环的、取代的或未取代的、分支的或未分支的烯基；取代的或未取代的炔基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、脂族氧基、杂脂族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂族硫代氧基、杂脂族硫代氧基、烷基硫代氧基、杂烷基硫代氧基、芳基硫代氧基、杂芳基硫代氧基、单–或二–脂族氨基、单–或二–杂脂族氨基、单–或二–烷基氨基、单–或二–杂烷基氨基、单–或二–芳基氨基或单–或二–杂芳基氨基；或2个R^X1基团一起形成5–6元杂环。示例性的酰基包括醛(–CHO)、羧酸(–CO₂H)、酮、酰基卤、酯、酰胺、亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯和脲。酰基取代基包括、但不限于：本文所述的任意取代基，其导致稳定部分的形成(例如，脂族、烷基、烯基、炔基、杂脂族、杂环、芳基、杂芳基、酰基、氧代、亚氨基、硫代氧代、氰基、异氰基、氨基、叠氮基、硝基、羟基、硫醇、卤素、脂族氨基、杂脂族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷基芳基、芳基烷基、脂族氧基、杂脂族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂族硫代氧基、杂脂族硫代氧基、烷基硫代氧基、杂烷基硫代氧基、芳基硫代氧基、杂芳基硫代氧基、酰氧基等，它们各自可以进一步被取代或未取代)。

脂族的–本文使用的术语“脂族的”或“脂族基团”表示任选地取代的烃部分，其可以是直链的(即，未分支的)、分支的或环状的(“碳环的”)，且可以是完全饱和的，或可以含有一个或多个不饱和单元，但是它不是芳族的。除非另外指出，脂族基团含有1-12个碳原子。在有些实施方案中，脂族基团含有1-6个碳原子。在有些实施方案中，脂族基团含有1-4个碳原子，在其它实施方案中，脂族基团含有1-3个碳原子。合适的脂族基团包括、但不限于：直链的或分支的、烷基、烯基和炔基、及其杂合物，诸如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基。

烯基–本文使用的术语“烯基”表示通过去除单个氢原子从具有至少一个碳–碳双键的直链或支链脂族部分衍生出的任选地取代的单价基团。在某些实施方案中，在本发明中采用的烯基含有2-6个碳原子。在某些实施方案中，在本发明中采用的烯基含有2-5个碳原子。在有些实施方案中，在本发明中采用的烯基含有2-4个碳原子。在另一个实施方案中，采用的烯基含有2-3个碳原子。烯基包括，例如，乙烯基、丙烯基、丁烯基、1–甲基–2–丁烯–1–基等。

烷基–本文使用的术语“烷基”表示通过去除单个氢原子从含有1-6个碳原子的脂族部分衍生出的任选地取代的饱和的、直链或支链烃基团。在有些实施方案中，在本发明中采用的烷基含有1-5个碳原子。在另一个实施方案中，采用的烷基含有1-4个碳原子。在其它实施方案中，所述烷基含有1-3个碳原子。在另一个实施方案中，所述烷基含有1-2个碳。烷基的实例包括、但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、仲戊基、异戊基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、仲己基、正庚基、正辛基、正癸基、正十一基、月桂基等。

炔基–本文使用的术语“炔基”表示通过去除单个氢原子从具有至少一个碳–碳三键的直链或支链脂族部分衍生出的任选地取代的单价基团。在某些实施方案中，在本发明中采用的炔基含有2-6个碳原子。在某些实施方案中，在本发明中采用的炔基含有2-5个碳原子。在有些实施方案中，在本发明中采用的炔基含有2-4个碳原子。在另一个实施方案中，采用的炔基含有2-3个碳原子。代表性的炔基包括、但不限于：乙炔基、2–丙炔基(炔丙基)、1–丙炔基等。

芳基–如本文使用的，单独地或作为更大部分的一部分（如在“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳氧基烷基”中）使用的术语“芳基”表示具有共5-10个环成员的任选地取代的单环的和双环的环系统，其中该系统中的至少一个环是芳族的，且其中该系统中的每个环含有3-7个环成员。术语“芳基”可以与术语“芳基环”互换使用。在本发明的某些实施方案中，“芳基”表示芳族环系统，其包括但不限于、苯基、联苯基、萘基、蒽基等，其可以携带一个或多个取代基。

芳基烷基–本文使用的术语“芳基烷基”表示被芳基(例如，芳族或杂芳族基团)取代的烷基。

二价烃链–本文使用的术语“二价烃链”(也称作“二价亚烷基”)是聚亚甲基，即–(CH₂)_z–，其中z是1-30、1-20、1-12、1-8、1-6、1-4、1-3、1-2、2-30、2-20、2-10、2-8、2-6、2-4或2-3的正整数。取代的二价烃链是这样的聚亚甲基，其中一个或多个亚甲基氢原子被取代基替换。合适的取代基包括下面关于取代的脂族基团所述的那些。

羰基–本文使用的术语“羰基”表示含有碳-氧双键的单价或二价的部分。羰基的非限制性实例包括醛、酮、羧酸、酯、酰胺、烯酮、酰基卤、酸酐、脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、硫酯、内酯、内酰胺、氧肟酸酯、异氰酸酯和氯甲酸酯。

环脂族的–如本文使用的，单独地或作为更大部分的一部分使用的术语“环脂族的”、“碳环”或“碳环的”表示任选地取代的饱和的或部分不饱和的本文所述的具有3-10个成员的环状脂族单环的或双环的环系统。环脂族基团包括、但不限于，环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环庚烯基、环辛基、环辛烯基和环辛二烯基。在有些实施方案中，所述环烷基具有3-6个碳。

卤素–本文使用的术语“卤”和“卤素”表示选自氟(氟代、–F)、氯(氯代、–Cl)、溴(溴代、–Br)和碘(碘代、–I)的原子。

杂脂族的–本文使用的术语“杂脂族的”或“杂脂族基团”表示，除了碳原子以外，具有1-5个杂原子的任选地取代的烃部分，其可以是直链的(即，未分支的)、分支的或环状的(“杂环的”)，且可以是完全饱和的，或可以含有一个或多个不饱和单元，但是它不是芳族的。除非另外指出,杂脂族基团含有1-6个碳原子，其中1-3个碳原子任选地且独立地被选自氧、氮和硫的杂原子替换。在有些实施方案中，杂脂族基团含有1-4个碳原子，其中1-2个碳原子任选地且独立地被选自氧、氮和硫的杂原子替换。在其它实施方案中，杂脂族基团含有1-3个碳原子，其中1个碳原子任选地且独立地被选自氧、氮和硫的杂原子替换。合适的杂脂族基团包括、但不限于：直链的或分支的、杂烷基、杂烯基和杂炔基。

杂芳烷基–本文使用的术语“杂芳烷基”表示被杂芳基取代的烷基，其中所述烷基和杂芳基部分独立地任选地被取代。

杂芳基–如本文使用的，单独地或作为更大部分（例如，“杂芳烷基”或“杂芳烷氧基”）的一部分使用的术语“杂芳基”表示这样的任选地取代的基团，其具有5-10个环原子、优选5、6或9个环原子；具有6、10或14个在环状阵列中共享的π电子；且除了碳原子以外，具有1-5个杂原子。杂芳基包括、但不限于，噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、唑基、异唑基、二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基。本文使用的术语“杂芳基”和“杂芳–”也包括这样的基团，其中杂芳族环与一个或多个芳基、碳环或杂环稠合，其中连接的基团或点是在杂芳族环上。非限制性实例包括吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、4H–喹嗪基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩嗪基、四氢喹啉基和四氢异喹啉基。杂芳基可以是单环的或双环的。术语“杂芳基”可以与术语“杂芳基环”、“杂芳基”或“杂芳族的”互换使用，这些术语中的任一个包括任选地被取代的环。

杂原子–本文使用的术语“杂原子”表示氮、氧或硫，且包括氮或硫的任意氧化形式和碱性氮的任意季铵化形式。术语“氮”也包括取代的氮。

杂环–本文使用的术语“杂环”、“杂环基”、“杂环基团”和“杂环”互换地使用，表示稳定的、任选地取代的5-7元单环的或7-10元双环的杂环部分，它是饱和的或部分不饱和的，且除了碳原子以外，具有一个或多个上面定义的杂原子。杂环可以在产生稳定结构的任意杂原子或碳原子处连接到它的下垂基团上，且任一个环原子可以任选地被取代。这样的饱和的或部分不饱和的杂环基团的实例包括、但不限于，四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、哌啶基、吡咯啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、唑烷基、哌嗪基、二烷基、二氧戊环基、二氮杂卓基、氧氮杂卓基、硫杂氮杂卓基、吗啉基和奎宁环基。术语“杂环”、“杂环基”、“杂环基环”、“杂环基”、“杂环部分”和“杂环基团”在本文中互换地使用，且也包括这样的基团，其中杂环基环与一个或多个芳基、杂芳基或碳环（诸如二氢吲哚基、3H–吲哚基、色满基、菲啶基或四氢喹啉基）稠合，其中连接基团或点是在杂环基环上。杂环基可以是单环的或双环的。术语“杂环基烷基”表示被杂环基取代的烷基，其中所述烷基和杂环基部分独立地任选地被取代。

不饱和的–本文使用的术语“不饱和的”是指具有一个或多个双键或三键的部分。

部分不饱和的–本文使用的术语“部分不饱和的”表示包含至少一个双键或三键的环部分。术语“部分不饱和的”意在包括具有多个不饱和位点的环，但是无意包括本文定义的芳基或杂芳基部分。

任选地取代的–如本文所述，本发明的化合物可以含有“任选地取代的”部分。一般而言，无论在前面有还是没有术语“任选地”，术语“取代”是指指定的部分的一个或多个氢被合适的取代基替换。除非另有说明，“任选地取代的”基团可以具有在该基团的每个可取代的位置处的合适的取代基，且当任意给定结构中的超过一个位置可以被超过一个选自特定集合的取代基取代时，在每个位置的取代基可以是相同的或不同的。本发明预见到的取代基的组合优选地是导致形成稳定的或化学上可行的化合物的那些。本文使用的术语“稳定的”表示，当处于特定条件下时基本上不改变的化合物，所述条件允许它们的生产、检测，以及在某些实施方案中，允许它们的回收、纯化和用于一个或多个本文公开的目的。

在“任选地取代的”基团的可取代的碳原子上的合适的单价取代基独立地是卤素；–(CH₂)_0–4Ro；–(CH₂)_0–4ORo；–O–(CH₂)_0–4C(O)ORo；–(CH₂)_0–4CH(ORo)₂；–(CH₂)_0–4SRo；–(CH₂)_0–4Ph，其可以被Ro取代；–(CH₂)_0–4O(CH₂)_0–1Ph，其可以被Ro取代；–CH=CHPh，其可以被Ro取代；–NO₂；–CN；–N₃；–(CH₂)_0–4N(Ro)₂；–(CH₂)_0–4N(Ro)C(O)Ro；–N(Ro)C(S)Ro；–(CH₂)_0–4N(Ro)C(O)NRo₂；–N(Ro)C(S)NRo₂；–(CH₂)_0–4N(Ro)C(O)ORo；–N(Ro)N(Ro)C(O)Ro；–N(Ro)N(Ro)C(O)NRo₂；–N(Ro)N(Ro)C(O)ORo；–(CH₂)_0–4C(O)Ro；–C(S)Ro；–(CH₂)_0–4C(O)ORo；–(CH₂)_0–4C(O)SRo；–(CH₂)_0–4C(O)OSiRo₃；–(CH₂)_0–4OC(O)Ro；–OC(O)(CH₂)_0–4SR–，SC(S)SRo；–(CH₂)_0–4SC(O)Ro；–(CH₂)_0–4C(O)NRo₂；–C(S)NRo₂；–C(S)SRo；–SC(S)SRo，–(CH₂)_0–4OC(O)NRo₂；–C(O)N(ORo)Ro；–C(O)C(O)Ro；–C(O)CH₂C(O)Ro；–C(NORo)Ro；–(CH₂)_0–4SSRo；–(CH₂)_0–4S(O)₂Ro；–(CH₂)_0–4S(O)₂ORo；–(CH₂)_0–4OS(O)₂Ro；–S(O)₂NRo₂；–(CH₂)_0–4S(O)Ro；–N(Ro)S(O)₂NRo₂；–N(Ro)S(O)₂Ro；–N(ORo)Ro；–C(NH)NRo₂；–P(O)₂Ro；–P(O)Ro₂；–OP(O)Ro₂；–OP(O)(ORo)₂；SiRo₃；–(C_1–4直链或支链亚烷基)O–N(Ro)₂；或–(C_1–4直链或支链亚烷基)C(O)O–N(Ro)₂，其中每个Ro可以如下所定义地被取代，且独立地是氢、C_1–6脂族、–CH₂Ph、–O(CH₂)_0–1Ph或具有0–4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5–6元饱和的、部分不饱和的或芳基环，或者，尽管有上面的定义，2个独立地出现的Ro与它们的插入原子一起形成具有0–4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3–12元饱和的、部分不饱和的、或芳基单环或双环的环，其可以如下所定义地被取代。

在Ro(或2个独立地出现的Ro与它们的插入原子一起形成的环)上的合适的单价取代基独立地是卤素、–(CH₂)_0–2R^●、–(卤代R^●)、–(CH₂)_0–2OH、–(CH₂)_0–2OR^●、–(CH₂)_0–2CH(OR^●)₂；–O(卤代R^●)、–CN、–N₃、–(CH₂)_0–2C(O)R^●、–(CH₂)_0–2C(O)OH、–(CH₂)_0–2C(O)OR^●、–(CH₂)_0–2SR^●、–(CH₂)_0–2SH、–(CH₂)_0–2NH₂、–(CH₂)_0–2NHR^●、–(CH₂)_0–2NR^● ₂、–NO₂、–SiR^● ₃、–OSiR^● ₃、–C(O)SR^●、–(C_1–4直链或支链亚烷基)C(O)OR^●或–SSR^●，其中每个R^●是未取代的，或当前面具有“卤代”时，仅被一个或多个卤素取代，且独立地选自C_1–4脂族、–CH₂Ph、–O(CH₂)_0–1Ph或具有0–4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5–6元饱和的、部分不饱和的或芳基环。在Ro的饱和碳原子上的合适的二价取代基包括=O和=S。

在“任选地取代的”基团的饱和碳原子上的合适的二价取代基包括下述的：=O、=S、=NNR^* ₂、=NNHC(O)R^*、=NNHC(O)OR^*、=NNHS(O)₂R^*、=NR^*、=NOR^*、–O(C(R^* ₂))_2–3O–或–S(C(R^* ₂))_2– ₃S–，其中每个独立出现的R^*选自：氢、可以如下所定义地被取代的C_1–6脂族、或具有0–4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的5–6元饱和的、部分不饱和的或芳基环。结合到“任选地取代的”基团的邻位可取代碳上的合适的二价取代基包括：–O(CR^* ₂)_2–3O–，其中每个独立出现的R^*选自：氢、可以如下所定义地被取代的C_1–6脂族、或具有0–4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的5–6元饱和的、部分不饱和的或芳基环。

在R^*的脂族基团上的合适的取代基包括卤素、–R^●、–(卤代R^●)、–OH、–OR^●、–O(卤代R^●)、–CN、–C(O)OH、–C(O)OR^●、–NH₂、–NHR^●、–NR^● ₂或–NO₂，其中每个R^●是未取代的，或当前面具有“卤代”时，仅被一个或多个卤素取代，且独立地是C_1–4脂族、–CH₂Ph、–O(CH₂)_0–1Ph、或具有0–4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5–6元饱和的、部分不饱和的或芳基环。

在“任选地取代的”基团的可取代的氮上的合适的取代基包括–R^?、–NR^? ₂、–C(O)R^?、–C(O)OR^?、–C(O)C(O)R^?、–C(O)CH₂C(O)R^?、–S(O)₂R^?、–S(O)₂NR^? ₂、–C(S)NR^? ₂、–C(NH)NR^? ₂或–N(R^?)S(O)₂R^?;其中每个R^?独立地是氢、可以如下所定义地被取代的C_1–6脂族、未取代的–OPh、或具有0–4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的5–6元饱和的、部分不饱和的或芳基环，或者，尽管有上面的定义，2个独立地出现的R^?与它们的插入原子一起形成具有0–4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的3–12元饱和的、部分不饱和的、或芳基单环或双环的环。

在R^?的脂族基团上的合适的取代基独立地是卤素、–R^●、–(卤代R^●)、–OH、–OR^●、–O(卤代R^●)、–CN、–C(O)OH、–C(O)OR^●、–NH₂、–NHR^●、–NR^● ₂或–NO₂，其中每个R^●是未取代的，或当前面具有“卤代”时，仅被一个或多个卤素取代，且独立地是C_1–4脂族、–CH₂Ph、–O(CH₂)_0–1Ph、或具有0–4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5–6元饱和的、部分不饱和的或芳基环。

合适的保护基–本文使用的术语“合适的保护基”表示氨基保护基或羟基保护基（取决于它在化合物内的位置），且包括在下述文献中详述的那些：ProtectingGroupsinOrganicSynthesis,T.W.Greene和P.G.M.Wuts,第3版,JohnWiley&Sons,1999。

合适的氨基–保护基包括：氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、9–芴甲氧羰酰胺(Fmoc)、9–(2–磺基)芴甲氧羰酰胺、9–(2,7–二溴)芴甲氧羰酰胺、2,7–二叔丁基–[9–(10,10–二氧代–10,10,10,10–四氢噻嗯烷基)]氨基甲酸甲酯(DBD–Tmoc)、4–甲氧基苯酰基氨基甲酸酯(Phenoc)、2,2,2–三氯乙基氨基甲酸酯(Troc)、2–三甲基甲硅烷基乙基氨基甲酸酯(Teoc)、2–苯乙基氨基甲酸酯(hZ)、1–(1–金刚烷基)–1–甲基乙基氨基甲酸酯(Adpoc)、1,1–二甲基–2–卤代乙基氨基甲酸酯、1,1–二甲基–2,2–二溴乙基氨基甲酸酯(DB–t–BOC)、1,1–二甲基–2,2,2–三氯乙基氨基甲酸酯(TCBOC)、1–甲基–1–(4–联苯基)乙基氨基甲酸酯(Bpoc)、1–(3,5–二叔丁基苯基)–1–甲基乙基氨基甲酸酯(t–Bumeoc)、2–(2’–和4’–吡啶基)乙基氨基甲酸酯(Pyoc)、2–(N,N–二环己基甲酰胺基)乙基氨基甲酸酯、叔丁基氨基甲酸酯(BOC)、1–金刚烷基氨基甲酸酯(Adoc)、乙烯基氨基甲酸酯(Voc)、烯丙基氨基甲酸酯(Alloc)、1–异丙基烯丙基氨基甲酸酯(Ipaoc)、肉桂基氨基甲酸酯(Coc)、4–硝基肉桂基氨基甲酸酯(Noc)、8–喹啉基氨基甲酸酯、N–羟基哌啶基氨基甲酸酯、烷基二硫氨基甲酸酯、苄基氨基甲酸酯(Cbz)、对甲氧基苄基氨基甲酸酯(Moz)、对硝基苄基氨基甲酸酯、对溴苄基氨基甲酸酯、对氯苄基氨基甲酸酯、2,4–二氯苄基氨基甲酸酯、4–甲基亚磺酰基苄基氨基甲酸酯(Msz)、9–蒽基氨基甲酸甲酯、二苯基氨基甲酸甲酯、2–甲基硫代乙基氨基甲酸酯、2–甲磺酰基乙基氨基甲酸酯、2–(对甲苯磺酰基)乙基氨基甲酸酯、[2–(1,3–二噻烷基)]氨基甲酸甲酯(Dmoc)、4–甲基苯硫基氨基甲酸酯(Mtpc)、2,4–二甲基苯硫基氨基甲酸酯(Bmpc)、2–膦酰基乙基氨基甲酸酯(Peoc)、2–三苯基膦酰基异丙基氨基甲酸酯(Ppoc)、1,1–二甲基–2–氰基乙基氨基甲酸酯、间–氯–对–酰氧基苄基氨基甲酸酯、对(二羟基硼基)苄基氨基甲酸酯、5–苯并异唑基氨基甲酸甲酯、2–(三氟甲基)–6–色酮基氨基甲酸甲酯(Tcroc)、间硝基苯基氨基甲酸酯、3,5–二甲氧基苄基氨基甲酸酯、邻硝基苄基氨基甲酸酯、3,4–二甲氧基–6–硝基苄基氨基甲酸酯、苯基(邻硝基苯基)氨基甲酸甲酯、吩噻嗪基–(10)–羰基衍生物、N’–对甲苯磺酰基氨基羰基衍生物、N’–苯基氨基硫代羰基衍生物、叔戊基氨基甲酸酯、S–苄基硫代氨基甲酸酯、对氰基苄基氨基甲酸酯、环丁基氨基甲酸酯、环己基氨基甲酸酯、环戊基氨基甲酸酯、环丙基氨基甲酸甲酯、对癸基氧基苄基氨基甲酸酯、2,2–二甲氧基羰基乙烯基氨基甲酸酯、邻–(N,N–二甲基甲酰胺基)苄基氨基甲酸酯、1,1–二甲基–3–(N,N–二甲基甲酰胺基)丙基氨基甲酸酯、1,1–二甲基丙炔基氨基甲酸酯、二(2–吡啶基)氨基甲酸甲酯、2–呋喃基氨基甲酸甲酯,2–碘乙基氨基甲酸酯、异冰片基氨基甲酸酯,异丁基氨基甲酸酯、异烟酰基氨基甲酸酯、对-(p’–甲氧基苯偶氮基)苄基氨基甲酸酯、1–甲基环丁基氨基甲酸酯、1–甲基环己基氨基甲酸酯、1–甲基–1–环丙基氨基甲酸甲酯、1–甲基–1–(3,5–二甲氧基苯基)乙基氨基甲酸酯、1–甲基–1–(对苯偶氮基苯基)乙基氨基甲酸酯、1–甲基–1–苯乙基氨基甲酸酯、1–甲基–1–(4–吡啶基)乙基氨基甲酸酯、苯基氨基甲酸酯、对(苯偶氮基)苄基氨基甲酸酯、2,4,6–三–叔丁基苯基氨基甲酸酯、4–(三甲铵)苄基氨基甲酸酯、2,4,6–三甲基苄基氨基甲酸酯、甲酰胺、乙酰胺、氯乙酰胺、三氯乙酰胺、三氟乙酰胺、苯基乙酰胺、3–苯基丙酰胺、吡啶酰胺、3–吡啶基羧酰胺、N–苯甲酰基苯基内氨酰基衍生物、苯甲酰胺、对苯基苯甲酰胺、邻硝基苯基乙酰胺、邻硝基苯氧基乙酰胺、乙酰乙酰胺、(N’–二硫代苄氧基羰基氨基)乙酰胺、3–(对羟基苯基)丙酰胺、3–(邻硝基苯基)丙酰胺、2–甲基–2–(邻硝基苯氧基)丙酰胺、2–甲基–2–(邻苯偶氮基苯氧基)丙酰胺、4–氯丁酰胺、3–甲基–3–硝基丁酰胺、邻硝基肉桂酰胺、N–乙酰蛋氨酸衍生物、邻硝基苯甲酰胺、邻–(苯甲酰氧基甲基)苯甲酰胺、4,5–二苯基–3–唑啉–2–酮、N–邻苯二甲酰亚胺、N–二硫杂琥珀酰亚胺(Dts)、N–2,3–二苯基马来酰亚胺、N–2,5–二甲基吡咯、N–1,1,4,4–四甲基二甲硅烷基氮杂环戊烷加合物(STABASE)、5–取代的1,3–二甲基–1,3,5–三氮杂环己烷–2–酮、5–取代的1,3–二苄基–1,3,5–三氮杂环己烷–2–酮、1–取代的3,5–二硝基–4–吡啶酮、N–甲胺、N–烯丙胺、N–[2–(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲胺(SEM)、N–3–乙酰氧基丙胺、N–(1–异丙基–4–硝基–2–氧代–3–吡咯啉–3–基)胺、季铵盐、N–苄基胺、N–二(4–甲氧基苯基)甲胺、N–5–二苯并环庚基胺、N–三苯基甲胺(Tr)、N–[(4–甲氧基苯基)二苯基甲基]胺(MMTr)、N–9–苯基芴基胺(PhF)、N–2,7–二氯–9–芴基亚甲胺、N–二茂铁基甲氨基(Fcm)、N–2–吡啶甲基氨基N’–氧化物、N–1,1–二甲基硫代亚甲胺、N–亚苄基胺、N–对甲氧基亚苄基胺、N–二苯基亚甲胺、N–[(2–吡啶基)2,4,6-三甲苯基]亚甲胺、N–(N’,N’–二甲氨基亚甲基)胺、N,N’–亚异丙基二胺、N–对硝基亚苄基胺、N–亚水杨酰基胺、N–5–氯亚水杨酰基胺、N–(5–氯–2–羟基苯基)苯基亚甲胺、N–亚环己基胺、N–(5,5–二甲基–3–氧代–1–环己烯基)胺、N–硼烷衍生物、N–二苯基硼酸衍生物、N–[苯基(五羰基铬–或钨)羰基]胺、N–铜螯合物、N-锌螯合物、N–硝基胺、N–亚硝胺、N–氧化胺、二苯基膦酰胺(Dpp)、二甲基硫代膦酰胺(Mpt)、二苯基硫代膦酰胺(Ppt)、二烷基氨基磷酸酯、二苄基氨基磷酸酯、二苯基氨基磷酸酯、苯次磺酰胺、邻硝基苯次磺酰胺(Nps)、2、4–二硝基苯次磺酰胺、五氯苯次磺酰胺、2–硝基–4–甲氧基苯次磺酰胺、三苯基甲基次磺酰胺、3–硝基吡啶次磺酰胺(Npys)、对甲苯磺酰胺(Ts)、苯磺酰胺、2,3,6–三甲基–4–甲氧基苯磺酰胺(Mtr)、2,4,6–三甲氧基苯磺酰胺(Mtb)、2,6–二甲基–4–甲氧基苯磺酰胺(Pme)、2,3,5,6–四甲基–4–甲氧基苯磺酰胺(Mte)、4–甲氧基苯磺酰胺(Mbs)、2,4,6–三甲基苯磺酰胺(Mts)、2,6–二甲氧基–4–甲基苯磺酰胺(iMds)、2,2,5,7,8–五甲基色满–6–磺酰胺(Pmc),甲磺酰胺(Ms)、β–三甲基甲硅烷基乙磺酰胺(SES)、9–蒽磺酰胺、4–(4’,8’–二甲氧基萘基甲基)苯磺酰胺(DNMBS)、苄基磺酰胺、三氟甲基磺酰胺和苯酰基磺酰胺。

合适的羟基保护基包括甲基、甲氧基甲基(MOM)、甲基硫代甲基(MTM)、叔丁基硫代甲基、(苯基二甲基甲硅烷基)甲氧基甲基(SMOM)、苄氧基甲基(BOM)、对甲氧基苄氧基甲基(PMBM)、(4–甲氧基苯氧基)甲基(p–AOM)、愈创木酚甲基(GUM)、叔丁氧基甲基、4–戊烯基氧基甲基(POM)、硅氧基甲基、2–甲氧基乙氧基甲基(MEM)、2,2,2–三氯乙氧基甲基、二(2–氯乙氧基)甲基、2–(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基(SEMOR)、四氢吡喃基(THP)、3–溴四氢吡喃基、四氢噻喃基、1–甲氧基环己基、4–甲氧基四氢吡喃基(MTHP)、4–甲氧基四氢噻喃基、4–甲氧基四氢噻喃基S,S–二氧化物、1–[(2–氯–4–甲基)苯基]–4–甲氧基哌啶–4–基(CTMP)、1,4–二烷–2–基、四氢呋喃基、四氢噻吩基,2,3,3a,4,5,6,7,7a–八氢–7,8,8–三甲基–4,7–亚甲基苯并呋喃–2–基、1–乙氧基乙基、1–(2–氯乙氧基)乙基、1–甲基–1–甲氧基乙基、1–甲基–1–苄氧基乙基、1–甲基–1–苄氧基–2–氟乙基、2,2,2–三氯乙基、2–三甲基甲硅烷基乙基、2–(苯基氧硒基)乙基、叔丁基、烯丙基、对氯苯基、对甲氧基苯基、2,4–二硝基苯基、苄基、对甲氧基苄基、3,4–二甲氧基苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基、对卤苄基、2,6–二氯苄基、对氰基苄基、对苯基苄基、2–吡啶甲基、4–吡啶甲基、3–甲基–2–吡啶甲基N–氧桥、二苯基甲基、p,p’–二硝基二苯甲基、5–二苯并环庚基、三苯基甲基、α–萘基二苯基甲基、对甲氧基苯基二苯基甲基、二(对甲氧基苯基)苯基甲基、三(对甲氧基苯基)甲基、4–(4’–溴苯酰氧基苯基)二苯基甲基、4,4’,4’’–三(4,5–二氯邻苯二甲酰亚胺基苯基)甲基、4,4’,4’’–三(乙酰丙酰基氧基苯基)甲基、4,4’,4’’–三(苯甲酰氧基苯基)甲基、3–(咪唑–1–基)二(4’,4’’–二甲氧基苯基)甲基、1,1–二(4–甲氧基苯基)–1’–芘基甲基、9–蒽基、9–(9–苯基)呫吨基、9–(9–苯基–10–氧代)蒽基、1,3–苯并二硫戊环–2–基、苯并异噻唑基S,S–二氧桥、三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、二甲基异丙基甲硅烷基(IPDMS)、二乙基异丙基甲硅烷基(DEIPS)、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、三苄基甲硅烷基、三–对二甲苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基(DPMS)、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基(TBMPS)、甲酸酯、苯甲酰基甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、对氯苯氧基乙酸酯、3–苯基丙酸酯、4–氧代戊酸酯(乙酰丙酸酯)、4,4–(乙烯二硫代)戊酸酯(乙酰丙酰基二硫缩醛)、特戊酸酯、金刚酸酯、巴豆酸酯、4–甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苯基苯甲酸酯、2,4,6–三甲基苯甲酸酯(酸酯)、烷基甲基碳酸酯、9–芴基甲基碳酸酯(Fmoc)、烷基乙基碳酸酯、2,2,2–三氯乙基碳酸烷基酯(Troc)、2–(三甲基甲硅烷基)乙基碳酸酯(TMSEC)、2–(苯磺酰基)乙基碳酸酯(Psec)、2–(三苯基膦酰基)乙基碳酸酯(Peoc)、异丁基碳酸烷基酯、乙烯基碳酸烷基酯、烯丙基碳酸烷基酯、对硝基苯基碳酸烷基酯、苄基碳酸烷基酯、对甲氧基苄基碳酸烷基酯、3、4–二甲氧基苄基碳酸烷基酯、邻硝基苄基碳酸烷基酯、对硝基苄基碳酸烷基酯、S–苄基硫代碳酸烷基酯、4–乙氧基–1–萘基碳酸酯、二硫代碳酸甲酯、2–碘苯甲酸酯、4–叠氮基丁酸酯、4–硝基–4–甲基戊酸酯、邻–(二溴甲基)苯甲酸酯、2–甲酰基苯磺酸酯、2–(甲基硫代甲氧基)乙基、4–(甲基硫代甲氧基)丁酸酯、2–(甲基硫代甲氧基甲基)苯甲酸酯、2,6–二氯–4–甲基苯氧基乙酸酯、2,6–二氯–4–(1,1,3,3–四甲基丁基)苯氧基乙酸酯、2,4–二(1,1–二甲基丙基)苯氧基乙酸酯、氯二苯基乙酸酯、异丁酸酯、单琥珀酸酯、(E)–2–甲基–2–丁烯酸酯、邻–(甲氧基羰基)苯甲酸酯、α–萘甲酸酯、硝酸酯、烷基N、N、N’、N’–四甲基磷二酰胺、N–苯基氨基甲酸烷基酯、硼酸酯、二甲基硫代膦基、2,4–二硝基苯基磺酸烷基酯、硫酸酯、甲磺酸盐(甲磺酸酯)、磺酸苄酯和甲苯磺酰化(Ts)。对于保护1,2–或1,3–二醇，保护基包括亚甲基缩醛、亚乙基缩醛、1–叔丁基亚乙基缩酮、1–苯亚乙基缩酮、(4–甲氧基苯基)亚乙基缩醛、2,2,2–三氯亚乙基缩醛、丙酮化合物、亚环戊基缩酮、亚环己基缩酮、亚环庚基缩酮、亚苄基缩醛、对甲氧基亚苄基缩醛、2,4–二甲氧基亚苄基缩酮、3,4–二甲氧基亚苄基缩醛、2–硝基亚苄基缩醛、甲氧基亚甲基缩醛、乙氧基亚甲基缩醛、二甲氧基亚甲基原酸酯、1–甲氧基亚乙基原酸酯、1–乙氧基亚乙基原酸酯、1,2–二甲氧基亚乙基原酸酯、α–甲氧基亚苄基原酸酯、1–(N,N–二甲氨基)亚乙基衍生物、α–(N,N’–二甲氨基)亚苄基衍生物、2–氧杂亚环戊基原酸酯、二叔丁基甲硅亚烷基(DTBS)、1,3–(1,1,3,3–四异丙基二亚硅氧烷基)衍生物(TIPDS)、四–叔丁氧基二硅氧烷–1,3–二亚基衍生物(TBDS)、环状碳酸酯、环状硼酸酯、硼酸乙基酯和硼酸苯基酯。

在显示出化学变量(例如，R基团)连接到与环键交叉的键上的任意情况下，这是指一个或多个这样的变量任选地连接到具有该交叉键的环上。在这样的环上的每个R基团可以连接在任意合适的位置，这通常理解为是指，该基团替代氢原子连接到母体环上。这包括下述可能，即2个R基团可以连接在同一个环原子上。此外，当在环上存在超过一个R基团时，各自可以与连接的其它R基团相同或不同，且每个基团独立于可以连接在相同分子的其它位置上的其它R基团进行定义，即使它们可能由相同的标识符来表示。

可生物降解的–本文使用的术语“可生物降解的”表示，在生理或内体条件下降解的分子(即，丧失至少一些它们的共价结构)。可生物降解的分子不一定是水解性地可降解的，可能需要酶作用来降解。

生物分子–本文使用的术语“生物分子”表示在细胞和组织中常见的天然存在的或人工制备的(例如，通过合成或重组方法)分子(例如，多肽、氨基酸、多核苷酸、核苷酸、多糖、糖类、脂类、核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、甾类、代谢物等)。生物分子的具体类别包括、但不限于：酶、受体、神经递质、激素、细胞因子、细胞响应修饰剂（诸如生长因子和趋化因子）、抗体、疫苗、半抗原、毒素、干扰素、核酶、反义试剂、质粒、DNA和RNA。

药物–本文使用的术语“药物”表示改变、抑制、激活或以其它方式影响生物学事件的小分子或生物分子。例如，药物可以包括、但不限于：抗-AIDS物质，抗癌物质，抗生素，抗糖尿病物质，免疫抑制剂，抗病毒物质，酶抑制剂，神经毒素，阿片样物质，安眠药，抗-组胺，润滑剂，安神剂，抗惊厥药，肌肉松弛药和抗-帕金森物质，抗-痉挛药和肌肉收缩药（包括通道阻滞剂），缩瞳药和抗胆碱能药，抗-青光眼化合物，抗-寄生物和/或抗-原生动物化合物，细胞-胞外基质相互作用的调节剂（包括细胞生长抑制剂和抗-粘附分子），血管扩张剂，DNA、RNA或蛋白合成的抑制剂，抗高血压药，镇痛药，解热剂，甾体和非甾体抗炎药，抗-血管生成因子，反分泌因子，抗凝血药和/或抗血栓药，局部麻醉药，眼药，前列腺素，抗抑郁药，抗精神病物质，止吐药，和显像剂。适用于本发明的示例性药物的更完整的列表可以参见：AxelKleemann和JurgenEngel的“PharmaceuticalSubstances:Syntheses,Patents,Applications”,ThiemeMedicalPublishing,1999;“MerckIndex:AnEncyclopediaofChemicals,Drugs,andBiologicals”,SusanBudavari等人编,CRCPress,1996,和美国药典-25(UnitedStatesPharmacopeia-25)/国家处方集-20（NationalFormulary-20），由UnitedStatesPharmcopeialConvention,Inc.,RockvilleMD,2001公布。

外源性–本文使用的“外源性的”分子是在没有施用给患者之前不以显著水平存在于患者中的分子。在某些实施方案中，患者是哺乳动物，例如，人、狗、猫、大鼠、迷你猪等。如果这类患者的正常血清包含小于0.1mM的分子，则本文使用的分子不以显著水平存在于患者中。在某些实施方案中，患者的正常血清可以包含小于0.08mM、小于0.06mM或小于0.04mM的分子。

多分支的–本文使用的“多分支的”结构是包含至少1个分支的支链的共价结构(例如，树枝状聚合的结构)。多分支的结构可以包括聚合的和/或非聚合的亚结构。

正常血清–本文使用的“正常血清”是通过合并大约等量的来自5位或更多非糖尿病患者的凝固全血的液体部分所得到的血清。随机地选择18-30岁的非糖尿病的人患者，他们在抽血时没有呈现出糖尿病症状。

聚合物–本文使用的“聚合物”或“聚合的结构”是包含一串共价结合的单体的结构。聚合物可以由一类单体或超过一类单体制成。因此，术语“聚合物”包括共聚物，包括嵌段共聚物，其中不同类型的单体在全部聚合物内单独成簇。聚合物可以是直链的或分支的。

多核苷酸–本文使用的“多核苷酸”是核苷酸的聚合物。术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可以互换使用。所述聚合物可以包括天然的核苷(即，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)、核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘代尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、4-乙酰基胞苷、5-(羧基羟甲基)尿苷、二氢尿苷、甲基假尿苷、1-甲基腺苷、1-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷和2-硫代胞苷)、化学修饰的碱基、生物修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)、插入的碱基、修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、2′-O-甲基胞苷、阿拉伯糖和己糖)或修饰的磷酸酯基团(例如，硫代磷酸酯和5'-N-亚磷酰胺连接)。

多肽–本文使用的“多肽”是氨基酸的聚合物。术语“多肽”、“蛋白”、“寡肽”和“肽”可以互换使用。多肽可以含有天然的氨基酸、非天然的氨基酸(即，在自然界中不存在、但是可以掺入多肽链中的化合物)和/或氨基酸类似物，这是本领域已知的。另外，可以修饰多肽中的一个或多个氨基酸残基，例如，通过添加化学实体，诸如碳水化合物基团、磷酸酯基团、法尼基基团、异法尼基基团、脂肪酸基团、用于缀合的连接物、官能化或其它修饰等。这些修饰可以包括肽的环化、D-氨基酸的掺入等。

多糖–本文使用的“多糖”是糖的聚合物。术语“多糖”、“碳水化合物”和“寡糖”可以互换使用。聚合物可以包括天然的糖(例如，阿拉伯糖、来苏糖、核糖、木糖、核酮糖、木酮糖、阿洛糖、阿卓糖、半乳糖、葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、甘露糖、塔罗糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、甘露庚酮糖、景天庚酮糖、辛酮糖和sialose)和/或修饰的糖(例如，2′-氟核糖、2′-脱氧核糖和己糖)。示例性的二糖包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、龙胆二糖、异麦芽糖、曲二糖、昆布二糖、甘露二糖、蜜二糖、黑曲霉糖、芸香糖和木二糖。

小分子–本文使用的术语“小分子”表示具有相对低分子量的天然存在的或人工制备的(例如，通过化学合成)分子。通常，小分子是单体的，且具有小于约1500Da的分子量。优选的小分子是生物活性的，它们在动物（优选哺乳动物、更优选人）中产生局部的或全身的作用。在某些优选的实施方案中，小分子是药物。优选地，尽管不一定，药物是已经被适当的管理机构或主体认为使用安全且有效的药物。例如，美国食品药品管理局（FDA）在21C.F.R.§§330.5、331-361和440-460下列出的人用药物、美国食品药品管理局（FDA）在21C.F.R.§§500-589下列出的兽医用药物，都视作根据本发明的应用所可接受的。

治疗–本文使用的术语“治疗”表示将本公开内容的缀合物施用给有此需要的受试者，其目的是减轻、解除、改变、改善、提高或影响病症(例如，糖尿病)、病症的一种或多种症状(例如，高血糖症)或向病症的倾向。

附图说明

图1：得到的RP-HPLC色谱图之间的对比：(a)使用TSAT-C6作为支架、AEM作为配体和NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素作为药物合成的示例性缀合物(缀合物I-1)，和(b)根据实施例32合成的胰岛素-糖原缀合物。

图2：缀合物I-1(□)、缀合物I-16(△)和RHI(◆)在PBS缓冲液中的加速的稳定性测试(AST)聚集试验。所述缀合物与药用级RHI相比表现出极大增强的稳定性。

图3：加速的稳定性测试(AST)化学稳定性结果：(a)RP-HPLCAST缀合物稳定性和(b)AST缀合物的LC/MS数据。

图4：新鲜的缀合物(▲)和72小时AST缀合物()在非糖尿病的、雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(n=4)中的体内生物活性。72小时AST缀合物生物活性与新鲜的缀合物难以区分(p>0.21，对于所有时点)。

图5：在~20U胰岛素当量/kg的剂量皮下注射的(▲)胰岛素-葡聚糖(70K)在非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)中的血糖抑制特性。

图6:在~2.5U胰岛素当量/kg的剂量皮下注射的(■)胰岛素-糖原(II型oyster)在非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)中的血糖抑制特性。

图7:以3.5U当量胰岛素/kg皮下施用的(◆)TSAT-C6-AEM-2胰岛素缀合物I-1和()可溶的重组人胰岛素(RHI)在雄性非糖尿病的SD大鼠中产生的血糖水平。每个数据集合表示n=6只大鼠的平均值和标准差。

图8:以3.5U当量胰岛素/kg皮下施用的(◆)TSAT-C6-AEM-2胰岛素缀合物I-1和()可溶的重组人胰岛素(RHI)在雄性非糖尿病的SD大鼠在雄性非糖尿病的SD大鼠中产生的血清胰岛素浓度。每个数据集合表示n=6只大鼠的平均值和标准差。

图9：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠皮下注射TSAT-C6-AEM-2(B29-取代的)胰岛素缀合物I-7(5U/kg)以后(◆)血清胰岛素和(○)血糖水平的图。数据表示n=3只大鼠的平均值和标准差。

图10：AEG、AEM、AEBM和AETM的化学结构。如证实的，这些基于糖的配体对ConA的亲和力增加。

图11：一些示例性的非树枝状聚合的缀合物中间体的化学结构。为了例证目的，也显示了包括糖的示例性缀合物配体(AEG、AEM、AEBM、AETM、AEGA和AEF)。

图12：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠皮下注射TSAT-C6-AEM-2胰岛素缀合物I-1(◆)、可溶的重组人胰岛素(○)和赖脯胰岛素(Δ)(都3.5U/kg)以后血清胰岛素(左图)和血糖(右图)水平的图。数据表示n=6只大鼠的平均值和标准差。

图13：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(对于每个制剂，n=3)皮下注射基于TSAT-C6的胰岛素缀合物（具有显示的不同配体）以后血糖水平的图。随着配体的亲和力增加，葡萄糖降低效应减少。

图14：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)皮下注射TSAT-C6-AEM-2缀合物I-1(3.5U/kg)以后血清胰岛素(左图)和血糖(右图)水平的图。

图15：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)皮下注射TSAT-C6-AEBM-2I-3缀合物(5U/kg)以后血清胰岛素(左图)和血糖(右图)水平的图。

图16：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)皮下注射TSAT-C6-AEBM-1AETM-1缀合物I-4(5U/kg)以后血清胰岛素(左图)和血糖(右图)水平的图。

图17：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)皮下注射TSAT-C6-AETM-2缀合物I-2(5U/kg)以后血清胰岛素(左图)和血糖(右图)水平的图。

图18：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)皮下注射TSAT-C6-AETM-2缀合物I-2、随后在15分钟后腹膜内注射α-甲基甘露糖(左图)或盐水(右图)以后，血清胰岛素和血糖水平的图。α-甲基甘露糖是非常高亲和力的糖，其能够与AETM竞争结合凝集素诸如ConA。如证实的，由注射α-甲基甘露糖产生的PK/PD特性的变化是非常显著的(p<0.05)。

图19：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)皮下注射可溶的重组人胰岛素(RHI)、随后在15分钟后腹膜内注射α-甲基甘露糖(左图)或盐水(右图)以后，血清胰岛素和血糖水平的图。如证实的，注射α-甲基甘露糖没有产生PK/PD特性的变化(p>>0.05)。

图20：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(对于每个实验，n=3)皮下注射TSAT-C6-AETM-2缀合物I-2、随后在15分钟后腹膜内注射α-甲基甘露糖(?)、L-岩藻糖(■)或盐水(▲)以后，血清胰岛素水平的图。如证实的，α-甲基甘露糖和L-岩藻糖似乎表现出相同类型的作用。

图21：在时间0给给非糖尿病的、雄性SD大鼠皮下注射TSAT-C6-AETM-2缀合物I-2、随后在15分钟后腹膜内注射葡萄糖(?)、半乳糖(■)或盐水(▲)以后，血清胰岛素水平的图。如证实的，半乳糖与盐水相比没有表现出作用。葡萄糖似乎表现出较小作用；但是，这被下述事实复杂化，即来自缀合物的外源性胰岛素迅速地降低葡萄糖，所以没有发生使用α-甲基甘露糖和L-岩藻糖所观察到的持久作用。

图22：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)皮下注射TSAT-C6-AETM-2缀合物I-2溶液以后，血清胰岛素和血糖水平的图，所述缀合物以5U/kg溶解在(a)含有1Mα-甲基甘露糖的缓冲盐水或(b)缓冲盐水中。在(a)中，随后使用与在(b)中所用的相同体积的盐水溶液，在不同于缀合物溶液所用的皮下位点，在15min注射大鼠。在(b)中，随后使用与在(a)中所用的相同体积的1Mα-甲基甘露糖溶液，在不同于缀合物溶液所用的皮下位点，在15min注射大鼠。如证实的，相对于实验(b)，在实验(a)中，血清胰岛素水平没有增加，且血糖水平没有降低。

图23：在时间0以5U/kg给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)皮下注射TSAT-C6-AETM-2缀合物I-2溶液以后，血清胰岛素和血糖水平的图。在缀合物注射以后15min、60min、120min或240min，给大鼠施用4g/kg腹膜内a-MM注射。

图24：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)皮下注射TSAT-C6-AEM-2缀合物I-7、随后在15分钟后腹膜内注射α-甲基甘露糖(左图)或盐水(右图)以后，血清胰岛素和血糖水平的图。α-甲基甘露糖是非常高亲和力的糖，其能够与AETM竞争结合凝集素诸如ConA。如证实的，由注射α-甲基甘露糖产生的PK/PD特性的变化是非常显著的(p<0.05)。

图25：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)皮下注射TSAT-C6-GA-2缀合物I-5、随后在15分钟后腹膜内注射α-甲基甘露糖(左图)或盐水(右图)以后，血清胰岛素和血糖水平的图。α-甲基甘露糖是非常高亲和力的糖，其能够与AEM竞争结合凝集素诸如ConA。如证实的，由注射α-甲基甘露糖产生的PK/PD特性的变化不是显著的。

图26：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)皮下注射DSS-C6-AEM-1缀合物I-8、随后在15分钟后腹膜内注射α-甲基甘露糖(左图)或盐水(右图)以后，血清胰岛素和血糖水平的图。α-甲基甘露糖是非常高亲和力的糖，其能够与AEM竞争结合凝集素诸如ConA。如证实的，由注射α-甲基甘露糖产生的PK/PD特性的变化不是显著的。

图27：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)皮下注射TSPE-AEM-3缀合物I-9、随后在15分钟后腹膜内注射α-甲基甘露糖(左图)或盐水(右图)以后，血清胰岛素和血糖水平的图。α-甲基甘露糖是非常高亲和力的糖，其能够与AEM竞争结合凝集素诸如ConA。如证实的，由注射α-甲基甘露糖产生的PK/PD特性的变化是显著的(p<0.05)。

图28：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)皮下注射DSS-AETM-1缀合物I-10、随后在15分钟后腹膜内注射α-甲基甘露糖(左图)或盐水(右图)以后，血清胰岛素和血糖水平的图。α-甲基甘露糖是非常高亲和力的糖，其能够与AEM竞争结合凝集素诸如ConA。如证实的，由注射α-甲基甘露糖产生的PK/PD特性的变化是显著的(p<0.05)。

图29：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)皮下注射TSPE-AETM-3缀合物I-11、随后在15分钟后腹膜内注射α-甲基甘露糖(左图)或盐水(右图)以后，血清胰岛素和血糖水平的图。α-甲基甘露糖是非常高亲和力的糖，其能够与AEM竞争结合凝集素诸如ConA。如证实的，由注射α-甲基甘露糖产生的PK/PD特性的变化是显著的(p<0.05)。

图30：以0.4mg/kg将(?)RHI和(▲)TSAT-C6-AETM-2缀合物I-6静脉内注射进非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/组)中，血清胰岛素浓度随时间而变化的图。使用两隔室双指数模型，拟合数据(n=3的平均值)。TSAT-C6-AETM-2缀合物比RHI快许多地从血清中消除。

图31：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/剂量)皮下注射长效TSAT-C6-AETM-2(I-6)缀合物、随后在240分钟腹膜内注射葡萄糖(4g/kg)以后，血清胰岛素(?)和血糖()水平的图。如在实施例51中所述制备制剂：(a)1xP-1xZ、(b)4xP-4xZ和(c)10xP-4xZ。

图32：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/剂量)皮下注射TSAT-C6-AETM-2(I-6)缀合物、随后在240分钟腹膜内注射葡萄糖(4g/kg)以后，血清胰岛素(?)和血糖()水平的图。如在实施例52中所述制备制剂：(a)4xP-1xZ和(b)4xP-2xZ。

图33：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/剂量)皮下注射长效TSAT-C6-AETM-2(I-6)缀合物、随后在240分钟腹膜内注射葡萄糖(4g/kg)以后，血清胰岛素(?)和血糖()水平的图。如在实施例52中所述制备制剂：(a)10xP-1xZ和(b)10xP-2xZ。

图34：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/剂量)皮下注射长效TSAT-C6-AETM-2(I-6)缀合物、随后在240分钟腹膜内注射葡萄糖(4g/kg)以后，血清胰岛素(?)和血糖()水平的图。如在实施例53中所述制备制剂：(a)没有甲酚和(b)4x甲酚。

图35：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/剂量)皮下注射长效TSAT-C6-AETM-2(I-6)缀合物、随后在240分钟腹膜内注射葡萄糖(4g/kg)以后，血清胰岛素(?)和血糖()水平的图。如在实施例54中所述制备制剂：(a)没有盐、(b)3.3x盐和(c)甘油。

图36：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/剂量)皮下注射长效TSAT-C6-AETM-2(I-6)缀合物、随后在240分钟腹膜内注射葡萄糖(4g/kg)以后，血清胰岛素(?)和血糖()水平的图。如实施例55所述，制备含有递增量的未修饰的胰岛素的制剂：(a)1/24、(b)1/12和(c)1/6。

图37：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/剂量)皮下注射根据实施例56制备的长效TSAT-C6-AETM-2缀合物I-6、随后在240分钟腹膜内注射葡萄糖(4g/kg)以后，血清胰岛素(?)和血糖()水平的图。

图38：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/剂量)皮下注射根据实施例57制备的长效TSAT-C6-AETM-2缀合物I-6、随后在240分钟腹膜内注射葡萄糖(4g/kg)以后，血清胰岛素(?)和血糖()水平的图。在2-8℃储存(a)1周或(b)2周后，注射所述物质。

图39：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/剂量)皮下注射根据实施例57制备的长效TSAT-C6-AETM-2缀合物I-6、随后在240分钟腹膜内注射葡萄糖(4g/kg)以后，血清胰岛素(?)和血糖()水平的图。在室温储存(a)1周或(b)2周后，注射所述物质。

图40：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/剂量)皮下注射根据实施例58制备的长效缀合物制剂、随后在240分钟腹膜内注射葡萄糖(4g/kg)以后，血清胰岛素(?)和血糖()水平的图。所述缀合物是DSS-AEM-1(I-8)、DSS-AETM-1(I-10)、TSAT-C6-AEM-2(I-7)、C6-酰胺-AEM-2(I-17)、TSPE-AEM-3(I-9)和TSPE-AETM-3(I-11)。

图41：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/剂量)皮下注射根据实施例59制备的长效缀合物制剂、随后在240分钟腹膜内注射α-甲基甘露糖(4g/kg)以后，血清胰岛素(?)和血糖()水平的图。所述缀合物是(a)TSAT-C6-AETM-2(I-6)和(b)TSAT-C6-GA-2。

图42：在时间0给非糖尿病的(正常)和糖尿病的(DM’s)雄性SD大鼠皮下注射TSAT-C6-AETM-2(B29-取代的,PZI)缀合物I-6以后，血糖水平的图。在5、10和20U/kg，施用缀合物。如证实的，非糖尿病的雄性SD大鼠没有表现出任何低血糖症，而糖尿病的雄性SD大鼠的葡萄糖水平表现出明确的与剂量成比例的响应，该响应在最高剂量时持续8小时。

图43：在时间0给非糖尿病的(正常)和糖尿病的(DM’s)雄性SD大鼠皮下注射TSAT-C6-AETM-2(B29-取代的,PZI)缀合物I-6以后，在24小时内的血糖水平的图。在7、14和28U/kg，施用缀合物。

图44：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/剂量)皮下注射根据实施例67制备的长效缀合物I-17制剂、随后在240分钟腹膜内注射葡萄糖(4g/kg)以后，血清胰岛素(?)和血糖()水平的图。

图45：示例性的胰岛素-缀合物的结构。如在实施例中所述，使用重组野生型人胰岛素(关于野生型人胰岛素的结构，参见图63)，制备这些缀合物中的每一个。如图45所示，在椭圆形线内的符号“胰岛素”因此主要意图表示野生型人胰岛素。如本文讨论的，应当理解，除了别的以外，本公开内容也包括含有除了野生型人胰岛素以外的胰岛素分子的这些和其它缀合物形式。

图46：在注射缀合物I-6或RHI(左图)和含有和没有葡萄糖或α-甲基甘露糖的缀合物I-6(右图)以后，血清胰岛素浓度随时间而变化的图。

图47：前2个图显示了在非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)中恒定静脉内(i.v.)输注RHI(3.5mU/min)或I-6(15mU/min)以后，血清胰岛素(?)和血糖()水平的图。在240分钟，腹膜内注射葡萄糖(4g/kg)。接下来的3个图对比了当在240分钟腹膜内注射葡萄糖(4、2或1g/kg)时，在非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)中恒定静脉内(i.v.)输注RHI(3.5mU/min)或I-6(15mU/min)以后，血清胰岛素(?)和血糖()水平的图。

图48：在有和没有葡萄糖或α-甲基甘露糖存在下，注射缀合物以后，血清胰岛素浓度随时间而变化的图。在t=-60min和贯穿整个研究，给大鼠静脉内灌注糖溶液。在时间0在10U/kg静脉内注射每种缀合物，并测量血清缀合物浓度。

图49：在非糖尿病的迷你猪糖-依赖性的消除半衰期研究中测试的胰岛素缀合物的组成。如在实施例中所述，使用重组野生型人胰岛素(关于野生型人胰岛素的结构，参见图63)，制备这些缀合物中的每一个。图49中的示意图因此主要意图表示野生型人胰岛素。如本文讨论的，应当理解，除了别的以外，本公开内容也包括含有除了野生型人胰岛素以外的胰岛素分子的这些和其它缀合物形式。

图50：在葡萄糖、α-甲基甘露糖或盐水输注中，非糖尿病的迷你猪中的β-期消除半衰期结果。

图51：在0.1U/kg静脉内(i.v.)注射进配有双血管进入口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n=3/研究)以后，(a)重组人胰岛素(RHI)和(b)二取代的-AETM-2胰岛素缀合物II-2的血清浓度的图。在每个实验中，给动物静脉内输注(◆)α甲基甘露糖(a-MM)溶液(25%w/v，在80ml/h的恒定速率输注)或()无溶液。将数据绘制为从双隔室双指数模型衍生出的曲线拟合的平均值。

图52:在下述条件下以0.1U/kg静脉内注射缀合物以后，配有双血管进入口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n=3/研究)中的血糖抑制曲线：(a)没有静脉内糖输注或(b)静脉内α甲基甘露糖(a-MM)输注(25%w/v，在80ml/h的恒定速率输注)。()RHI、(○)I-7、()I-6、()I-11和(●)II-2。

图53:在时间0以0.25、0.50和1.00U/kg的剂量皮下注射可溶的Di-Sub--AETM-2胰岛素缀合物II-2以后，在禁食条件下的(a,——,实心符号)四氧嘧啶-糖尿病的Yucatan迷你猪(n=3/剂量)和(b,----,空心符号)非糖尿病的Yucatan迷你猪(n=3/剂量)中的血糖水平。将数据绘制为平均值±1个标准差。注：图53(b)为了清楚而放大比例尺。

图54：在时间0以(▲,△)0.063和(,□)0.125U/kg的剂量皮下注射可溶的重组人胰岛素(RHI)以后，在禁食条件下的(a,——,实心符号)四氧嘧啶-糖尿病的Yucatan迷你猪(n=3/剂量)和(b,----,空心符号)非糖尿病的Yucatan迷你猪(n=3/剂量)中的血糖水平。将数据绘制为平均值±1个标准差。注：图54(b)为了清楚而放大比例尺。

图55：用于非糖尿病的迷你猪糖-依赖性的消除半衰期研究中的其它胰岛素缀合物。如在实施例中所述，使用重组野生型人胰岛素(关于野生型人胰岛素的结构，参见图63)，制备这些缀合物中的每一个。图55中的示意图因此主要意图表示野生型人胰岛素。如本文讨论的，应当理解，除了别的以外，本公开内容也包括含有除了野生型人胰岛素以外的胰岛素分子的这些和其它缀合物形式。

图56：在大鼠和迷你猪中施用RHI或缀合物I-6以后，血清胰岛素浓度随时间而变化的图。

图57：其它胰岛素-缀合物在迷你猪中的静脉内半衰期结果的总结。

图58：在糖尿病的和正常的迷你猪中单次皮下注射0.25、0.5和1U/kg胰岛素缀合物II-2以后，血清胰岛素水平的图。

图59：有和没有a-MM输注，在迷你猪中静脉内注射RHI和缀合物I-6、II-3和II-2以后，血清葡萄糖水平的图。

图60：在迷你猪中作为对照测试的选择的胰岛素缀合物(C3,C4,和C7)以及胰岛素缀合物I-6、I-12、II-2和II-3的结构。如在实施例中所述，使用重组野生型人胰岛素(关于野生型人胰岛素的结构，参见图63)，制备这些缀合物中的每一个。图60中的示意图因此主要意图表示野生型人胰岛素。如本文讨论的，应当理解，除了别的以外，本公开内容也包括含有除了野生型人胰岛素以外的胰岛素分子的这些和其它缀合物形式。

图61：有和没有a-MM输注，在迷你猪中静脉内注射RHI和胰岛素缀合物I-6、I-12、II-2和C3以后，血清葡萄糖水平的图。

图62：有和没有a-MM输注，在迷你猪中静脉内注射RHI和胰岛素缀合物C7、C4、II-3和II-2以后，血清葡萄糖水平的图。

图63：野生型人胰岛素的结构。

具体实施方式

本申请参考了许多文件，包括专利和非专利文件。这些文件各自的所有内容通过引用并入本文。

在一个方面，本公开内容提供了以响应于糖（诸如葡萄糖）的全身浓度的方式控制诸如胰岛素等药物的药代动力学(PK)和/或药效动力学(PD)特性的方法。如在实施例中所讨论的，所述方法部分地基于下述发现：即使在没有外源性多价糖-结合分子（诸如ConA）存在下，当将某些胰岛素-缀合物修饰成包括高亲和力糖配体时，可以使它们表现出响应于糖浓度变化的PK/PD特性。该发现是意外的，并提供了史无前例的制备简单的不含凝集素的糖-响应性的药物系统的机会。在另一个方面，本公开内容提供了示例性缀合物和制备它们的方法。一般而言，这些缀合物包括药物和一个或多个单独的配体，所述配体各自包括糖。在某些实施方案中，所述配体能够与糖(例如，葡萄糖或甘露糖)竞争结合内源性糖结合分子。在某些实施方案中，所述配体能够与葡萄糖或甘露糖竞争结合ConA。如下面更详细地讨论的，在某些实施方案中，所述配体和药物可以共价地或非共价地连接到缀合物框架上。在某些实施方案中，所述框架是非聚合的。在某些实施方案中，缀合物可以具有1的多分散性指数和小于约20,000Da的分子量。在某些实施方案中，所述缀合物具有本文定义和描述的式(I)或(II)。在某些实施方案中，所述缀合物是长效的(即，表现出比可溶的重组人胰岛素或RHI更持久的PK特性)。

缀合物

在一个方面，本公开内容提供了缀合物，其包含药物和配体，所述配体包括第一种糖。所述配体(或当缀合物包括超过一种配体时，多种配体)使得，当将所述缀合物施用给哺乳动物时，所述缀合物的至少一种药代动力学或药效动力学性质对第二种糖的血清浓度是敏感的。在某些实施方案中，所述缀合物的PK和/或PD性质对内源糖（诸如葡萄糖）的血清浓度是敏感的。在某些实施方案中，所述缀合物的PK和/或PD性质对外源糖的血清浓度是敏感的，所述外源糖例如但不限于：甘露糖、L-岩藻糖、N-乙酰基葡糖胺和/或α-甲基甘露糖。

如下面更详细地讨论的，在某些实施方案中，所述配体和药物可以共价地或非共价地连接到缀合物框架上。

在某些实施方案中，没有药物时缀合物的分子量小于约10,000Da。例如，没有药物时缀合物的分子量可以是在约250至约5,000Da、约450至约3,500Da、约750至约2,500Da、或约900至约2,000Da的范围内。

在某些实施方案中，包括药物的缀合物的分子量小于约20,000Da。例如，包括药物的缀合物的分子量可以是在约2,000至约18,000Da、约4,000至约15,000Da、约5,000至约10000Da、或约6,500至约8,000Da的范围内。

在某些实施方案中，所述缀合物具有唯一分子量(即，具有1的多分散性指数)。

PK和PD性质

在不同的实施方案中，通过糖的血清浓度的变动，可以修饰缀合物(即，缀合的药物，和/或通过化学或酶促降解已经从缀合物释放出的药物)的药代动力学和/或药效动力学行为。

例如，从药代动力学(PK)角度看，当糖(例如，葡萄糖)的血清浓度增加时，或当糖的血清浓度上穿阈值(例如，高于正常葡萄糖水平)时，血清浓度曲线可能向上移动。

在某些实施方案中，当施用给处于禁食和高血糖条件下的哺乳动物时，缀合物的血清浓度曲线是基本上不同的。本文使用的术语“基本上不同的”是指，通过studentt-检验(p<0.05)测得，2条曲线是统计上不同的。本文使用的术语“禁食条件”是指，通过组合来自5个或更多个禁食的非糖尿病个体的数据所得到的血清浓度曲线。在某些实施方案中，禁食的非糖尿病个体是随机地选择的18-30岁的人，他们在在抽血时没有显现糖尿病症状，且在抽血时间的12小时内没有进食。本文使用的术语“高血糖条件”是指，通过组合来自5个或更多个禁食的非糖尿病个体的数据所得到的血清浓度曲线，其中通过同时施用缀合物和葡萄糖来诱导高血糖条件(葡萄糖C_max比在禁食条件下观察到的平均葡萄糖浓度高至少100mg/dL)。缀合物和葡萄糖的同时施用仅要求，在缀合物以可检测水平存在于血清中的时期内，发生葡萄糖C_max。例如，可以使葡萄糖注射(或摄入)定时发生在缀合物施用之前短时间内、同时或之后短时间内。在某些实施方案中，通过不同途径或在不同位置，施用缀合物和葡萄糖。例如，在某些实施方案中，皮下地施用缀合物，同时口服地或静脉内地施用葡萄糖。

在某些实施方案中，与禁食条件相比，在高血糖条件下缀合物的血清C_max更高。额外地或可替代地，在某些实施方案中，与禁食条件相比，在高血糖条件下缀合物的血清曲线线面积(AUC)更高。在不同的实施方案中，与禁食条件相比，在高血糖条件下缀合物的血清消除速率更慢。如在实施例中所讨论的，我们已经发现：在某些实施方案中，使用具有一个短的和一个长的半衰期的两隔室双指数模型，可以拟合缀合物的血清浓度曲线。长半衰期表现得对葡萄糖浓度特别敏感。因而，在某些实施方案中，与禁食条件相比，在高血糖条件下长半衰期更长。在某些实施方案中，禁食条件包含小于100mg/dL(例如，80mg/dL、70mg/dL、60mg/dL、50mg/dL等)的葡萄糖C_max。在某些实施方案中，高血糖条件包含超过200mg/dL(例如，300mg/dL、400mg/dL、500mg/dL、600mg/dL等)的葡萄糖C_max。应当理解，其它PK参数诸如平均血清停留时间(MRT)、平均血清吸收时间(MAT)等可以替代任意的前述参数使用，或一起使用。

在人、狗、猫和大鼠中的葡萄糖浓度的正常范围是60-200mg/dL。对于具有不同正常范围的物种(例如，在迷你猪中的葡萄糖浓度的正常范围是40-150mg/dl)，本领域技术人员能够外推下述值。低于60mg/dL的葡萄糖浓度被视作低血糖的。高于200mg/dL的葡萄糖浓度被视作高血糖的。在某些实施方案中，使用葡萄糖钳（glucoseclamp）方法(参见实施例)，可以测试缀合物的PK性质，当在50和200mg/dL、50和300mg/dL、50和400mg/dL、50和500mg/dL、50和600mg/dL、100和200mg/dL、100和300mg/dL、100和400mg/dL、100和500mg/dL、100和600mg/dL、200和300mg/dL、200和400mg/dL、200和500mg/dL、200和600mg/dL等葡萄糖浓度施用时，缀合物的血清浓度曲线可以是基本上不同的。额外地或可替代地，在所述2个葡萄糖浓度，血清T_max、血清C_max、平均血清停留时间(MRT)、平均血清吸收时间(MAT)和/或血清半衰期可以是基本上不同的。如下面讨论的，在某些实施方案中，100mg/dL和300mg/dL可以用作比较葡萄糖浓度。但是，应当理解，本公开内容包括这些实施方案中的每一个，其中比较葡萄糖浓度的替代对包括但不限于下述对中的任一对：50和200mg/dL、50和300mg/dL、50和400mg/dL、50和500mg/dL、50和600mg/dL、100和200mg/dL、100和400mg/dL、100和500mg/dL、100和600mg/dL、200和300mg/dL、200和400mg/dL、200和500mg/dL、200和600mg/dL等。

因而，在某些实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，缀合物的C_max更高。在某些实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，缀合物的C_max高了至少50%(例如，至少100%、至少200%或至少400%)。

在某些实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，缀合物的AUC更高。在某些实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，缀合物的AUC高了至少50%(例如，至少例如，至少100%、至少200%或至少400%)。

在某些实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，缀合物的血清消除速率更慢。在某些实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较低浓度(例如，100相对于300mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，缀合物的血清消除速率快了至少25%(例如，至少50%、至少100%、至少200%或至少400%)。

如在实施例中所讨论的，我们已经发现：在某些实施方案中，使用具有一个短的和一个长的半衰期的两隔室双指数模型，可以拟合缀合物的血清浓度曲线。长半衰期表现得对葡萄糖浓度特别敏感。因而，在某些实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，长半衰期更长。在某些实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，长半衰期长了至少50%(例如，至少100%、至少200%或至少400%)。

在某些实施方案中，本公开内容提供了这样的方法，其中在两种不同的葡萄糖浓度(例如，300相对于100mg/dL葡萄糖)，得到缀合物的血清浓度曲线；使用具有一个短的和一个长的半衰期的两隔室双指数模型，拟合2条曲线；并对比在2种葡萄糖浓度下得到的长半衰期。在某些实施方案中，该方法可以用作测试或对比一种或多种缀合物的葡萄糖敏感性的试验。

在某些实施方案中，本公开内容提供了这样的方法，其中在相同条件(例如，禁食条件)下，得到缀合的药物(例如，本公开内容的胰岛素缀合物)和未缀合的药物形式(例如，RHI)的血清浓度曲线；使用具有一个短的和一个长的半衰期的两隔室双指数模型，拟合2条曲线；并对比得到的缀合的和未缀合的药物的长半衰期。在某些实施方案中，该方法可以用作鉴别比未缀合的药物更迅速地清除的缀合物的试验。

在某些实施方案中，当施用给在高血糖条件下的哺乳动物时，缀合物的血清浓度曲线与未缀合形式的药物的血清浓度曲线基本上相同。本文使用的术语“基本上相同”是指，通过studentt-检验(p>0.05)测得，2条曲线之间不存在统计差异。在某些实施方案中，当在禁食条件下施用时，缀合物的血清浓度曲线基本上不同于未缀合形式的药物的血清浓度曲线。在某些实施方案中，当在高血糖条件下施用时，缀合物的血清浓度曲线与未缀合形式的药物的血清浓度曲线基本上相同，且当在禁食条件下施用时，基本上不同。在某些实施方案中，所述高血糖条件包含超过200mg/dL(例如，300mg/dL、400mg/dL、500mg/dL、600mg/dL等)的葡萄糖C_max。在某些实施方案中，所述禁食条件包含小于100mg/dL(例如，80mg/dL、70mg/dL、60mg/dL、50mg/dL等)的葡萄糖C_max。应当理解，可以对比任意的前述PK参数，诸如血清T_max、血清C_max、AUC、平均血清停留时间(MRT)、平均血清吸收时间(MAT)和/或血清半衰期。

从药效动力学(PD)角度看，当葡萄糖浓度增加时，或当葡萄糖浓度上穿阈值(例如，高于正常葡萄糖水平)时，缀合物的生物活性可能增加。在某些实施方案中，与高血糖条件相比，当在禁食条件下施用时，缀合物的生物活性更低。在某些实施方案中，所述禁食条件包含小于100mg/dL(例如，80mg/dL、70mg/dL、60mg/dL、50mg/dL等)的葡萄糖C_max。在某些实施方案中，所述高血糖条件包含超过200mg/dL(例如，300mg/dL、400mg/dL、500mg/dL、600mg/dL等)的葡萄糖C_max。

在某些实施方案中，通过测量维持稳定葡萄糖浓度所需的葡萄糖输注速率(GIR)，可以测试缀合物的PD性质。根据这样的实施方案，当在50和200mg/dL、50和300mg/dL、50和400mg/dL、50和500mg/dL、50和600mg/dL、100和200mg/dL、100和300mg/dL、100和400mg/dL、100和500mg/dL、100和600mg/dL、200和300mg/dL、200和400mg/dL、200和500mg/dL、200和600mg/dL等的葡萄糖浓度施用时，缀合物的生物活性可以是基本上不同的。因而，在某些实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，缀合物的生物活性更高。在某些实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，缀合物的生物活性高了至少25%(例如，至少50%或至少100%)。

在某些实施方案中，所述缀合物包括胰岛素分子作为药物。根据这样的实施方案，通过对比达到最小血糖浓度所需的时间(T_nadir)、血糖水平保持低于起始值的特定百分比(例如，起始值的70%或T_70%BGL)的持续时间等，可以观察胰岛素的PD行为。

一般而言，应当理解，根据多种公开的药代动力学和药效动力学方法中的任一种(例如，关于适合皮下递送的方法，参见Baudys等人,BioconjugateChem.9:176-183,1998)，可以测定在本部分中讨论的PK和PD特征中的任一个。还应当理解，可以在任意哺乳动物(例如，人、大鼠、猫、迷你猪、狗等)中测量PK和/或PD性质。在某些实施方案中，在人中测量PK和/或PD性质。在某些实施方案中，在大鼠中测量PK和/或PD性质。在迷你猪中测量在某些实施方案中，PK和/或PD性质。在某些实施方案中，在狗中测量PK和/或PD性质。

还应当理解，尽管在葡萄糖-响应性的缀合物的背景下描述了前述内容，相同的性质和试验适用于对其它糖做出响应的缀合物，所述其它糖包括外源糖，例如甘露糖、L-岩藻糖、N-乙酰基葡糖胺、α-甲基甘露糖等。如在下面和在实施例中更详细地讨论的，替代对比在禁食和高血糖条件下的PK和/或PD性质，可以在施用和不施用外源糖的情况下，在禁食条件下，对比PK和/或PD性质。应当理解，可以将缀合物设计成响应于给定外源糖的不同C_max值。

配体

一般而言，所述缀合物包括至少1个配体。在某些实施方案中，所述缀合物包括单个配体。在某些实施方案中，所述缀合物包括至少2个单独的配体，例如，2、3、4、5或更多个配体。当存在超过一个配体时，所述配体可以具有相同或不同的化学结构。

在某些实施方案中，所述配体能够与糖(例如，葡萄糖或甘露糖)竞争结合内源性糖-结合分子(例如，但不限于表面活性蛋白A和D或选择蛋白家族的成员)。在某些实施方案中，所述配体能够与糖(例如，葡萄糖或甘露糖)竞争结合细胞-表面糖受体(例如，但不限于巨噬细胞甘露糖受体、葡萄糖运载体配体、内皮细胞糖受体或肝细胞糖受体)。在某些实施方案中，所述配体能够与葡萄糖竞争结合内源的葡萄糖-结合分子(例如，但不限于表面活性蛋白A和D或选择蛋白家族的成员)。在某些实施方案中，所述配体能够与糖竞争结合非人凝集素(例如，ConA)。在某些实施方案中，所述配体能够与葡萄糖或甘露糖竞争结合非人凝集素(例如，ConA)。示例性的结合葡萄糖的凝集素包括钙联接蛋白、钙网织蛋白、N-乙酰基葡糖胺受体、选择蛋白、无唾液酸糖蛋白受体、胶原凝集素(结合甘露糖的凝集素)、甘露糖受体、聚集蛋白聚糖、多能聚糖、豌豆凝集素(PSA)、蚕豆凝集素、兵豆凝集素、大豆凝集素、花生凝集素、山黧豆凝集素、驴喜豆凝集素、槐凝集素、bowringiamilbraedii凝集素、伴刀豆球蛋白A(ConA)和商陆丝裂原。

在某些实施方案中，所述配体具有式(IIIa)或(IIIb):

其中：

每个R¹独立地是氢、–OR^y、–N(R^y)₂、–SR^y、–O-Y、–G-Z或–CH₂R^x；

每个R^x独立地是氢、–OR^y、–N(R^y)₂、–SR^y或–O-Y；

每个R^y独立地是–R²、–SO₂R²、–S(O)R²、–P(O)(OR²)₂、–C(O)R²、–CO₂R²或–C(O)N(R²)₂；

每个Y独立地是单糖、二糖或三糖；

每个G独立地是共价键或任选地取代的C_1-9亚烷基，其中G的一个或多个亚甲基单元任选地被下述基团替换：–O–、–S–、–N(R²)–、–C(O)–、–OC(O)–、–C(O)O–、–C(O)N(R²)–、–N(R²)C(O)–、–N(R²)C(O)N(R²)–、–SO₂–、–SO₂N(R²)–、–N(R²)SO₂–或–N(R²)SO₂N(R²)–；

每个Z独立地是卤素、–N(R²)₂、–OR²、–SR²、–N₃、–C≡CR²、–CO₂R²、–C(O)R²或–OSO₂R²；且

每个R²独立地是氢或选自下述的任选地取代的基团：C_1-6脂族，苯基，具有1-2个选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环，或具有1-4个选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳基环。

在某些实施方案中，式(IIIa)或(IIIb)的配体是单糖。在某些实施方案中，所述配体是二糖。在某些实施方案中，所述配体是三糖。在某些实施方案中，所述配体是四糖。在某些实施方案中，所述配体包含不超过共4个单糖部分。

如上面一般地定义的，每个R¹独立地是氢、–OR^y、–N(R^y)₂、–SR^y、–O-Y、–G-Z或–CH₂R^x。在某些实施方案中，R¹是氢。在某些实施方案中，R¹是–OH。在其它实施方案中，R¹是–NHC(O)CH₃。在某些实施方案中，R¹是–O-Y。在某些其它实施方案中，R¹是–G-Z。在有些实施方案中，R¹是–CH₂OH。在其它实施方案中，R¹是–CH₂-O-Y。在其它实施方案中，R¹是–NH₂。本领域普通技术人员会理解，式(IIIa)或(IIIb)中的每个R¹取代基可以属于(R)或(S)立体化学。

如上面一般地定义的，每个R^x独立地是氢、–OR^y、–N(R^y)₂、–SR^y或–O-Y。在有些实施方案中，R^x是氢。在某些实施方案中，R^x是–OH。在其它实施方案中，R^x是–O-Y。

如上面一般地定义的，每个R^y独立地是–R²、–SO₂R²、–S(O)R²、–P(O)(OR²)₂、–C(O)R²、–CO₂R²或–C(O)N(R²)₂。在有些实施方案中，R^y是氢。在其它实施方案中，R^y是–R²。在有些实施方案中，R^y是–C(O)R²。在某些实施方案中，R^y是乙酰基。在其它实施方案中，R^y是–SO₂R²、-S(O)R²、-P(O)(OR²)₂、-CO₂R²或–C(O)N(R²)₂。

如上面一般地定义的，Y是单糖、二糖或三糖。在某些实施方案中，Y是单糖。在有些实施方案中，Y是二糖。在其它实施方案中，Y是三糖。在有些实施方案中，Y是甘露糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖或吡喃木糖。在有些实施方案中，Y是蔗糖、麦芽糖、松二糖、海藻糖、纤维二糖或乳糖。在某些实施方案中，Y是甘露糖。在某些实施方案中，Y是D-甘露糖。本领域普通技术人员会理解，糖Y通过异头碳连接到–O-Y的氧基团上，形成糖苷键。所述糖苷键可以属于α或β构型。

如上面一般地定义的，每个G独立地是共价键或任选地取代的C_1-9亚烷基，其中G的一个或多个亚甲基单元任选地被下述基团替换：–O–、–S–、–N(R²)–、–C(O)–、–OC(O)–、–C(O)O–、–C(O)N(R²)–、–N(R²)C(O)–、–N(R²)C(O)N(R²)–、–SO₂–、–SO₂N(R²)–、–N(R²)SO₂–或–N(R²)SO₂N(R²)–。在有些实施方案中，G是共价键。在某些实施方案中，G是–O-C_1-8亚烷基。在某些实施方案中，G是–OCH₂CH₂–。

如上面一般地定义的，每个Z独立地是卤素、–N(R²)₂、–OR²、–SR²、–N₃、–C≡CR²、–CO₂R²、–C(O)R²或–OSO₂R²。在有些实施方案中，Z是卤素或–OSO₂R²。在其它实施方案中，Z是–N₃或-C≡CR²。在某些实施方案中，Z是–N(R²)₂、-OR²或–SR²。在某些实施方案中，Z是–SH。在某些实施方案中，Z是–NH₂。在某些实施方案中，-G-Z是–OCH₂CH₂NH₂。

在有些实施方案中，在式(IIIa)的C1碳上的R¹取代基是–G-Z，得到式(IIIa-i)的化合物:

其中R¹、G和Z如本文所定义和所述。

在有些实施方案中，所述配体具有式(IIIa-ii):

其中R¹、R^x、G和Z如本文所定义和所述。

在某些实施方案中，所述配体可以具有与葡萄糖相同的化学结构，或可以是葡萄糖的化学上有关的物质。在不同的实施方案中，配体可以有利地具有与葡萄糖不同的化学结构，例如，为了精细调节缀合物的葡萄糖响应。例如，在某些实施方案中，可以使用包含葡萄糖、甘露糖、L-岩藻糖或它们的衍生物(例如，α-L-吡喃岩藻糖苷、甘露糖胺、β-连接的N-乙酰基甘露糖胺、甲基葡萄糖、甲基甘露糖、乙基葡萄糖、乙基甘露糖、丙基葡萄糖、丙基甘露糖等)和/或它们的更高阶组合(例如，二甘露糖、线性的和/或分支的三甘露糖等)的配体。

在某些实施方案中，所述配体包括单糖。在某些实施方案中，所述配体包括二糖。在某些实施方案中，所述配体包括三糖。在有些实施方案中，所述配体包含糖和一个或多个胺基。在某些实施方案中，所述糖和胺基被C₁-C₆烷基（例如，C₁-C₃烷基）隔开。在有些实施方案中，所述配体是氨基乙基葡萄糖(AEG)。在有些实施方案中，所述配体是氨基乙基甘露糖(AEM)。在有些实施方案中，所述配体是氨基乙基二甘露糖(AEBM)。在有些实施方案中，所述配体是氨基乙基三甘露糖(AETM)。在有些实施方案中，所述配体是β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)。在有些实施方案中，所述配体是氨基乙基岩藻糖(AEF)。在某些实施方案中，糖配体属于“D”构型。在其它实施方案中，糖配体属于“L”构型。我们在下面显示了这些示例性的配体的结构。本领域技术人员会认识到其它示例性的配体。

一般而言，配体可以直接地或间接地(即，通过连接物或框架)缀合到药物上。如下面更详细地讨论的，配体可以天然地存在于缀合物框架内(例如，作为聚合物主链的一部分，或作为单体的侧基)。替代地(或额外地)，可以将配体人工地掺入缀合物框架内(例如，以合成地添加到缀合物框架上的化学基团的形式)。在某些实施方案中，缀合物可以包括框架，所述框架包含5个或更多个、10个或更多个、或20个或更多个配体。在某些实施方案中，缀合物可以包含少至1、2、3、4或5个单独的配体。

在某些实施方案中，通过不同的缀合点，将至少2个单独的配体缀合到药物上。在某些实施方案中，将至少2个单独的配体缀合到单个缀合物框架上，所述框架也缀合到药物上。在有些实施方案中，将至少1个配体（诸如AETM、AEG、AEM、AEBM、AEGA或AEF）缀合到1个胰岛素分子上。在某些实施方案中，将至少1个AETM配体缀合物到1个胰岛素分子上。在有些实施方案中，通过一个缀合点或多个缀合点，将至少2个配体（诸如AETM、AEG、AEM、AEBM、AEGA或AEF）缀合到1个胰岛素分子上。在某些实施方案中，所述至少2个配体不是相同的配体。在某些实施方案中，所述至少2个配体是相同的配体。在某些实施方案中，通过一个缀合点或多个缀合点，将至少2个AETM配体缀合到1个胰岛素分子上。如下面在某些示例性缀合物框架中更详细地讨论的，在某些实施方案中，所述单独的配体和药物(例如，胰岛素分子)可以各自位于分支的缀合物框架的单独分支上。例如，所述配体和药物可以位于这些分支的末端。在某些实施方案中，可以使用多分支的缀合物框架。包括聚合的和非聚合的缀合物框架。

在下面更详细地讨论将配体缀合到缀合物框架上的方法。在某些实施方案中，通过C1、C2或C6位置，缀合(直接地，或经由连接物间接地)在一个或多个配体内的糖。在某些实施方案中，所述缀合涉及C1位。糖的C1位也称作异头碳，且可以添加到处于α或β构象的药物或缀合物框架上。在某些实施方案中，所述C1位构造成α异头物。在其它实施方案中，所述C1位构造成β异头物。

药物

应当理解，缀合物可以包含任意药物。缀合物可以包含相同药物的超过一个拷贝，和/或可以包含超过一类药物。所述缀合物不限于任何特定药物，且可以包括小分子药物或生物分子药物。一般而言，使用的药物取决于要治疗的疾病或障碍。本文使用的术语“药物”包括药物的盐和非盐形式。例如，术语“胰岛素分子”包括胰岛素分子的所有盐和非盐形式。应当理解，根据药物，所述盐形式可以是阴离子的或阳离子的。

例如但不限于：在不同的实施方案中，缀合物可以包含下述药物中的任一种：双氯芬酸、硝苯地平、利斯的明、哌甲酯、氟西汀、罗格列酮、泼尼松、泼尼松龙、可待因、乙基吗啡、右美沙芬、那可丁、喷托维林、乙酰半胱氨酸、溴己新、肾上腺素、异丙肾上腺素、奥西那林、麻黄碱、非诺特罗、利米特罗、异丙托铵、胆茶碱、羟丙茶碱、倍氯米松、布地奈德、去乙酰毛花苷、地高辛、洋地黄毒苷、丙吡胺、海葱次苷、奎尼丁、普鲁卡因胺、美西律、氟卡尼、阿普洛尔、普萘洛尔、纳多洛尔、吲哚洛尔、氧烯洛尔、拉贝洛尔、噻吗洛尔、阿替洛尔、戊四硝酯、硝酸异山梨酯、单硝酸异山梨酯、硝苯地平、苯基胺、维拉帕米、地尔硫卓、环扁桃酯（cyclandelar）、烟醇、烟酸肌醇、前列地尔、依替福林、普瑞特罗、多巴酚丁胺、多巴胺、双氢麦角胺、胍乙啶、倍他尼定、甲基多巴、利舍平、胍法辛、曲美芬、肼屈嗪、双肼屈嗪、哌唑嗪、二氮嗪、卡托普利、硝苯地平、依那普利、硝普钠、苄氟噻嗪、氢氯噻嗪、甲氯噻嗪、泊利噻嗪、氯噻酮、cinetazon、氯帕胺、美夫西特、美托拉宗、布美他尼、ethacrynacide、螺内酯、阿米洛利、氯贝丁酯、烟酸、戊四烟酯、溴苯那敏、桂利嗪、右氯苯那敏、氯马斯汀、安他唑啉、赛庚啶、异丙嗪、西眯替丁、雷尼替丁、硫糖铝、罂粟碱、莫沙维林、阿托品、丁基莨菪胺、emepron、glucopyrron、莨菪碱、mepensolar、甲基东莨菪碱、羟苄利明、probanteline、特罗地林、番泻叶糖苷、波希鼠李皮提取物（sagradaextract）、丹蒽醌、比沙可啶、匹可硫酸钠、乙基羟乙基纤维素、地芬诺酯、洛哌丁胺、柳氮磺吡啶、pyrvin、甲苯达唑、dimeticon、富马酸亚铁、琥珀酸亚铁、ferritetrasemisodium、氰钴胺素、叶酸肝素、肝素辅因子、diculmarole、华法林、链激酶、尿激酶、因子VIII、因子IX、维生素K、thiopeta、白消安、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、左旋溶肉瘤素、卡莫司汀、mercatopurin、硫鸟嘌呤、azathioprin、阿糖胞苷、长春碱、长春新碱、vindesin、丙卡巴肼、达卡巴嗪、洛莫司汀、雌莫司汀、替尼泊苷、依托泊苷、顺铂、amsachrin、氨鲁米特、磷雌酚、甲羟孕酮、羟孕酮、甲地孕酮、去甲脱氢羟孕酮、他莫昔芬、环孢素、磺胺索嘧啶、苄青霉素、青霉素V、双氯西林、氯唑西林、flucoxacillin、氨苄西林、阿莫西林、匹氨西林、巴氨西林、哌拉西林、美洛西林、美西林、匹美西林、头孢噻吩、头孢氨苄、cephradin、头孢羟氨苄、头孢克洛、cefuroxim、头孢噻肟、头孢他啶、头孢西丁、氨曲南、亚胺培南、西司他丁、四环素、赖甲环素、地美环素、美他环素、oxitetracycline、多西环素、氯霉素、螺旋霉素、夫西地酸、林可霉素、克林霉素、大观霉素、利福平、两性霉素B、灰黄霉素、制霉菌素、万古霉素、甲硝唑、替硝唑、甲氧苄啶、诺氟沙星、柳氮磺吡啶、aminosalyl、异烟肼、乙胺丁醇、呋喃妥因、萘啶酸、metanamine、氯喹、羟氯喹、tinidazol、酮康唑、阿昔洛韦、干扰素碘苷、视黄醛、tiamin、右泛醇、吡哆醇、叶酸、抗坏血酸、生育酚、植物甲萘醌、芬氟拉明、促皮质素、替可克肽、促甲状腺素、垂体生长激素、人蛋氨生长素、加压素、赖氨加压素、去氨加压素、缩宫素、绒毛膜促性腺激素、醋酸考的松、氢化可的松、fluodrocortison、泼尼松、泼尼松龙、氟羟甲基睾丸素、美睾酮、诺龙、司坦唑醇、羟甲烯龙、环丙孕酮、左甲状腺素、碘塞罗宁、丙硫氧嘧啶、卡比吗唑、甲硫咪唑(tiamazol)、双氢速甾醇、阿法骨化醇、骨化三醇、胰岛素、甲苯磺丁脲、氯磺丙脲、妥拉磺脲、格列吡嗪、格列本脲、苯巴比妥、甲乙哌酮、pyrityidion、甲丙氨酯、氯氮卓、地西泮、硝西泮、巴氯芬、奥沙西泮、dikaliumclorazepat、劳拉西泮、氟硝西泮、阿普唑仑、咪达唑仑、羟嗪、丹曲林、chlometiazol、丙脒(propionmazine)、阿利马嗪、氯丙嗪、左美丙嗪、醋奋乃静、氟奋乃静、奋乃静、丙氯拉嗪、三氟拉嗪、地西拉嗪、硫利达嗪、哌氰嗪、氯普噻吨、替扎尼定、扎来普隆、zuclopentizol、氟哌噻吨、替沃噻吨、氟哌啶醇、曲米帕明、奥匹哌醇、chlomipramin、地昔帕明、洛非帕明、阿米替林、去甲阿米替林、普罗替林、马普替林、咖啡因、桂利嗪、赛克力嗪、茶苯海明、美克洛嗪、prometazine、硫乙拉嗪、甲氧氯普胺、东莨菪碱、苯巴比妥、苯妥英、乙琥胺、扑米酮、卡马西平、氯硝西泮、奥芬那君、阿托品、苯扎托品、比哌立登、美噻吨、丙环定、左旋多巴、溴隐亭、金刚烷胺、ambenon、吡啶斯的明、synstigmine、双硫仑、吗啡、可待因、喷他佐辛、丁丙诺啡、哌替啶、苯哌利定、芬太尼、美沙酮、哌腈米特、右丙氧芬、凯托米酮、阿司匹林、塞来考昔、安替比林、保泰松、阿扎丙宗、吡罗昔康、麦角胺、双氢麦角胺、赛庚啶、pizitifen、flumedroxon、别嘌醇、丙磺舒、金硫丁二钠金诺芬、青霉胺、雌二醇、戊酸雌二醇、雌三醇、炔雌醇、dihydrogesterone、利奈孕酮、甲羟孕酮、去甲脱氢羟孕酮、环芬尼、氯米芬、左炔诺孕酮、美雌醇、奥硝唑、替硝唑、益康唑、克霉唑、那他霉素、咪康唑、舒苯汀、甲基麦角胺、地诺前列素、地诺前列酮、吉美前列素、溴隐亭、苯丙醇胺、色甘酸钠、azetasolamide、双氯非那胺、倍他胡萝卜素、纳洛酮、亚叶酸钙、尤其是可乐定、茶碱、双嘧达莫、hydrochlothiazade、东莨菪碱、吲哚美辛、呋塞米、氯化钾、吗啡、布洛芬、沙丁胺醇、特布他林、降钙素等。应当理解，该列表意图是示例性的，已知的或以后发现的任意药物可以用于本公开内容的缀合物中。

在不同的实施方案中，缀合物可以包括肽或非肽的激素药物，例如：肾上腺素、去甲肾上腺素、血管紧张素、房肽素、醛甾酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、睾酮、二氢睾酮、降钙素、骨化三醇、骨化二醇、促皮质素、皮质醇、多巴胺、雌二醇、雌酮、雌三醇、促红细胞生成素、滤泡刺激激素、胃泌素、葛瑞林、高血糖素、促性腺素释放激素、生长激素、生长激素释放激素、人绒毛膜促性腺激素、组胺、人胎盘催乳激素、胰岛素、胰岛素-样生长因子、抑制素、瘦素、白三烯、促脂解素、褪黑激素、阿立新、缩宫素、甲状旁腺激素、黄体酮、催乳素、催乳素释放激素、前列腺素、肾素、5-羟色胺、胰泌素、生长抑素、血小板生成素、甲状腺刺激激素、促甲状腺素释放激素(或促甲状腺素)、促甲状腺素释放激素、甲状腺素、三碘甲状腺原氨酸、加压素等。在某些实施方案中，所述激素可以选自：高血糖素、胰岛素、胰岛素-样生长因子、瘦素、甲状腺刺激激素、促甲状腺素释放激素(或促甲状腺素)、促甲状腺素释放激素、甲状腺素和三碘甲状腺原氨酸。在某些实施方案中，所述药物是胰岛素-样生长因子1(IGF-1)。应当理解，该列表意图是示例性的，已知的或以后发现的任意激素药物可以用于本公开内容的缀合物中。

在不同的实施方案中，缀合物可以包括甲状腺激素。

在不同的实施方案中，缀合物可以包括抗糖尿病药物(即，对遭受糖尿病的患者具有有益效果的药物)。

在不同的实施方案中，缀合物可以包括胰岛素分子。本文使用的术语“胰岛素”或“胰岛素分子”包括胰岛素分子的所有盐和非盐形式。应当理解，所述盐形式可以是阴离子的或阳离子的，取决于胰岛素分子。“胰岛素”或“胰岛素分子”意在包括胰岛素的野生型和修饰形式，只要它们是生物活性的(即，当体内施用时，能够造成葡萄糖的可检测的减少)。野生型胰岛素包括来自任意物种的纯化的、合成的或重组形式的胰岛素(例如，人胰岛素、猪胰岛素、牛胰岛素、兔胰岛素、绵羊胰岛素等)。它们中的许多可商业得到，例如，购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。胰岛素的多种修饰形式是本领域已知的(例如参见Crotty和Reynolds,Pediatr.Emerg.Care.23:903-905,2007和Gerich,Am.J.Med.113:308-16,2002和其中引用的参考文献)。胰岛素的修饰形式可以是化学修饰的(例如，通过添加化学部分，诸如PEG基团或脂肪酰基链，如下所述)和/或突变的(即，通过添加、删除或置换一个或多个氨基酸)。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子与野生型胰岛素相差1-10(例如，1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-9、5-8、5-7、5-6、6-9、6-8、6-7、7-9、7-8、8-9、9、8、7、6、5、4、3、2或1)个氨基酸置换、添加和/或删除。在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子与野生型胰岛素仅相差氨基酸置换。在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子与野生型胰岛素仅相差氨基酸添加。在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子与野生型胰岛素相差氨基酸置换和添加。在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子与野生型胰岛素相差氨基酸置换和删除。

在某些实施方案中，基于涉及的残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性，可以进行氨基酸置换。在某些实施方案中，置换可以是保守的，也就是说，用一个具有类似形状和电荷的氨基酸替换一个氨基酸。保守置换是本领域众所周知的，且通常包括在下述组内的置换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；门冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和酪氨酸、苯丙氨酸。在某些实施方案中，在选择合适的突变时，可以考虑氨基酸的疏水指数。本领域通常理解疏水氨基酸指数在赋予多肽的相互作用生物功能中的重要性。或者，基于亲水性，可以有效地进行类似氨基酸的置换。本领域通常理解亲水性在赋予多肽的相互作用生物功能中的重要性。在美国专利号5,691,198中，进一步讨论了疏水指数或亲水性在设计多肽中的应用。

在下面和在图63中，显示了人胰岛素(A-链和B-链)的野生型序列。

A-链(SEQIDNO:1)：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN

B-链(SEQIDNO:2)：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT

人胰岛素与兔、猪、牛和绵羊胰岛素的差别仅在于氨基酸A8、A9、A10和B30(参见下表)。

在不同的实施方案中，本公开内容的胰岛素分子在B-肽序列的B28和/或B29位置处突变。例如，赖脯胰岛素(HUMALOG?)是一种速效胰岛素突变体，其中在B-肽的C-端末端上的倒数第二位的赖氨酸和脯氨酸残基已经反转(Lys^B28Pro^B29-人胰岛素)。该修饰会阻断胰岛素多聚体的形成。门冬胰岛素(NOVOLOG?)是另一种速效胰岛素突变体，其中在位置B28处的脯氨酸已经被门冬氨酸置换(Asp^B28-人胰岛素)。该突变体也会阻止多聚体的形成。在有些实施方案中，在位置B28和/或B29处的突变伴有一个或多个在胰岛素多肽别处的突变。例如，谷赖胰岛素(APIDRA?)是另一种速效胰岛素突变体，其中在位置B3处的门冬氨酸已经被赖氨酸残基替换，且在位置B29处的赖氨酸已经被谷氨酸残基替换(Lys^B3Glu^B29-人胰岛素)。

在不同的实施方案中，本公开内容的胰岛素分子具有与人胰岛素相比迁移的等电点。在有些实施方案中，通过将一个或多个精氨酸残基添加到胰岛素A-肽的N-端和/或胰岛素B-肽的C-端，实现等电点迁移。这样的胰岛素多肽的实例包括Arg^A0-人胰岛素、Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、Arg^A0Arg^B31Arg^B32-人胰岛素和Arg^A0Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素。作为其它实例，甘精胰岛素(来得时?)是一种示例性的长效胰岛素突变体，其中Asp^A21已经被甘氨酸替换，且2个精氨酸残基已经添加到B-肽的C-端。这些变化的作用是迁移等电点，产生在pH4完全可溶的溶液。因而，在有些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含A-肽序列（其中A21是Gly）和B-肽序列（其中B31和B32是Arg-Arg）。应当理解，本公开内容包括这些突变和本文所述的任意其它突变的所有单个和多个组合(例如，Gly^A21-人胰岛素、Gly^A21Arg^B31-人胰岛素、Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、Arg^B31-人胰岛素)。

在不同的实施方案中，本公开内容的胰岛素分子被截短。例如，在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素多肽的B-肽序列缺少B1、B2、B3、B26、B27、B28、B29和/或B30。在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素多肽的B-肽序列缺少残基组合。例如，所述B-肽序列可以缺少残基B(1-2)、B(1-3)、B(29-30)、B(28-30)、B(27-30)和/或B(26-30)。在有些实施方案中，这些删除和/或截短适用于任意的前述胰岛素分子(例如，但不限于生成des(B30)-赖脯胰岛素、des(B30)-门冬胰岛素、des(B30)-谷赖胰岛素、des(B30)-甘精胰岛素等)。

在有些实施方案中，胰岛素分子含有在A或B-肽序列的N-或C-端上的额外的氨基酸残基。在有些实施方案中，一个或多个氨基酸残基位于位置A0、A21、B0和/或B31。在有些实施方案中，一个或多个氨基酸残基位于位置A0。在有些实施方案中，一个或多个氨基酸残基位于位置A21。在有些实施方案中，一个或多个氨基酸残基位于位置B0。在有些实施方案中，一个或多个氨基酸残基位于位置B31。在某些实施方案中，胰岛素分子不包含在任何额外的在位置A0、A21、B0或B31处的氨基酸残基。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子被突变，使得一个或多个酰胺化的氨基酸被酸形式替换。例如，可以用门冬氨酸或谷氨酸替换天冬酰胺。同样地，可以用门冬氨酸或谷氨酸替换谷氨酰胺。具体地，可以用门冬氨酸或谷氨酸替换Asn^A18、Asn^A21或Asn^B3或那些残基的任意组合。可以用门冬氨酸或谷氨酸替换Gln^A15或Gln^B4或二者。在某些实施方案中，胰岛素分子具有在位置A21处的门冬氨酸或在位置B3处的门冬氨酸或二者。

本领域技术人员会认识到:可能突变胰岛素分子中的其它氨基酸，同时保留生物活性。例如但不限于下述的修饰也是本领域广泛接受的：用门冬氨酸替换在位置B10的组氨酸残基(His^B10→Asp^B10)；用门冬氨酸替换在位置B1的苯丙氨酸残基(Phe^B1→Asp^B1)；用丙氨酸替换在位置B30的苏氨酸残基(Thr^B30→Ala^B30)；用丙氨酸替换在位置B26的酪氨酸残基(Tyr^B26→Ala^B26)；和用门冬氨酸替换在位置B9的丝氨酸残基(Ser^B9→Asp^B9)。

在不同的实施方案中，本公开内容的胰岛素分子具有延长的作用特性。因而，在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子可以被脂肪酸酰化。也就是说，在胰岛素分子的氨基和脂肪酸的羧酸基团之间形成酰胺键。所述氨基可以是胰岛素分子的N-端氨基酸的α-氨基，或可以是胰岛素分子的赖氨酸残基的ε-氨基。本公开内容的胰岛素分子可以在野生型人胰岛素中存在的3个氨基中的一个或多个处被酰化，或可以在已经导入到野生型人胰岛素序列中的赖氨酸残基上被酰化。在某些实施方案中，胰岛素分子可以在位置B1处被酰化。在某些实施方案中，胰岛素分子可以在位置B29处被酰化。在某些实施方案中，所述脂肪酸选自肉豆蔻酸(C14)、十五酸(C15)、棕榈酸(C16)、十七酸(C17)和硬脂酸(C18)。例如，地特胰岛素(LEVEMIR?)是一种长效胰岛素突变体，其中Thr^B30已经被删除，且C14脂肪酸链(肉豆蔻酸)已经添加到Lys^B29上。

在有些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子的A-肽的N-端、B-肽的N-端、位于位置B29的Lys的ε-氨基或任意其它可利用的氨基共价地连接到下述通式的脂肪酸部分上：

其中R^F是氢或C_1-30烷基。在有些实施方案中，R^F是C_1-20烷基、C_3-19烷基、C_5-18烷基、C_6-17烷基、C_8-16烷基、C_10-15烷基或C_12-14烷基。在某些实施方案中，所述胰岛素多肽在A1位置处缀合到该部分上。在某些实施方案中，所述胰岛素多肽在B1位置处缀合到该部分上。在某些实施方案中，所述胰岛素多肽在位于位置B29的Lys的ε-氨基处缀合到该部分上。在某些实施方案中，胰岛素分子的位置B28是Lys，且Lys^B28的ε-氨基缀合到该脂肪酸部分上。在某些实施方案中，胰岛素分子的位置B3是Lys，且Lys^B3的ε-氨基缀合到该脂肪酸部分上。在有些实施方案中，所述脂肪酸链的长度是8-20个碳。在有些实施方案中，所述脂肪酸是辛酸(C8)、壬酸(C9)、癸酸(C10)、十一烷酸(C11)、十二烷酸(C12)或十三烷酸(C13)。在某些实施方案中，所述脂肪酸是肉豆蔻酸(C14)、十五烷酸(C15)、棕榈酸(C16)、十七烷酸(C17)、硬脂酸(C18)、十九烷酸(C19)或花生酸(C20)。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：Lys^B28Pro^B29-人胰岛素(赖脯胰岛素)、Asp^B28-人胰岛素(门冬胰岛素)、Lys^B3Glu^B29-人胰岛素(谷赖胰岛素)、Arg^B31Arg^B32-人胰岛素(甘精胰岛素)、N^εB29-肉豆蔻酰基-des(B30)-人胰岛素(地特胰岛素)、Ala^B26-人胰岛素、Asp^B1-人胰岛素、Arg^A0-人胰岛素、Asp^B1Glu^B13-人胰岛素、Gly^A21-人胰岛素、Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、Arg^A0Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、Arg^A0Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、des(B30)-人胰岛素、des(B27)-人胰岛素、des(B28-B30)-人胰岛素、des(B1)-人胰岛素、des(B1-B3)-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB29-棕榈酰基-人胰岛素、N^εB29-肉豆蔻酰基-人胰岛素、N^εB28-棕榈酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-肉豆蔻酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB29-棕榈酰基-des(B30)-人胰岛素、N^εB30-肉豆蔻酰基-Thr^B29Lys^B30-人胰岛素、N^εB30-棕榈酰基-Thr^B29Lys^B30-人胰岛素、N^εB29-(N-棕榈酰基-γ-谷氨酰基)-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-(N-lithocolyl-γ-谷氨酰基)-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-(ω-羧基十七酰基)-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-(ω-羧基十七酰基)-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB29-辛酰基-人胰岛素、N^εB29-肉豆蔻酰基-Gly^A21Arg^B31Arg^B31-人胰岛素、N^εB29-肉豆蔻酰基-Gly^A21Gln^B3Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB29-肉豆蔻酰基-Arg^A0Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB29-Arg^A0Gly^A21Gln^B3Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB29-肉豆蔻酰基-Arg^A0Gly^A21Asp^B3Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB29-肉豆蔻酰基-Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB29-肉豆蔻酰基-Arg^A0Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB29-辛酰基-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB29-辛酰基-Gly^A21Gln^B3Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB29-辛酰基-Arg^A0Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB29-辛酰基-Arg^A0Gly^A21Gln^B3Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB29-辛酰基-Arg^B0Gly^A21Asp^B3Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB29-辛酰基-Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB29-辛酰基-Arg^A0Arg^B31Arg^B32-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素多肽之一的突变和/或化学修饰：N^εB28-肉豆蔻酰基-Gly^A21Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB28-肉豆蔻酰基-Gly^A21Gln^B3Lys^B28Pro^B30Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB28-肉豆蔻酰基-Arg^A0Gly^A21Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB28-肉豆蔻酰基-Arg^A0Gly^A21Gln^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB28-肉豆蔻酰基-Arg^A0Gly^A21Asp^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB28-肉豆蔻酰基-Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB28-肉豆蔻酰基-arg^A0Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB28-辛酰基-Gly^A21Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB28-辛酰基-Gly^A21Gln^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB28-辛酰基-Arg^A0Gly^A21Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB28-辛酰基-Arg^A0Gly^A21Gln^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB28-辛酰基-Arg^A0Gly^A21Asp^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB28-辛酰基-Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB28-辛酰基-Arg^A0Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB29-十三酰基-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-十四酰基-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-癸酰基-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-十二烷酰基-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-十三酰基-Gly^A21-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-十四酰基-Gly^A21-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-癸酰基-Gly^A21-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-十二烷酰基-Gly^A21-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-十三酰基-Gly^A21Gln^B3-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-十四酰基-Gly^A21Gln^B3-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-癸酰基-Gly^A21-Gln^B3-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-十二烷酰基-Gly^A21-Gln^B3-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-十三酰基-Ala^A21-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-十四酰基-Ala^A21-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-癸酰基-Ala^A21-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-十二烷酰基-Ala^A21-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-十三酰基-Ala^A21-Gln^B3-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-十四酰基-Ala^A21Gln^B3-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-癸酰基-Ala^A21Gln^B3-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-十二烷酰基-Ala^A21Gln^B3-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-十三酰基-Gln^B3-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-十四酰基-Gln^B3-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-癸酰基-Gln^B3-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-十二烷酰基-Gln^B3-des(B30)-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB29-十三酰基-Gly^A21-人胰岛素、N^εB29-十四酰基-Gly^A21-人胰岛素、N^εB29-癸酰基-Gly^A21-人胰岛素、N^εB29-十二烷酰基-Gly^A21-人胰岛素、N^εB29-十三酰基-Ala^A21-人胰岛素、N^εB29-十四酰基-Ala^A21-人胰岛素、N^εB29-癸酰基-Ala^A21-人胰岛素、N^εB29-十二烷酰基-Ala^A21-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB29-十三酰基-Gly^A21Gln^B3-人胰岛素、N^εB29-十四酰基-Gly^A21Gln^B3-人胰岛素、N^εB29-癸酰基-Gly^A21Gln^B3-人胰岛素、N^εB29-十二烷酰基-Gly^A21Gln^B3-人胰岛素、N^εB29-十三酰基-Ala^A21Gln^B3-人胰岛素、N^εB29-十四酰基-Ala^A21Gln^B3-人胰岛素、N^εB29-癸酰基-Ala^A21Gln^B3-人胰岛素、N^εB29-十二烷酰基-Ala^A21Gln^B3-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB29-十三酰基-Gln^B3-人胰岛素、N^εB29-十四酰基-Gln^B3-人胰岛素、N^εB29-癸酰基-Gln^B3-人胰岛素、N^εB29-十二烷酰基-Gln^B3-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB29-十三酰基-Glu^B30-人胰岛素、N^εB29-十四酰基-Glu^B30-人胰岛素、N^εB29-癸酰基-Glu^B30-人胰岛素、N^εB29-十二烷酰基-Glu^B30-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB29-十三酰基-Gly^A21Glu^B30-人胰岛素、N^εB29-十四酰基-Gly^A21Glu^B30-人胰岛素、N^εB29-癸酰基-Gly^A21Glu^B30-人胰岛素、N^εB29-十二烷酰基-Gly^A21Glu^B30-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB29-十三酰基-Gly^A21Gln^B3Glu^B30-人胰岛素、N^εB29-十四酰基-Gly^A21Gln^B3Glu^B30-人胰岛素、N^εB29-癸酰基-Gly^A21Gln^B3Glu^B30-人胰岛素、N^εB29-十二烷酰基-Gly^A21Gln^B3Glu^B30-人胰岛素、N^εB29-十三酰基-Ala^A21Glu^B30-人胰岛素、N^εB29-十四酰基-Ala^A21Glu^B30-人胰岛素、N^εB29-癸酰基-Ala^A21Glu^B30-人胰岛素、N^εB29-十二烷酰基-Ala^A21Glu^B30-人胰岛素、N^εB29-十三酰基-Ala^A21Gln^B3Glu^B30-人胰岛素、N^εB29-十四酰基-Ala^A21Gln^B3Glu^B30-人胰岛素、N^εB29-癸酰基-Ala^A21Gln^B3Glu^B30-人胰岛素、N^εB29-十二烷酰基-Ala^A21Gln^B3Glu^B30-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB29-十三酰基-Gln^B3Glu^B30-人胰岛素、N^εB29-十四酰基-Gln^B3Glu^B30-人胰岛素、N^εB29-癸酰基-Gln^B3Glu^B30-人胰岛素、N^εB29-十二烷酰基-Gln^B3Glu^B30-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB29-甲酰基-人胰岛素、N^αB1-甲酰基-人胰岛素、N^αA1-甲酰基-人胰岛素、N^εB29-甲酰基-N^αB1-甲酰基-人胰岛素、N^εB29-甲酰基-N^αA1-甲酰基-人胰岛素、N^αA1-甲酰基-N^αB1-甲酰基-人胰岛素、N^εB29-甲酰基-N^αA1-甲酰基-N^αB1-甲酰基-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB29-乙酰基-人胰岛素、N^αB1-乙酰基-人胰岛素、N^αA1-乙酰基-人胰岛素、N^εB29-乙酰基-N^αB1-乙酰基-人胰岛素、N^εB29-乙酰基-N^αA1-乙酰基-人胰岛素、N^αA1-乙酰基-N^αB1-乙酰基-人胰岛素、N^εB29-乙酰基-N^αA1-乙酰基-N^αB1-乙酰基-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB29-丙酰基-人胰岛素、N^αB1-丙酰基-人胰岛素、N^αA1-丙酰基-人胰岛素、N^εB29-乙酰基-N^αB1-丙酰基-人胰岛素、N^εB29-丙酰基-N^αA1-丙酰基-人胰岛素、N^αA1-丙酰基-N^αB1-丙酰基-人胰岛素、N^εB29-丙酰基-N^αA1-丙酰基-N^αB1-丙酰基-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB29-丁酰基-人胰岛素、N^αB1-丁酰基-人胰岛素、N^αA1-丁酰基-人胰岛素、N^εB29-丁酰基-N^αB1-丁酰基-人胰岛素、N^εB29-丁酰基-N^αA1-丁酰基-人胰岛素、N^αA1-丁酰基-N^αB1-丁酰基-人胰岛素、N^εB29-丁酰基-N^αA1-丁酰基-N^αB1-丁酰基-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB29-戊酰基-人胰岛素、N^αB1-戊酰基-人胰岛素、N^αA1-戊酰基-人胰岛素、N^εB29-戊酰基-N^αB1-戊酰基-人胰岛素、N^εB29-戊酰基-N^αA1-戊酰基-人胰岛素、N^αA1-戊酰基-N^αB1-戊酰基-人胰岛素、N^εB29-戊酰基-N^αA1-戊酰基-N^αB1-戊酰基-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB29-己酰基-人胰岛素、N^αB1-己酰基-人胰岛素、N^αA1-己酰基-人胰岛素、N^εB29-己酰基-N^αB1-己酰基-人胰岛素、N^εB29-己酰基-N^αA1-己酰基-人胰岛素、N^αA1-己酰基-N^αB1-己酰基-人胰岛素、N^εB29-己酰基-N^αA1-己酰基-N^αB1-己酰基-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB29-庚酰基-人胰岛素、N^αB1-庚酰基-人胰岛素、N^αA1-庚酰基-人胰岛素、N^εB29-庚酰基-N^αB1-庚酰基-人胰岛素、N^εB29-庚酰基-N^αA1-庚酰基-人胰岛素、N^αA1-庚酰基-N^αB1-庚酰基-人胰岛素、N^εB29-庚酰基-N^αA1-庚酰基-N^αB1-庚酰基-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^αB1-辛酰基-人胰岛素、N^αA1-辛酰基-人胰岛素、N^εB29-辛酰基-N^αB1-辛酰基-人胰岛素、N^εB29-辛酰基-N^αA1-辛酰基-人胰岛素、N^αA1-辛酰基-N^αB1-辛酰基-人胰岛素、N^εB29-辛酰基-N^αA1-辛酰基-N^αB1-辛酰基-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB29-壬酰基-人胰岛素、N^αB1-壬酰基-人胰岛素、N^αA1-壬酰基-人胰岛素、N^εB29-壬酰基-N^αB1-壬酰基-人胰岛素、N^εB29-壬酰基-N^αA1-壬酰基-人胰岛素、N^αA1-壬酰基-N^αB1-壬酰基-人胰岛素、N^εB29-壬酰基-N^αA1-壬酰基-N^αB1-壬酰基-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB29-癸酰基-人胰岛素、N^αB1-癸酰基-人胰岛素、N^αA1-癸酰基-人胰岛素、N^εB29-癸酰基-N^αB1-癸酰基-人胰岛素、N^εB29-癸酰基-N^αA1-癸酰基-人胰岛素、N^αA1-癸酰基-N^αB1-癸酰基-人胰岛素、N^εB29-癸酰基-N^αA1-癸酰基-N^αB1-癸酰基-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB28-甲酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αB1-甲酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αA1-甲酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-甲酰基-N^αB1-甲酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-甲酰基-N^αA1-甲酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αA1-甲酰基-N^αB1-甲酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-甲酰基-N^αA1-甲酰基-N^αB1-甲酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB29-乙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αB1-乙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αA1-乙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-乙酰基-N^αB1-乙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB28-乙酰基-N^αA1-乙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αA1-乙酰基-N^αB1-乙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-乙酰基-N^αA1-乙酰基-N^αB1-乙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB28-丙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αB1-丙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αA1-丙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-丙酰基-N^αB1-丙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-丙酰基-N^αA1-丙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αA1-丙酰基-N^αB1-丙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-丙酰基-N^αA1-丙酰基-N^αB1-丙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB28-丁酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αB1-丁酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αA1-丁酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-丁酰基-N^αB1-丁酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-丁酰基-N^αA1-丁酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αA1-丁酰基-N^αB1-丁酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-丁酰基-N^αA1-丁酰基-N^αB1-丁酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB28-戊酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αB1-戊酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αA1-戊酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-戊酰基-N^αB1-戊酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-戊酰基-N^αA1-戊酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αA1-戊酰基-N^αB1-戊酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-戊酰基-N^αA1-戊酰基-N^αB1-戊酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB28-己酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αB1-己酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αA1-己酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-己酰基-N^αB1-己酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-己酰基-N^αA1-己酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αA1-己酰基-N^αB1-己酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-己酰基-N^αA1-己酰基-N^αB1-己酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB28-庚酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αB1-庚酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αA1-庚酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-庚酰基-N^αB1-庚酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-庚酰基-N^αA1-庚酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αA1-庚酰基-N^αB1-庚酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-庚酰基-N^αA1-庚酰基-N^αB1-庚酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB28-辛酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αB1-辛酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αA1-辛酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-辛酰基-N^αB1-辛酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-辛酰基-N^αA1-辛酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αA1-辛酰基-N^αB1-辛酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-辛酰基-N^αA1-辛酰基-N^αB1-辛酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB28-壬酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αB1-壬酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αA1-壬酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-壬酰基-N^αB1-壬酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-壬酰基-N^αA1-壬酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αA1-壬酰基-N^αB1-壬酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-壬酰基-N^αA1-壬酰基-N^αB1-壬酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB28-癸酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αB1-癸酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αA1-癸酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-癸酰基-N^αB1-癸酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-癸酰基-N^αA1-癸酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^αA1-癸酰基-N^αB1-癸酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^εB28-癸酰基-N^αA1-癸酰基-N^αB1-癸酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^εB29-戊酰基-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^αB1-己酰基-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^αA1-庚酰基-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB29-辛酰基-N^αB1-辛酰基-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB29-丙酰基-N^αA1-丙酰基-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^αA1-乙酰基-N^αB1-乙酰基-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB29-甲酰基-N^αA1-甲酰基-N^αB1-甲酰基-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^εB29-甲酰基-des(B26)-人胰岛素、N^αB1-乙酰基-Asp^B28-人胰岛素、N^εB29-丙酰基-N^αA1-丙酰基-N^αB1-丙酰基-Asp^B1Asp^B3AspB²¹-人胰岛素、N^εB29-戊酰基-Gly^A21-人胰岛素、N^αB1-己酰基-Gly^A21-人胰岛素、N^αA1-庚酰基-Gly^A21-人胰岛素、N^εB29-辛酰基-N^αB1-辛酰基-Gly^A21-人胰岛素、N^εB29-丙酰基-N^αA1-丙酰基-Gly^A21-人胰岛素、N^αA1-乙酰基-N^αB1-乙酰基-Gly^A21-人胰岛素、N^εB29-甲酰基-N^αA1-甲酰基-N^αB1-甲酰基-Gly^A21-人胰岛素、N^εB29-丁酰基-des(B30)-人胰岛素、N^αB1-丁酰基-des(B30)-人胰岛素、N^αA1-丁酰基-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-丁酰基-N^αB1-丁酰基-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-丁酰基-N^αA1-丁酰基-des(B30)-人胰岛素、N^αA1-丁酰基-N^αB1-丁酰基-des(B30)-人胰岛素、N^εB29-丁酰基-N^αA1-丁酰基-N^αB1-丁酰基-des(B30)-人胰岛素。

本公开内容也包括非人胰岛素(例如，猪胰岛素、牛胰岛素、兔胰岛素、绵羊胰岛素等)的修饰形式，其包含任一种前述突变和/或化学修饰。

这些和其它修饰的胰岛素分子详细描述在美国专利号6,906,028、6,551,992、6,465,426、6,444,641、6,335,316、6,268,335、6,051,551、6,034,054、5,952,297、5,922,675、5,747,642、5,693,609、5,650,486、5,547,929、5,504,188、5,474,978、5,461,031和4,421,685和美国专利号7,387,996、6,869,930、6,174,856、6,011,007、5,866,538和5,750,497中，它们的整个公开内容通过引用并入本文。

在不同的实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包括3个野生型二硫键(即，1个在A-链的位置7和B-链的位置7之间，第2个在A-链的位置20和B-链的位置19之间，第3个在A-链的位置6和11之间)。

在有些实施方案中，修饰和/或突变胰岛素分子，以降低它对胰岛素受体的亲和力。不希望限于特定理论，据信，通过修饰(例如，酰基化)或突变来减弱胰岛素分子的受体亲和力，可以降低从血清中消除胰岛素分子的速率。在有些实施方案中，降低的胰岛素受体亲和力在体外翻译成胰岛素-缀合物的优良体内活性。在某些实施方案中，胰岛素分子被突变，使得突变位点用作缀合点，且在突变位点处的缀合会减少与胰岛素受体的结合(例如，Lys^A3)。在某些其它实施方案中，在现有的野生型氨基酸或末端处的缀合会减少与胰岛素受体的结合(例如，Gly^A1)。在有些实施方案中，在位置A4、A5、A8、A9或B30处，缀合胰岛素分子。在某些实施方案中，通过野生型氨基酸侧链(例如，Glu^A4)，发生在位置A4、A5、A8、A9或B30处的缀合。在某些其它实施方案中，在位置A4、A5、A8、A9或B30处突变胰岛素分子，以提供缀合位点(例如，Lys^A4、Lys^A5、Lys^A8、Lys^A9或Lys^B30)。

下面描述了缀合药物（包括胰岛素分子）的方法。在某些实施方案中，通过A1氨基酸残基，将胰岛素分子缀合到配体或缀合物框架上。在某些实施方案中，所述A1氨基酸残基是甘氨酸。但是，应当理解，本公开内容不限于N-端缀合，且在某些实施方案中，可以通过非末端A-链氨基酸残基来缀合胰岛素分子。具体地，本公开内容包括通过在A-链的任意位置处存在的赖氨酸残基(野生型或通过定点诱变导入)的ε-胺基进行缀合。应当理解，在A-链上的不同缀合位置可以导致胰岛素活性的不同降低。在某些实施方案中，胰岛素分子通过B1氨基酸残基缀合到缀合物框架上。在某些实施方案中，所述B1氨基酸残基是苯丙氨酸。但是，应当理解，本公开内容不限于N-端缀合，且在某些实施方案中，胰岛素分子可以通过非末端B-链氨基酸残基进行缀合。具体地，本公开内容包括通过在B-链的任意位置处存在的赖氨酸残基(野生型或通过定点诱变导入)的ε-胺基进行缀合。例如，在某些实施方案中，可以通过B29赖氨酸残基来缀合胰岛素分子。在谷赖胰岛素的情况下，可以通过B3赖氨酸残基缀合到至少1个配体上。应当理解，在B-链上不同的缀合位置可以导致胰岛素活性的不同降低。

在某些实施方案中，配体缀合到药物（诸如胰岛素分子）的超过一个缀合点上。例如，胰岛素分子可以缀合在A1N-端和B29赖氨酸处。在有些实施方案中，在碳酸盐缓冲液中进行酰胺缀合，以缀合在B29和A1位置，而不是在B1位置。在其它实施方案中，胰岛素分子可以缀合在A1N-端、B1N-端和B29赖氨酸处。在其它实施方案中，使用保护基，使得缀合发生在B1和B29或B1和A1位置处。应当理解，可以采用在胰岛素分子上的缀合点的任意组合。在有些实施方案中，至少1个缀合点是突变的赖氨酸残基，例如，Lys^A3。

在不同的实施方案中，缀合物可以包括胰岛素敏化剂(即，增强胰岛素作用的药物)。增强胰岛素作用的药物包括双胍类(例如，二甲双胍)和格列酮类。第一种格列酮药物是曲格列酮，其被证实具有严重的副作用。第二代格列酮包括吡格列酮和罗格列酮，它们被更好地耐受，尽管罗格列酮已经在某些试验中与不利的心血管事件相关联。

在不同的实施方案中，缀合物可以包括胰岛素促分泌剂(即，刺激胰腺β细胞的胰岛素分泌的药物)。例如，在不同的实施方案中，缀合物可以包括磺酰脲。磺酰脲类药物会刺激胰腺β细胞的胰岛素分泌，这通过使它们对葡萄糖作用敏化来实现。此外，磺酰脲类药物可以抑制高血糖素分泌，并使靶组织对胰岛素作用敏化。第一代磺酰脲类药物包括甲苯磺丁脲、氯磺丙脲和氨磺丁脲。在更低剂量有活性的第二代磺酰脲类药物包括格列吡嗪、格列本脲、格列齐特、格列波脲和格列美脲。在不同的实施方案中，缀合物可以包括氯茴苯酸。合适的氯茴苯酸包括那格列奈、米格列奈和瑞格列奈。它们的低血糖作用比磺酰脲类药物更快和更短。其它胰岛素促分泌剂包括高血糖素-样肽1(GLP-1)和GLP-1类似物(即，与GLP-1相差1-10个氨基酸置换、添加或删除和/或化学修饰的、具有GLP-1样生物活性的肽)。通过抑制胃排空、增加饱满感（通过中枢作用）和通过抑制高血糖素释放，GLP-1会减少食物摄入。GLP-1通过增加胰腺胰岛细胞增殖来降低血浆葡萄糖水平，并在食物消耗后增加胰岛素生产。可以化学地修饰GLP-1，例如，通过脂质缀合（如在利拉鲁肽中），以延长它的体内半衰期。其它胰岛素促分泌剂包括艾塞那肽-4和艾塞那肽-4类似物(即，与艾塞那肽-4相差1-10个氨基酸置换、添加或删除和/或化学修饰的、具有艾塞那肽-4样生物活性的肽)。在钝尾毒蜥的毒液中发现的艾塞那肽-4表现出GLP-1样生物活性。它具有比GLP-1长许多的半衰期，且不象GLP-1，它可以在它的N-端处截短8个氨基酸残基，而不丧失生物活性。GLP-1和艾塞那肽-4的N-端区域是几乎相同的，显著差异是第二个氨基酸残基，在GLP-1中是丙氨酸，在艾塞那肽-4中是甘氨酸，这赋予艾塞那肽-4对体内消化的抗性。与GLP-1相比，艾塞那肽-4也具有在它的C-端处的额外9个氨基酸残基。Mann等人Biochem.Soc.Trans.35:713-716,2007和Runge等人,Biochemistry46:5830-5840,2007描述了许多种可以用于本公开内容的缀合物中的GLP-1和艾塞那肽-4类似物。GLP-1的短半衰期源自二肽肽酶IV(DPP-IV)的酶消化。在某些实施方案中，通过施用DPP-IV抑制剂(例如，维格列汀、西他列汀、沙格列汀、利拉利汀或阿洛利汀)，可以增强内源性GLP-1的作用。

在不同的实施方案中，缀合物可以包括胰淀素或胰淀素类似物(即，与胰淀素相差1-10个氨基酸置换、添加或删除和/或化学修饰的、具有胰淀素样生物活性的肽)。胰淀素在葡萄糖调节中起重要作用(例如，参见Edelman和Weyer,DiabetesTechnol.Ther.4:175-189,2002)。胰淀素是神经内分泌激素，其与胰岛素一起由胰腺β细胞响应于食物摄入共分泌。尽管胰岛素的作用是调节葡萄糖从血流中消失，胰淀素的作用是辅助调节葡萄糖在来自胃和肝的血流中出现。乙酸普兰林肽(SYMLIN?)是示例性的胰淀素类似物。由于天然的人胰淀素是淀粉样蛋白形成状态，设计普兰林肽的策略包含，用来自不是淀粉样蛋白形成状态的大鼠胰淀素的那些残基置换某些残基。具体地，已知脯氨酸残基是破坏结构的残基，所以这些直接地从大鼠序列移植进人序列中。还用天冬酰胺置换Glu-10。

在不同的实施方案中，预缀合的药物可以含有一个或多个反应部分(例如，羧基或反应性的酯、胺、羟基、醛、巯基、马来酰亚胺基、炔基、叠氮基等部分)。如下面讨论的，在某些实施方案中，这些反应部分可以促进缀合过程。具体实例包括携带α-端胺和/或ε-胺赖氨酸基团的肽药物。应当理解，这些反应部分中的任一种可以人工地添加到已知的药物上（如果尚未存在的话）。例如，在肽药物的情况下，可以将合适的氨基酸(例如，赖氨酸)添加或置换进氨基酸序列中。另外，如下面更详细地讨论的，应当理解，通过在缀合之前选择性地阻断某些反应部分，可以控制缀合过程。

在不同的实施方案中，可以采用本公开内容的缀合物，以操纵葡萄糖和胰岛素之间的天然反馈机制(其中胰岛素水平随着葡萄糖水平的增加而增加，且葡萄糖水平随着胰岛素水平的降低而降低)。或者，在不同的实施方案中，所述药物可以是这样的分子，其：(a)具有与胰岛素相同的功能(例如，降低葡萄糖水平)、(b)刺激胰岛素的生产和/或(c)增强胰岛素的作用。例如，如上面讨论的，可以使用胰岛素促分泌剂或胰岛素敏化剂替代胰岛素作为药物。

在不同的实施方案中，可以使用缀合物，其包括具有与葡萄糖非直接相关的功能的药物。没有限制地，可以使用对葡萄糖做出响应的缀合物来提供长期的、进餐时间药物给药。需要定期地和/或与食物一起给药的任意药物可以从这样的递送系统受益。如本领域众所周知的，许多传统的药物需要与食物一起或在进餐时间给药。例如，抑制脂肪吸收的药物(例如，奥利司他)有利地在进餐时间给药。类似地，降低脂质水平（例如，洛伐他汀、阿托伐他汀或辛伐他汀）或甘油三酯水平（例如，吉非贝齐）的药物也可以有利地在进餐时间释放。

示例性的胰岛素缀合物

在不同的实施方案中，本公开内容的缀合物包含缀合到一个或多个配体上的胰岛素分子，所述配体独立地选自：氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)。在某些实施方案中，所述胰岛素分子通过A1氨基酸残基进行缀合。在某些实施方案中，所述胰岛素分子通过B1氨基酸残基进行缀合。在某些实施方案中，所述胰岛素分子通过Lys^B29的ε-氨基进行缀合。在某些实施方案中，所述胰岛素分子是通过Lys^B3的ε-氨基缀合的谷赖胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的缀合物包含缀合到一个或多个氨基乙基葡萄糖(AEG)配体上的胰岛素分子。在某些实施方案中，本公开内容的缀合物包含缀合到一个或多个氨基乙基甘露糖(AEM)配体上的胰岛素分子。在某些实施方案中，本公开内容的缀合物包含缀合到一个或多个氨基乙基二甘露糖(AEBM)配体上的胰岛素分子。在某些实施方案中，本公开内容的缀合物包含缀合到一个或多个氨基乙基三甘露糖(AETM)配体上的胰岛素分子。在某些实施方案中，本公开内容的缀合物包含缀合到一个或多个β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)配体上的胰岛素分子。在某些实施方案中，本公开内容的缀合物包含缀合到一个或多个氨基乙基岩藻糖(AEF)配体上的胰岛素分子。

在不同的实施方案中，本公开内容的缀合物包含缀合到2个或更多个单独的配体上的胰岛素分子。在有些实施方案中，本公开内容的缀合物包含缀合到2个单独的配体上的胰岛素分子。在其它实施方案中，本公开内容的缀合物包含缀合到3个单独的配体上的胰岛素分子。在某些实施方案中，本公开内容的缀合物包含缀合到4个单独的配体上的胰岛素分子。在某些实施方案中，这样的缀合物的2个或更多个单独的配体是氨基乙基葡萄糖(AEG)。在某些实施方案中，这样的缀合物的2个或更多个单独的配体是氨基乙基甘露糖(AEM)。在某些实施方案中，这样的缀合物的2个或更多个单独的配体是氨基乙基二甘露糖(AEBM)。在某些实施方案中，这样的缀合物的2个或更多个单独的配体是氨基乙基三甘露糖(AETM)。在某些实施方案中，这样的缀合物的2个或更多个单独的配体是β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)。在某些实施方案中，这样的缀合物的2个或更多个单独的配体是氨基乙基岩藻糖(AEF)。

在不同的实施方案中，本公开内容的缀合物包含缀合到单个缀合物框架上的2个或更多个单独的配体，所述框架也缀合到胰岛素分子上。在有些实施方案中，这样的缀合物的2个或更多个单独的配体和胰岛素分子各自位于单个分支的缀合物框架的单独分支上。在有些实施方案中，这样的缀合物的2个或更多个单独的配体和胰岛素分子各自位于单个分支的缀合物框架的单独分支的末端上。在有些实施方案中，这样的缀合物的2个或更多个单独的配体通过2个或更多个不同的缀合点缀合到胰岛素分子上。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过A1氨基酸残基和Lys^B29的ε-氨基进行缀合。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子缀合到2个单独的缀合物框架上，所述框架各自缀合到一个或多个单独的配体上。在其它这样的实施方案中，所述胰岛素分子缀合到2个单独的缀合物框架上，所述框架各自缀合到1个配体上。在其它这样的实施方案中，所述胰岛素分子缀合到2个单独的分支的缀合物框架上，所述框架各自缀合到2个配体上。在某些这样的实施方案中，所述配体位于分支的缀合物框架的单独分支上。在其它这样的实施方案中，所述配体位于分支的缀合物框架的单独分支的末端。

在不同的实施方案中，本公开内容的缀合物包含缀合到氨基乙基葡萄糖(AEG)上的胰岛素分子。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过A1氨基酸残基进行缀合。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过B1氨基酸残基进行缀合。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过Lys^B29的ε-氨基进行缀合。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子是通过Lys^B3的ε-氨基缀合的谷赖胰岛素。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过A1氨基酸残基和Lys^B29的ε-氨基进行缀合。

在不同的实施方案中，本公开内容的缀合物包含缀合到氨基乙基甘露糖(AEM)上的胰岛素分子。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过A1氨基酸残基进行缀合。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过B1氨基酸残基进行缀合。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过Lys^B29的ε-氨基进行缀合。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子是通过Lys^B3的ε-氨基缀合的谷赖胰岛素。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过A1氨基酸残基和Lys^B29的ε-氨基进行缀合。

在不同的实施方案中，本公开内容的缀合物包含缀合到氨基乙基二甘露糖(AEBM)上的胰岛素分子。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过A1氨基酸残基进行缀合。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过B1氨基酸残基进行缀合。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过Lys^B29的ε-氨基进行缀合。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子是通过Lys^B3的ε-氨基缀合的谷赖胰岛素。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过A1氨基酸残基和Lys^B29的ε-氨基进行缀合。

在不同的实施方案中，本公开内容的缀合物包含缀合到氨基乙基三甘露糖(AETM)上的胰岛素分子。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过A1氨基酸残基进行缀合。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过B1氨基酸残基进行缀合。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过Lys^B29的ε-氨基进行缀合。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子是通过Lys^B3的ε-氨基缀合的谷赖胰岛素。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过A1氨基酸残基和Lys^B29的ε-氨基进行缀合。

在不同的实施方案中，本公开内容的缀合物包含缀合到β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)上的胰岛素分子。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过A1氨基酸残基进行缀合。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过B1氨基酸残基进行缀合。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过Lys^B29的ε-氨基进行缀合。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子是通过Lys^B3的ε-氨基缀合的谷赖胰岛素。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过A1氨基酸残基和Lys^B29的ε-氨基进行缀合。

在不同的实施方案中，本公开内容的缀合物包含缀合到氨基乙基岩藻糖(AEF)上的胰岛素分子。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过A1氨基酸残基进行缀合。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过B1氨基酸残基进行缀合。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过Lys^B29的ε-氨基进行缀合。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子是通过Lys^B3的ε-氨基缀合的谷赖胰岛素。在某些这样的实施方案中，所述胰岛素分子通过A1氨基酸残基和Lys^B29的ε-氨基进行缀合。

缀合物框架

本部分描述了一些示例性缀合物框架。在不同的实施方案中，本公开内容的缀合物可以具有通式(I)：

其中：

每次出现的表示缀合物内的潜在分支；

每次出现的表示缀合物分支内的潜在重复；

每次出现的独立地是共价键、碳原子、杂原子或选自下述的任选地取代的基团：酰基、脂族、杂脂族、芳基、杂芳基和杂环；

每次出现的T独立地是共价键或二价的、直链的或分支的、饱和的或不饱和的、任选地取代的C_1-30烃链，其中T的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被下述基团替换：-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)₂-、-N(R)SO₂-、-SO₂N(R)-、杂环基、芳基或杂芳基；

每次出现的R独立地是氢、合适的保护基或酰基部分、芳基烷基部分、脂族部分、芳基部分、杂芳基部分或杂脂族部分；

–B是–T–L^B–X；

每次出现的X独立地是配体；

每次出现的L^B独立地是共价键或通过将T与X共价缀合衍生出的基团；

–D是–T–L^D–W；

每次出现的W独立地是药物；

每次出现的L^D独立地是共价键或通过将T与W共价缀合衍生出的基团；

k是1-12的整数，包括端值；

q是1-4的整数，包括端值；

每次出现的p独立地是1-5的整数，包括端值；且

每次出现的n独立地是0-5的整数，包括端值；且

每次出现的m独立地是1-5的整数，包括端值；且

每次出现的v独立地是0-5的整数，包括端值，条件是在每个k-分支内，n的至少1次出现是≥1，且v的至少1次出现是≥1。

应当理解，通式(I)(和本文中的其它通式)没有特别地列出每个氢。例如，如果中央的是C₆芳基且k+q<6，应当理解，在C₆芳基环上的开放位置包括氢。

一般而言，应当理解，每次出现的表示潜在的分支节点，且在每个节点处的分支的数目由k（对于中央的）和n（对于未出现在中央的）的值决定。普通技术人员会理解，因为每次出现的n可以是0-5的整数，本公开内容预见到这些缀合物的线性的、分支的和多分支的(例如，树枝状聚合物-样)实施方案。要求的条件是：在每个k-分支内，n的至少1次出现是≥1，且v的至少1次出现是≥1，从而确保每种缀合物包括B(即，配体)的至少1次出现。

在某些实施方案中，在p-括号的部分中每次出现的被许多n-括号的部分取代，对应着n≥1的值。例如，当在2个k-分支中k=2且p=2时，所述缀合物可以具有式(Ia):

。

在其它实施方案中，在p-括号的部分中仅在末端出现的被许多n-括号的部分取代，对应着n≥1的值。例如，当在2个k-分支中k=2且p=2(且对于在2个k-分支中的第一个p-括号的部分，n=0)时，所述缀合物可以具有式(Ib):

。

在某些实施方案中，在m-括号的部分中每次出现的被许多B部分取代，对应着v≥1的值。例如，当k=2、每次出现的p=1且每次出现的m=2时，所述缀合物可以具有式(Ic):

。

在其它实施方案中，在m-括号的部分中仅在末端出现的被许多B部分取代，对应着v≥1的值。例如，当k=2、每次出现的p=1且每次出现的m=2(且对于在每个n-分支中的第一个m-括号的部分，v=0)时，所述缀合物可以具有式(Id):

。

作为其它实例，当q=1且在前式的2个k-分支中n=1时，所述缀合物可以具有式(Ie):

。

或者，当q=1且在前式的2个k-分支中n=2时,所述缀合物可以具有式(If):

。

在不同的实施方案中，本公开内容也提供了包括配体和/或药物的缀合物，所述药物非共价地结合到缀合物框架上。

例如，在有些实施方案中，本公开内容提供了前述式中任一个的缀合物，其中：

、T、D、k、q、p、n、m和v中的每一个如在上面和本文中所述地定义；

–B是–T–LRP^B–X；

每次出现的X独立地是配体；且

每次出现的LRP^B独立地是配体-受体对，其在T和X之间形成非共价键，在人血清中具有小于1pmol/L的解离常数。

在其它实施方案中，本公开内容提供了前述式中任一个的缀合物，其中：

、T、B、k、q、p、n、m和v中的每一个如在上面和本文中所述地定义；

–D是–T–LRP^D–W；

每次出现的W独立地是药物；且

每次出现的LRP^D独立地是配体-受体对，其在T和W之间形成非共价键，在人血清中具有小于1pmol/L的解离常数。

、T、k、q、p、n、m和v中的每一个如在上面和本文中所述地定义；

–B是–T–LRP^B–X；

每次出现的X独立地是配体；

每次出现的LRP^B独立地是配体-受体对，其在T和X之间形成非共价键，在人血清中具有小于1pmol/L的解离常数；

–D是–T–LRP^D–W；

每次出现的W独立地是药物；且

在另一个方面，本公开内容的缀合物可以具有通式(II):

其中、B、T、D、v、m、n、p和k如本文所定义和所述，且j是1-4的整数，包括端值。式(II)的缀合物可以具有多个配体与药物的缀合位点(即，其中2个或更多个配体通过药物上的不同位点（例如，生物分子药物中的不同氨基酸）缀合到单个药物分子上)。应当理解，当q是1时，上述的亚类(即，式(Ia)-(If))适用于当j是1时的式(II)缀合物。同样地，本领域技术人员可以预见到其中j是2、3或4的缀合物的类似亚类。

为了例证目的，且为了避免混淆，应当理解，式(II)缀合物中出现的––D––(即，当j是2时)可以表示为：––T–L^D–W–L^D–T––(当药物共价地结合到缀合物框架上时)或––T–LRP^D–W–LRP^D–T––(当药物非共价地结合到缀合物框架上时)。

示例性基团的描述

(节点)

在某些实施方案中，每次出现的是选自下述的独立地任选地取代的基团：酰基、脂族、杂脂族、芳基、杂芳基和杂环。在有些实施方案中，每次出现的是相同的。在有些实施方案中，中央的不同于所有其它出现的。在某些实施方案中，除了中央的以外，所有出现的是相同的。

在有些实施方案中，是任选地取代的芳基或杂芳基。在有些实施方案中，是6元芳基。在某些实施方案中，是苯基。

在某些实施方案中，是选自N、O或S的杂原子。在有些实施方案中，是氮原子。在有些实施方案中，是氧原子。在有些实施方案中，是硫原子。在有些实施方案中，是碳原子。

T(间隔物)

在某些实施方案中，每次出现的T独立地是二价的、直链的或分支的、饱和的或不饱和的、任选地取代的C_1-20烃链，其中T的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被下述基团替换：-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)₂-、-N(R)SO₂-、-SO₂N(R)-、杂环基、芳基或杂芳基。在某些实施方案中，T的1、2、3、4或5个亚甲基单元任选地且独立地被替换。在某些实施方案中，T是从C_1-10、C_1-8、C_1-6、C_1-4、C_2-12、C_4-12、C_6-12、C_8-12或C_10-12烃链构建，其中T的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被下述基团替换：-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)₂-、-N(R)SO₂-、-SO₂N(R)-、杂环基、芳基或杂芳基。在有些实施方案中，T的一个或多个亚甲基单元被杂环基替换。在有些实施方案中，T的一个或多个亚甲基单元被三唑部分替换。在某些实施方案中，T的一个或多个亚甲基单元被-C(O)-替换。在某些实施方案中，T的一个或多个亚甲基单元被-C(O)N(R)-替换。在某些实施方案中，T的一个或多个亚甲基单元被-O-替换。

在有些实施方案中，T是。

在某些实施方案中，每次出现的T是相同的。

在某些实施方案中，每次出现的T(在基团B和D之外)是共价键，且所述缀合物具有通式(IV)或(V):

其中、B、D、v、m、n、p、k和j如本文所定义和所述。

在通式(IV)和(V)的某些实施方案中，每次出现的（除了中央的以外）是共价键，每次出现的v=1，且所述缀合物具有式(VI)或(VII):

其中、B、D、q、k和j如本文所定义和所述。

在式(VI)的某些这样的实施方案中，k=1且q=1。

在其它实施方案中，k=2且q=1。

在其它实施方案中，k=3且q=1。

在其它实施方案中，k=1且q=2。

在其它实施方案中，k=2且q=2。

在式(VII)的某些这样的实施方案，k=1且j=2。

在其它实施方案中，k=2且j=2。

在其它实施方案中，k=3且j=2。

在其它实施方案中，k=1且j=1。

在其它实施方案中，k=2且j=1。

在其它实施方案中，k=3且j=1。

在其它实施方案中，k=1且j=3。

在其它实施方案中，k=2且j=3。

在其它实施方案中，k=3且j=3。

在有些实施方案中，本公开内容提供了通式(VIa)的缀合物:

其中B和D如本文所定义和所述。

例如，在有些实施方案中，本公开内容提供了下式的缀合物：

；

；或

，

其中W和X如本文所定义和所述。

在有些实施方案中，本公开内容提供了通式(VIb)的缀合物:

其中B和D如本文所定义和所述。

；

；或

，

其中W和X如本文所定义和所述。

；

；或

，

其中W和X如本文所定义和所述。

在有些实施方案中，本公开内容提供了通式(VIc)的缀合物:

其中B和D如本文所定义和所述。

；或

，

其中W和X如本文所定义和所述。

在有些实施方案中，本公开内容提供了通式(VId)或(VIe)的缀合物:

其中B和D如本文所定义和所述。

，

其中W和X如本文所定义和所述。

应当理解，式(VIa)、(VIb)、(VIc)、(VId)和(VIe)的亚类及其种适用于式(VII)缀合物，其中j是1。同样地，本领域技术人员可以预见到式(VII)缀合物的类似亚类和种类，其中j是2、3或4。例如，当j是2时，本公开内容提供了下式的缀合物：

，

其中B和D如本文所定义和所述。

在某些实施方案中，本公开内容提供了下式的缀合物：

；

;；或，

其中W、X和j如本文所定义和所述。

在另一个方面，本公开内容的缀合物可以具有通式(VIII):

其中、T、D、v、m和n如关于式(I)缀合物所定义和所述，且B是–T–L^B–X，其中每次出现的X独立地是配体，所述配体包括糖。

或，

其中W和X如关于式(I)缀合物所定义和所述。

在另一个方面，缀合物支架不具有式(I)或(II)，而是大环。在有些实施方案中，所述大环是多胺大环。例如，在不同的实施方案中，本公开内容的缀合物可以具有通式(IX):

其中D如关于式(I)缀合物所定义和所述，且B是–T–L^B–X，其中每次出现的X独立地是配体，所述配体包括糖。

B(配体)

在某些实施方案中，–B是–T–L^B–X，其中X是配体，且L^B是共价键或通过将X与T共价缀合衍生出的基团。本文描述了示例性的配体和它们的糖组分。

D(药物)

在某些实施方案中，–D是–T–L^D–W，其中W是药物，且L^D是共价键或通过将W与T共价缀合衍生出的基团。示例性的药物如上所述。

L^B和L^D(共价缀合)

普通技术人员会理解，许多种缀合化学可以用于给X共价缀合T和/或给W共价缀合T(通常称作“组分”)。这样的技术是本领域广泛已知的，下面讨论了示例性的技术。组分可以直接地键合(即，没有插入化学基团)或经由间隔物(例如，偶联剂或共价链，其提供缀合的元件和缀合物框架的其它部分之间的某种物理分隔)间接地键合。应当理解，组分可以通过任意数目的化学键共价地结合到缀合物框架上，所述化学键包括但不限于酰胺、胺、酯、醚、硫醚、异脲、亚胺等键。在某些实施方案中，L^B和/或L^D(对于本部分的目的，通常称作“L”)是共价键。在有些实施方案中，L是通过给T的任选地取代的羰基-反应性的、硫醇-反应性的、胺-反应性的或羟基-反应性的部分缀合X或W的羧基、硫醇、胺或羟基而衍生出的任选地取代的部分。在有些实施方案中，L是通过给X或W的任选地取代的羧基-反应性的、硫醇-反应性的、胺-反应性的或羟基-反应性的部分缀合T的羧基、硫醇、胺或羟基而衍生出的任选地取代的部分。在有些实施方案中，L是。在有些实施方案中，L是琥珀酰亚胺部分。

在不同的实施方案中，使用本领域已知的“点击化学”（clickchemistry）反应，可以使组分共价地结合到缀合物框架上。这些反应包括，例如，环化加成反应、亲核的开环反应和添加到碳-碳重键上(例如，参见Kolb和Sharpless,DrugDiscoveryToday8:1128-1137,2003和其中引用的参考文献，以及Dondoni,Chem.AsianJ.2:700-708,2007和其中引用的参考文献)。如上面所讨论的，在不同的实施方案中，所述组分可以经由天然的或化学添加的下垂基团结合到缀合物框架上。一般而言，应当理解，一对反应基团的第一个和第二个成员(例如，羧基和胺基，它们反应生成酰胺键)可以存在于所述组分和框架的任一个上(即，2个成员的相对位置是无关的，只要它们反应生成缀合物)。下面更详细地讨论示例性的连接。

在不同的实施方案中，使用Kim等人,Biomaterials24:4843-4851(2003)所述的方法，可以将携带羧基(或反应性的酯)的组分缀合到携带-OH的框架(OBF)上。简而言之，将OBF与携带羧基的组分一起溶解在DMSO中，并借助于N’,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化剂，在干燥气氛下反应。使用碳二亚胺(EDAC)偶联方法，可以将携带羧基的组分缀合到携带-NH₂的框架(NBF)上。使用该方法，通过在pH5缓冲液中与EDAC反应，随后加入NBF，将携带羧基的组分官能化。在这些情况的任一种中(和在下述情况的任一种中)，通过任意数目的本领域技术人员可利用的方法，可以纯化得到的产物，所述方法包括，但不限于、尺寸排阻色谱法、反相色谱法、硅胶色谱法、离子交换色谱法、超滤和选择性沉淀。

在不同的实施方案中，可以将携带胺的组分偶联到携带-COOH的框架(CBF)上。CBF使用活化的酯部分(例如，参见Hermanson的BioconjugateTechniques,第2版,AcademicPress,2008和其中引用的参考文献)。简而言之，将具有末端活化的羧酸酯（诸如–NHS、–SSC、–NPC等）的CBF溶解在无水有机溶剂（诸如DMSO或DMF）中。然后加入希望的当量数的携带胺的组分，并在室温混合几小时。也可以将携带胺的组分缀合到CBF上，以生成稳定的酰胺键，如Baudys等人,Bioconj.Chem.9:176-183,1998所述。通过在无水条件下，向CBF和携带胺的组分在二甲基亚砜(DMSO)中的溶液中加入三丁胺(TBA)和氯甲酸异丁基酯，可以实现该反应。或者，通过氰化作用（cyanalation），可以将携带胺的组分偶联到OBF上，所述氰化作用使用下述试剂，包括但不限于、溴化氰(CNBr)、N-氰基三乙基铵四氟硼酸盐(CTEA)、1-氰基-4-(二甲氨基)-吡啶四氟硼酸盐(CDAP)和对硝基苯基氰酸酯(pNPC)。CNBr反应可以在弱碱性pH的水溶液中进行。CDAP反应在弱碱性pH的DMSO和水的混合物中进行，使用三乙胺(TEA)作为催化剂。在某些实施方案中，可以将携带胺的组分缀合到NBF上，例如，通过在含有吡啶的缓冲的水溶液中的戊二醛偶联，随后用甘氨酸猝灭。在某些实施方案中，使用希夫碱偶联方法，可以将携带胺的组分缀合到携带醛的框架上，然后还原(例如，参见Hermanson的BioconjugateTechniques,第2版,AcademicPress,2008和其中引用的参考文献，以及Mei等人的Pharm.Res.16：1680-1686,1999和其中引用的参考文献)。简而言之，将具有末端活化的醛(例如，乙醛、丙醛、丁醛等)的框架溶解在水性缓冲液中，所述缓冲液具有中性或更低的pH，以防止不希望的醛水解。然后加入希望的当量数的携带胺的组分，并在室温混合，然后加入过量的合适的还原剂(例如，硼氢化钠、氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、吡啶硼烷、三乙胺硼烷等)。

在不同的实施方案中，根据二乙烯基砜(DVS)方法，可以将携带羟基的组分缀合到OBF上。使用该方法，将OBF加入到pH11.4碳酸氢盐缓冲液中，并用DVS活化，随后加入携带羟基的组分，然后加入甘氨酸，以中和和猝灭反应。使用上述的活化的酯部分，也可以将携带羟基的组分偶联到OBF上，以生成酯键。

在不同的实施方案中，使用相对温和的方法，可以将携带巯基的组分偶联到携带马来酰亚胺的框架(MBF)上，以生成硫醚键(例如，参见Hermanson的BioconjugateTechniques,第2版,AcademicPress,2008和其中引用的参考文献)。因为马来酰亚胺基对水解的敏感度比活化的酯低很多，该反应可以在水性条件下进行。简而言之，将MBF溶解在pH6.5-7.5的缓冲的水溶液中，随后加入希望的当量数的携带巯基的组分。在室温混合几小时以后，可以纯化硫醚偶联的缀合物。根据Thoma等人,J.Am.Chem.Soc.121:5919-5929,1999所述的方法，也可以将携带巯基的组分缀合到NBF上。该反应包括将NBF悬浮于无水二甲基甲酰胺(DMF)中，随后加入2,6-二甲基吡啶和酸酐，随后纯化反应中间体。然后将携带巯基的组分加入中间体在含有三乙胺的DMF中的溶液中。

在不同的实施方案中，使用铜(I)-催化的现代版的Huisgen-型叠氮化物–炔烃环加成，可以将携带叠氮化物的组分偶联到携带炔烃的框架(ABF)上，得到1,4-二取代的1,2,3-三唑(例如，参见Dondoni,Chem.AsianJ.2:700–708,2007和其中引用的参考文献，以及Dedola等人,Org.Biomol.Chem.5：1006–1017,2007)。该反应通常称作“点击”反应，可以在例如纯的THF中进行，其中使用N,N-二异丙基乙胺和Cu(PPh₃)₃Br作为催化剂系统(例如，参见Wu等人,Chem.Commun.5775-5777,2005)。该反应也可以在3:1(THF:水)混合物中进行，其中使用抗坏血酸钠和CuSO₄·5H₂O作为催化剂系统(例如，参见Wu等人,同上)。在任一种情况下，以希望的当量数，将携带叠氮化物的组分加入到ABF中，随后在室温混合12-48小时。或者，使用与上述完全相同的条件，可以将携带炔烃的组分缀合到携带叠氮化物的框架上。

某些组分可以天然地具有超过一个相同的化学反应部分。在有些实施例中，选择化学反应类型和条件以在那些位点中的仅一个处选择性地反应组分是可能的。例如，在通过反应性的胺缀合胰岛素的情况下，在某些实施方案中，N-端α-Phe-B1是比N-端α-Gly-A1和ε-Lys-B29更优选的连接位点，以保留胰岛素生物活性(例如，参见Mei等人,Pharm.Res.16：1680-1686,1999和其中引用的参考文献，以及Tsai等人,J.Pharm.Sci.86：1264-1268,1997)。在胰岛素和十六醛(醛-封端的分子)之间的一个示例性反应中，研究人员发现：在有氰基硼氢化钠存在下，以1:6(胰岛素:醛mol/mol)的比例，在含有54%异丙醇的1.5MpH6.8水杨酸钠水溶液中混合2种组分过夜，导致向单取代的Phe-B1仲胺-缀合的产物的超过80%转化率(Mei等人,Pharm.Res.16:1680-1686,1999)。他们的研究证实，溶剂、pH和胰岛素:醛比的选择都影响反应的选择性和产率。但是，在大多数情况下，难以通过化学反应条件的选择来实现选择性。因此，在某些实施方案中，可以有利地选择性地保护组分(例如，胰岛素)的除了希望发生反应的位点以外的所有位点，然后在已经反应和纯化物质以后，进行去保护步骤。例如，在文献中可得到许多选择性地保护胰岛素胺基的实例，包括在酸性(BOC)、弱酸性(柠康酸酐)和碱性(MSC)条件下可以去保护的那些(例如，参见Tsai等人,J.Pharm.Sci.86：1264-1268,1997;Dixon等人,Biochem.J.109：312-314,1968；和Schuettler等人,D.BrandenburgHoppeSeyler'sZ.Physiol.Chem.360：1721,1979)。在一个实施例中，可以用叔丁氧基羰基(BOC)选择性地保护Gly-A1和Lys-B29胺，然后通过在90%三氟醋酸(TFA)/10%苯甲醚溶液中在4℃温育1小时进行缀合后，除去该BOC。在一个实施方案中，将胰岛素干粉溶解在无水DMSO中，随后加入过量的三乙胺。向该溶液中，缓慢地加入大约2当量的二碳酸二叔丁酯在THF中的溶液，然后将该溶液混合30-60分钟。反应后，将粗溶液倒入过量的丙酮中，随后逐滴加入稀HCl，以沉淀反应过的胰岛素。将沉淀物离心，用丙酮洗涤，并在真空下彻底干燥。使用制备反相HPLC或离子交换色谱法(例如，参见Tsai等人,J.Pharm.Sci.86：1264-1268,1997)，可以从未反应的胰岛素、不希望的二-BOC异构体和单-BOC和三-BOC副产物中，分离出希望的二-BOC保护的产物。在反相HPLC的情况下，将粗产物在含有0.1%TFA的70%水/30%乙腈中的溶液装载上C8柱，并用递增的乙腈梯度洗脱。收集希望的二-BOC峰，旋转蒸发以去除乙腈，并低压冻干，以得到纯产物。

LRP^B和LRP^D(非共价缀合)

普通技术人员会理解，可以使用许多种缀合化学，使X与T和/或W与T(通常称作“组分”)非共价缀合。这样的技术是本领域广泛已知的，在下面讨论了示例性的技术。在某些实施方案中，非共价键在人血清中的解离常数(K_d)小于1pmol/L。例如，组分可以通过非共价配体-受体对非共价地结合到缀合物框架上，这是本领域众所周知的(例如，但不限于基于生物素-抗生物素蛋白的对)。在这样的实施方案中，配体受体对的一个成员共价地结合到组分上，而该对的其它成员共价地结合到缀合物框架上。当组合组分和缀合物框架时，配体和它的受体之间的强非共价相互作用造成组分非共价地结合到缀合物框架上。典型的配体/受体对包括蛋白/辅因子和酶/底物对。除了常用的生物素/抗生物素蛋白对以外，它们包括但不限于：生物素/抗生蛋白链菌素、地高辛配基/抗-地高辛配基、FK506/FK506-结合蛋白(FKBP)、雷帕霉素/FKBP、亲环蛋白/环孢素和谷胱甘肽/谷胱甘肽转移酶对。本领域技术人员会认识到其它合适的配体/受体对，例如，与表位标签配对的单克隆抗体，例如但不限于：谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、c-myc、FLAG?和在下述文献中描述的其它那些：“AdvancesinMutagenesis”的第105-152页，Kessler编,Springer-Verlag,1990;“AffinityChromatography:MethodsandProtocols(MethodsinMolecularBiology)”PascalBaillon编,HumanaPress,2000;和“ImmobilizedAffinityLigandTechniques”，Hermanson等人编,AcademicPress,1992。

k和q

k是1-12的整数，包括端值。在某些实施方案中，k=1-6，例如，1、2或3。q是1-4的整数，包括端值，并限定了结合到中央的基团上的D基团的数目。在某些实施方案中，q=1。在有些实施方案中，q=2。在某些实施方案中，k+q是2-6的整数，包括端值。在某些实施方案中，k+q=2、3或4。

p和m

每次出现的p独立地是1-5的整数，包括端值。在某些实施方案中，每次出现的p是相同的。在某些实施方案中，p=1、2或3。在某些实施方案中，p=1。

每次出现的m独立地是1-5的整数，包括端值。在某些实施方案中，每次出现的m是相同的。在某些实施方案中，m=1、2或3。在某些实施方案中，m=1。

n和v

每次出现的n独立地是0-5的整数，包括端值，条件是：在每个k-分支内，n的至少1次出现是≥1。在给定的k-分支内的分支在本文中称作n-分支。

在某些实施方案中，在p-括号的部分中每次出现的被许多n-括号的部分取代，对应着n≥1的值，例如，参见上面的式(Ia)。在有些这样的实施方案中，缀合物中每次出现的n是相同的。在有些这样的实施方案中，n=1或2。

在其它实施方案中，在p-括号的部分中仅在末端出现的被许多n-括号的部分取代，对应着n≥1的值，例如，参见上面的式(Ib)。在某些实施方案中，每个k-分支包括仅一次出现的n≥1(即，所有其它出现的n=0)。在有些这样的实施方案中，缀合物中每次出现的n是相同的。在有些这样的实施方案中，n=1或2。

每次出现的v独立地是0-5的整数，包括端值，条件是：在每个k-分支内，至少1次出现的v是≥1。

在某些实施方案中，在m-括号的部分中每次出现的被许多B部分取代，对应着v≥1的值，例如，参见上面的式(Ic)。在有些这样的实施方案中，在缀合物中每次出现的v是相同的。在有些这样的实施方案中，v=1或2。

在其它实施方案中，在m-括号的部分中仅在末端出现的被许多B部分取代，对应着v≥1的值，例如，参见上面的式(Id)。在某些实施方案中，每个k-分支包括仅一次出现的v≥1(即，所有其它出现的v=0)。在有些这样的实施方案中，在缀合物中每次出现的v是相同的。在有些这样的实施方案中，v=1或2。在某些实施方案中，每个n-分支包括至少1次出现的v≥1。在某些实施方案中，每个n-分支包括仅一次出现的v≥1(即，所有其它出现的v=0)。在有些这样的实施方案中，在缀合物中每次出现的v是相同的。在有些这样的实施方案中，v=1或2。

j

式(II)的j是1-4的整数，包括端值，并限定了与D基团缀合的数目。在某些实施方案中，j=1。在某些实施方案中，j=2。在有些实施方案中，j=3。在其它实施方案中，j=4。

药物负载

一般而言，通过调节缀合物框架的分子量和/或化学活化的水平(即，当将下垂基团添加到框架上时)，可以控制负载到缀合物上的药物的量。在不同的实施方案中，药物负载水平可以是在5-99%w/w（药物相对于缀合物）的范围内。在不同的实施方案中，可以使用在50-99%的更窄范围内（例如，在80-99%的范围内）的负载水平。

其它

应当理解，尽管前述部分在单独的标题下描述了缀合物的组分(例如，配体、药物、框架)，本公开内容包括含有任一种和所有公开的配体、药物和框架的缀合物。

用于制备缀合物的中间体

在一个方面，本公开内容提供了用于制备缀合物的试剂。因而，在不同的实施方案中，提供了通式(I)的化合物，其中：

、T、D、k、q、k+q、p、n、m和v中的每一个如在上面和本文中所述地定义；

–B是–T–L^B’；且

每次出现的L^B’独立地是氢、含有炔烃的部分、含有叠氮化物的部分、或任选地取代的羰基-反应性的、硫醇-反应性的、胺-反应性的或羟基-反应性的部分。

在其它实施方案中，提供了通式(I)的化合物，其中：

、T、B、k、q、k+q、p、n、m和v中的每一个如在上面和本文中所述地定义；

–D是–T–L^D’；且

每次出现的L^D’独立地是氢、含有炔烃的部分、含有叠氮化物的部分、或任选地取代的羰基-反应性的、硫醇-反应性的、胺-反应性的或羟基-反应性的部分。

制备缀合物的方法

如在实施例中所述，我们已经例证了制备前述缀合物的方法，其中使用胰岛素（作为示例性的药物）和氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、氨基乙基岩藻糖(AEF)和/或β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)（作为示例性的配体）。使用三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、三-琥珀酰亚胺基氨基三乙酸酯(TSAT)、三-琥珀酰亚胺基-1,3,5-苯三羧化物(TSB)和苯-1,3,5-三羧基-(N-4-丁酸-NHS-酯)酰胺(TSB-C4)作为缀合物框架（但不限于这些），可以制备缀合物，其在每个缀合位点具有2个配体，且在所有框架组分之间具有短距离。如果需要框架组分之间更多的距离，则可以使用琥珀酰亚胺基(6-氨基己酰基)氨基三乙酸酯(TSAT-C6)、琥珀酰亚胺基(6-氨基(PEO-6))氨基三乙酸酯(TSAT-PEO-6)、苯-1,3,5-三羧基-(N-6-氨基己酸-NHS酯)酰胺(TSB-C6)和苯-1,3,5-三羧基-(N-10-氨基癸酸-NHS酯)酰胺(TSB-C10)。与TSAT-PEO-6相比，TSAT-C6间隔物臂化学赋予缀合物更多的疏水特性。

例如，为了例证目的，在一个实施方案中，配体(例如，AEG、AEM、AEMB和AETM)和胰岛素都可以通过末端活化的酯与TSAT-C6框架反应，生成胰岛素-TSAT-C6-AEG-2、胰岛素-TSAT-C6-AEM-2、胰岛素-TSAT-C6-AEMB-2和胰岛素-TSAT-C6-AETM-2缀合物。如在实施例中所讨论的，事先合成各种配体。在有些实施方案中，胰岛素的A1和B29氨基是如在实施例中所述BOC-保护的，使得每个胰岛素仅可以在Phe-B1α-氨基处反应。在有些实施方案中，胰岛素的B1和B29氨基是如在实施例中所述BOC-保护的，使得每个胰岛素仅可以在Gly-A1α-氨基处反应。将大约1当量的BOC-胰岛素（作为40-50mg/ml的在DMSO中的溶液）在室温加入到50mg/ml的TSAT-C6在DMSO中的溶液（含有过量的三乙胺）中，并反应大约1小时。接着，加入过量的AEG、AEM、AEBM和/或AETM(2-10当量)（作为100mg/ml在DMSO中的溶液），并反应另外2小时。反应后，将DMSO溶液在pH5盐水缓冲液中超稀释（superdilute）10倍，然后将pH调至8.0，并使溶液穿过BiogelP2柱，以去除低分子反应物和盐。使用3K超滤装置，浓缩在空隙级分中洗脱的物质，然后将它注射到制备级反相HPLC柱(C8，含有0.1%TFA的乙腈/水流动相)上，以从未反应的BOC2-胰岛素中纯化希望的产物。合并收集的希望的洗脱峰，并旋转蒸发，以去除乙腈，随后低压冻干，以得到干粉。最后，如下去除BOC保护基：将冻干粉溶解在4℃的90%TFA/10%苯甲醚中1小时，随后在含有0.150MNaCl的HEPESpH8.2缓冲液中10倍超稀释。使用NaOH溶液，将pH调至7.0-8.0，然后使物质穿过BiogelP2柱，以去除苯甲醚、BOC和任意其它污染盐。然后将去保护的、纯化的缀合物水溶液浓缩至希望的水平，并在4℃储存备用。

在另一个方面，使用在碳酸盐缓冲液中的未保护的胰岛素，可以在B29ε-氨基处发生反应，因为在那些条件下，B29氨基是在野生型胰岛素中存在的3个氨基中最有反应性的。在一个示例性的合成中，以60mM，将含有N-端活化的酯的框架溶解在无水DMSO中，随后加入三乙胺(TEA)。在室温快速搅拌该溶液10分钟。平行地，在适当体积的无水DMSO中，制备448mM配体溶液。溶解后，在10分钟时间段内，逐滴加入足够的配体溶液，以提供等于（框架上活化的酯基团的数目N减去1）x1.5的反应当量数。例如，如果每个框架上存在N=3个起始活化的酯基团，则加入(3x(3-1)x60mM/370mM)=0.973ml配体溶液。如果每个框架上存在N=4个起始活化的酯基团，则加入(3x(4-1)x60mM/370mM)=1.46ml配体溶液，以此类推。加入配体溶液以后，在室温搅拌该溶液1小时。

然后在17.2mM，单独地将携带胺的药物溶解在碳酸钠缓冲液(0.1M,pH11)中，随后用1.0N氢氧化钠，将pH调至10.8。溶解后，在75分钟时间段内，向药物/碳酸盐缓冲溶液中逐滴加入整个框架/DMSO/配体/TEA溶液。在加入过程中，在必要时，使用稀HCl或NaOH，每5分钟将得到的混合物的pH调至10.8。在滴加以后，将溶液搅拌另外15分钟，以确保完全反应。

然后在含有0.150MNaCl的20mMpH5.0HEPES缓冲的盐水溶液中，将得到的溶液超稀释10倍，随后用稀HCl调节pH至最终的pH8.0。首先使用适当的固相，通过尺寸排阻，纯化水溶液，用于希望的缀合的和未缀合的物质的分离。然后使用适当尺寸的超滤膜，将穿过柱空体积的溶液浓缩至大约40ml。使用制备反相HPLC，进一步纯化该溶液，以得到希望的产物。收集后，旋转蒸发该溶液以去除乙腈，并低压冻干以得到纯的缀合物。

此外，在碳酸盐缓冲液条件下，A1氨基是野生型胰岛素的第二高反应性的氨基。因而，在某些实施方案中，使用上述的条件，使用与B29-单取代的胰岛素-缀合物合成相比每个胰岛素分子大约10倍量的多价活性酯框架和配体，合成A1,B29-二取代的胰岛素-缀合物。

在另一个方面，使用与在美国专利号7,402,565中所报道的那些类似的方法，使用N-端保护氨基酸序列，合成B29-单取代的胰岛素-缀合物。具体地，将N-端肽序列工程化到胰岛素A-链和B-链上，使得保护氨基酸序列含有Arg^A0和Arg^B0，得到胰岛素中间体。缀合发生在胰岛素中间体上的Lys^B29处，同时N-端被保护免于生成缀合副产物。用胰蛋白酶处理缀合的胰岛素中间体，以切割N-端保护氨基酸序列，得到胰岛素-缀合物，其中仅Lys^B29被缀合。在有些实施方案中，所述胰岛素中间体源自在美国专利号7,402,565中所述的单链胰岛素前体。在有些实施方案中，所述胰岛素中间体是含有除了Lys^B29以外的缀合位点的突变体，并进行与关于Lys^B29所述类似的合成。

应当理解，这些示例性的方法可以用于生产具有不同的配体和药物、不同的缀合化学、框架组分之间的不同隔离和/或不同配价的其它缀合物，其中用如下所述的不同框架取代TSAT-C6框架。

例如，如果需要框架组分之间更远的距离和/或需要在缀合位点处保留电荷，则可以将适当尺寸的携带胺的二乙基缩醛(例如，氨基丙醛二乙基缩醛(APDA)或氨基丁醛二乙基缩醛(ABDA))缀合到本文列出的框架上的反应基团之一上，随后使剩余的反应基团与目标配体(例如AEM、AEBM或AETM)彻底反应。然后可以在酸性条件下，从二乙基缩醛暴露出反应性的醛基，然后用胰岛素进行还原胺化，以完成药物缀合步骤，然后可以采用ABDA-TSAT、ABDA-LCTSAT等。

在另一个实施例中，可以使用四-(N-琥珀酰亚胺基羧基丙基)季戊四醇(TSPE)来向每个缀合位点添加3个配体，实现增加的多价。本领域技术人员还会理解，任一种上述教导可以用于生成具有甚至更高阶配价的多分支的(例如，树枝状聚合物-样)缀合物。例如，在TopicsinCurrentChemistry.217：202-238,2001中，R?ckendorf和Lindhorst提供了用于生产多分支的结构的流行方案的综述。

此外，根据上述方法，又可以使已经含有预定多价程度的配体反应，生成甚至更高阶的配体多样性。例如，可以如下制备含有末端反应性胺的二价的AEM-2、AEBM-2或AETM-2分子：向也缀合了反应性胺的合适框架上，缀合2个每种配体。可以如下制备含有末端反应性胺的三价的AEM-3、AEBM-3或AETM-3分子：向也缀合了反应性胺的合适框架上，缀合3个每种配体。可以使NH₂-二价的糖与上述的相同框架反应，以生成药物-缀合物，其中每个药物分子具有4和6个配体。可以使NH₂-三价的糖与上述的相同框架反应，以生成药物缀合物，其中每个药物分子具有6和9个配体。

在所有情况下，应当认识到，通过调节框架化学、配价和配体:框架化学计量，可以经由多价框架将不同配体的混合物缀合到同一个药物上。例如，根据该混合的配体方法，胰岛素-AEM-1-AEBM-1、胰岛素-AEBM-1-AETM-1、胰岛素-AEM-2-AETM-2和胰岛素-AEM-1-AETM-2都可以合成。

在某些情况下，可能希望通过不同的方法，将配体缀合到框架（而不是药物）上。例如，二价的马来酰亚胺/单价的活化的酯官能化的框架(例如，琥珀酰亚胺基-3,5-二马来酰亚胺基苯基苯甲酸酯(SDMB))可以用于在单独的步骤中缀合2个巯基官能化的配体和1个胺-官能化的药物。例如，使用本文所述的方法，可以将胰岛素或另一种含有胺的药物缀合到框架的活化的酯部分上。在单独的步骤中，通过与4-亚氨基硫醇烷反应，可以将氨基乙基糖(AEM、AEBM、AETM)转化成携带末端巯基的配体。最后，可以将框架-二-马来酰亚胺-胰岛素缀合物与过量的巯基-官能化的糖混合，生产得到的二价的-配体-胰岛素缀合物。

持续释放制剂

如在实施例中所讨论的，在某些实施方案中，可能有利地以持续方式(即，以表现出比可溶的重组人胰岛素更持久的吸收特性的形式)施用缀合物。这会提供持续的缀合物水平，该水平对葡萄糖波动做出响应的时标(timscale)与典型葡萄糖波动时标更密切相关(即，小时，而不是分钟)。在某些实施方案中，当施用给在非高血糖条件(即，禁食条件)下的哺乳动物时，所述持续释放制剂可以表现出缀合物的零级释放。

应当理解，可以使用能提供持续吸收特性的任意制剂。在某些实施方案中，通过组合缀合物和减慢它向体循环中的释放性质的其它成分，可以实现持续吸收。例如，PZI(鱼精蛋白锌胰岛素)制剂可以用于该目的。如在实施例中所述，我们已经发现：在某些实施方案中，用本公开内容的缀合物制备的PZI制剂的吸收特性和稳定性对在制剂中包含的鱼精蛋白和锌的绝对和相对量是敏感的。例如，鉴于商业的PZI和NPH(中性鱼精蛋白锌)胰岛素制剂仅需要约0.05至约0.2mg鱼精蛋白/mg胰岛素，有些PZI-缀合物制品需要约1至约5mg鱼精蛋白/mg缀合物，以便有效地维持吸收特性。此外，尽管商业的鱼精蛋白胰岛素制品含有约0.006mg锌/mg胰岛素，我们已经发现：在某些实施方案中，与鱼精蛋白浓度一起增加锌浓度，可以产生更稳定的、容易分散的制剂。在某些情况下，锌含量是在约0.05至约0.5mg锌/mg缀合物的范围内。此外，我们还意外地发现：在某些实施方案中，与在B29-胺基处被取代的胰岛素-缀合物相比，在B1-胺基处被取代的胰岛素-缀合物需要更多的鱼精蛋白和锌，以有效地维持释放特性。本公开内容包括这些PZI制剂的非结晶的和结晶的形式。

因而，在某些实施方案中，本公开内容的制剂包含约0.05至约10mg鱼精蛋白/mg缀合物。例如，约0.2至约10mg鱼精蛋白/mg缀合物，例如，约1至约5mg鱼精蛋白/mg缀合物。

在某些实施方案中，本公开内容的制剂包含约0.006至约0.5mg锌/mg缀合物。例如，约0.05至约0.5mg锌/mg缀合物，例如，约0.1至约0.25mg锌/mg缀合物。

在某些实施方案中，本公开内容的制剂包含比例(w/w)在约100:1至约5:1（例如，约50:1至约5:1，例如，约40:1至约10:1）范围内的鱼精蛋白和锌。在某些实施方案中，本公开内容的PZI制剂包含比例(w/w)在约20:1至约5:1（例如，约20:1至约10:1、约20:1至约15:1、约15:1至约5:1、约10:1至约5:1、约10:1至约15:1）范围内的鱼精蛋白和锌。

所述实施例也描述了在PZI制剂中包含一种或多种下述组分的益处：抗微生物防腐剂、等渗剂和/或未缀合的胰岛素分子。

在某些实施方案中，本公开内容的制剂包含抗微生物防腐剂(例如，间甲酚、苯酚、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)。在某些实施方案中，所述抗微生物防腐剂是间甲酚。例如，在某些实施方案中，制剂可以包括约0.1至约1.0%v/v间甲酚。例如，约0.1至约0.5%v/v间甲酚，例如，约0.15至约0.35%v/v间甲酚。

在某些实施方案中，本公开内容的制剂包含多元醇作为等渗剂(例如，甘露醇、丙二醇或甘油)。在某些实施方案中，所述等渗剂是甘油。在某些实施方案中，所述等渗剂是盐，例如NaCl。例如，制剂可以包含约0.05至约0.5MNaCl，例如，约0.05至约0.25MNaCl或约0.1至约0.2MNaCl。

在某些实施方案中，本公开内容的制剂包含一定量的未缀合的胰岛素分子。在某些实施方案中，制剂包含摩尔比在约100:1-1:1（例如，约50:1-2:1或约25:1-2:1）范围内的缀合的胰岛素分子与未缀合的胰岛素分子。

本公开内容也包括使用小分子制剂领域众所周知的标准的持续的(也称作延长的)释放制剂(例如，参见Remington’sPharmaceuticalSciences,第19版,MackPublishingCo.,Easton,PA,1995)。本公开内容也包括使用依赖于泵或阻碍扩散来逐步递送缀合物的装置。在某些实施方案中，通过使用修饰的胰岛素分子，可以提供长效制剂可以(额外地或可替代地)。例如，在制备缀合物时，可以使用甘精胰岛素(来得时?)或地特胰岛素(LEVEMIR?)来替代野生型人胰岛素。甘精胰岛素是一种示例性的长效胰岛素类似物，其中Asp-A21已经被甘氨酸替代，且2个精氨酸已经被添加到B-链的C-端上。这些变化的作用是迁移等电点，生成在pH4完全可溶的溶液。地特胰岛素是另一种长效胰岛素类似物，其中Thr-B30已经被删除，且C14脂肪酸链已经添加到Lys-B29上。

缀合物的应用

在另一个方面，本公开内容提供了使用缀合物的方法。一般而言，所述缀合物可以用于响应于糖(例如，葡萄糖或本文所述的外源糖，诸如甘露糖、α-甲基甘露糖、L-岩藻糖等)可控地提供生物活性的药物。本公开内容包括通过施用本公开内容的缀合物来治疗疾病或病症。尽管所述缀合物可以用于治疗任意患者(例如，狗、猫、牛、马、绵羊、猪、小鼠等)，它们最优选地用于治疗人。可以通过任意途径，将缀合物施用给患者。一般而言，最适当的给药途径取决于多种因素，包括要治疗的疾病或病症的性质、药物的性质、患者的状况等。一般而言，本公开内容包括通过下述途径给药：口服、静脉内、肌肉内、动脉内、皮下、心室内、透皮、直肠、阴道内、腹膜内、局部(作为散剂、软膏剂或滴剂)、经颊或作为口或鼻喷雾剂或气雾剂。用于这些不同途径的药物组合物的配制和生产的一般考虑因素，可以参见例如，Remington’sPharmaceuticalSciences,第19版,MackPublishingCo.,Easton,PA,1995。在不同的实施方案中，所述缀合物可以皮下给药，例如，通过注射。所述缀合物可以溶解在载体中，以便于递送。例如，所述载体可以是水溶液，包括，但不限于无菌水、盐水或缓冲的盐水。

一般而言，施用治疗有效量的缀合物形式的药物。药物d“治疗有效量”是指：足以在合理的收益/风险比（这包括平衡药物的效能和毒性）治疗疾病或病症的药物的量。一般而言，通过标准的药理学方法，可以在细胞培养物中或使用实验动物测定治疗效能和毒性，例如，通过计算ED₅₀(在50%的治疗受试者中治疗上有效的剂量)和LD₅₀(在50%的治疗受试者中致死的剂量)。ED₅₀/LD₅₀表示药物的治疗指数。尽管一般而言，具有大治疗指数的药物是优选的，如本领域众所周知的，在严重疾病或病症的情况下，特别是在缺少替代治疗选择的情况下，更小的治疗指数可能是可接受的。在临床试验过程中，确定给人施用的适当剂量范围的最终选择。

在不同的实施方案中，所述药物是胰岛素，且胰岛素的平均日剂量是在10-200U的范围内，例如，25-100U(其中1单位的胰岛素是~0.04mg)。在某些实施方案中，在每天基础上，施用具有这些胰岛素剂量的量的缀合物。在某些实施方案中，在每周基础上，施用具有5-10倍这些胰岛素剂量的量的缀合物。在某些实施方案中，在每两周基础上，施用具有10-20倍这些胰岛素剂量的量的缀合物。在某些实施方案中，在每月基础上，施用具有20-40倍这些胰岛素剂量的量的缀合物。本领域技术人员会认识到，该相同的方案可以外推至具有已知的剂量范围的其它被批准的药物，例如，本文所述的被批准的胰岛素敏化剂和胰岛素促分泌剂中的任一种。通常，缀合的药物的剂量高于未缀合的药物的正常剂量。

在某些实施方案中，本公开内容的缀合物可以用于治疗患者(例如，哺乳动物患者)的高血糖症。在某些实施方案中，所述患者是糖尿病患者。但是，本发明的方法不限于治疗糖尿病患者。例如，在某些实施方案中，缀合物可以用于治疗具有与受损的血糖控制（血糖控制）有关的感染的患者的高血糖症。在某些实施方案中，缀合物可以用于治疗糖尿病。

在某些实施方案中，当将本公开内容的缀合物或制剂(使用胰岛素分子作为药物)施用给患者(例如，哺乳动物患者)时，它比未缀合形式的胰岛素分子诱导更少的低血糖症。在某些实施方案中，与包含未缀合形式的胰岛素分子的制剂相比，本公开内容的制剂(含有包括胰岛素分子作为药物的缀合物)在患者(例如，哺乳动物患者)中诱导更低的HbA1c值。在某些实施方案中，与包含未缀合形式的胰岛素分子的制剂相比，所述制剂产生的HbA1c值降低了至少10%(例如，至少20%、至少30%、至少40%、至少50%)。在某些实施方案中，所述制剂产生小于7%（例如，在约4至约6%的范围内）的HbA1c值。在某些实施方案中，包含未缀合形式的胰岛素分子的制剂产生超过7%（例如，约8至约12%）的HbA1c值。

应该理解，对于任意给定患者而言药物的总日用量由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任意特定患者的具体治疗有效量取决于多种因素，包括待治疗的疾病或病症；采用的具体药物的活性；采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；给药时间，给药途径和采用的具体药物的排泄速率；治疗持续时间；与采用的具体药物组合或同时使用的药物；和医学领域众所周知的类似因素。在不同的实施方案中，本公开内容的缀合物可以施用于超过一个位置。例如，本公开内容具体地包括这样的方法，其中按照连续的时间表(例如，每天1次、每2天1次、每周1次、每2周1次、每月1次等)，将缀合物通过皮下注射施用给患者。

在不同的实施方案中，可以将本公开内容的缀合物施用给正在接受至少一种额外治疗的患者。在不同的实施方案中，所述至少一种额外治疗意在治疗与施用的缀合物相同的疾病或障碍。在不同的实施方案中，所述至少一种额外治疗意在治疗主要药物的副作用。可以在相同的、重叠的或无重叠的时间范围内，施用2种或更多种治疗，只要存在患者接受来自两种治疗的益处的时期。2种或更多种治疗可以在相同或不同的时间表施用，只要存在患者接受来自两种治疗的益处的时期。2种或更多种治疗可以在相同或不同的制剂内施用，只要存在患者接受来自两种治疗的益处的时期。在某些实施方案中，本公开内容的单个缀合物可以包括超过一种用于治疗相同疾病或障碍的药物。在某些实施方案中，可以施用本公开内容2种或更多种单独的缀合物(作为混合物或单独地)，它们包括用于治疗相同疾病或障碍的不同药物。在某些实施方案中，可以将未缀合的第二药物与本公开内容的缀合物相混合(即，与缀合物制剂简单地混合、且未共价地结合到缀合物上的药物)。例如，在某些实施方案中，这些方案中的任一个可以用于将超过一种抗糖尿病药物施用给受试者。在下面，在胰岛素相关的治疗的背景下，更详细地描述了该方案的某些示例性的实施方案；但是，从前述内容可以明白，其它治疗会受益于这样的联合方案。

胰岛素敏化剂(例如双胍类诸如二甲双胍、格列酮类)通过增加患者对给定量的胰岛素的响应来起作用。正在接受胰岛素敏化剂的患者因此需要比相同患者在未接受胰岛素敏化剂时更低剂量的本公开内容的胰岛素缀合物。因而，在某些实施方案中，可以将胰岛素缀合物施用给也正在用胰岛素敏化剂治疗的患者。在不同的实施方案中，可以以至多为在没有胰岛素敏化剂存在时所需的正常剂量的75%，施用本公开内容的缀合物。在不同的实施方案中，可以施用至多为正常剂量的50、40、30或20%。

胰岛素抗性是这样的障碍，其中正常量的胰岛素不足以产生正常的胰岛素响应。例如，胰岛素-抗性的患者可能需要高剂量的胰岛素，以便克服它们的抗性，并提供足够的葡萄糖降低效应。在这些情况下，在更低抗性的患者中通常诱导低血糖症的胰岛素剂量在高抗性患者中不会发挥葡萄糖降低效应。类似地，当他们在合适的时间范围内提供高水平的生物活性的胰岛素时，本公开内容的缀合物仅对于该患者亚类是有效的。在某些实施方案中，通过组合2个方案，可以促进该患者亚类的治疗。因而，在某些实施方案中，传统的基于胰岛素的治疗被用于提供胰岛素的基线水平，并在患者需要时施用本发明的缀合物来提供生物活性的胰岛素的受控补充。因而，在某些实施方案中，可以将胰岛素缀合物施用给也正在用胰岛素治疗的患者。在不同的实施方案中，可以以高达在没有本公开内容的缀合物存在时所需的正常剂量的75%，施用胰岛素。在不同的实施方案中，可以施用高达正常剂量的50、40、30或20%。应当理解，该组合方案也可以用于正在接受胰岛素促分泌剂(例如磺酰脲、GLP-1、exendin-4等)和/或胰岛素敏化剂(例如双胍诸如二甲双胍、格列酮)的胰岛素抗性的患者。

外源性触发剂

如以前所述的，本文所述的方法、缀合物和组合物不限于葡萄糖响应性的缀合物。如在实施例中所证实的，几种示例性的葡萄糖-响应性的缀合物也对外源糖（诸如α-甲基甘露糖和L-岩藻糖）有响应。因此，应当理解，在某些实施方案中，通过外源性地施用除了葡萄糖以外的糖（诸如α-甲基甘露糖和L-岩藻糖）或可以改变缀合物的PK或PD性质的任意其它糖，可以触发缀合物。

在已经如上所述施用缀合物(例如，作为持续释放制剂)以后，通过施用合适的外源糖，可以触发它。在某个实施方案中，施用触发量的外源糖。本文使用的外源糖的“触发量”是足以造成缀合物的至少一种PK和/或PD性质(例如，前面讨论的C_max、AUC、半衰期等)的变化的量。应当理解，缀合物的任一种前述施用方法同样适用于外源糖。还应当理解，缀合物和外源糖的施用方法可以是相同的或不同的。在不同的实施方案中，施用方法是不同的(例如，为了例证目的，可以在每周基础上，通过皮下注射，施用缀合物，同时在每天基础上，口服施用外源糖)。外源糖的口服施用具有特别的价值，因为它会促进患者顺应性。一般而言，应当理解，缀合物的PK和PD性质与外源糖的PK特性有关。因而，通过控制外源糖的PK特性，可以调节（tailor）缀合物PK和PD性质。如本领域众所周知的，基于剂量、途径、频率和使用的制剂，可以调节外源糖的PK特性。例如，如果需要缀合物的短且强烈的活化，则可以使用口服立即释放制剂。相反，如果需要缀合物的更长的、强烈程度更低的活化，则可以改为使用口服延长释放制剂。立即和延长释放制剂的配制和生产的一般考虑因素，可以参见，例如，Remington’sPharmaceuticalSciences,第19版,MackPublishingCo.,Easton,PA,1995。

还应当理解，本公开内容的缀合物和外源糖的相对施用频率可以是相同的或不同的。在某些实施方案中，比缀合物更频繁地施用外源糖。例如，在某些实施方案中，可以每天施用缀合物，同时每天施用外源糖超过1次。在某些实施方案中，可以每周2次、每周1次、每2周1次或每月1次地施用缀合物，同时每天施用外源糖。在某些实施方案中，每月施用缀合物，并每周2次、每周1次或每2周1次地施用外源糖。本领域技术人员会认识到这些方案的其它变化，并随使用的缀合物和制剂的性质而变化。

具体实施方式

实施例

在图45中显示了在实施例中描述和使用的示例性缀合物I-1至I-17和II-1至II-7的结构。

I.制备示例性缀合物的方法

该第一组实施例描述了制备示例性缀合物的不同方法。所述实施例也包括纯化和测定起始成分和终产物的试验。应当理解：可以改进这些方法以生成落入本发明范围内的其它缀合物。

实施例1–叠氮基乙基葡萄糖(AzEG)的合成

a.溴乙基葡萄糖的合成

用去离子水洗涤DOWEX50Wx4树脂(AlfaAesar,WardHill,MA)以去除颜色。用2.2L2-溴乙醇(30.5mol,25当量;124.97克/mol;1.762克/mL;BP=150℃;AlfaAesar)处理225克D-葡萄糖(1.25mol;1当量,AlfaAesar)和140克DOWEX50Wx4的混合物，并将搅拌的混合物加热至80℃4小时。通过TLC(20%甲醇/二氯甲烷(DCM))，监测反应。在约4小时后，反应结束，将它冷却至室温。过滤溶液以去除树脂，并用乙酸乙酯和DCM洗涤树脂。在旋转蒸发器中将得到的滤液蒸发（strip）成琥珀色油。蒸发后得到共400克。

以下述方式，在硅胶(4kg二氧化硅，包装在DCM中)上纯化该琥珀色油。将粗产物溶解于DCM中，并装载上柱，然后用2x4L10%甲醇/DCM、2x4L15%甲醇/DCM和3x4L20%甲醇/DCM洗脱。合并含有产物的级分(基于TLC)，并蒸发至干燥，得到152克1-α-溴乙基-葡萄糖(42%)。

b.溴乙基葡萄糖向叠氮基乙基葡萄糖(AzEM)的转化

给5L圆底3颈烧瓶（配有加热套、高架搅拌器和温度计）装载150克溴乙基葡萄糖(525mmol)。将该油溶解于2L水中，并用68.3克叠氮化钠(1.05mol,2当量;65克/mol;Alfa-Aesar)处理，随后用7.9克碘化钠(52.5mmol,0.08当量;149.89克/mol;Alfa-Aesar)处理，并将该溶液温热至50℃，搅拌过夜。将该溶液冷却至室温，并在旋转蒸发器上浓缩至干燥。用在40℃的3x500ml5:1体积的CHCl₃:MeOH消化固体残余物。过滤合并的有机部分，并蒸发至干燥，得到叠氮基乙基葡萄糖(86克)，为灰白色固体。TLC(20%MeOH/DCM;用H₂SO₄焦化)：单个斑点，与原料不可辨别。

c.叠氮基乙基葡萄糖的再纯化

将32克叠氮基乙基葡萄糖放入100mL水中。通过玻璃微纤维过滤器(WhatmanGF/B)，过滤浑浊的溶液。在旋转蒸发器上，将金色的滤液蒸发成固体。将该固体放入甲醇(100mL)中，并通过玻璃微纤维过滤器再次过滤浑浊的溶液。在真空下，将得到的淡黄色滤液蒸发成固体。

将该固体放入微量甲醇(50mL)中，并在搅拌下，缓慢地加入乙酸乙酯(150mL)。冷却并过滤该浓料浆。将固体风干(吸水的)，并放入60℃烘箱过夜。TLC具有极其微量的起始物。产量15.4g。在真空下蒸发母液，得到黄色胶质。在此时，不尝试进一步纯化该物质。

实施例2–叠氮基乙基甘露糖(AzEM)的合成

a.溴乙基甘露糖的合成

用去离子水洗涤DOWEX50Wx4树脂(AlfaAesar,WardHill,MA)，以去除颜色。用2.2L2-溴乙醇(30.5mol,25当量;124.97克/mol;1.762克/mL;BP=150℃;AlfaAesar)处理225克D-甘露糖(1.25mol;1当量,AlfaAesar)和140克DOWEX50Wx4的混合物，并将搅拌的混合物加热至80℃4小时。通过TLC(20%甲醇/二氯甲烷(DCM))，监测反应。在约4小时后，反应结束，然后冷却至室温。过滤溶液以去除树脂，并用乙酸乙酯和DCM洗涤树脂。在旋转蒸发器中将得到的滤液蒸发成琥珀色油。

以下述方式，在硅胶(4kg二氧化硅，包装在DCM中)上纯化该琥珀色油。将粗产物溶解于DCM中，并装载上柱，然后用2x4L10%甲醇/DCM、2x4L15%甲醇/DCM、和3x4L20%甲醇/DCM洗脱。合并含有产物的级分(基于TLC)，并蒸发至干燥，得到152克1-α-溴乙基-甘露糖(42%)。

b.溴乙基甘露糖向叠氮基乙基甘露糖(AzEM)的转化

给5L圆底3颈烧瓶（配有加热套、高架搅拌器和温度计）装载150克溴乙基甘露糖(525mmol)。将该油溶解于2L水中，并用68.3克叠氮化钠(1.05mol,2当量;65克/mol;Alfa-Aesar)处理，随后用7.9克碘化钠(52.5mmol,0.08当量;149.89克/mol;Alfa-Aesar)处理，并将该溶液温热至50℃，搅拌过夜。将该溶液冷却至室温，并在旋转蒸发器上浓缩至干燥。用在40℃的3x500ml5:1体积的CHCl₃:MeOH消化固体残余物。过滤合并的有机部分，并蒸发至干燥，得到叠氮基乙基甘露糖，为灰白色固体。

c.叠氮基乙基甘露糖的再纯化

将32克叠氮基乙基甘露糖放入100mL水中。通过玻璃微纤维过滤器(WhatmanGF/B)，过滤浑浊的溶液。在旋转蒸发器上，将滤液蒸发成固体。将该固体放入甲醇(100mL)中，并通过玻璃微纤维过滤器再次过滤浑浊的溶液。在真空下，将得到的淡黄色滤液蒸发成固体。

将该固体放入微量甲醇(50mL)中，并在搅拌下，缓慢地加入乙酸乙酯(150mL)。冷却并过滤该浓料浆。将固体风干(吸水的)，并放入60℃烘箱过夜。在真空下蒸发母液，得到黄色胶质。

实施例3–叠氮基乙基甘露二糖(AzEBM)的合成

使用苯二甲醚，选择性地保护来自实施例2的AzEM化合物，通过柱色谱法纯化，随后与苄基溴反应，得到1-α-(2-叠氮基乙基)-4,6-苯甲醛二缩醛-3-苄基-吡喃甘露糖苷。随后使用三氟甲基磺酸银化学法，在严格无水条件下，用1-α-溴-2,3,4,6-四苯甲酰基吡喃甘露糖苷，糖基化产物，得到受保护的-叠氮基乙基甘露二糖产物。然后将中间产物去保护，以去除苯甲酰基，得到AzEBM。

实施例4–叠氮基乙基甘露三糖(AzETM)的合成

a.1-α-溴-2,3,4,6-四苯甲酰基-甘露糖

向含有搅拌棒和氮入口的500mL3-颈烧瓶中加入40克(60.9mmol)五苯甲酰基甘露糖和80mL二氯甲烷。将得到的溶液在冰浴中冷却至<5℃，并以维持反应温度<10℃的速率，通过加料漏斗，加入80mL33%HBr-乙酸溶液。在加入结束后(~30min.)，去除冰浴，并继续搅拌3小时。

用等体积(160mL)的DCM稀释反应液，并连续用水(2x500mL)、饱和碳酸氢盐(2x50mL)和盐水(1x50mL)萃取，经硫酸镁干燥，蒸发溶剂，得到41克稳定的泡沫(理论产量40.1克)，并在冰箱中在N₂下储存。该物质不经进一步纯化地使用。通过TLC，监测反应：硅胶(己烷/乙酸乙酯,7/3)原料R_f0.65，产物R_f0.8紫外显影。¹HNMR(CDCl₃)δ8.11(d,2H),8.01(m,4H),7.84(d,2H),7.58(m,4H),7.41(m,6H),7.28(t,2H),6.58(s,1H),6.28(m,2H),5.8(m,1H),4.75(dd,1H)4.68(dd,1H)4.5(dd,1H)。

b.1-叠氮基乙基-2,4-二苯甲酰基甘露糖

向含有搅拌棒、氮入口和300ml无水乙腈的1.0L3-颈烧瓶中加入25克1-叠氮基乙基甘露糖(100.4mmol)和50mL邻苯甲酸三乙基酯(220mmol,2.2当量)。在室温搅拌得到的料浆，并加入0.8mL(10mmol)纯的三氟醋酸(TFA)。该溶液在10分钟内澄清，并继续搅拌另外2小时，然后加入25ml10%TFA水溶液，并继续搅拌另外2小时，以将中间体水解成酯异构体。在真空下蒸发溶剂成粘稠的油，与50mLDCM一起研磨，并再次蒸发成粘稠的油。

将甲苯(70mL)加入残余物中，给该粘稠的溶液接种2,4-二苯甲酰基叠氮基乙基甘露糖。在15分钟内形成细微的沉淀物，继续在室温搅拌过夜。将得到的浓悬浮液在冰箱中放置2-4小时，然后过滤，并用冰冷的甲苯(2x10mL)洗涤固体。将固体风干至恒重，得到21克(总产量22.85克，在50%异构体纯度)~95%异构体纯度。将产物放入40mL甲苯中，搅拌1小时，然后在冰箱中放置另外2小时。过滤固体，并用冰冷的甲苯(2x10mL)洗涤，风干至恒重，以83%产率得到18.5克单一异构体产物2,4-二苯甲酰基叠氮基乙基甘露糖。母液含有不希望的异构体和小量希望的异构体。通过TLC，监测反应：SG(己烷/乙酸乙酯7/3)原料R_f0.0,原酸酯中间体R_f0.9.(己烷/乙酸乙酯：8/2)SMR_f0.8，希望的异构体R_f0.4，不希望的异构体R_f0.2¹HNMR300MHz(CDCl₃)δ8.12(t,4H),7.66(t,2H),7.5(m,4H),5.56(t,1H),5.48(m,1H),5.14(m,1H),4.5(dd,1H),4.0(m,2H),3.8(m,3H),3.56(m,1H),3.44(m,1H)。

c.高苯甲酰化的-甘露(α-1,3)-甘露(α-1.6)-α-1-叠氮基乙基吡喃甘露糖苷

向具有搅拌棒、氮入口的1.0L3-颈烧瓶中加入在185mLDCM中的41克粗的1-溴-四苯甲酰基甘露糖(60.9mmol,~2.5当量)。向其中加入11.2克2,4-二苯甲酰基叠氮基乙基甘露糖(24.5mmol)，随后加入11.2克4A筛。将料浆在室温搅拌10分钟，在甲醇/冰浴中冷却至–15℃。

在一个单独的深色罐中加入190mL甲苯，随后加入15.1克三氟甲磺酸银(AgOTf)(58.8mmol,2.4当量)，并在暗处搅拌成溶液。将该溶液转移至大加料漏斗，逐滴加入到搅拌的悬浮液中，同时保护反应避光。通过调节AgOTf加入速率，维持反应温度<-10℃。在加入结束后(~30分钟)，去除冷却浴，将反应物搅拌另外2小时，直到通过TLC(SG,己烷/乙酸乙酯：7/3,溴R_f0.9,叠氮基R_f0.4,trios产物R_f0.5,紫外显影)证实保留单一产物。

加入三乙胺(7mL,5.0当量)，随后加入200mLDCM。通过硅胶和硅藻土垫，过滤得到的料浆，并用2x75mLDCM洗涤。在真空下蒸发溶剂，并将残余物放入乙酸乙酯中，依次用水(2x100mL)、碳酸氢盐(2x50mL)、盐水(1x75mL)洗涤，并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，得到39克稳定的泡沫(总产量39.5克)。¹HNMR300MHz(CDCl₃)δ8.3(d,2H),8.2(m,8H),7.85(d,4H),7.75(dd,4H),7.3-7.65(m,30H),7.2(t,2H),6.05(m,4H),5.9(t,2H),5.63(m,2H),5.38(s,2H),5.18(d,1H),4.65(m,4H),4.5(m,2H),4.35(m,4H),3,8(m,2H),3.54(m,2H)。

d.甘露(α-1,3)-甘露(α-1.6)-α-1-叠氮基乙基吡喃甘露糖苷

向搅拌的3.0克高苯甲酰化的-甘露(α-1,3)-甘露(α-1.6)-α-1-叠氮基乙基吡喃甘露糖苷(1.86mmol)在40mL甲醇中的悬浮液中加入0.2mL4.28M甲醇钠的甲醇溶液。将得到的悬浮液在室温搅拌20小时，得到澄清的溶液。通过TLC(SG,己烷/乙酸乙酯：8/2SMR_f0.4，产物R_f0.0)，监测反应结束。

在真空下蒸发甲醇，得到油状半固体。将残余物放入乙酸乙酯(50mL)中，并搅拌3小时。过滤固体，用新鲜的乙酸乙酯(2x20mL)洗涤，并风干至恒重，得到1.09克(总产量1.07克)产物。母液含有残余的苯甲酸甲酯，即去保护副产物。

实施例5–从叠氮基乙基-糖(AzEG、AzEM、AzEBM、AzETM)合成氨基乙基-糖(AEG、AEM、AEBM、AETM)

使用钯/碳催化剂、小量醋酸和乙醇溶剂，在室温容易地氢化来自实施例1-4的叠氮基-封端的化合物，得到对应的胺-封端的化合物。图10显示了AEG、AEM、AEBM、AETM的化学结构。该过程与下面关于AETM所述的过程相同，除了本领域技术人员会理解：试剂、溶剂等的量应当与要氢化的糖-配体的摩尔数匹配。

a.甘露(α-1,3)-甘露(α-1.6)-α-1-氨基乙基吡喃甘露糖苷(“氨基乙基三甘露糖”,AETM)

向5.3克(9.25mmol)甘露(α-1,3)-甘露(α-1.6)-α-1-叠氮基乙基吡喃甘露糖苷在100mL水和50mL乙醇中的溶液中加入0.8克5%Pd/C。在30-40psi，氢化该剧烈搅拌的悬浮液48小时，或直到通过TLC(SG,甲醇,SMR_f0.75，产物R_f0.0,PMA显影)证实没有原料。悬浮液经硅藻土过滤，用乙醇(2x50mL)冲洗，并在真空下浓缩滤液。

该物质的HPLC(C18,3%乙腈/97%0.1%H₃P0_4,220nm,2ml/min)产生注射柱空隙物质的紫外吸收，Rt2.5分钟，指示苯甲酸酯。

用70mL水和12ml1NNaOH稀释滤液，并在室温搅拌溶液过夜(HPLC：没有紫外物质在柱空隙Rt2.5min.，在Rt10.5分钟的紫外物质与苯甲酸一起洗脱)。加入2克脱色炭，将搅拌的悬浮液加热至80℃，冷却至室温，并经硅藻土过滤。用2NHCl，将滤液pH调至8.0，并在真空下浓缩无色溶液至约50%体积。

将溶液装载上树脂柱(Dowex50W,50克)，并用水(6x75mL)洗涤，直到洗脱级分是中性pH，去除任何残余的酸副产物。用0.25N氢氧化铵(6x75mL)，从柱洗掉胺产物，合并含有胺产物的级分（茚三酮检测），并在真空下浓缩至25-30mL。将该浓缩的溶液逐滴加入300mL搅拌的乙醇中，并继续搅拌另外2小时。过滤产物，用新鲜的乙醇(2x50mL)洗涤，并风干至恒重。将得到的白色无定形固体在真空干燥箱中在80℃进一步干燥5小时，得到4.1克白色颗粒状固体(总产量5.1克)。NMR证实没有任何芳族质子。¹HNMR300MHz(D₂O)δ5.08(s,1H),4.87(s,1H),4.81(s,1H),4.8-3.6(m,18H)、2.9(m,2H)。

实施例6–二炔丙基糖合成和AE-配体的生产

a.二炔丙基丙二酸二乙基酯的合成

将二乙基丙二酸酯(122.5g,0.7648mol)加入含有乙醇钠(从金属钠制备,38.5g,1.67mol)的无水乙醇(800ml)中。30min后，将炔丙基溴(200g,1.68mol)缓慢地加入搅拌的悬浮液中，保持温度低于60℃。将混合物回流过夜(15小时)。通过过滤，去除沉淀的盐，并用乙醇洗涤。在真空中去除溶剂，用水稀释残余物，并用乙醇(2x200ml)萃取。合并的萃取物经MgSO₄干燥，过滤，并用Et₂O洗涤，并在真空中去除溶剂，得到金色油。将该油放在高真空(40℃)中3小时，并静置。固体开始结晶，形成油状固体。静置过夜(16小时)。将环己烷装入烧瓶中，破碎固体，过滤，并用环己烷洗涤，得到白色结晶产物(81克,44.8%产率)。通过气相色谱法跟踪反应。

b.二炔丙基丙二酸的合成

在600ml10%氢氧化钾醇溶液中回流二炔丙基丙二酸二乙基酯(80克,0.339mol)过夜(15小时)。在真空中去除溶剂，并用3NHCl酸化残余物。用Et₂O(2x300ml)萃取残余物。合并的萃取物经MgSO₄干燥，过滤，用Et₂O洗涤，并在真空中浓缩成油。放在高真空(40℃)中2小时，并静置，得到二炔丙基丙二酸，为油(46克,75.4%产率)。通过气相色谱法跟踪反应。

c.二炔丙基醋酸的合成

在135℃加热二炔丙基丙二酸(26克,0.443mol)，直到CO₂停止展开。然后将它冷却成油。在0.5psi，蒸馏油。组合在蒸馏瓶中的剩余油状残余物和固体(15.7克,79.9%产率)，并原样用于下一步。

d.[2-(3-丙-2-炔基-己-5-酰氨基)-乙基]-氨基甲酸叔丁基酯的合成

通过加料漏斗，将在50mlCH₃CN中的N-boc-乙二胺(18.3克,0.1143mol)缓慢地加入在0℃搅拌的溶液中，所述溶液含有在300mlCH₃CN中的二炔丙基醋酸(15.56克,0.1143mol)、TBTU(36.74克,0.114mol)和DIPEA(29.6克,0.229mol)。进行沉淀。去除冰浴，并在环境温度搅拌产物过夜(16小时)。现在反应是完全均匀的。在真空中浓缩溶液，并用800ml水稀释残余物。过滤得到的固体，用水充分洗涤，并真空干燥，得到14.3克粗产物。从DCM中重结晶(2x)，过滤，并用己烷洗涤，得到产物(9.85克,31%产率,通过HPLC(214nm)测得98%纯度)。

e.叠氮基糖与[2-(3-丙-2-炔基-己-5-酰氨基)-乙基]-氨基甲酸叔丁基酯的点击反应

向在DCM(20mL)中的1,1-二炔丙基-乙酰基-(-1N,2N-BOC-1,2-二氨基乙基)酰胺(DP,418mg,1.5mmol)中，在5分钟内逐滴加入0℃的TFA(4mL)。将变黑的溶液在室温搅拌过夜。在减压下蒸发挥发物。将甲苯(20mL)加入残余物中，并在减压下搅拌2次。得到的黑色油不经进一步纯化地使用。

向该残余物中，加入THF(20mL)和水(20mL)，并搅拌15分钟。加入硫酸铜(225mg,0.9mmol)，随后加入抗坏血酸钠(180mg,0.9mmol)。将得到的混合物加热至55-60℃6小时，然后在室温搅拌18小时。在减压下蒸发溶液至约一半体积，并通过微纤维玻璃过滤器进行过滤。将得到的澄清溶液放在树脂柱(Dowex50X-2)上，用水(6x75mL)洗涤至中性pH，然后用10%NH₄OH(8x75mL)洗涤。合并用茚三酮染色阳性的级分，并在减压下蒸发成玻璃状固体。将玻璃状残余物放入水(250mL)中，并用0.5克炭处理，并加热至回流。在硅藻土和微纤维过滤器上过滤冷却的料浆。将得到的淡黄色溶液在减压下蒸发成玻璃状固体，加入甲醇，并蒸发(2x)，得到灰白色泡沫(0.9克,总产量1.0克)。

实施例7–三炔丙基糖合成和AE-配体的生产

a.2-(2-BOC-氨基乙基)硫代乙酰胺-三[(炔丙氧基)甲基]氨基甲烷

向N-(2-巯基乙基)氨基甲酸叔丁酯(FrontrunOrganix,Ipswich,MA;177.26mg,1mmol)在乙醇(5mL)中的溶液中，加入NaOH(1.1mmol)，并在室温搅拌。向该溶液中加入2-溴乙酰胺-三[(炔丙氧基)甲基]氨基甲烷(356mg,1.0mmol,参见J.Org.Chem.73,5602,2008)，并继续搅拌20小时(TLCSG8/2己烷/乙酸乙酯，产物R_f0.4)。在真空下蒸发溶剂，将残余物放入乙酸乙酯(40mL)中，并用水(25mL)、0.5NNaOH(25mL)和盐水(25mL)连续洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤，并浓缩成油(360mg,总产量452.3mg)。NMRCDCl₃,(ppm)：7.05(s,1H,N-H);5.25((s,1H,N-H);4.85(s,6H);3.85(s,6H);3.3(m,2H);3.15(s,2H);2.7(m,2H);2.42(s,3H);1.22(s,9H)。

b.2-(2-氨基乙基)硫代乙酰胺-三[(三唑并-1-(2-乙基甘露糖)4-甲氧基)甲基]氨基甲烷

向在室温搅拌的2-(2-BOC-氨基乙基)硫代乙酰胺-三[(炔丙氧基)甲基]氨基甲烷(1克,2.21mmol)在DCM(40mL)中的溶液中，逐滴加入TFA(4mL)。将得到的溶液搅拌过夜。在真空下去除溶剂，并将残余物放入甲苯(15mL)中，并蒸发至干燥。

将残余物放入THF(40mL)、水(40mL)中，并搅拌成溶液。加入叠氮基乙基甘露糖(3.75当量，2.0克,8.3mmol)，然后加入硫酸铜(500mg,2.0mmol)和抗坏血酸钠(400mg,2.0mmol)，并将得到的混合物在55-60℃(油浴)搅拌6小时，冷却至室温，并搅拌过夜。将得到的混合物在真空下浓缩至一半体积，并通过微玻璃过滤器过滤。将滤液装载上树脂柱(Dowex50w50x4-100)，并用水(6x75mL)洗脱至中性。然后用15%氢氧化铵(10x75mL)洗脱柱，合并茚三酮阳性的级分，并浓缩成玻璃状泡沫(1.29克,总产量(分子量1099g/mol)，2步53%)。

实施例8–NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素的合成

在一个典型的合成中，将4g胰岛素粉末(SigmaAldrich,St.Louis,MO)溶解于在室温的100ml无水DMSO中，随后加入4ml三乙胺(TEA)。将该溶液在室温搅拌30分钟。接着，将1.79ml(2.6当量)二-叔丁基-二碳酸酯/THF溶液(SigmaAldrich,St.Louis,MO)缓慢地加入该胰岛素-TEA溶液中，并混合大约1小时。如下猝灭反应：加入4ml储备溶液（其含有在5mlDMSO中的250ul乙醇胺），随后混合5分钟。猝灭后，将整个溶液倒入1600ml丙酮中，并用药刀简单地混合。接着，将18.9%HCl:水溶液的8x400μl等分试样逐滴加到混合物表面的上面，以沉淀反应的胰岛素。然后将沉淀的物质离心，并将上清液倾析进第二个烧杯中，同时将沉淀物饼放在一边。向该上清液中，将18.9%HCl:水溶液的另外8x400μl等分试样逐滴加到混合物表面的上面，得到反应的胰岛素的第二份沉淀物。将该第二份沉淀物离心，并抛弃上清液。用丙酮洗涤来自2个沉淀步骤的合并的离心饼1次，然后在真空下在室温干燥，得到粗粉末，其通常含有60%的希望的BOC2产物和40%的BOC3物质。

使用制备反相HPLC方法，从粗粉末分离纯的BOC2-胰岛素。缓冲液A是含有0.1%TFA的去离子水，缓冲液B是含有0.1%TFA的乙腈。以25mg/ml，将粗粉末溶解在70%A/30%B混合物中，并进行注射器式过滤，然后注射到柱上。在纯化之前，使用WatersDeltraPrep600系统，以15ml/分钟，用70%A/30%B流动相平衡柱(WatersSymmetryPrepC18、7um、19x150mm)。以15ml/分钟的流速，经5分钟的时间段，将大约5ml粗粉末溶液注射到柱上，然后在接下来的3.5分钟时间段内，采用70%A/30%B至62%A/38%B的线性梯度，并保持另外2.5分钟。使用该方法，希望的BOC2峰在大约10.6分钟洗脱，后面紧跟着BOC3峰。收集后，旋转蒸发该溶液以去除乙腈，并低压冻干，以得到纯的BOC2-胰岛素粉末。通过LC-MS(HTLaboratories,SanDiego,CA)，验证身份，并通过N-端测序(WesternAnalytical,St.Louis,MO)，测定缀合部位。

实施例9–苯-1,3,5-三羧基-(N-ω-氨基酸-NHS酯)酰胺框架的合成

将1,3,5-苯三羰基氯(1克,3.8mmol)在二氯甲烷(DCM)(5mL)中的溶液逐滴加入到在冰浴中剧烈搅拌的ω-氨基酸(3.1当量)在1NNaOH(25mL)中的溶液中。去除冰浴，并在室温继续搅拌4小时。逐滴加入2NHCl(~15mL)，至大约pH2，并将得到的料浆搅拌另外2小时。过滤沉淀物，用冷水(2x20mL)洗涤，并在真空下在空气中干燥，然后在60℃烘箱中干燥过夜。得到的白色固体不经进一步纯化地使用。每种ω-氨基酸的产量(4-氨基丁酸：产量1.6克，91%；6-氨基己酸：产量1.9克，92%)

将上述物质放入含有N-羟基琥珀酰亚胺(3.1mmol,3.1当量)的DMSO(5mL)中，并加入在室温的N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺(EDCI,3.6mmol,3.6当量)。将得到的溶液搅拌24小时，用水(125mL)稀释，并用乙酸乙酯(3x50mL)萃取。用水(2x50mL)、盐水(1x50mL)洗涤合并的有机相，并经MgSO₄干燥。蒸发溶剂，并与乙腈(10mL)一起研磨半固体残余物。过滤固体，并用冷溶剂洗涤，在真空下在空气中干燥，然后在60℃烘箱中干燥过夜。产物不含有脲副产物。苯-1,3,5-三羧基-(N-6-氨基己酸-NHS酯)酰胺(TSB-C6)：304mg,36%，熔点140-142℃。苯-1,3,5-三羧基-(N-4-丁酸-NHS-酯)酰胺(TSB-C4)：245mg,45%，熔点182-184℃。

实施例10–树枝状框架合成

a.含有硝基的炔烃-末端官能化的树枝状物（dendron）的氢化

得到含有n=2、4或8个末端炔烃和硝基丙酸核心的树枝状物(例如，从PolymerFactory,Sweden)，并不经进一步纯化地使用。将树枝状物溶解在100mlDCM和乙醇的50:50体积的混合物中，并加入0.8克5%Pd/C。将该剧烈搅拌的悬浮液在30-40psi氢化48小时，或直到通过TLC看不到原料。在硅藻土上过滤悬浮液，用乙醇(2x50mL)冲洗，并在真空下浓缩滤液。

用70mL水和12ml1NNaOH稀释滤液，并将溶液在室温搅拌过夜。加入2克脱色炭，并将搅拌的悬浮液加热至80℃，冷却至室温，并在硅藻土上过滤。使用2NHCl，将滤液pH调节至8.0，并在真空下浓缩无色溶液至约50%体积。

将溶液装载上树脂柱(Dowex50W,50克)，并用水洗涤，直到洗脱级分是中性pH(6x75mL)，去除任何残余的酸副产物。用0.25N氢氧化铵(6x75mL)，从柱洗掉胺产物，并合并含有胺产物(茚三酮检测)的级分，并使用旋转蒸发器真空蒸发。

b.树枝状物(胺,炔烃-4)与叠氮基乙基甘露糖的反应

将氢化后得到的含有氨基核心和4个末端炔烃基团的树枝状物产物(8.3mmol)放入THF(40mL)、水(40mL)中，并搅拌成溶液。加入叠氮基乙基甘露糖(4.75当量，2.53克,10.51mmol)，然后加入硫酸铜(500mg,2.0mmol)和抗坏血酸钠(400mg,2.0mmol)，并将得到的混合物在55-60℃(油浴)搅拌6小时，冷却至室温，并搅拌过夜。将得到的混合物在真空下浓缩至一半体积，并通过微玻璃过滤器过滤。将滤液装载上树脂柱(Dowex50w50x4-100)，并用水(6x75mL)洗脱至中性。然后用15%氢氧化铵(10x75mL)洗脱柱，合并茚三酮阳性的级分，并浓缩成玻璃状泡沫。

实施例11–胺-官能化的药物与多价活化的酯在有机溶剂中的缀合(首先添加药物)

将含有N-端活化的酯的框架以60mM溶解在1.0ml无水DMSO中，随后加入400ul(过量)三乙胺(TEA)。将该溶液在室温快速地搅拌10分钟。然后，在7.4mM的浓度，将携带胺的药物单独地溶解在7.9mlDMSO中。溶解后，在10分钟时间段内，将整个药物溶液逐滴加入到框架/DMSO/TEA溶液中，随后在室温混合2小时。然后以下述方式，使剩余的活化的酯与胺-官能化的配体反应。在适当体积的无水DMSO中，制备370mM配体溶液。溶解后，加入足够的溶液，以提供等于（最初的活化的酯基团的数目N-1）的3倍的反应当量数。例如，如果每个框架上存在N=3个最初活化的酯基团，则加入(3x(3-1)x60mM/370mM)=0.973ml配体溶液。如果每个框架上存在N=4个最初活化的酯基团，则加入(3x(4-1)x60mM/370mM)=1.46ml配体溶液，以此类推。加入配体溶液后，将该溶液在室温搅拌另外1小时，以确保完全反应。

然后在含有0.150MNaCl的20mMpH5.0HEPES缓冲盐水溶液中，将得到的溶液超稀释10倍，随后用稀HCl调节pH至最终的pH8.0。首先使用适当的固相，通过尺寸排阻，纯化水溶液，用于希望的缀合的和未缀合的物质的分离。然后使用适当尺寸的超滤膜，将穿过柱空体积的溶液浓缩至大约10ml。使用制备反相HPLC（在WatersC8、7um、19x150mm柱上），进一步纯化该溶液，以得到希望的产物。缓冲液A是含有0.1%TFA的去离子水，缓冲液B是含有0.1%TFA的乙腈。在纯化之前，使用WatersDeltraPrep600系统，以15ml/分钟，用80%A/20%B流动相平衡柱。在2分钟时间段内，以15ml/分钟的流速，将大约5ml粗产物溶液注射到柱上，然后在接下来的5分钟内采用80%A/20%B至75%A/25%B的线性梯度，继之以在接下来的22分钟内75%A/25%B至62%A/38%B的更慢的线性梯度。目标峰的保留时间随使用的药物、框架和配体而异。收集后，旋转蒸发该溶液以去除乙腈，并低压冻干以得到纯的缀合物，其身份可以通过LC-MS(HTLaboratories,SanDiego,CA)予以证实。

实施例12–具有多价糖-均质配体的B1-胰岛素缀合物

使用下述的框架和配体，使用在实施例11中描述的方法和携带胺的药物，即实施例8的NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素(分子量=6,008g/mol)，制备胰岛素缀合物。三-琥珀酰亚胺基-1,3,5-苯三羧化物(TSB)、三-琥珀酰亚胺基氨基三乙酸酯(TSAT)、三-琥珀酰亚胺基(6-氨基己酰基)氨基三乙酸酯(TSAT-C6)和四-(N-琥珀酰亚胺基羧基丙基)季戊四醇TSPE活化的酯框架购自MolecularBiosciences(Boulder,CO)，并不经进一步纯化地使用。根据实施例9，合成TSB-C4和TSB-C6框架。根据实施例1-5，合成AEM、AEBM和AETM配体。适当尺寸的尺寸排阻介质是BiogelP2(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)，适当尺寸的超滤膜分子量截止值是3kD。

在所有情况下，如下去除BOC保护基：将根据实施例11得到的冻干粉在4℃溶解在90%TFA/10%苯甲醚中1小时，然后在含有0.150MNaCl的25mMHEPESpH8.2缓冲液中10倍超稀释。使用NaOH溶液，将pH调节至7.0-8.0，然后使物质穿过BiogelP2柱，以去除苯甲醚、BOC和去保护的其它低分子量副产物以及任意其它污染盐。然后，使用Amicon3K膜(Millipore,Billerica,MA)，浓缩去保护的、纯化的缀合物水溶液至大约58U胰岛素/ml(基于A280测量)，并在4℃储存备用。因为开始的NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素物质仅具有1个在Phe-B1末端处的游离胺基，Phe-B1是胰岛素与框架缀合的唯一位点，这通过对每种去保护的终产物进行N-端测序来证实。

在下表中(和在别处，如在实施例中)，框架分子量值是针对框架的活化的酯。这使得可以立即计算要加入反应混合物中的活化的酯框架的质量。反应后，框架丧失活化的酯，所以在终产物中的分子量贡献低许多。

实施例13–具有多价糖–混合配体的B1-胰岛素缀合物

使用在实施例11中描述的方法和携带胺的药物，即实施例8的NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素(分子量=6,008g/mol)，制备胰岛素缀合物，其具有连接到框架上的糖配体的混合物。

TSAT-C6和TSPE活化的酯框架购自MolecularBiosciences(Boulder,CO)，并不经进一步纯化地使用。根据实施例1-5，合成AEM、AEBM和AETM。适当尺寸的尺寸排阻介质是BiogelP2(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)，适当尺寸的超滤膜分子量截止是3kD。

在所有情况下，如下去除BOC保护基：将根据实施例11得到的冻干粉在4℃溶解在90%TFA/10%苯甲醚中1小时，然后在含有0.150MNaCl的25mMHEPESpH8.2缓冲液中10倍超稀释。使用NaOH溶液，将pH调节至7.0-8.0，然后使物质穿过BiogelP2柱，以去除苯甲醚、BOC和去保护的其它低分子量副产物以及任意其它污染盐。然后，使用Amicon3K膜(Millipore,Billerica,MA)，浓缩去保护的、纯化的缀合物水溶液至希望的水平，并在4℃储存备用。因为开始的NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素物质仅具有1个在Phe-B1末端处的游离胺基，Phe-B1是胰岛素与框架缀合的唯一位点，这通过对每种去保护的终产物进行N-端测序来证实。

实施例14–使用预制备的多价糖制备含有多价糖的B1-胰岛素缀合物

使用在实施例11中描述的方法和携带胺的药物，即实施例8的NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素(分子量=6,008g/mol)，从预先合成的含有多价胺的配体制备下述胰岛素缀合物。二琥珀酰亚胺基底物(DSS)和TSAT-C6活化的酯框架购自MolecularBiosciences(Boulder,CO)，并不经进一步纯化地使用。通过将2个每种配体缀合到也缀合了反应性胺的合适框架上，制备含有末端反应性胺的二价的AEM-2、AEBM-2和AETM-2分子。通过将3个每种配体缀合到也缀合了反应性胺的合适框架上，制备含有末端反应性胺的三价的AEM-3、AEBM-3和AETM-3分子。适当尺寸的尺寸排阻介质是BiogelP2(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)，适当尺寸的超滤膜分子量截止是3kD。

实施例15–使用树枝状框架–均质配体制备含有多价糖的B1-胰岛素缀合物

将0.1克(0.098mmol)在实施例10b中制备的含有1个氨基核心和4个末端炔烃基团的树枝状物以100mg/ml溶解在无水DMSO中。将该溶液逐滴加入含有二琥珀酰亚胺基底物(DSS,MolecularBiosciences,0.098mmol)和三乙胺(400uL)的溶液中，并在室温反应1小时。然后将该混合物逐滴加入到含有实施例8的NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素(分子量=6,008g/mol)(0.588g,0.098mmol)的50mg/ml溶液中，并反应2小时。

在水中超稀释得到的缀合物，并将pH调节至8.0。使用BioGelP2，将溶液脱盐，随后使用Amicon3k超滤装置进行浓缩。通过反相色谱法，纯化得到的溶液，旋转蒸发去除乙腈，并低压冻干。如下去除BOC保护基：通过在4℃将冻干粉溶解在90%TFA/10%苯甲醚中1小时，然后在含有0.150MNaCl的25mMHEPESpH8.2缓冲液中10倍超稀释。使用NaOH溶液，将pH调节至7.0-8.0，然后使物质穿过BiogelP2柱，以去除苯甲醚、BOC和去保护的其它低分子量副产物以及任意其它污染盐。然后，使用Amicon3K膜(Millipore,Billerica,MA)，浓缩去保护的、纯化的缀合物水溶液至希望的水平，并在4℃储存备用。因为开始的NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素物质仅具有1个在Phe-B1末端处的游离胺基，Phe-B1是胰岛素与框架缀合的唯一位点，这通过对每种去保护的终产物进行N-端测序来证实。

实施例16–NH₂-B29-BOC2(A1,B1)-胰岛素的合成

a.Fmoc-1-(B29)-胰岛素

在一个典型的合成中，将4克胰岛素粉末(SigmaAldrich,St.Louis,MO)溶解于在室温的100ml无水DMSO中，随后加入4ml三乙胺(TEA)。将该溶液在室温搅拌30分钟。接着，将1.2当量的9-芴基甲基N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(Fmoc-NHS)(SigmaAldrich,St.Louis,MO)（作为1.0MFmoc-NHS在THF中的溶液）缓慢地加入该胰岛素-TEA溶液中。将反应物混合大约1小时。如下猝灭反应：通过加入4ml储备溶液（含有在5mlDMSO中的250ul乙醇胺），随后混合5分钟。猝灭后，将整个溶液倒入1600ml丙酮中，并用药刀简单混合。接着，将18.9%HCl:水溶液的8x400μl等分试样逐滴加到混合物的表面上，以沉淀反应过的胰岛素。然后将沉淀物离心，并将上清液倾析进第二个烧杯中，同时将沉淀饼留出。向上清液中，将18.9%HCl:水溶液的另外8x400μl等分试样逐滴加到混合物的表面上，以得到反应过的胰岛素的第二份沉淀物。将该第二份沉淀物离心，并抛弃上清液。用丙酮洗涤来自2个沉淀步骤的合并的离心饼1次，随后在真空下在室温干燥，得到粗粉末，其通常含有20%的Fmoc1产物、65%的Fmoc2产物和15%的未反应的胰岛素。

使用制备反相HPLC方法来从粗粉末分离纯的希望的Fmoc1-胰岛素。缓冲液A是含有0.1%TFA的去离子水，缓冲液B是含有0.1%TFA的乙腈。在25mg/ml，将粗粉末溶解在70%A/30%B混合物中，并通过注射器式滤器过滤，然后注射到柱上。在纯化之前，使用WatersDeltraPrep600系统，在15ml/分钟，用70%A/30%B流动相平衡柱(WatersSymmetryPrepC18、7um、19x150mm)。在5分钟时间段内，以15ml/分钟的流速，将大约5ml粗粉末溶液注射到柱上，然后在接下来的3.5分钟时间段内，采用70%A/30%B至62%A/38%B的线性梯度，并保留另外2.5分钟。使用该方法，在未反应的RHI峰之后，希望的Fmoc1峰在大约3分钟洗脱，后面紧跟着Fmoc2-胰岛素峰。收集后，旋转蒸发该溶液以去除乙腈，并低压冻干，以得到纯的Fmoc1-胰岛素粉末。通过LC-MS(HTLaboratories,SanDiego,CA)证实身份（identity），并通过N-端测序(WesternAnalytical,St.Louis,MO)，测定缀合部位。

b.BOC2(A1,B1)-Fmoc-(B29)-胰岛素

在典型合成中，将1gFmoc1-(B29)-胰岛素溶解于在室温的25ml无水DMSO中，随后加入1ml三乙胺(TEA)。将该溶液在室温搅拌30分钟。接着，将0.379ml(2.2当量)的二-叔丁基-二碳酸酯/THF溶液(SigmaAldrich,St.Louis,MO)缓慢地加入该胰岛素-TEA溶液中，并混合大约1小时。如下猝灭反应：通过加入1ml储备溶液（含有在5mlDMSO中的250ul乙醇胺），随后混合5分钟。猝灭后，将整个溶液倒入400ml丙酮中，并用药刀简单混合。接着，将18.9%HCl:水溶液的8x100μl等分试样逐滴加到混合物的表面上，以沉淀反应过的胰岛素。然后将沉淀物离心，并将上清液倾析进第二个烧杯中，同时将沉淀饼留出。向上清液中，将18.9%HCl:水溶液的另外8x100μl等分试样逐滴加到混合物的表面上，以得到反应过的胰岛素的第二份沉淀物。将该第二份沉淀物离心，并抛弃上清液。用丙酮洗涤来自2个沉淀步骤的合并的离心饼1次，随后在真空下在室温干燥，得到粗粉末，其通常含有大于90%的希望的BOC2-Fmoc-1产物。

使用制备反相HPLC方法来从粗粉末分离纯的BOC2-Fmoc-1-胰岛素。缓冲液A是含有0.1%TFA的去离子水，缓冲液B是含有0.1%TFA的乙腈。在25mg/ml，将粗粉末溶解在70%A/30%B混合物中，并通过注射器式滤器过滤，然后注射到柱上。在纯化之前，使用WatersDeltraPrep600系统，在15ml/分钟，用70%A/30%B流动相平衡柱(WatersSymmetryPrepC18、7um、19x150mm)。在5分钟时间段内，以15ml/分钟的流速，将大约5ml粗粉末溶液注射到柱上，然后在接下来的3.5分钟时间段内，采用70%A/30%B至62%A/38%B的线性梯度，并保留另外2.5分钟。使用该方法，在Fmoc1-胰岛素原料之后，希望的BOC2-Fmoc-1峰在大约5分钟洗脱。收集后，旋转蒸发该溶液以去除乙腈，并低压冻干，以得到纯的BOC2(A1,B1)-Fmoc(B29)-胰岛素粉末。通过LC-MS(HTLaboratories,SanDiego,CA)证实身份，并通过N-端测序(WesternAnalytical,St.Louis,MO)，测定缀合部位。

c.NH₂-(B29)-BOC2(A1,B1)-胰岛素

如下去除BOC2(A1,B1)-Fmoc(B29)的Fmoc保护基：将根据前述步骤得到的冻干粉溶解在4℃的20%哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)溶液中30分钟，然后在含有0.150MNaCl的25mMHEPESpH8.2缓冲液中10倍超稀释。使用NaOH溶液，将pH调至7.0-8.0，然后使物质穿过BiogelP2柱，以去除Fmoc、DMF和任意其它污染盐。在需要时，将NH₂-(B29)-BOC2(A1,B1)-胰岛素低压冻干成粉末，或在需要时直接地在水溶液中使用。

实施例17–NH₂-B29-BOC2(A1,B1)-胰岛素缀合物的合成

作为使用实施例16的NH₂-B29-BOC2(A1,B1)-胰岛素的替代，使用实施例8的NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素，可以制备在以前的实施例中描述的所有多价配体-药物缀合物。所有得到的缀合物具有相同的分子量和置换特征程度，但是与胰岛素分子的缀合位点是在εB29氨基处，而不是N-端Phe-B1处。这可以通过N-端测序来证实。

实施例18–胺-官能化的药物与多价活化的酯在有机溶剂中的缀合(最后添加药物)

本实施例描述了在实施例11中描述的方法（其中在配体之前，将药物添加到框架上）的一个替代方案。在本实施例中，在药物之前，将配体添加到框架上。

在60mM，将含有N末端活化的酯的框架溶解在1ml无水DMSO中，随后加入400ul(过量)三乙胺(TEA)。将该溶液在室温迅速搅拌10分钟。平行地，在适当体积的无水DMSO中，制备122mM配体溶液。溶解后，在10分钟的时间段内逐滴加入足够的配体溶液，以提供精确地等于框架上活化的酯基团的数目N减去1的反应当量数。例如，如果框架上存在N=3个活化的酯基团，则加入(1x(3-1)x60mM/122mM)=0.98ml配体溶液。如果框架上存在N=4个活化的酯基团，则加入(1x(4-1)x60mM/122mM)=1.5ml配体溶液，以此类推。加入配体溶液后，将该溶液在室温搅拌2小时。

然后以8.1mM的浓度，单独地将携带胺的药物溶解在7.5ml无水DMSO中。溶解后，在1分钟时间段内，将整个药物溶液加入到框架/DMSO/配体/TEA溶液中，然后在室温混合另外2小时，以确保完全反应。

然后将得到的溶液在含有0.150MNaCl的20mMpH5.0HEPES缓冲的盐水溶液中10倍超稀释，再用稀HCl调节pH至最终的pH8.0。首先使用适当的固相，通过尺寸排阻，纯化水溶液，用于希望的缀合的和未缀合的物质的分离。然后使用适当尺寸的超滤膜，将穿过柱空体积的溶液浓缩至大约10ml。使用制备反相HPLC（在WatersSymmetryPrepC18,7um柱,19x150mm上），进一步纯化该溶液，以得到希望的产物。缓冲液A是含有0.1%TFA的去离子水，缓冲液B是含有0.1%TFA的乙腈。在纯化之前，使用WatersDeltraPrep600系统，在15ml/分钟，用80%A/20%B流动相平衡柱。在2分钟时间段内，以15ml/分钟的流速，将大约5ml粗产物溶液注射到柱上，然后在接下来的5分钟内采用80%A/20%B至75%A/25%B的线性梯度，继之以在接下来的22分钟内75%A/25%B至62%A/38%B的更慢的线性梯度。目标峰的保留时间随使用的药物、框架和配体而异。收集后，旋转蒸发该溶液以去除乙腈，并低压冻干以得到纯的缀合物，其身份可以通过LC-MS(HTLaboratories,SanDiego,CA)予以证实。

实施例19–在有机溶剂中从未保护的胰岛素生成的含有多价糖的B29-胰岛素缀合物

本实施例利用下述事实，即在未保护的胰岛素中，Lys-B29ε-氨基部分是最有反应性的胺，其次是A1，然后是B1。因此，当使用未保护的胰岛素作为含有胺的药物时，得到的缀合物应当主要在Lys-B29位置被取代。使用在实施例18中所述的方法和重组人胰岛素(分子量=5808Da,SigmaAldrich,St.Louis,MO)作为含有胺的药物，使用购自MolecularBiosciences(Boulder,CO)的TSAT-C6活化的酯框架，制备下述胰岛素缀合物。如前所述，合成AEM和AETM。适当尺寸的尺寸排阻介质是BiogelP2(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)，适当尺寸的超滤膜分子量截止值是3kDa。

根据N-端测序，大约85%的含有AEM的框架通过Lys-B29缀合到胰岛素上，大约87%的含有AETM的框架通过Lys-B29缀合到胰岛素上。

实施例20–在水性溶剂中用多价活化的酯进行胺-官能化的药物缀合(最后添加药物)

本实施例描述了在实施例18中所述的方法的替代方法，其中在替代有机溶剂的水性溶剂中进行反应。

以60mM，将含有N末端活化的酯的框架溶解在6.25ml无水DMSO中，随后加入2ml(过量)三乙胺(TEA)。在室温快速搅拌该溶液10分钟。平行地，在适当体积的无水DMSO中，制备448mM配体溶液。溶解后，在10分钟时间段内，逐滴加入足够的配体溶液，以提供等于（框架上活化的酯基团的数目N减去1）*1.5的反应当量数。例如，如果框架上存在N=3个活化的酯基团，则加入(1.5x(3-1)x60mM/448mM)x6.25ml=2.5ml配体溶液。如果框架上存在N=4个活化的酯基团，则加入(1.5x(4-1)x60mM/448mM)x6.25ml=3.8ml配体溶液，以此类推。加入配体溶液后，将该溶液在室温搅拌1小时。

然后以17.2mM，单独地将携带胺的药物溶解在2.67ml0.1M、pH11碳酸钠缓冲液中，随后用1.0N氢氧化钠，将pH调至10.8。溶解后，在75分钟时间段内，向药物/碳酸盐缓冲溶液中逐滴加入整个框架/DMSO/配体/TEA溶液。在加入过程中，在必要时，使用稀HCl或NaOH，每5分钟将得到的混合物的pH调至10.8。在滴加以后，将溶液搅拌另外15分钟，以确保完全反应。

然后在含有0.150MNaCl的20mMpH5.0HEPES缓冲的盐水溶液中，将得到的溶液超稀释10倍，随后用稀HCl调节pH至最终的pH8.0。首先使用适当的固相，通过尺寸排阻，纯化水溶液，用于希望的缀合的和未缀合的物质的分离。然后使用适当尺寸的超滤膜，将穿过柱空体积的溶液浓缩至大约40ml。使用制备反相HPLC（在WatersSymmetryPrepC18、7um、19x150mm柱上），进一步纯化该溶液，以得到希望的产物。缓冲液A是含有0.1%TFA的去离子水，缓冲液B是含有0.1%TFA的乙腈。在纯化之前，使用WatersDeltraPrep600系统，在15ml/分钟，用80%A/20%B流动相平衡柱。在2分钟时间段内，以15ml/分钟的流速，将大约5ml粗产物溶液注射到柱上，然后在接下来的5分钟内采用80%A/20%B至75%A/25%B的线性梯度，继之以在接下来的22分钟内75%A/25%B至62%A/38%B的更慢的线性梯度。目标峰的保留时间随使用的药物、框架和配体而异。收集后，旋转蒸发该溶液以去除乙腈，并低压冻干以得到纯的缀合物，其身份可以通过LC-MS(HTLaboratories,SanDiego,CA)予以证实。

实施例21–在水性溶剂中从未保护的胰岛素合成的B29-AEM-2-胰岛素缀合物

本实施例利用下述事实，即在未保护的胰岛素中，Lys-B29ε-氨基部分是最有反应性的胺，其次是A1，然后是B1。因此，当使用未保护的胰岛素作为含有胺的药物时，得到的缀合物应当主要在Lys-B29位置被取代。使用在实施例20中所述的方法和和重组人胰岛素(分子量=5808,SigmaAldrich,St.Louis,MO)作为含有胺的药物，使用购自MolecularBiosciences(Boulder,CO)的TSAT-C6活化的酯框架，制备AEM-2胰岛素缀合物。如前所述，合成用作胰岛素类似物的AEM。适当尺寸的尺寸排阻介质是BiogelP2(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)，适当尺寸的超滤膜分子量截止值是3kD。发现终产物(通过HPLC测得，95%纯度)具有希望的分子量6729g/mol(LC-MS)，这代表每个胰岛素缀合了共2.0个AEM分子，大于85%的缀合物分子缀合在Lys-B29位点(N-端测序)。

实施例22–使用含有醛的框架泛在地缀合胺-官能化的药物

a.用超过一个配体和一个末端醛官能化的框架

首先，以60mM，将含有N末端活化的酯的框架溶解在27.0ml无水DMSO中，随后加入800ul(过量)三乙胺(TEA)。将该溶液在室温快速地搅拌10分钟。在580mM，在5ml无水DMSO中，制备携带胺的二乙基缩醛的储备溶液。溶解后，在5分钟的时间段内，将2.9ml二乙基缩醛溶液逐滴加入到框架/DMSO/TEA溶液中，随后在室温混合另外15分钟。然后以下述方式，使剩余的活化的酯与胺-官能化的配体反应。在适当体积的无水DMSO中，制备370mM配体溶液。溶解后，加入足够的溶液，以提供等于（最初的活化的酯基团的数目N-1）的1.5倍的反应当量数。例如，如果每个框架上存在N=3个最初活化的酯基团，则加入(1.5x(3-1)x60mMx27/370mM)=13ml配体溶液。如果每个框架上存在N=4个最初活化的酯基团，则加入(1.5x(4-1)x60mMx27/370mM)=20ml配体溶液，以此类推。加入配体溶液后，将该溶液在室温搅拌另外1小时45分钟，以确保完全反应。反应后，用二乙醚稀释整个溶液10倍，剧烈混合，并离心，以从上清液分离含有希望的物质的稠密的底相。抛弃上清液后，加入相同体积的乙醇，以制备固体沉淀物。离心并抛弃上清液以后，用乙醇和醚充分洗涤该物质，然后在真空下干燥，以得到含有多个配体和1个二乙基缩醛基团的粗产物框架。

b.胺-官能化的药物与末端醛缀合

干燥后，通过在60ml去离子水中溶解收集的物质，将溶液pH调至1.0，从二乙基缩醛产生醛基。将该溶液混合30分钟，然后加入6ml含有1.5MNaCl的200mMHEPESpH8.2缓冲液，并使用稀NaOH溶液，将溶液pH调至6.5。将48mmol含有胺的药物加入该溶液中，并在必要时，将pH重新调至6.5。如下单独地制备还原剂的储备溶液：将1.5g氰基硼氢化钠(SigmaAldrich,St.Louis,MO)溶解在15ml含有0.150MNaCl的20mMHEPESpH7.0缓冲液中，并用稀HCl溶液小心地调节pH至6.5。将13ml氰基硼氢化物储备溶液加入药物/框架/醛溶液中，并在室温反应过夜。

首先使用适当的固相，通过尺寸排阻，纯化得到的水溶液，用于希望的缀合的和未缀合的物质的分离。然后使用适当尺寸的超滤膜，将穿过柱空体积的溶液浓缩至大约10ml。使用制备反相HPLC（在WatersSymmetryPrepC18,7um柱,19x150mm上），进一步纯化该溶液，以得到希望的产物。缓冲液A是含有0.1%TFA的去离子水，缓冲液B是含有0.1%TFA的乙腈。在纯化之前，使用WatersDeltraPrep600系统，以15ml/分钟，用80%A/20%B流动相平衡柱。在2分钟时间段内，以15ml/分钟的流速，将大约5ml粗产物溶液注射到柱上，然后在接下来的5分钟内采用80%A/20%B至75%A/25%B的线性梯度，继之以在接下来的22分钟内75%A/25%B至62%A/38%B的更慢的线性梯度。目标峰的保留时间随使用的药物、框架和配体而异。收集后，旋转蒸发该溶液以去除乙腈，并低压冻干以得到纯的缀合物，其身份可以通过LC-MS(HTLaboratories,SanDiego,CA)予以证实。

实施例23–含有末端反应性的醛基的AEM-2-框架和随后在B1处进行胰岛素缀合

a.用2个AEM和1个氨基丁醛二乙基缩醛(ABDA)官能化的TSAT

根据在实施例22a中描述的方法，使用TSAT(MolecularBiosciences,Boulder,CO)作为多价活化的酯框架，并使用4-氨基丁醛二乙基缩醛(SigmaAldrich,St.Louis,MO)作为携带胺的二乙基缩醛，合成该物质。如以前所述合成的AEM(分子量=223g/mol)用作配体。

b.使TSAT-AEM-2-ABDA与NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素缀合

使用在实施例22b中描述的方法、在上面(a)中生产的TSAT-AEM-2-ABDA、以及根据实施例8合成的携带胺的药物NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素(分子量=6,008g/mol)，合成该物质。适当尺寸的尺寸排阻介质是BiogelP2(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)，适当尺寸的超滤膜分子量截止值是3kD。因为开始的NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素物质仅具有1个在Phe-B1末端处的游离胺基，Phe-B1是胰岛素与框架缀合的唯一位点。如下去除BOC保护基：将冻干粉在4℃溶解在90%TFA/10%苯甲醚中1小时，然后在含有0.150MNaCl的25mMHEPESpH8.2缓冲液中10倍超稀释。使用NaOH溶液，将pH调至7.0-8.0，然后使物质穿过BiogelP2柱，以去除苯甲醚、BOC和去保护的其它低分子量副产物以及任意其它污染盐。然后使用Amicon3K膜(Millipore,Billerica,MA)，浓缩去保护的、纯化的缀合物水溶液至希望的水平，并在4℃储存备用。

发现终产物(通过HPLC测得，95%纯度)具有希望的分子量6462g/mol(LC-MS)，这代表每个胰岛素缀合了共2.0个AEM分子，其中99%缀合在Phe-B1位点处(N-端测序)。

实施例24–含有末端反应性的醛基的AEM-3-框架和随后在B1处进行胰岛素缀合

a.用3个AEM和1个氨基丁醛二乙基缩醛(ABDA)官能化的TSPE

根据在实施例22a中描述的方法，使用TSPE(MolecularBiosciences,Boulder,CO)作为多价活化的酯框架，并使用4-氨基丁醛二乙基缩醛(SigmaAldrich,St.Louis,MO)作为携带胺的二乙基缩醛，合成该物质。如以前所述合成的AEM(分子量=223g/mol)用作配体。

b.使TSPE-AEM-3-ABDA与NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素缀合

使用在实施例22b中描述的方法、在上面(a)中生产的TSPE-AEM-3-ABDA、以及根据实施例8合成的携带胺的药物NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素(分子量=6,008g/mol)，合成该物质。适当尺寸的尺寸排阻介质是BiogelP2(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)，适当尺寸的超滤膜分子量截止值是3kD。因为开始的NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素物质仅具有1个在Phe-B1末端处的游离胺基，Phe-B1是胰岛素与框架缀合的唯一位点。如下去除BOC保护基：将冻干粉在4℃溶解在90%TFA/10%苯甲醚中1小时，然后在含有0.150MNaCl的25mMHEPESpH8.2缓冲液中10倍超稀释。使用NaOH溶液，将pH调至7.0-8.0，然后使物质穿过BiogelP2柱，以去除苯甲醚、BOC和去保护的其它低分子量副产物以及任意其它污染盐。然后使用Amicon3K膜(Millipore,Billerica,MA)，浓缩去保护的、纯化的缀合物水溶液至希望的水平，并在4℃储存备用。

发现终产物(通过HPLC测得，95%纯度)具有希望的分子量6897g/mol(LC-MS)，这代表每个胰岛素缀合了共3.0个AEM分子，其中99%缀合在Phe-B1位点处(N-端测序)。

实施例25–含有末端反应性的醛基的AEM-3-框架和随后使用未保护的胰岛素在B1处进行胰岛素缀合

a.用3个AEM和1个氨基丁醛二乙基缩醛(ABDA)官能化的TSPE

b.使TSPE-AEM-3-ABDA与NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素缀合

使用在实施例22b中描述的方法、在上面(a)中生产的TSPE-AEM-3-ABDA、以及携带胺的药物未修饰的胰岛素(分子量=5,808g/mol,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)，合成该物质。适当尺寸的尺寸排阻介质是BiogelP2(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)，适当尺寸的超滤膜分子量截止值是3kD。尽管起始的未保护的胰岛素物质具有3个游离胺基，Phe-B1是胰岛素与支架缀合的优势位点，这是由于下述事实，即Phe-B1(pKa~6.8)在pH6.5时是最有反应性的胺。将冻干粉溶解于含有0.150MNaCl的25mMHEPESpH8.2缓冲液中。使用NaOH溶液，将pH调至7.0-8.0，然后使用Amicon3K膜(Millipore,Billerica,MA)，将物质浓缩至希望的水平，并在4℃储存备用。

发现终产物(通过HPLC测得，95%纯度)具有希望的分子量6897g/mol(LC-MS)，这代表每个胰岛素缀合了共3.0个AEM分子，其中>85%缀合在Phe-B1位点处(N-端测序)。

实施例26–混合的框架化学和对应的药物和配体的分别缀合

琥珀酰亚胺基-3,5-二马来酰亚胺基苯基苯甲酸酯(SDMB)可以购自MolecularBiosciences(Boulder,CO)，并不经进一步纯化地用于下述实施例中。将SDMB以60mM溶解于1.0ml无水DMSO中，随后加入400ul(过量)三乙胺(TEA)。将该溶液在室温快速地搅拌10分钟。然后将携带胺的药物单独地溶解于7.5ml无水DMSO中，浓度为8.1mM。溶解后，在10分钟的时间段内，将整个SDMB溶液逐滴加入到DMSO-药物溶液中，随后在室温混合另外2小时，以确保完全反应。

然后在含有0.150MNaCl的20mMpH5.0HEPES缓冲盐水溶液中，将得到的溶液超稀释10倍，随后用稀HCl调节pH至最终的pH8.0。首先使用适当的固相，通过尺寸排阻，纯化水溶液，用于希望的缀合的和未缀合的物质的分离。然后使用适当尺寸的超滤膜，将穿过柱空体积的溶液浓缩至大约10ml。

单独地，将6.0mmol含有胺的配体溶解于含有0.150MNaCl的20mMpH8.2HEPES缓冲盐水溶液中，浓度为450mM。向该溶液中，加入6.6mmol亚氨基硫醇烷(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)，并在pH8.2在室温反应30分钟，以将胺-端基团转化成末端巯基。将得到的物质与10ml在前述步骤中制备的药物-框架-二-马来酰亚胺缀合物溶液相混合。使马来酰亚胺基与指示剂-类似物巯基在pH8.2反应2小时，以确保完全反应。然后使用适当的固相，通过尺寸排阻，纯化得到的溶液，用于希望的缀合的和未缀合的物质的分离。然后使用适当尺寸的超滤膜，将穿过柱空体积的溶液浓缩至大约10ml。

最后，使用制备反相HPLC（在WatersSymmetryPrepC18,7um柱,19x150mm上），进一步纯化该溶液，以得到希望的产物。缓冲液A是含有0.1%TFA的去离子水，缓冲液B是含有0.1%TFA的乙腈。在纯化之前，使用WatersDeltraPrep600系统，以15ml/分钟，用80%A/20%B流动相平衡柱。在2分钟时间段内，以15ml/分钟的流速，将大约5ml粗产物溶液注射到柱上，然后在接下来的5分钟内采用80%A/20%B至75%A/25%B的线性梯度，继之以在接下来的22分钟内75%A/25%B至62%A/38%B的更慢的线性梯度。目标峰的保留时间随使用的药物、框架和配体而异。收集后，旋转蒸发该溶液以去除乙腈，并低压冻干以得到纯的缀合物，其身份可以通过LC-MS(HTLaboratories,SanDiego,CA)予以证实。

实施例27–使用混合的框架化学将胰岛素缀合到氨基乙基糖上

使用在实施例26中描述的方法和根据实施例8合成的携带胺的药物NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素(分子量=6,008g/mol)，得到下述的具体的药物缀合物。如以前所述，合成AEM(分子量=223g/mol)、AEBM(分子量=385g/mol)和AETM(分子量=547g/mol)，并在合成中用作配体。适当尺寸的尺寸排阻介质是BiogelP2(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)，适当尺寸的超滤膜分子量截止是3kD。

在所有情况下，如下去除BOC保护基：将根据实施例26得到的冻干粉在4℃溶解在90%TFA/10%苯甲醚中1小时，然后在含有0.150MNaCl的25mMHEPESpH8.2缓冲液中10倍超稀释。使用NaOH溶液，将pH调节至7.0-8.0，然后使物质穿过BiogelP2柱，以去除苯甲醚、BOC和去保护的其它低分子量副产物以及任意其它污染盐。然后，使用Amicon3K膜(Millipore,Billerica,MA)，浓缩去保护的、纯化的缀合物水溶液至大约58U胰岛素/ml(基于A280测量)，并在4℃储存备用。因为开始的NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素物质仅具有1个在Phe-B1末端处的游离胺基，Phe-B1是胰岛素与框架缀合的唯一位点。这可以通过对每种去保护的终产物进行N-端测序来证实。

实施例28–用于使药物与互补框架缀合的泛在点击化学

将含有至少1个氨基官能团和一个或多个末端炔烃基团的框架(8.3mmol)放入THF(40mL)、水(40mL)中，并搅拌成溶液。加入携带叠氮基乙基的药物(10.51mmol)，随后加入硫酸铜(500mg,2.0mmol)和抗坏血酸钠(400mg,2.0mmol)。将得到的混合物在55-60℃(油浴)搅拌6小时，冷却至室温，搅拌过夜，并在真空下浓缩至一半体积，并通过微玻璃过滤器过滤。将滤液装载上树脂柱(Dowex50w50x4-100)，并用水(6x75mL)洗脱至中性。然后用15%氢氧化铵(10x75mL)洗脱柱，合并茚三酮阳性的级分，并浓缩成玻璃状泡沫。

实施例29–使用来自诸如牛和猪等其它物种的天然胰岛素制备的缀合物

使用用于缀合人胰岛素的任意方法，可以偶联来自其它物种的含有至少1个反应性胺官能团的胰岛素(例如，牛和猪胰岛素)。本领域技术人员会理解，从牛或猪胰岛素制成的目标缀合物的分子量与从人胰岛素制成的那些相差在下表中列出的量。

本领域技术人员还理解：从牛或猪胰岛素制成的目标缀合物的色谱峰保留时间可能稍微不同于从人胰岛素制成的那些缀合物，这是由于胰岛素之间结构的较小差异。

实施例30–用诸如赖脯胰岛素、门冬胰岛素、谷赖胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素等胰岛素类似物制备的缀合物

使用用于缀合人胰岛素的任意方法，可以偶联含有至少1个反应性胺官能团的所有已知的胰岛素类似物(例如，赖脯胰岛素、门冬胰岛素、谷赖胰岛素、甘精胰岛素和地特胰岛素)。本领域技术人员会理解：从胰岛素类似物制成的目标缀合物的分子量与从人胰岛素制成的那些相差在下表中列出的量。

本领域技术人员还理解：从胰岛素类似物制成的目标缀合物的色谱峰保留时间可能稍微不同于从人胰岛素制成的那些缀合物，这是由于胰岛素之间结构的较小差异。

当使用未保护的谷赖胰岛素时，谷赖胰岛素(其不含有B29赖氨酸，但是含有B3赖氨酸)的使用会主要产生B3缀合物。但是，如果需要B1-谷赖胰岛素缀合物，则首先使用与实施例8所述的BOC-(A1,B29)-人胰岛素相同的方法，合成BOC-(A1,B3)-谷赖胰岛素。

实施例31–使用肽胰岛素促分泌剂缀合物制备的缀合物

使用用于缀合胰岛素的方法中的任一种，可以偶联含有N-端胺官能团的肽胰岛素促分泌剂(例如，但不限于GLP-1或GLP-1类似物依泽那肽)。

II.示例性缀合物的体外试验

该第二组实施例描述了研究某些示例性缀合物的体外性质的不同实验。

实施例32–胰岛素-糖原缀合物的合成

该比较实施例描述了根据美国专利申请公开号20070099820的胰岛素-糖原缀合物的合成。简而言之，将1克可商业得到的、未纯化的牡蛎糖原(II型,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)溶解于去离子水中，浓度为10mg/ml。将固体CNBr加入得到的溶液中，CNBr与糖原的质量比为0.68，并使用3N氢氧化钠(NaOH)溶液，使pH维持恒定在10.7±0.2。搅拌15分钟后，加入另一份等质量的固体CNBr，并使pH维持恒定在10.7±0.2，同时搅拌45分钟。然后将胰岛素加入该溶液中，胰岛素与糖原的质量比为0.60，并使用固体碳酸氢钠，将pH调节至9.15。将该溶液搅拌过夜，使用50kDaMWCO聚醚砜圆盘膜过滤器(Millipore,Bedford,MA)，在去离子水中彻底超滤，并低压冻干。然后通过凝胶过滤HPLC(Waters,Milford,MA)，在Superdex^TM30HiLoad16/60(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)填充的柱上使用1M醋酸流动相，从未缀合的胰岛素纯化得到的粉末。然后低压冻干胰岛素糖原级分，得到缀合物，为纯的白色粉末。得到的纯化的物质含有1.0wt%的胰岛素/胰岛素-糖原缀合物，这使用氨基酸分析(UCLABiopolymersLaboratory,LosAngeles,CA)测得。

实施例33–液相色谱法分析

本实施例描述了根据实施例32合成的胰岛素-糖原和根据本发明合成的示例性缀合物的RP-HPLC特性之间的差异。将100ul根据实施例32合成的胰岛素-糖原的5mg/ml溶液和100ul示例性缀合物的1mg/ml溶液分别注射到WatersSymmetryC85um柱(4.6mmx250mm)上，该柱用80%Water/20%乙腈(CH₃CN)流动相(各自含有0.1%TFA)平衡过。使用TSAT-C6（作为框架）、AEM（作为配体）和NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素（作为药物），合成在本研究中使用的示例性缀合物。

使用下述的梯度方法，在1.0ml/分钟，洗脱样品：0-5分钟–恒定80%Water/20%CH₃CN，5-35分钟–线性梯度至50%Water/50%CH₃CN。图1中的洗脱特性显示示例性缀合物的单个波峰，其指示相对于胰岛素-糖原缀合物的宽的且异源的洗脱特性而言单个化学不同的物质，这指示不同的化学和/或分子量实体的宽广分布。

实施例34–分子量分布分析

本实施例描述了根据实施例32合成的胰岛素-糖原和相同的示例性缀合物之间的分子量和分子量分布的差异。如下测定胰岛素-糖原缀合物的分子量和分子量分布：将1ml在pH7HEPES缓冲盐水中的25mg/ml溶液注射到用HEPES缓冲盐水平衡过的Ultrahydrogel尺寸排阻柱(WatersCorporation,Millford,MA)上。在0.5ml/min，在30分钟的时间段内，洗脱柱，并测量洗脱特性，作为在280nm的吸光度。在使用相同方法的单独实验中，注射1000、5000、12000、25000、50000、80000、150000、270000和410000g/mol的葡聚糖分子量标准品(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)，以建立分子量相对于保留时间的校准曲线。基于胰岛素-糖原缀合物的校准曲线和洗脱特性，测得平均分子量是500,000g/mol，分布中的67%在250,000至1,000,000g/mol的宽范围内洗脱(数据未显示)。相反，测得示例性缀合物仅具有精确在6,730g/mol的单个分子量，这通过LC/MS(HTLaboratories,SanDiego,CA)测得(数据未显示)。

实施例35–缀合物的化学和物理稳定性

本实施例根据在Hinds等人(Bioconj.Chem.11:195-201,2000)中描述的方法，在37℃和150击打/min的机械搅拌速率，对比了示例性缀合物和未缀合的胰岛素在加速条件下的稳定性。选择药用级重组人胰岛素(RHI)，作为加速的稳定性研究的对照。Holcombe等人(DiabetesCare27:1241-1242,2004)描述了，在非加速条件下，RHI稳定性在室温(RT)维持至少30天，且当冷藏时，显著延长。图2显示了RHI和2种示例性缀合物在pH7.4磷酸盐缓冲盐水(PBS)中在50U/ml的聚集稳定性试验的结果。在所有情况下，如下测定在溶液中的剩余百分比：在给定的时间点离心(4500xg,5min)溶液，测量上清液的A280，将上清液A280除以原始起始溶液的A280。使用TSAT-C6（作为框架）、AEM（作为配体）和NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素（作为药物），合成缀合物I-1(参见图45)。使用TSPE（作为框架）、AEM（作为配体）和NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素（作为药物），合成缀合物I-16(参见图45)。

在37℃连续搅拌48小时后，小于6%的RHI在溶液中保持稳定，而大部分RHI沉淀出来，成为不溶的聚集体。在相同的时间段以后，两种缀合物保持基本上更稳定，因为96%-99%的缀合物在PBS溶液中保持完整且可溶。数据确定地证实，在这些条件下，所述缀合物比RHI明显更稳定。

使用RP-HPLC来评估缀合物的化学稳定性(参见图3a)。在48小时的加速稳定性以后，使用C8-反相柱，使用水-乙腈洗脱梯度，分析缀合物溶液。与在得到的液相色谱痕迹中发现的未缀合的(游离的)胰岛素和脱酰氨基胰岛素的百分比一起，显示了前-和后-稳定性缀合物样品的保留时间。没有观察到可检测量的游离胰岛素或脱酰氨基胰岛素，表明：(i)糖和胰岛素分子之间的共价键是稳定的，和(ii)在加速稳定性实验(AST)期间，没有发生缀合物的显著的化学降解。在AST之前和与AST平行地，还对缀合物进行90-天非加速稳定性实验，其包括每天在4℃和室温之间的热循环。在平行研究结束时，RP-HPLC证实，缀合物仍然是化学上和物理上稳定的(数据未显示)。

在对缀合物进行AST之前和之后得到的LC-MS数据，进一步证实了缀合物在HEPES缓冲液中的化学稳定性。令人感兴趣地，在PBS中48小时的AST缀合物样品证实，已经发生实质的降解，而在HEPES缓冲液中48小时的AST缀合物样品是十分完整的和稳定的(参见图3b)。在AST之前和之后，在HEPES中储存的缀合物I-7具有6730Da的分子量，表明两个甘露糖残基、缀合物框架和胰岛素都没有发生化学变化，且是非常稳定的。为了确保缀合物稳定性，用于储存、体外测试和体内测试的所有缓冲液都含有HEPES作为缓冲剂。在某些实施方案中，本公开内容提供了一种组合物，其包含在HEPES缓冲液中的本发明的缀合物。

LC-MS数据极大地增强了美国食品药品管理局（FDA）生产管理顺应性，因为LC-MS实验可以容易地用作缀合物的化学身份试验。由于药物(例如，胰岛素)、缀合物框架和缀合物都具有不同的分子量，可以如下容易地计算得到的配体比例：从缀合物分子量减去缀合物框架分子量，得到归因于糖基团的剩余质量。在缀合物I-7的情况下，准确地计算甘露糖:胰岛素摩尔比为2.0。

实施例36–缀合物的功能稳定性

在证实了缀合物是化学上和物理上稳定的以后，使用Sprague-Dawley大鼠，在5U/kg，相对于新鲜的缀合物，在体内测试72小时AST缀合物的皮下生物活性(参见图4)。

72小时HEPESAST缀合物数据的分析证实，达到葡萄糖最低值所需的时间(T_最低值)是60分钟，恢复禁食血糖值的70%所需的时间(T_70%BG)是小于128+15min。在每个时点，使用studentt-检验(n=4，对于每个组)，对比新鲜的缀合物和72小时AST缀合物生物活性曲线，证实没有显著差异(都p-值>0.21)。这些结果是在制剂的指定靶标内，指示保存的缀合物化学稳定性翻译成保存的体内功能性能。

III.示例性缀合物的体内试验

该第三组实施例描述了研究某些示例性缀合物的体内性质的不同实验。

实施例37–缀合物生物活性相对于RHI和葡聚糖或糖原缀合物

(a)胰岛素-葡聚糖生物活性

该比较实施例评价了皮下施用的胰岛素-葡聚糖(Sigma-Aldrich,分子量~70K)的体内药效动力学特性。如下面证实的，根据美国专利公开号20040202719合成的胰岛素-葡聚糖缀合物在皮下注射以后相对缓慢地起作用，因为缀合物聚合物的高分子量会显著阻碍进入体循环中的吸收速率。使用修饰的溴化氰(CNBr)偶联反应，合成胰岛素-葡聚糖。简而言之，将500mg葡聚糖(分子量=70K,Sigma-Aldrich)溶解于50ml去离子水中。将56mg固体CNBr加入得到的溶液中，并使用5NNaOH溶液，将pH维持在10.7±0.2。搅拌15min后，加入另外56mg固体CNBr，并将pH维持在10.7±0.2，同时搅拌45分钟。然后将300mg重组人胰岛素(RHI)加入该溶液中，并使用固体碳酸氢钠，将pH调至9.15。将该溶液搅拌过夜，使用10KMWCO聚醚砜圆盘膜过滤器(Millipore,Bedford,MA)，在去离子水中彻底超滤，并低压冻干。然后通过高效液相色谱法(Waters,Milford,MA)，在Superdex^TM75填充的柱(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)上，使用1M醋酸流动相，从未缀合的胰岛素纯化得到的粉末。然后低压冻干胰岛素-葡聚糖级分，得到缀合物，为纯的粉末。通过氨基酸分析(UCLABiopolymersLaboratory,LosAngeles,CA)，测得胰岛素缀合程度是10%(w/w)。

使用0.25ml灭菌的1xPBS溶液(20U当量胰岛素/ml)，将胰岛素-葡聚糖皮下注射在禁食的正常非糖尿病大鼠(雄性Sprague-Dawley,200-250g,n=4)的颈后。通过尾静脉抽血，在-15和0分钟和在注射后15、30、45、60、90、120、180、240、300和360分钟，收集血样。使用可商业得到的测试条(PrecisionXtra,AbbottLaboratories,AbbottPark,IL)，测量血糖值。如图5所示，发现达到葡萄糖最低浓度所需的时间(T_最低值)是注射后约3小时，且血清葡萄糖水平在注射后保持降低至少5小时。

(b)胰岛素-糖原生物活性

本实施例评价了皮下施用的胰岛素-糖原的体内药效动力学特性。根据实施例32，合成胰岛素-糖原缀合物。通过将2.5当量U胰岛素/kg剂量注射在禁食的正常非糖尿病大鼠(雄性Sprague-Dawley,200-250g,n=4)的颈后，评价胰岛素-糖原缀合物的生物活性。通过尾静脉抽血，在-15和0分钟和在注射后15、30、45、60、90、120、180、240、300和360分钟，收集血样。使用可商业得到的测试条(PrecisionXtra,AbbottLaboratories,AbbottPark,IL)，测量血糖值。与上面的胰岛素-葡聚糖缀合物相比，高分子量胰岛素-糖原缀合物远远更快速地降低葡萄糖水平，且达到更大的程度(参见图6)。该快速的作用和消除特性是由于高分子量糖原聚合物链在皮下注射以后的快速酶消化。

(c)一种示例性缀合物和RHI生物活性

本实施例评价和对比了皮下施用的示例性缀合物和重组人胰岛素(RHI)的体内药效动力学特性。使用TSAT-C6（作为支架）、AEM（作为指示剂类似物）和NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素（作为药物），合成示例性缀合物（图45中的I-1）。在每种情况下，在3.5U/kg，将缀合物或RHI注射在禁食的正常非糖尿病大鼠(雄性Sprague-Dawley,400-500g,n=6)的颈后。通过尾静脉抽血，在0分钟和注射后30、60、90、120、150、180、210、240和300分钟，收集血样。使用可商业得到的测试条(PrecisionXtra,AbbottLaboratories,AbbottPark,IL)，测量血糖值。如图7所示，RHI和示例性缀合物的葡萄糖抑制特性几乎相同，尽管示例性缀合物不能在体内酶促地被消化。缀合物的该快速的作用和消除特性最可能是由于下述事实，即缀合物仅比RHI大14%，使得增加的分子量在药效动力学性质方面的任何作用几乎可以忽略。

实施例38–与RHI的PK对比

本实施例描述和对比了用皮下施用的示例性缀合物和重组人胰岛素(RHI)得到的血清胰岛素特性。使用TSAT-C6（作为框架）、AEM（作为配体）和NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素（作为药物），合成示例性缀合物（图45中的I-1）。在每种情况下，在3.5U/kg，将缀合物或RHI注射在禁食的正常非糖尿病大鼠(雄性Sprague-Dawley,400-500g,n=6)的颈后。通过尾静脉抽血，在0分钟和注射后30、60、90、120、150、180、210、240和300分钟，收集血样。在4℃离心来自每个时点的血液，以收集血清。随后使用可商业得到的ELISA试剂盒(人胰岛素ELISA,Mercodia,Uppsala,Sweden)，测量血清胰岛素浓度。从图8可以看出，缀合物的药代动力学特性与RHI在统计上难以区分，证实了该缀合物在皮下注射后，被迅速吸收到血清中，并迅速从血清消除。

实施例39–AEM-2-TSAT-C6-胰岛素缀合物的B29-取代形式的PK和生物活性

本实施例描述了皮下施用的示例性缀合物所得到的血清胰岛素和血糖抑制特性。使用TSAT-C6（作为框架）、AEM（作为配体）和重组人胰岛素（作为药物），合成示例性缀合物（图45中的I-7）（用于生产B29-取代的缀合物，替代实施例37和38中的B1-取代的缀合物）。在该情况下，以5U/kg，将缀合物注射在禁食的正常非糖尿病大鼠(雄性Sprague-Dawley,400-500g,n=3)的颈后。在0分钟和注射后30、60、90、120、150、180、210、240和300分钟，通过尾静脉抽血，收集血样。使用可商业得到的测试条(PrecisionXtra,AbbottLaboratories,AbbottPark,IL)，测量血糖值。另外，在4℃离心来自每个时间点的血液，以收集血清。随后使用可商业得到的ELISA试剂盒(人胰岛素ELISA,Mercodia,Uppsala,Sweden)，测量血清胰岛素浓度。从图9可以看出，B29-取代的缀合物的药代动力学特性与RHI以及来自实施例38的B1-取代的缀合物在统计上难以区分，表明该缀合物也在皮下注射后，被迅速吸收到血清中，并迅速从血清中消除。

实施例40–与赖脯胰岛素的PK和生物活性对比

本实施例对比了用皮下施用的示例性缀合物和赖脯胰岛素得到的血清胰岛素和血糖特性。赖脯胰岛素(HUMALOG?)是一种速效胰岛素类似物，其中在B-链的C-端末端上的倒数第二位的赖氨酸和脯氨酸残基已经反转。该修饰会阻断胰岛素多聚体的形成。为了对比，也提供了来自可溶的重组人胰岛素(RHI)的数据(参见实施例38和图8)。

使用TSAT-C6（作为框架）、AEM（作为配体）和NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素（作为药物），合成了示例性缀合物（图45中的I-1）。在每种情况下，在3.5U/kg，将缀合物或赖脯胰岛素注射在禁食的正常非糖尿病大鼠(雄性Sprague-Dawley,400-500克,n=6)的颈后。通过尾静脉抽血，在0分钟和注射后30、60、90、120、150、180、210、240和300分钟，收集血样。使用可商业得到的测试条(PrecisionXtra,AbbottLaboratories,AbbottPark,IL)，测量血糖值。另外，在4℃离心来自每个时点的血液，以收集血清。随后使用可商业得到的ELISA试剂盒(人胰岛素ELISA,Mercodia,Uppsala,Sweden)，测量血清胰岛素浓度。从图12可以看出，缀合物的药代动力学特性与赖脯胰岛素在统计上难以区分。

实施例41–配体对生物活性的影响

本实施例对比了用一系列皮下施用的示例性缀合物得到的血糖特性。使用TSAT-C6（作为框架）和NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素（作为药物），合成示例性缀合物。配体组成随缀合物而变化，以覆盖一定范围的亲和力：AEM-2、AEBM-2、AETM-1-AEBM-1和AETM-2(从最低至最高亲和力)。在图45中，将胰岛素缀合物显示为I-1、I-2、I-3和I-4。在每种情况下，在5U/kg(对于AEM-2，3.5U/kg)，将缀合物注射在禁食的正常非糖尿病大鼠(雄性Sprague-Dawley,400-500克,n=6)的颈后。通过尾静脉抽血，在0分钟和注射后30、60、90、120、150、180、210、240和300分钟，收集血样。使用可商业得到的测试条(PrecisionXtra,AbbottLaboratories,AbbottPark,IL)，测量血糖值。另外，在4℃离心来自每个时点的血液，以收集血清。随后使用可商业得到的ELISA试剂盒(人胰岛素ELISA,Mercodia,Uppsala,Sweden)，测量血清胰岛素浓度。

从图13可以看出，随着配体的亲和力增加，葡萄糖降低效应降低。该数据提供了配体的性质可以影响缀合物的生物活性的第一个指征。图14-16显示了测试的4种缀合物中的每一种的血糖水平以及血清胰岛素水平。这些结果非常清楚地证实，具有更高配体亲和力的缀合物的降低的葡萄糖响应源自缀合物的降低的PK特性(对于图14的AEM-2和图17的AETM-2)。

实施例42–外源性抑制剂对PK和生物活性的影响

考虑到在实施例41中描述的数据，我们假设，使用具有更高配体亲和力的缀合物观察到的减少的PK特性和生物活性可能源自与内源性糖结合分子的更强结合。例如，不希望限于任何特定理论，我们假设，与内源性“凝集素-样”蛋白（诸如表面活性蛋白A和D或选择蛋白家族的成员）的结合可能造成这些缀合物比具有更低配体亲和力的缀合物更快速地清除。

为了测试该假设，我们运行了一组实验，以测定外源性配体是否竞争与这些提出的内源性糖结合分子的结合，并从而在给药后增加缀合物的PK特性。在所有实验中，使用高亲和力AETM-2缀合物I-2。在每种情况下，将相同剂量的缀合物注射在禁食的正常非糖尿病大鼠(雄性Sprague-Dawley,400-500克,n=6)的颈后。延迟15分钟后，腹膜内地注射一定剂量的外源性配体。在0分钟和初次缀合物注射后30、60、90、120、150、180、210、240和300分钟，通过尾静脉抽血，收集血样。使用可商业得到的测试条(PrecisionXtra,AbbottLaboratories,AbbottPark,IL)，测量血糖值。另外，在4℃离心来自每个时点的血液，以收集血清。随后使用可商业得到的ELISA试剂盒(人胰岛素ELISA,Mercodia,Uppsala,Sweden)，测量血清胰岛素浓度。在15分钟后，通过注射盐水（替代外源性配体），进行对照。

图18显示了当施用α-甲基甘露糖时得到的结果。α-甲基甘露糖是非常高亲和力的糖，其能够与AETM竞争结合凝集素诸如ConA。如证实的，由注射α-甲基甘露糖产生的PK/PD特性的变化是非常显著的(p<0.05)。

图19是一个对照实验，其中使用可溶的重组人胰岛素(RHI)替代AETM-2缀合物，进行最初注射。如证实的，当注射α-甲基甘露糖时，没有产生PK/PD特性的变化(p>>0.05)。

已知内源性的结合甘露聚糖的凝集素(MBL)以下述相对亲和力结合糖：D-甘露糖、L-岩藻糖>D-葡萄糖、N-乙酰基-D-氨基葡萄糖>>D-半乳糖。因此，我们决定进行2个实验，对比L-岩藻糖(高亲和力配体)、D-葡萄糖(中间体亲和力配体)和D-半乳糖(低亲和力配体)对AETM-2缀合物的PK/PD特性的影响。在图20中，对比了使用L-岩藻糖的结果与使用α-甲基甘露糖得到的结果。如证实的，α-甲基甘露糖和L-岩藻糖似乎表现出相同类型的作用。在图21中，对比了使用D-葡萄糖和D-半乳糖的结果。与盐水相比，半乳糖没有表现出影响。葡萄糖似乎表现出较小作用；但是，这被下述事实复杂化，即来自缀合物的外源性胰岛素迅速地降低葡萄糖，所以没有发生使用α-甲基甘露糖和L-岩藻糖所观察到的持久作用。

实施例43–外源性抑制剂在局部注射部位处的影响

考虑到在实施例42中描述的数据，我们开始确定α-甲基甘露糖(a-MM)诱导的血清缀合物浓度和生物活性的增加是否是在皮下注射部位增加的吸收速率的结果。将高亲和力TSAT-C6-AETM-2缀合物I-2用于该实验。首先，使用含有1Ma-MM的缓冲盐水溶液或缓冲盐水溶液，将缀合物稀释至5U/ml(0.2mg/ml胰岛素当量)的浓度。在时间0，将每种溶液以5U/kg的剂量皮下注射进3只非糖尿病的、雄性SD大鼠各自的颈后，并在0分钟和在注射后15、30、45、60、90、120、150、180、240和300分钟，通过尾静脉抽血，收集血样。使用可商业得到的测试条(PrecisionXtra,AbbottLaboratories,AbbottPark,IL)，测量血糖值。另外，在4℃离心来自每个时点的血液，以收集血清。随后使用可商业得到的ELISA试剂盒(ISO胰岛素ELISA,Mercodia,Uppsala,Sweden)，测量血清胰岛素浓度。在该实验中，在15分钟后，接受a-MM缀合物溶液的大鼠也在单独的后肢（hindquarter）注射部位处接受缓冲盐水溶液皮下注射。在15分钟后，接受盐水缀合物溶液的大鼠也在单独的后肢注射部位处接受a-MM溶液皮下注射。这些15-分钟延迟注射用于确保使用缀合物溶液皮下注射的a-MM的量不会升高a-MM的全身浓度至高得足以引起在图18中表现出的a-MM诱导的作用的类型。

在图22中显示的结果表明，在实验误差内，通过有意地与缀合物共同注射高浓度的a-MM抑制剂，根本没有增强缀合物PK和生物活性特性。这些结果与下述假设相一致，即通过改变从注射部位进入体循环的吸收特性，外源糖不会作用于缀合物。

实施例44–在最初缀合物注射以后延迟外源性抑制剂注射的影响

基于图22的结果，a-MM-增强的PK和生物活性结果不能通过增加的注射部位吸收来解释，而必然是缀合物已经吸收以后发生的全身作用的结果。下述的2个假设可以解释这样的行为：(a)缀合物通过竞争糖可以破坏的凝集素依赖性的机理从体内消除，或(b)缀合物结合体内的凝集素，且仅在有竞争糖存在下会被释放进循环中。在(b)的情况下，可以预见到，在缀合物已经从皮下蓄池完全吸收以后将a-MM导入动物中，会造成吸收的缀合物从凝集素位点释放进体内，由此增加它的血清浓度和生物活性。但是，如果消除机制象在(a)中所述那样工作，则在缀合物已经从皮下蓄池完全吸收以后注射a-MM，不会造成血清浓度或生物活性的任何增加，因为缀合物已经从体内彻底消除。

为了测定可能的机制，将高亲和力TSAT-C6-AETM-2缀合物I-2以5U/kg注射在禁食的正常非糖尿病大鼠(雄性Sprague-Dawley,400-500克,n=3/组)的颈后。在4个不同的延迟时间(15分钟、60分钟、120分钟和240分钟)以后，腹膜内地注射4g/kg剂量的a-MM溶液。对于每个实验，在0分钟和在下述间隔，通过尾静脉抽血，收集血样：

使用可商业得到的测试条(PrecisionXtra,AbbottLaboratories,AbbottPark,IL)，测量血糖值。另外，在4℃离心来自每个时点的血液，以收集血清。随后使用可商业得到的ELISA试剂盒(ISO胰岛素ELISA,Mercodia,Uppsala,Sweden)，测量血清胰岛素浓度。

如图23所示，由腹膜内a-MM注射导致的血清缀合物浓度和生物活性的增加更少，且缀合物注射和腹膜内a-MM注射之间的延迟时间越长，更不普遍。例如，在240分钟后，没有观察到血清缀合物浓度的增加，指示在缀合物完全吸收以后，在体内不存在凝集素-结合的缀合物蓄池。这些结果与提出的机制(a)相一致，与提出的机制(b)不一致。应当理解，尽管我们假设，机制(a)可能负责使用本公开内容的缀合物所观察到的PK性质，本文提出的权利要求绝不限于特定作用机制。

实施例45–a-MM对PK和生物活性的影响随着配体亲和力而变化

考虑到在实施例42中描述的数据，我们开始确定使用不同的糖配体（相对于在实施例42中使用的AETM配体）合成的缀合物的药代动力学和药效动力学行为。在本实施例中，使用TSAT-C6框架，并根据在实施例20中所述的方法，合成下述缀合物(注：氨基葡萄糖-HCl或GA-HCl购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)，并不经进一步纯化而使用):

根据N-端测序,大约90%的每个含有糖的框架通过Lys-B29缀合到胰岛素上。TSAT-C6-AEM-2(B29)和TSAT-C6-GA-2(B29)在图2中分别显示为缀合物I-7和I-5。

对于在上表中描述的缀合物，重复在实施例42中描述的相同类型的实验。在每种情况下，将相同剂量的缀合物(5U/kg)注射在禁食的正常非糖尿病大鼠(雄性Sprague-Dawley,400-500克,n=3)的颈后。延迟15分钟后，腹膜内地注射4g/kg剂量的a-MM。在0分钟和初次缀合物注射后30、60、90、120、150、180、210、240和300分钟，通过尾静脉抽血，收集血样。使用可商业得到的测试条(PrecisionXtra,AbbottLaboratories,AbbottPark,IL)，测量血糖值。另外，在4℃离心来自每个时点的血液，以收集血清。随后使用可商业得到的ELISA试剂盒(ISO胰岛素ELISA,Mercodia,Uppsala,Sweden)，测量血清胰岛素浓度。在15分钟后，通过注射替代a-MM的盐水，制作对照。

图24和25显示了当腹膜内注射施用a-MM、并在15分钟后分别皮下注射I-7和I-5时得到的结果。如证实的，与盐水注射对照组相比，对于缀合物I-7而言，由注射a-MM导致的PK/PD特性的增加是非常显著的(p<0.05)。但是，a-MM-诱导的血清缀合物浓度的增加程度小于用来自实施例42的AETM-2缀合物所得到的程度。I-5缀合物特性不受a-MM注射的影响，正如在图19中用RHI得到的结果。总之，这些数据表明，两种甘露糖-衍生的缀合物(AEM-2和AETM-2)都表现出a-MM-增强的PK/PD特性，而更低亲和力-氨基葡萄糖衍生出的缀合物则不然。此外，更低亲和力的AEM-2缀合物的PK特性的相对变化小于用更高亲和力的AETM-2缀合物观察到的变化。

实施例46–a-MM对PK和生物活性的影响随着配体配价而变化

在本实施例中，我们开始确定已经共价连接了递增数量的示例性的糖配体的缀合物的药代动力学和药效动力学行为。根据在实施例20中所述的方法，使用下面指定的框架和糖配体，合成所有缀合物:

根据N-端测序,大约90%的每个含有糖的框架通过Lys-B29缀合到胰岛素上。缀合物在图45中显示为I-8、I-9、I-10和I-11。

对于在上表中描述的缀合物，重复在实施例45中所述的相同类型的实验。在每种情况下，将相同剂量的缀合物(5U/kg)注射在禁食的正常非糖尿病大鼠(雄性Sprague-Dawley,400-500克,n=3)的颈后。延迟15分钟后，腹膜内地注射4g/kg剂量的a-MM。在0分钟和初次缀合物注射后30、60、90、120、150、180、210、240和300分钟，通过尾静脉抽血，收集血样。使用可商业得到的测试条(PrecisionXtra,AbbottLaboratories,AbbottPark,IL)，测量血糖值。另外，在4℃离心来自每个时间点的血液，以收集血清。随后使用可商业得到的ELISA试剂盒(ISO胰岛素ELISA,Mercodia,Uppsala,Sweden)，测量血清胰岛素浓度。在15分钟后，通过注射替代a-MM的盐水，制作对照。

图26和27显示了当腹膜内注射施用a-MM、并在15分钟后分别皮下注射I-8和I-9时得到的结果。如证实的，与盐水注射对照组相比，对于I-9而言，由注射a-MM导致的PK/PD特性的增加是非常显著的(p<0.05)，对于I-8，则显著性更低。此外，I-9缀合物表现出与来自实施例42的I-2缀合物大致相同的a-MM-诱导的PK特性，它们二者都比从I-8得到的PK特性更显著得多。

图28和29显示了当腹膜内注射施用a-MM、并在15分钟后分别皮下注射I-10和I-11时得到的结果。如证实的，与盐水注射对照组相比，对于I-11而言，由注射a-MM导致的PK/PD特性的增加是非常显著的(p<0.05)，对于I-10，则显著性稍低。此外，I-11缀合物表现出与来自实施例42的I-2缀合物大致相同的a-MM-诱导的PK特性，它们二者都比从I-10得到的PK特性稍微更显著。

实施例47–体内半衰期/消除速率对比

在实施例44中得到的结果与示例性缀合物通过竞争糖的存在可以破坏的凝集素依赖性的机理从体内消除相一致。为了更详细地研究该机制，我们对示例性缀合物进行下述实验，以测定与未缀合的胰岛素相比，它们在体内从血清清除的速率。根据在实施例20中所述的一般方法，合成在本研究中使用的所有缀合物。

在每种情况下，在0.4mg缀合物/kg体重，将可溶的缀合物施用到双颈静脉插管的雄性Sprague-Dawley大鼠(Taconic,JV/JV,350-400g,n=3)中。通过1个颈静脉插管，静脉内地注射无菌的缀合物溶液或对照胰岛素，随后立即注射肝素-盐水追加液，以确保所有缀合物剂量都施用进动物中。第2个插管用于在t=0(给药前)和在给药后1、2、4、8、15、30、60、90、120和180分钟时收集血样。

使用可商业得到的测试条(PrecisionXtra,AbbottLaboratories,AbbottPark,IL)，测量血糖值。另外，在4℃离心来自每个时间点的血液，以收集血清。随后使用可商业得到的ELISA试剂盒(异胰岛素ELISA,Mercodia,Uppsala,Sweden)，测量血清胰岛素或血清缀合物浓度。

图30显示了RHI或TSAT-C6-AETM-2缀合物（在图45中显示为I-6）的血清浓度随着静脉内注射后的时间而变化。显然，与RHI相比，I-6更迅速地从血清中消除。使用具有下述通式的两隔室双指数模型，最佳地拟合数据：C(t)=A_oEXP(-at)+B_oEXP(-bt)，其中t是时间，C(t)是随着时间而变化的在血清中的浓度，A_o是第一隔室浓度常数，a是第一隔室指数时间常数，B_o是第二隔室浓度常数，且b是第二隔室指数时间常数。与每个隔室有关的消除半衰期(分钟)是：t1/2(a)=0.693/a，t1/2(b)=0.693/b。在图30中，对于RHI，t1/2(a)=0.76，t1/2(b)=11.46，且对于I-6，t1/2(a)=0.47，t1/2(b)=2.87。换而言之，I-6的t1/2(b)比RHI的t1/2(b)短约4倍。

下表总结了使用与上述完全相同的方法测试的许多缀合物(结构显示在图45中)的t1/2参数:

该数据与下述假设相一致，即示例性缀合物比未缀合的胰岛素更迅速地从血清中消除，其程度由特定缀合物对内源凝集素的亲和力和每种缀合物取代的配体的数目决定。此外，在实施例42和44-46中证实的a-MM诱导的PK/PD特性的增加与测试的每种缀合物的b期半衰期的降低非常相关。

实施例48–在葡萄糖输注下的体内半衰期/消除速率

在本实施例中，进一步假设生理浓度的葡萄糖的存在可以抑制示例性缀合物的清除速率。为了测定在高血糖条件下所述缀合物在体内从血清中清除的速率，进行下述实验。在每种情况下，以0.4mg缀合物/kg体重，将I-7施用进双颈静脉插管的雄性Sprague-Dawley大鼠(Taconic,JV/JV,350-400g,n=3)中。

在开始实验之前1小时，将1个大鼠插管连接至含有无菌的50%w/v葡萄糖溶液的注射器输液泵。由实验人员调节泵输注速率，以确保在实验期间的所有时间，动物中的血糖水平保持高于300mg/dL。使用可商业得到的测试条(PrecisionXtra,AbbottLaboratories,AbbottPark,IL)，测量血糖。在一个典型实验中，发现保持动物高于300mg/dL所需的泵输注速率通常大于85uL/min。在t=0min，采取血样，然后通过第2个大鼠插管，静脉内地注射无菌的缀合物溶液或对照胰岛素，随后立即注射肝素-盐水追加液，以确保所有缀合物剂量都施用进动物中。用肝素-盐水另外冲洗插管线以后，第2个插管用于在给药后t=1、2、4、8、15、30、60、90、120和180分钟收集血样。

在4℃离心来自每个时间点的血液，以收集血清，随后使用可商业得到的ELISA试剂盒(异胰岛素ELISA,Mercodia,Uppsala,Sweden)，测量血清胰岛素或血清缀合物浓度。根据两隔室模型（其中t1/2(a)=(ln2)/k_a，且t1/2(b)=(ln2)/k_b），使用2个独立衰减指数之和(C(t)=aexp(-k_at)+bexp(-k_bt))，最佳拟合相对于时间数据的胰岛素或缀合物血清浓度。下表总结了使用和不使用葡萄糖输注时的I-7的t1/2参数以及来自实施例47的RHI所得到的那些参数：

我们从这些数据可以得到结论，即葡萄糖能够抑制该缀合物的加速的血清消除，由此使b期消除半衰期从2.77倍增至5.11分钟。

实施例49–在a-MM输注下的体内半衰期/消除速率

在本实施例中，进一步假设任意高浓度的抑制性糖（葡萄糖除外，诸如α-甲基-甘露糖(a-MM)）的存在可以抑制胰岛素-糖缀合物的清除速率。为了测定在a-MM存在下，示例性缀合物在体内从血清清除的速率，进行下述实验。在每种情况下，以0.4mg缀合物/kg体重，将可溶的缀合物施用进双颈静脉插管的雄性Sprague-Dawley大鼠(Taconic,JV/JV,350-400g,n=3)中。

在开始实验之前1小时，将1个大鼠插管连接至含有无菌的25%w/va-MM溶液的注射器输液泵。由实验人员调节泵输注速率，但是通常设定在85uL/min。在t=0min，采取血样，然后通过第2个大鼠插管，静脉内地注射无菌的缀合物溶液或对照胰岛素，随后立即注射肝素-盐水追加液，以确保所有缀合物剂量都施用进动物中。用肝素-盐水另外冲洗插管线以后，第2个插管用于在给药后t=1、2、4、8、15、30、60、90、120和180分钟收集血样。

另外，使用可商业得到的测试条(PrecisionXtra,AbbottLaboratories,AbbottPark,IL)，测量血糖。在4℃离心来自每个时间点的血液，以收集血清，随后使用可商业得到的ELISA试剂盒(异胰岛素ELISA,Mercodia,Uppsala,Sweden)，测量血清胰岛素或血清缀合物浓度。根据两隔室模型（其中t1/2(a)=(ln2)/k_a，且t1/2(b)=(ln2)/k_b），使用2个独立衰减指数之和(C(t)=aexp(-k_at)+bexp(-k_bt))，最佳拟合相对于时间数据的胰岛素或缀合物血清浓度。下表总结了使用和不使用a-MM输注时的TSAT-C6-AEM-2缀合物的t1/2参数以及来自实施例48的葡萄糖输注所得到的那些参数和来自实施例47的没有糖输注的RHI所得到的那些参数：

我们从这些数据可以得到结论，即a-MM不仅会抑制该缀合物的加速的血清消除，而且其抑制程度甚至大于葡萄糖。在该情况下，b期消除半衰期从2.77几乎增加到4倍至10.09分钟。

IV.其它实施例

该第四组实施例描述了研究某些示例性缀合物的合成、制剂和性质的不同实验。

实施例50–使用鱼精蛋白、锌和其它赋形剂的长效胰岛素缀合物

鉴于来自以前的实施例的数据与糖-依赖性的血清消除机制相一致，我们开始开发会提供稳定的、持久的从皮下注射部位吸收的速率的缀合物制剂。在稳定的吸收速率，在任意时间点的血清缀合物浓度主要由糖-依赖性的消除速率控制。以此方式，我们可以配制长效的、持久释放的胰岛素，其表现出糖-响应性的PK特性。

为了制备长效缀合物，我们从缀合物溶液制备了PZI(鱼精蛋白锌胰岛素)制剂。在B1-端处被胰岛素取代的缀合物不会容易地形成非结晶的或结晶的PZI制剂，所以我们使用基于实施例20的方法制备的B29-取代的缀合物。在这些制剂中使用的赋形剂包括鱼精蛋白、锌、间甲酚和盐，它们都商业上购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。可以改变这些组分的浓度，以便得到最佳平坦的、持久的吸收速率。另外，在有些情况下，发现加入小量未修饰的胰岛素有助于稳定化该制剂。在这些情况下，改变样品中含有的未修饰的胰岛素的浓度，以得到最佳平坦的、持久的吸收速率。在测试的所有制剂中，使用下述配方：

除非另外指出，在以上表中所述的次序加入所述组分制备出制剂以后，将它们轻轻混合30分钟，然后进行体内试验。

为了测试给定的制剂的持续释放特性以及葡萄糖-响应的PK特性，进行下述实验。在预定的剂量(在大多数情况下，~15U/kg，除非另外指出)，将制剂注射到禁食的正常非糖尿病大鼠(雄性Sprague-Dawley,400-500克,n=3)的颈后。延迟240分钟后，腹膜内地注射葡萄糖剂量(4g/kg)。在0分钟和初次缀合物注射后30、60、90、120、150、180、210、240和300分钟，通过尾静脉抽血，收集血样。使用可商业得到的测试条(PrecisionXtra,AbbottLaboratories,AbbottPark,IL)，测量血糖值。另外，在4℃离心来自每个时间点的血液，以收集血清。随后使用可商业得到的ELISA试剂盒(异胰岛素ELISA,Mercodia,Uppsala,Sweden)，测量血清胰岛素浓度。根据生产商的试验说明书，异胰岛素ELISA与大鼠胰岛素具有71%交叉反应性。将血清样品稀释10倍，以便使在每个样品中检测到的内源大鼠胰岛素的量最小化，但是不能完全排除大鼠胰岛素检测的可能性。因此，结果通常被报告为“测量的胰岛素”，其可以由一定量的内源大鼠胰岛素以及缀合物或RHI（取决于实验）组成。尽管如此，同样地处理在每个下述实施例中收集的所有样品，并可以直接对比性能的差异。

实施例51–鱼精蛋白浓度对长效胰岛素缀合物性能的影响

本实施例的目的是证实鱼精蛋白浓度对示例性缀合物的时间作用（timeaction）和葡萄糖-响应的PK特性的影响。在本实施例中，使用在实施例50中所述的一般（generalized）制剂和体内方法，测试了根据在实施例20中描述的方法合成的I-6:

通过施用剂量为15U/kg(体重克数/1.87=注射体积微升数)的上述三种制剂中的每一种，进行4小时腹膜内葡萄糖注射(4g/kg)实验。在图31a-c中显示的结果证实：随着制剂中的鱼精蛋白浓度增加，在4小时葡萄糖注射以后，目标制剂延长更多，且测得的血清胰岛素特性的增加更显著。在紧随在注射以后的短时间段内，1xP-1xZ制剂释放出胰岛素缀合物负荷的主要部分，使得在腹膜内葡萄糖攻击后检测出非常微小的信号。另一方面，10xP-4xZ制剂在前4小时内释放出低基础量的胰岛素，没有低血糖症，并随后在紧随在腹膜内葡萄糖注射以后，实现测得的胰岛素浓度增加超过4倍。

实施例52–锌浓度对长效胰岛素缀合物性能的影响

本实施例的目的是证实锌浓度对示例性缀合物的制剂稳定性、时间作用和葡萄糖-响应的PK特性的影响。在本实施例中，使用在实施例50中所述的一般制剂和体内方法，测试了根据在实施例20中描述的方法合成的I-6:

通过施用剂量为15U/kg(体重克数/1.87=注射体积微升数)的上述四种制剂中的每一种，进行4小时腹膜内葡萄糖注射(4g/kg)实验。在图32a-b和33a-b中显示的结果证实：在实验误差内，锌的浓度对制剂的总体持续释放性质或葡萄糖-响应特性没有显著影响。在所有情况下，在腹膜内葡萄糖注射以后，观察到测得的胰岛素浓度的统计上显著的增加。如在实施例51中所证实的，无论锌浓度如何，与更低的鱼精蛋白(4xP)制剂相比，更高的鱼精蛋白(10xP)制剂随着时间释放更少的缀合物。但是，当将制剂在室温放置超过24小时时，两种10xP制剂从容易分散的微粒溶液转化成粘性的、团聚的两相溶液。对应的10xP-4xZ制剂没有发生该现象。类似地，发现4xP-1xZ制剂以与10xP-1xZ制剂相同的方式转化，而4xP-2xZ在室温可相对稳定数周。因此，可以调节对于给定鱼精蛋白浓度的锌浓度，以制备在长时间段内稳定的容易分散的制剂。

实施例53–间甲酚浓度对长效胰岛素缀合物性能的影响

本实施例的目的是证实间甲酚浓度对示例性缀合物的时间作用和葡萄糖-响应的PK特性的影响。在本实施例中，使用在实施例50中所述的一般制剂和体内方法，测试了根据在实施例20中描述的方法合成的I-6:

通过施用剂量为15U/kg(体重克数/1.87=注射体积微升数)的上述两种制剂，进行4小时腹膜内葡萄糖注射(4g/kg)实验。在图34a-b中显示的结果证实：间甲酚的存在会维持更延长的制剂。在紧随在注射以后的短时间段内，不含甲酚的制剂释放出胰岛素缀合物负荷（payload）的相当一部分，使得当用腹膜内葡萄糖攻击时观察到测得的胰岛素浓度的非常微小的增加。另一方面，4x甲酚制剂在前4小时内释放出低基础量的胰岛素，没有低血糖症，并随后在紧随在腹膜内葡萄糖注射以后，实现测得的胰岛素浓度增加3-4倍。

实施例54–盐/等渗剂浓度对长效胰岛素缀合物性能的影响

本实施例的目的是证实盐浓度和等渗剂的选择对示例性缀合物的时间作用和葡萄糖-响应的PK特性的影响。在本实施例中，使用在实施例50中所述的一般制剂和体内方法，测试了根据在实施例20中描述的方法合成的I-6:

通过施用剂量为15U/kg(体重克数/1.87=注射体积微升数)的上述三种制剂中的每一种，进行4小时腹膜内葡萄糖注射(4g/kg)实验。在图35a-c中显示的结果证实：盐在制剂中的存在会维持更延长的制剂。不含盐的制剂在实验的前4小时内释放出胰岛素缀合物负荷的相当一部分，使得当用腹膜内葡萄糖攻击时观察到测得的胰岛素浓度的非常微小的增加。另一方面，3.3x盐制剂在前4小时内释放出低基础量的缀合物，没有低血糖症，并随后在紧随在腹膜内葡萄糖注射以后，实现测得的胰岛素浓度增加约4倍。该性能类似于使用来自实施例51的10xP-4xZ制剂所得到的结果，后者与3.3x盐制剂完全相同，但是含有大约1/3的盐浓度(1.5M，相对于5.0M)。最后，用甘油替代NaCl作为等渗剂，似乎不会不利地影响制剂的延长性质。

实施例55–未修饰的胰岛素浓度对长效胰岛素缀合物性能的影响

本实施例的目的是证实包含不同浓度的未修饰的胰岛素对示例性缀合物的时间作用和葡萄糖-响应的PK特性的影响。在本实施例中，使用在实施例50中所述的一般制剂和体内方法，测试了根据在实施例20中描述的方法合成的I-6:

通过施用剂量为15U/kg(体重克数/1.87=注射体积微升数)的上述三种制剂中的每一种，进行4小时腹膜内葡萄糖注射(4g/kg)实验。在图36a-c中显示的结果证实：未修饰的胰岛素在制剂中的存在有益地产生更延长的制剂，在腹膜内葡萄糖注射以后测得的胰岛素浓度大幅增加。此外，未修饰的胰岛素的存在有助于保持制剂性能，甚至在室温温育几周以后(参见下面的实施例57)。

实施例56–长效胰岛素缀合物–剂量响应效应

在本实施例中，我们评价了长效示例性缀合物的特定制剂的剂量-响应效应。使用在实施例50中所述的一般制剂和体内方法，测试了根据在实施例20中描述的方法合成的缀合物I-6:

通过施用剂量为5或15U/kg(体重克数/1.87=注射体积微升数)的上述制剂，进行4小时腹膜内葡萄糖注射(4g/kg)实验。

如图37所示，在注射葡萄糖之前，缀合物表现出平坦的PK特性。在腹膜内葡萄糖攻击以后，测得的胰岛素浓度的增加是急剧的和剂量-依赖性的(对比用5U/kg(左图)和15U/kg(右图)剂量的缀合物得到的数据)。在早期或晚期时间点，没有观察到低血糖症。

实施例57–示例性的长效、葡萄糖-响应的缀合物的稳定性

在本实施例中，我们以2倍规模，合成了完全相同的来自实施例56的长效制剂。将一半所述物质在2-8℃储存并将另一半在室温储存1周或2周。在指定的储存时间以后，以15U/kg剂量(体重克数/1.87=注射体积微升数)，使用在实施例56中所述的相同的4小时腹膜内葡萄糖注射方法，重新分配和测试所述物质。如图38-39所示，甚至在冷冻(图38)或在室温(图39)储存至少2周后，该制剂表现出类似的性能。

实施例58–从具有不同配体亲和力和多价的缀合物制备的长效缀合物的性能

在本实施例中，我们开始确定从不同类型和数目的配体构建的缀合物的长效制剂的时间作用和葡萄糖-响应的PK特性。使用下面指定的框架和糖配体，根据在实施例20中所述的方法，合成用于本实施例的所有缀合物:

对于每种缀合物，使用下述长效制剂:

通过施用剂量为15U/kg(体重克数/1.87=注射体积微升数)的上述缀合物中的每一种，进行4小时腹膜内葡萄糖注射(4g/kg)实验。如图40a-e所示，所有缀合物表现出延长的吸收特性，在4小时葡萄糖注射以后，测得的血清胰岛素浓度具有一定程度的增加。在注射长效TSPE-AETM-3缀合物I-11以后的前4小时，似乎存在一些显著的缀合物吸收。但是，所有其它缀合物表现出平坦的吸收特性，象用TSAT-C6-AETM-2缀合物所观察到的特性一样。这些结果与下述事实紧密相关，即这些缀合物的半衰期都小于在实施例47-48中所述的未修饰的胰岛素，且它们各自表现出如在实施例45-46中所述的a-MM-诱导的PK/PD特性的增加。

实施例59–长效缀合物在腹膜内a-MM测试条件下的性能

在本实施例中，我们测试了从TSAT-C6-AETM-2(I-6)和TSAT-C6-GA-2(I-5)缀合物构建的缀合物长效制剂的a-MM-响应特性。根据在实施例20中所述的一般方法，制备两种缀合物。另外，对于每种缀合物，使用下述长效制剂:

为了测试制剂的持续释放性质以及a-MM-响应的PK特性，进行下述实验。以15U/kg(体重克数/1.87=注射体积微升数)，将制剂注射在禁食的正常非糖尿病大鼠(雄性Sprague-Dawley,400-500克,n=3)的颈后。延迟240分钟后，腹膜内地注射a-MM剂量(4g/kg)。在0分钟和初次缀合物注射后30、60、90、120、150、180、210、240和300分钟，通过尾静脉抽血，收集血样。使用可商业得到的测试条(PrecisionXtra,AbbottLaboratories,AbbottPark,IL)，测量血糖值。另外，在4℃离心来自每个时间点的血液，以收集血清。随后使用可商业得到的ELISA试剂盒(异胰岛素ELISA,Mercodia,Uppsala,Sweden)，测量血清胰岛素浓度。

如图41a所示，在腹膜内a-MM注射以后，长效TSAT-C6-AETM-2(I-6)制剂的峰:基线血清浓度比值甚至高于当用葡萄糖替代a-MM时用相同制剂观察到的结果。此外，在a-MM攻击以后，TSAT-C6-GA-2(I-5)制剂(图41b)没有表现出血清缀合物浓度的任何增加。这些结果与下述事实紧密相关，即TSAT-C6-GA-2(I-5)缀合物的消除半衰期与未修饰的胰岛素几乎相同(实施例47)，且它没有表现出a-MM-诱导的PK变化(实施例45)。

实施例60–在糖尿病患者和非糖尿病患者中的长效缀合物

为了证实长效TSAT-C6-AETM-2(I-6)制剂的体内效用，我们将它(5、10和20U/kg)施用给正常的和STZ-诱导的糖尿病的大鼠(雄性Sprague-Dawley,400-500克,n=6)。使用下述方法，制备所述制剂:

没有使用葡萄糖的外部腹膜内注射来触发缀合物的生物活性。相反，我们依赖于大鼠中的内源葡萄糖水平来控制缀合物制剂的PK和PD特性。在最初缀合物注射后的不同时间点，通过尾静脉抽血，收集血样。使用可商业得到的测试条(PrecisionXtra,AbbottLaboratories,AbbottPark,IL)，测量血糖值。如图42所示，对于正常的或糖尿病的大鼠，在早期或晚期时间点，没有观察到低血糖症。用糖尿病的大鼠观察到的葡萄糖特性是急剧的，并证实：所述缀合物被更高的葡萄糖浓度活化，并在长时间段内(在最高剂量，在8小时内)以与剂量成比例的方式发挥它们的葡萄糖降低效应。

使用不同的剂量(7、14和28U/kg)和更长的时间段(24小时)，重复该实验。来自该实验的结果如图43所示。

实施例61–使用脂肪酸酯进行缀合以制备长效制剂

应当理解，我们已经使用鱼精蛋白锌胰岛素的一个替代方案来制备示例性缀合物的长效形式。在本实施例中，我们证实了如何通过用长链脂肪酸共价修饰B29-ε-胺基，将B1-取代的胰岛素缀合物转化成长效制剂。例如，如在美国专利号6,869,930中所述，用C14-肉豆蔻酸酰基化胰岛素，会产生具有扁平的、延长的时间作用特性的可溶物质。根据实施例12的方法，合成了B1-取代的TSAT-C6-AETM-2(I-2)。然后可以将所述物质低压冻干成干粉，并用作下述操作的原料。

将肉豆蔻酸-NHS酯以60mM溶解在1ml无水DMSO中，随后加入400ul(过量)三乙胺(TEA)。将该溶液在室温快速地搅拌10分钟。然后单独地将缀合物I-2溶解在7.5ml无水DMSO中，浓度为8.1mM。溶解后，在1分钟时间段内，将整个溶液加入肉豆蔻酸-NHS酯溶液中，随后在室温混合另外2小时，以确保完全反应。

然后在含有0.150MNaCl的20mMpH5.0HEPES缓冲盐水溶液中，将得到的溶液超稀释10倍，随后用稀HCl调节pH至最终的pH8.0。首先使用适当的固相，通过尺寸排阻，纯化水溶液，用于希望的缀合的和未缀合的物质的分离。然后使用适当尺寸的超滤膜，将穿过柱空体积的溶液浓缩至大约10ml。使用制备反相HPLC（在WatersSymmetryPrepC18,7um柱,19x150mm上），进一步纯化该溶液，以得到希望的产物。缓冲液A是含有0.1%TFA的去离子水，缓冲液B是含有0.1%TFA的乙腈。在纯化之前，使用WatersDeltraPrep600系统，以15ml/分钟，用80%A/20%B流动相平衡柱。在2分钟时间段内，以15ml/分钟的流速，将大约5ml粗产物溶液注射到柱上，然后在接下来的5分钟内采用80%A/20%B至75%A/25%B的线性梯度，继之以在接下来的22分钟内75%A/25%B至62%A/38%B的更慢的线性梯度。目标峰的保留时间随使用的药物、框架和配体而异。收集后，旋转蒸发该溶液以去除乙腈，并低压冻干以得到纯的缀合物，其身份可以通过LC-MS(HTLaboratories,SanDiego,CA)予以证实。然后可以使用在实施例50和59中描述的4小时腹膜内葡萄糖或a-MM条件，评价得到的缀合物的延长的且糖-响应性的PK/PD特性。

实施例62–具有中性等电点的、含有胰岛素的长效缀合物

应当理解，我们已经使用鱼精蛋白锌胰岛素的其它替代方案来制备缀合物的长效形式。在本实施例中，我们证实了如何通过在制备缀合物过程中替换甘精胰岛素(来得时?)，例如，替代野生型人胰岛素，合成长效缀合物。在前述实施例中描述的任意的和所有的合成方法可以用于形成甘精胰岛素-缀合物。甘精胰岛素是一种示例性的长效胰岛素类似物，其中Asp-A21已经被甘氨酸替代，且2个精氨酸已经被添加到B-链的C-端上。这些变化的作用是迁移等电点，生成在pH4完全可溶、但是在生理pH不可溶的溶液。合成并纯化以后，然后可以使用在实施例50和59中描述的4小时腹膜内葡萄糖或a-MM条件，评价得到的缀合物的延长的且糖-响应性的PK/PD特性

实施例63–可溶性缀合物在泵递送系统中的应用

作为将糖-响应性的缀合物配制成长效制剂的替代，使用泵递送系统，可以静脉内地、皮下地或腹膜内地连续输注每一个。将已知浓度(通常25-100U/ml)的缀合物的无菌溶液装载进泵蓄池中，并以稳定的速率连续递送进选择的隔室中。将该速率调节至在受试者中没有观察到低血糖症时的最大水平。然后，使用在实施例50和59中描述的4小时腹膜内葡萄糖或a-MM条件，可以评价葡萄糖-响应性的PK/PD特性。该泵方法是有利的，因为不需要赋形剂来为缀合物提供稳定的输入和吸收速率。本领域已经描述了许多种胰岛素泵，且可以用于该目的。例如，参见在下述文献中描述的任一种泵：美国专利号4,435,173、4,498,843、4,923,375、5,062,841、6,650,951、6,744,350、6,852,104、7,377,907和7,515,060以及美国专利公开号20080172028、20090005726、20090112165、20090137957、20090177142、20090177154和20100004598，它们各自通过引用并入本文。

实施例64–C6-酰胺-AEM-2中间体的合成

本实施例描述了制备具有下述化学结构的ZC-AEM-2中间体的合成方法:

a.中间体Z2A

该方法的第一阶段包括：使试剂Z1A和Z1B化合生成中间体Z2A，如在下述的反应方案中所示：

这如下实现。在氮下、在室温，向250mL两颈烧瓶中，加入化合物Z1B(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,13.9g)、1-羟基苯并三唑水合物(HOBT,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,11.0g)和二甲基甲酰胺(DMF,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。将混合物冷却至0℃，该时间以后，在氮下，将化合物Z1A(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,9.5mL)和二-异丙基碳二亚胺(DIC,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,9.8ml)加入到混合物中。在室温搅拌反应液过夜。反应36小时后，加入(二甲氨基)吡啶(DMAP,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,7.71g)，并在48小时后，用布氏漏斗过滤反应混合物。将滤液保持在4℃过夜，并在次日进行后处理。

蒸发滤液，将得到的残余物放入120ml乙酸乙酯中，并用10%HCl水溶液(3x30mL)、饱和NaHCO₃水溶液(3x30mL)、盐水(3x20mL)连续洗涤，经无水硫酸钠干燥。在真空中浓缩溶液至干燥，得到产物，其不经进一步纯化地使用。

b.中间体Z3A

该方法的第二阶段包括将中间体Z2A转化成中间体Z3A，如在下述的反应方案中所示：

将化合物Z2A(16.0g)溶解于甲醇(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,85mL)中，并将溶液冷却至0℃。逐滴加入10%氢氧化钠水溶液(19mL)，并在0℃搅拌反应物3小时。然后，用小量水(15mL)溶解悬浮液。向该溶液中加入在0℃的安伯莱特（Amberlite）IR-120(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,H+形式)的15x2g等分试样。将珠子悬浮液搅拌0.5小时，产生pH为约5的溶液。过滤得到的混合物，以去除安伯莱特珠子，并在真空中浓缩和干燥滤液，以产生白色-红色固体，13.0g产量。

c.中间体Z4A

该方法的第三阶段包括：使中间体Z3A与试剂Z3B化合生成中间体Z4A，如在下述的反应方案中所示：

将化合物Z3B(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,19.0g)溶解于DMF(50mL)中。将悬浮液冷却至0℃，该时间以后，将三乙胺(15.0mL)加入该溶液中。将溶液的温度在0℃维持0.75小时。接着，向该溶液中加入在0℃的化合物Z3A(13.0g)溶解在DMF(24mL)中的溶液，随后加入HOBT(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,15.9g)、DMF(50mL)和DIC(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,15.0mL)。将得到的溶液在0℃搅拌另外1小时，然后温热至室温，并反应过夜另外18小时。

接着，将反应物重新冷却至0℃，加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,15mL)，并将得到的溶液搅拌0.5小时，直到溶液的pH是大约9.0。加入无水二氯甲烷(25mL)和DIC(3.5mL)，并继续搅拌另外10小时。加入更多的化合物Z3B(游离碱,2.5g)，并使反应在氮气氛下在室温进行另外50小时。

最后，过滤反应混合物，通过旋转蒸发，浓缩滤液。将残余物溶解于二氯甲烷(CH₂Cl₂,400mL)中，并用5%HCl溶液(3x200mL)洗涤有机相。将有机层冷却至0℃，用饱和碳酸氢钠溶液(3x100mL)和盐水(2x200mL)中和。有机溶液经硫酸镁干燥，然后通过过滤进行分离，并使用旋转蒸发进行浓缩。通过在硅胶上的柱色谱法(洗脱液相：二氯甲烷/甲醇50:1-5:1)，纯化残余物。在真空中浓缩和干燥柱级分过夜。得到白色固体，为Z4A(18.9g,产量81%)。

d.中间体Z5A

该方法的第四阶段包括将中间体Z4A转化成中间体Z5A，如在下述的反应方案中所示：

将酯Z4A(2.27g)溶解于甲醇(10mL)中，并在室温，向该溶液中加入5.0ml1.0M氢氧化钠溶液。将混合物在室温搅拌38小时。在该时间结束时，加入另外1.5ml2.0M氢氧化钠水溶液，并将混合物在室温搅拌另外14小时。

接着，用在0℃的10%HCl水溶液酸化反应混合物。用乙酸乙酯(3x25mL)萃取产物。合并的有机层经硫酸镁干燥，然后在真空中浓缩至干燥过夜，产生Z5A，为白色固体(2.2g)。

e.中间体Z6A

该方法的第五阶段包括：使中间体Z5A与氨基乙基甘露糖(AEM)化合生成中间体Z6A，如在下述的反应方案中所示：

在氮下在0℃，将二酸化合物Z5A(2.0g)、氨基乙基甘露糖(1.46g)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基-脲鎓六氟磷酸盐(HATU,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,2.7g)溶解于无水DMF(80mL)中。在氮气氛下在0℃，将DIPEA(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,3.0mL)逐滴加入该混合物中。将混合物在0℃搅拌1小时，然后在室温搅拌另外4小时。在此时，将氨基乙基甘露糖(0.5g)和HATU(0.52g)的另一等分试样加入在室温的反应液中，将溶液搅拌另外3小时。通过旋转蒸发，浓缩混合物，并通过在硅胶上的柱色谱法(二氯甲烷/甲醇20:1，然后6:1洗脱至1:1)，纯化残余物。收集级分，并在真空中蒸发，产生纯化的产物(TLC：上面的斑点,Rf0.6,二氯甲烷:甲醇1:3)。

应当理解，可以重复这整个方法，以得到具有不同配体的缀合物，其中当将中间体Z5A转化成中间体Z6A时，用另一种含有胺的试剂(例如，但不限于AEG、AEBM、AETM等)替换AEM。

f.中间体Z7A

该方法的第六阶段包括将中间体Z6A转化成中间体Z7A，如在下述的反应方案中所示：

将化合物Z6A(1.43g)溶解于无水甲醇(100mL)中。向该溶液中加入(1.00g碳载钯(Pd/C))，使氢气在该溶液中鼓泡，以还原保护基，得到对应的胺。发现在反应大约9小时以后，反应已经达到完全转化。

通过硅藻土垫，过滤反应混合物，并在真空中浓缩和干燥滤液。得到化合物Z7A，为褐色固体(1.16g,产量94%)。

g.中间体Z8A

下述方案显示了如何制备偶联剂Z8A：

向在0℃的冷却的N-羟基琥珀酰亚胺(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,NHS,7.0g)在干燥的CH₂Cl₂(65mL)中的溶液中，加入三乙胺(9.5mL)和已二酰氯(3.97mL,5.0g)。将得到的混合物在0℃搅拌2小时。用饱和NaCl水溶液(3x30mL)洗涤混合物，并经硫酸镁干燥。在真空中过滤和浓缩溶液，然后通过硅胶色谱法纯化残余物，得到白色固体(6.6g)，为产物Z8A。

h.中间体Z9A

下述方案显示了如何使偶联剂Z8A与中间体Z7A化合生成中间体Z9A:

将化合物Z7A(0.256g)溶解于无水DMF中，将溶液冷却至0℃。在氮气氛下，向该溶液中加入Z8A(0.710g)在无水DMF(15mL)中的溶液。将混合物在0℃搅拌2小时。

将溶液体积浓缩至1/3，滤出多余的未反应的DSS。将滤液进一步浓缩至大约3ml柱，并通过硅胶色谱法(洗脱液：二氯甲烷/甲醇20:1-4:1，然后3:1-1:1)进行纯化。在真空中浓缩和干燥收集的级分，得到151mg纯化的产物。¹HNMR(300MHz,DMSO)δ1.28-1.63(band,20H)、2.07-2.22(band,6H)、2.85(s,4H),3.08-3.64(band,22H),3.91(s,4H),4.08(s,2H),4.49(s,2H),4.57(d,2H,J=5.70Hz),4.64(s,2H),4.73(t,4H,J=5.10Hz),7.85(s,2H,酰胺NH),8.68,8.19,7.98(s,3H,酰胺NH)。LC-MS(实测1074.67[M+Na+],M=1051.57Da;计算1052.08Da)。

实施例65–C6-酰胺-AEM-2(B1)缀合物的合成

本实施例描述了从实施例64的中间体Z9A制备B1-缀合的胰岛素的方法。如下将化合物Z9A缀合到胰岛素上。在室温在氮下，将根据实施例8合成的NH₂-B1-BOC2(A1,B29)-胰岛素(0.167g)溶解于无水DMSO(3mL)中，并在室温搅拌0.5小时。在室温在氮下，向该溶液中加入无水三乙胺(0.013mL)。通过注射器泵，将在无水DMSO(1.5mL)中的化合物Z9A(0.177g)以(4.2uL/min)的速率加入到在室温的胰岛素-三乙胺混合物中，搅拌速率为80rpm。通过分析HPLC，监测反应转化率。4小时后，将另外3当量的TEA(0.010mL)加入到反应混合物中。在室温共10.5小时后，停止反应，并放在-20℃冰箱中过夜。

次日，融化反应混合物，并放在离子交换珠子(SPSephadex珠子,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,等度条件)的小填充柱上。在1000xg短暂地离心该柱4min，以纯化胰岛素缀合物(通过分析HPLC来评估)。将从离子交换柱收集的级分(6mL)逐滴加入到无水丙酮(30mL)中，同时在140rpm搅拌10min。将得到的悬浮液倒入50mL离心试管中，将其在3500xg旋转10min。从试管取出澄清的上清液，保留饼，并放置在一边。将上清液加入另外30ml丙酮中，以得到第二批沉淀物(加入几滴5NHCl以后)，然后在3500xg离心10min，以得到第二个离心饼。

在真空中干燥合并的饼1小时，以得到白色固体(197mg,92%产率)，通过分析HPLC测得>98%纯度。通过在实施例12中描述的方法，去除胰岛素缀合物BOC基团，以得到生物活性的胰岛素缀合物。

在本实施例中描述的方法具有下述优点：生成高产量、高纯度的胰岛素缀合物，无需反相HPLC。

实施例66–I-17：C6-酰胺-AEM-2(B29)缀合物的合成

本实施例描述了从实施例64的中间体Z9A制备B29-缀合的胰岛素的一种方法。如下将化合物Z9A缀合到胰岛素上。在室温在氮下，将根据实施例16合成的NH₂-B29-BOC2(A1,B1)-胰岛素(0.167g)溶解于无水DMSO(3mL)中，并在室温搅拌0.5小时。在室温在氮下，向该溶液中加入无水三乙胺(0.013mL)。通过注射器泵，将在无水DMSO(1.5mL)中的化合物Z9A(0.177g)以(4.2uL/min)的速率加入到在室温的胰岛素-三乙胺混合物中，搅拌速率为80rpm。通过分析HPLC，监测反应转化率。4小时后，将另外3当量的TEA(0.010mL)加入到反应混合物中。在室温共10.5小时后，停止反应，并放在-20℃冰箱中过夜。

在真空中干燥合并的饼1小时，以得到白色固体。通过在实施例12中描述的方法，去除胰岛素缀合物BOC基团，以得到生物活性的胰岛素缀合物。

实施例67–I-17：C6-酰胺-AEM-2(B29)缀合物的替代合成

本实施例描述了从实施例64的中间体Z9A制备B29-缀合的胰岛素的另一种方法。具体地，该替代方法包括将化合物Z9A直接偶联到未保护的胰岛素的B29ε氨基上。将化合物Z9A以53mM溶解于1.0ml无水DMSO中，随后加入0.4ml(过量)三乙胺(TEA)。将该溶液在室温快速搅拌5分钟。然后，以17.2mM，将重组人胰岛素(RHI)粉末单独地溶解于1ml0.1M、pH11碳酸钠缓冲液中，随后用1.0N氢氧化钠调节pH至10.8。溶解后，在10分钟内将整个化合物Z9A溶液逐滴加入到胰岛素/碳酸盐缓冲溶液中。滴加后，将溶液搅拌另外15分钟，以确保完全反应。

然后将得到的溶液在含有0.150MNaCl的20mMpH5.0HEPES缓冲盐水溶液中超稀释10倍，随后用稀HCl调节pH至最终的pH8.0。首先使用BiogelP2(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)，通过尺寸排阻，纯化该水溶液，用于希望的缀合的和未缀合的物质的分离。然后使用3kDa超滤膜，将穿过柱空体积的溶液浓缩至大约15ml。使用制备反相HPLC（在WatersSymmetryPrepC18、7um、19x150mm柱上），进一步纯化该溶液，以得到希望的产物。缓冲液A是含有0.1%TFA的去离子水，缓冲液B是含有0.1%TFA的乙腈。在纯化之前，使用WatersDeltraPrep600系统，以15ml/分钟，用80%A/20%B流动相平衡该柱。在2分钟时间段内，将大约5ml粗产物溶液注射到柱上，流速为15ml/分钟，然后在接下来的5分钟内，采用80%A/20%B至75%A/25%B的线性梯度，继之以在接下来的22分钟内75%A/25%B至62%A/38%B的更慢的线性梯度。收集希望的级分以后，旋转蒸发溶液以去除乙腈，并低压冻干以得到纯的缀合物，其身份通过LC-MS(HTLaboratories,SanDiego,CA)予以证实。发现终产物(通过HPLC测得，95%纯度)具有希望的分子量6744g/mol(LC-MS)，这代表每个胰岛素缀合了共2.0个AEM分子，大于85%的缀合物分子缀合在Lys-B29位点处(通过N-端测序测得)。

实施例68–长效I-17缀合物

在本实施例中，我们开始确定从实施例64的化合物Z9A构建的缀合物的长效制剂的时间作用和葡萄糖-响应性的PK特性。根据在实施例67中描述的方法，合成本实施例的缀合物。对于该缀合物，使用下述的长效制剂:

通过施用剂量为15U/kg(体重克数/1.87=注射体积微升数)的上述制剂，进行4小时腹膜内葡萄糖注射(4g/kg)实验。如图44所示，所述缀合物表现出延长的吸收特性，在4小时葡萄糖注射以后，测得的血清胰岛素浓度显著增加。

实施例69–从2-氨基乙基α-L-吡喃岩藻糖苷和2-氨基乙基N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖制备的缀合物和评价

来自实施例42的数据证实了L-岩藻糖的抑制假定的凝集素途径的能力，所述途径导致示例性缀合物的增加的PK特性。还已知，β-连接的N-乙酰基葡糖胺也可以抑制甘露糖和岩藻糖在其中作为抑制剂的途径(例如参见Haurum等人，Biochem.J.293:873-878,1993)。本实施例描述了使用2-氨基乙基α-L-吡喃岩藻糖苷或2-氨基乙基N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖配体，如何合成胰岛素缀合物，诸如上述的那些。根据Ni等人在BioconjugateChem.14:232-238,2003中的方法，制备2-氨基乙基α-L-吡喃岩藻糖苷(分子量=207g/mol)。根据Cai等人在OrganicLetters7:4021-4024,2005中的方法，合成2-氨基乙基N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖(分子量=264g/mol)。在上面在实施例11-13、15、17-27和29-31中描述的任一种缀合物合成方法中，这些配体中的任一种可以容易地替换氨基-官能化的糖配体。

根据在实施例42中描述的方法，在给大鼠皮下注射以后，关于a-MM、L-岩藻糖或葡萄糖-诱导的PK/PD特性的增加，在体内测试得到的缀合物的PK。还可以根据在实施例50-55中的方法，将缀合物配制成持续释放制剂，并随后根据在那些相同的实施例中描述的4小时腹膜内葡萄糖注射方法，评价它们的延长的和葡萄糖-响应性的药代动力学。也可以采用支持这些缀合物的释放的替代方法，诸如在实施例61-63中描述的那些。

实施例70–式(VIb-3)的示例性缀合物

在某些实施方案中，本公开内容提供了式(VIb-3)的缀合物:

其中：

W是胰岛素分子；且

每次出现的-X是

或。

在某些实施方案中，所述胰岛素分子选自：人胰岛素、猪胰岛素和牛胰岛素。在某些实施方案中，所述胰岛素分子是甘精胰岛素或地特胰岛素。在某些实施方案中，所述胰岛素分子包含3个二硫桥。

实施例71–示例性缀合物I-6

在某些实施方案中，本公开内容提供了缀合物I-6:

实施例72–式(VIc-2)的示例性缀合物

在某些实施方案中，本公开内容提供了式(VIc-2)的缀合物:

，

其中：

W是胰岛素分子；且

每次出现的-X是

或。

实施例73–式(VId-1)的示例性缀合物

在某些实施方案中，本公开内容提供了式(VId-1)的缀合物:

，

其中：

W是胰岛素分子；且

-X是

或。

实施例74–示例性的制剂

在某些实施方案中，本公开内容提供了包含缀合物的持续释放制剂，其中所述制剂包含鱼精蛋白和锌。应当理解，本公开内容包括含有本文所述的任一种缀合物(例如但不限于：图45、49、55、60、61或62中的任一种缀合物)的持续释放制剂。

在某些实施方案中，所述制剂包含约1至约5mg鱼精蛋白/mg缀合物;和约0.1至约0.25mg锌/mg缀合物。

在某些实施方案中，所述制剂包含比例(w/w)在约40:1至约10:1范围内的鱼精蛋白和锌。

在某些实施方案中，所述制剂另外包含一定量的未缀合的胰岛素分子。在某些实施方案中，所述制剂包含摩尔比在约25:1至约2:1范围内的缀合的胰岛素分子与未缀合的胰岛素分子。

在某些实施方案中，所述制剂另外包含抗微生物防腐剂。在某些实施方案中，所述抗微生物防腐剂是间甲酚。在某些实施方案中，所述制剂包含约0.15至约0.35%v/v间甲酚。

在某些实施方案中，所述制剂另外包含等渗剂。在某些实施方案中，所述等渗剂是甘油。在某些实施方案中，所述等渗剂是NaCl。在某些实施方案中，所述制剂包含约0.1至约0.2MNaCl。

在某些实施方案中，所述制剂包含：

比例(w/w)在约40:1至约10:1范围内的鱼精蛋白和锌；

摩尔比在约25:1至约2:1范围内的缀合的胰岛素分子与未缀合的胰岛素分子；

约0.15至约0.35%v/v间甲酚；和

甘油或约0.1至约0.2MNaCl。

在某些实施方案中，所述制剂包含：

约3.6mg鱼精蛋白/mg缀合物；和

约0.2mg锌/mg缀合物。

在某些实施方案中，所述制剂包含：

约3.6mg鱼精蛋白/mg缀合物；

约0.2mg锌/mg缀合物；和

摩尔比为约5:1的缀合的胰岛素分子与未缀合的胰岛素分子。

在某些实施方案中，所述制剂包含：

约3.6mg鱼精蛋白/mg缀合物；

约0.2mg锌/mg缀合物；

摩尔比为约5:1的缀合的胰岛素分子与未缀合的胰岛素分子；和

约0.2%v/v间甲酚。

在某些实施方案中，所述制剂包含：

约3.6mg鱼精蛋白/mg缀合物；

约0.2mg锌/mg缀合物；

摩尔比为约5:1的缀合的胰岛素分子与未缀合的胰岛素分子；

约0.2%v/v间甲酚；和

甘油或约0.15MNaCl。

实施例75–胰岛素与多价活化的酯在有机溶剂中缀合(首先添加药物)，得到A1-取代的胰岛素缀合物–一般方法

步骤1

将胰岛素溶解在100mM碳酸钠缓冲液(pH11)和乙腈的体积比为66:37的混合物中，浓度为14.7mM。单独地，将单官能化的保护基-活化的酯(例如，BOC-NHS)以467mM溶剂在乙腈中。胰岛素溶解后，将单官能化的保护基-活化的酯(例如，BOC-NHS)的小等分试样加入胰岛素溶液中。在整个过程中，监测pH，并通过加入0.1M氢氧化钠，维持pH在10.2-11.0之间。通过反相HPLC，监测反应。加入单官能化的保护基-活化的酯的等分试样，直到HPLC色谱图表明所有未修饰的胰岛素已经反应，且大部分反应混合物已经被转化成B29-保护的胰岛素。通常，保护基在性质上是更疏水的，且在胰岛素上反应以后，会在比未修饰的胰岛素更长的HPLC保留时间洗脱。

步骤2

单独地，将含有N-端活化的酯的框架以174mM溶解在1.267ml无水DMSO中，随后加入100μl(过量)三乙胺(TEA)。将该溶液在室温快速地搅拌10分钟。在另一个瓶子中，在适当体积的无水DMSO中，制备370mM配体溶液。溶解后，加入足够的溶液，以提供等于（最初的活化的酯基团的数目N-1）的3倍的反应当量数。例如，如果每个框架上存在N=3个最初活化的酯基团，则加入(3x(3-1)x60mM/370mM)=0.973ml配体溶液。如果每个框架上存在N=4个最初活化的酯基团，则加入(3x(4-1)x60mM/370mM)=1.46ml配体溶液，以此类推。加入配体溶液后，将该溶液在室温搅拌另外1小时，以确保完全反应。

步骤3

如步骤1所述胰岛素已经与保护基充分反应以后，且在步骤2中在框架和配体之间已经发生充分反应以后，将来自步骤2的框架-配体溶液逐滴加入到胰岛素溶液的等分试样中。通过HPLC，监测得到的反应物。加入等分试样，直到B29-保护的胰岛素完全反应，得到希望的B29-保护的、A1-框架/配体、胰岛素-缀合物。由于配体-框架经常比胰岛素更亲水，希望的产物的出现的信号是，与B29-胰岛素(来自步骤1)相比，向更短的HPLC保留时间的明显迁移。已经达到希望的反应水平以后，在含有0.150MNaCl的20mMpH5.0HEPES缓冲盐水溶液中超稀释反应液10倍，随后用稀HCl调节pH至最终的pH8.0。首先使用适当的固相，通过尺寸排阻，纯化水溶液，用于希望的缀合的和未缀合的物质的分离。然后使用适当尺寸的超滤膜，将穿过柱空体积的溶液浓缩至大约10ml。使用制备反相HPLC（在WatersC8、7um、19x150mm柱上），进一步纯化该溶液，以得到希望的产物。缓冲液A是含有0.1%TFA的去离子水，缓冲液B是含有0.1%TFA的乙腈。在纯化之前，使用WatersDeltraPrep600系统，以15ml/分钟，用80%A/20%B流动相平衡柱。在2分钟时间段内，以15ml/分钟的流速，将大约5ml粗产物溶液注射到柱上，然后在接下来的5分钟内采用80%A/20%B至75%A/25%B的线性梯度，继之以在接下来的22分钟内75%A/25%B至62%A/38%B的更慢的线性梯度。目标峰的保留时间随使用的胰岛素、框架和配体而异。收集后，旋转蒸发该溶液以去除乙腈，并低压冻干，以得到纯的单-保护的胰岛素-缀合物。

步骤4

在所有情况下，然后从胰岛素-缀合物去除保护基。在其中在步骤1中使用BOC保护基的情况下，如下去除BOC基团：将根据步骤3得到的冻干粉在4℃溶解在90%TFA/10%苯甲醚中1小时，随后在含有0.150MNaCl的25mMHEPESpH8.2缓冲液中10倍超稀释(如果在携带胺的药物上存在除了BOC以外的保护基，则采用适当的去保护条件替代TFA/苯甲醚。保护剂和去保护条件的列表可以参见，ProtectingGroupsinOrganicSynthesis,T.W.Greene和P.G.M.Wuts,第3版,JohnWiley&Sons,1999，如在定义部分中所述)。使用NaOH溶液，将pH调至7.0-8.0，然后使物质穿过BiogelP2柱，以去除苯甲醚、BOC和去保护的其它低分子量副产物以及任意其它污染盐。然后使用Amicon3K膜(Millipore,Billerica,MA)，浓缩去保护的、纯化的缀合物水溶液至大约66U胰岛素/ml(基于A280测量)，并在4℃储存备用。最终缀合物的身份通过LC-MS(HTLaboratories,SanDiego,CA)予以确认。通过N-端测序(WesternAnalytical,St.Louis,MO)，确认A1缀合位点，所述N-端测序揭示存在>95%的Phe-B1-链末端，且存在<5%的Gly^A1-链末端，这是由于用含有配体的框架置换Gly^A1。

本领域普通技术人员会理解，使用与实施例75所述类似的方法，可以将其它胺-官能化的药物缀合到含有配体的框架上。本领域普通技术人员还理解，实施例75不仅与野生型胰岛素有关，而且与本文所述的胰岛素突变体有关。

根据实施例75的方法，使用BOC-NHS作为保护剂，制备下述的胰岛素-缀合物。

根据实施例75的方法，可以制备下述的胰岛素-缀合物。在有些实施方案中，使用BOC-NHS作为保护剂，制备胰岛素-缀合物。

实施例76–胰岛素与多价活化的酯在有机溶剂中缀合(首先添加药物)，得到A1,B29-取代的胰岛素缀合物–一般方法

步骤1

将含有N-端活化的酯的框架以147mM溶解在2.5ml无水DMSO中，随后加入1.0mL(过量)三乙胺(TEA)。将该溶液在室温快速地搅拌10分钟。在另一个瓶子中，在适当体积的无水DMSO中，制备272mM配体溶液。溶解后，加入足够的溶液，以提供等于（最初的活化的酯基团的数目N-1）的3倍的反应当量数。例如，如果每个框架上存在N=3个最初活化的酯基团，则加入(3x(3-1)x60mM/370mM)=0.973ml配体溶液。如果每个框架上存在N=4个最初活化的酯基团，则加入(3x(4-1)x60mM/370mM)=1.46ml配体溶液，以此类推。加入配体溶液后，将该溶液在室温搅拌另外1小时，以确保完全反应。

步骤2

将胰岛素溶解在1.5ml100mM碳酸钠缓冲液(pH11)中，浓度为17.2mM。通过根据需要加入0.1MNaOH，将溶液pH维持在~11。胰岛素溶解后，将框架-配体溶液的小等分试样加入胰岛素溶液中。在整个过程中，监测pH，并通过加入0.1M氢氧化钠，维持pH在10.2-11.0之间。通过反相HPLC，监测反应。加入框架-配体溶液的等分试样，直到HPLC色谱图表明基本上所有未修饰的胰岛素已经反应，且大部分反应混合物已经被转化成小部分单-反应的胰岛素/框架/配体缀合物，且主要产物是二-反应的胰岛素/框架/配体缀合物。通常，框架-配体构建体比未修饰的胰岛素更亲水，造成单和二-反应的携带胺的药物产物在比未修饰的胰岛素更短的HPLC保留时间洗脱。同样地，希望的产物（二取代的胰岛素-缀合物）的HPLC峰会出现在比单-取代的胰岛素-缀合物更短的保留时间。

步骤3

如步骤2所述胰岛素已经与框架配体充分反应以后，然后在含有0.150MNaCl的20mMpH5.0HEPES缓冲盐水溶液中将该溶液超稀释10倍，随后用稀HCl调节pH至最终的pH8.0。首先使用适当的固相，通过尺寸排阻，纯化水溶液，用于希望的缀合的和未缀合的物质的分离。然后使用适当尺寸的超滤膜，将穿过柱空体积的溶液浓缩至大约10ml。使用制备反相HPLC（在WatersC8、7um、19x150mm柱上），进一步纯化该溶液，以得到希望的产物。缓冲液A是含有0.1%TFA的去离子水，缓冲液B是含有0.1%TFA的乙腈。在纯化之前，使用WatersDeltraPrep600系统，以15ml/分钟，用80%A/20%B流动相平衡柱。在2分钟时间段内，以15ml/分钟的流速，将大约5ml粗产物溶液注射到柱上，然后在接下来的5分钟内采用80%A/20%B至75%A/25%B的线性梯度，继之以在接下来的22分钟内75%A/25%B至62%A/38%B的更慢的线性梯度。目标峰的保留时间随使用的胰岛素、框架和配体而异。收集后，旋转蒸发该溶液以去除乙腈，并低压冻干以得到纯的缀合物。最终缀合物的身份通过LC-MS(HTLaboratories,SanDiego,CA)予以确认。A1,B29缀合位点通过N-端测序(WesternAnalytical,St.Louis,MO)予以确认，所述N-端测序揭示存在>95%的Phe-B1-链末端，且存在<5%的Gly^A1-链末端，这是由于用含有配体的框架置换Gly^A1。

本领域普通技术人员会理解，使用与实施例76所述类似的方法，可以将其它胺-官能化的药物缀合到含有配体的框架上。本领域普通技术人员还理解，实施例76不仅与野生型胰岛素有关，而且与本文所述的胰岛素突变体有关。

根据实施例76的方法，制备下述的胰岛素-缀合物。

根据实施例76的方法，可以制备下述的胰岛素-缀合物。

实施例77–胰岛素与多价活化的酯在有机溶剂中缀合(首先添加药物)，得到A1,B1-取代的胰岛素缀合物

步骤1

步骤2

将含有3个反应性胺基的胰岛素溶解于1.5mlDMSO中，浓度为17.2mM，所述每个反应性胺基具有可区分的pKa(例如，在野生型胰岛素的情况下，pKaGly^A1=8.0，Phe^B1=6.7，Lys^εB29=11.2；参见Mei等人,Pharm.Res.16:1680-1686,1999)，所述胰岛素预先已经在最高pKa胺基(例如，Lys^B29)处用单官能化的保护基-活化的酯(例如，BOC-NHS)单-保护。B29-BOC-胰岛素溶解后，将框架-配体溶液的小等分试样加入B29-BOC-胰岛素溶液中。通过反相HPLC，监测反应。加入框架-配体溶液的等分试样，直到HPLC色谱图表明基本上所有B29-BOC-胰岛素已经反应，且大部分反应混合物已经被转化成小部分单-反应的B29-BOC-胰岛素/框架/配体缀合物，且主要产物是二-反应的B29-BOC-胰岛素/框架/配体缀合物。通常，框架-配体构建体比B29-BOC-胰岛素更亲水，造成单-缀合的和二-缀合的B29-BOC-胰岛素-缀合物在比未修饰的B29-BOC-胰岛素更短的HPLC保留时间洗脱。同样地，希望的产物（B29-BOC-胰岛素-缀合物）的HPLC峰会出现在比单-取代的B29-BOC-胰岛素-缀合物更短的保留时间。

步骤3

如步骤2所述B29-BOC-胰岛素已经与含有配体的框架充分反应以后，然后在含有0.150MNaCl的20mMpH5.0HEPES缓冲盐水溶液中将该溶液超稀释10倍，随后用稀HCl调节pH至最终的pH8.0。首先使用适当的固相，通过尺寸排阻，纯化水溶液，用于希望的缀合的和未缀合的物质的分离。然后使用适当尺寸的超滤膜，将穿过柱空体积的溶液浓缩至大约10ml。使用制备反相HPLC（在WatersC8、7um、19x150mm柱上），进一步纯化该溶液，以得到希望的产物。缓冲液A是含有0.1%TFA的去离子水，缓冲液B是含有0.1%TFA的乙腈。在纯化之前，使用WatersDeltraPrep600系统，以15ml/分钟，用80%A/20%B流动相平衡柱。在2分钟时间段内，以15ml/分钟的流速，将大约5ml粗产物溶液注射到柱上，然后在接下来的5分钟内采用80%A/20%B至75%A/25%B的线性梯度，继之以在接下来的22分钟内75%A/25%B至62%A/38%B的更慢的线性梯度。目标峰的保留时间随使用的胰岛素、框架和配体而异。收集后，旋转蒸发该溶液以去除乙腈，并低压冻干以得到纯的缀合物。

步骤4

在所有情况下，然后从缀合物去除保护基。在其中在步骤1中使用BOC保护基的情况下，如下去除BOC基团：将根据步骤3得到的冻干粉在4℃溶解在90%TFA/10%苯甲醚中1小时，随后在含有0.150MNaCl的25mMHEPESpH8.2缓冲液中10倍超稀释(如果在携带胺的药物上存在除了BOC以外的保护基，则采用适当的去保护条件替代TFA/苯甲醚。保护剂和去保护条件的列表可以参见，ProtectingGroupsinOrganicSynthesis,T.W.Greene和P.G.M.Wuts,第3版,JohnWiley&Sons,1999，如在定义部分中所述)。使用NaOH溶液，将pH调至7.0-8.0，然后使物质穿过BiogelP2柱，以去除苯甲醚、BOC和去保护的其它低分子量副产物以及任意其它污染盐。然后使用Amicon3K膜(Millipore,Billerica,MA)，浓缩去保护的、纯化的缀合物水溶液至大约66U胰岛素/ml(基于A280测量)，并在4℃储存备用。最终缀合物的身份通过LC-MS(HTLaboratories,SanDiego,CA)予以确认。A1,B1缀合位点通过N-端测序(WesternAnalytical,St.Louis,MO)予以确认，所述N-端测序揭示基本上不存在Phe-B1-链末端，且没有Gly-A1-链末端，这是由于在两端被含有配体的框架置换。

本领域普通技术人员会理解，使用与实施例77所述类似的方法，可以将其它胺-官能化的药物缀合到含有配体的框架上。本领域普通技术人员还理解，实施例77不仅与野生型胰岛素有关，而且与本文所述的胰岛素突变体有关。

根据实施例77的方法，使用BOC-NHS作为保护剂，制备缀合物II-5。

根据实施例77的方法，可以制备下述的胰岛素-缀合物。

实施例78–胰岛素与多价活化的酯在有机溶剂中缀合(首先添加药物)，得到B1,B29-取代的胰岛素缀合物

步骤1

将含有N-端活化的酯的框架以147mM溶解在2.5ml无水DMSO中。与以前的实施例不同，不加入碱。将该溶液在室温快速地搅拌10分钟。在另一个瓶子中，在适当体积的无水DMSO中，制备272mM配体溶液。溶解后，加入足够的溶液，以提供等于（最初的活化的酯基团的数目N-1）的3倍的反应当量数。例如，如果每个框架上存在N=3个最初活化的酯基团，则加入(3x(3-1)x60mM/370mM)=0.973ml配体溶液。如果每个框架上存在N=4个最初活化的酯基团，则加入(3x(4-1)x60mM/370mM)=1.46ml配体溶液，以此类推。加入配体溶液后，将该溶液在室温搅拌另外1小时，以确保完全反应。

步骤2

将含有3个反应性胺基的胰岛素溶解于1.5mlDMSO中，浓度为17.2mM，所述每个反应性胺基具有可区分的pKa(例如，在野生型胰岛素的情况下，pKaGly^A1=8.0，Phe^B1=6.7，Lys^εB29=11.2；参见Mei等人,Pharm.Res.16:1680-1686,1999)，所述胰岛素预先已经在具有中间pKa的胺基(例如，对于野生型胰岛素，Gly^A1)处用单官能化的保护基-活化的酯(例如，BOC-NHS)单-保护(可以如下制备A1-BOC-胰岛素：使用实施例8的方法，但是与更少当量的BOC试剂反应，以便产生A1,B29-二BOC-胰岛素、A1-BOC-胰岛素和B29-BOC-胰岛素产物的分布。通过RP-HPLC，可以分离A1-BOC-胰岛素，并通过N-端测序予以确认)。A1-BOC-胰岛素溶解后，将框架-配体溶液的小等分试样加入A1-BOC-胰岛素溶液中。通过反相HPLC，监测反应。加入框架-配体溶液的等分试样，直到HPLC色谱图表明基本上所有未修饰的A1-BOC-胰岛素已经反应，且大部分反应混合物已经被转化成小部分单-缀合的A1-BOC-胰岛素/框架/配体缀合物，且主要产物是二-缀合的A1-BOC-胰岛素/框架/配体缀合物。通常，框架-配体构建体比A1-BOC-胰岛素更亲水，造成单和二取代的A1-BOC-胰岛素-缀合物在比未修饰的A1-BOC-胰岛素更短的HPLC保留时间洗脱。同样地，希望的产物（二取代的A1-BOC-胰岛素-缀合物）的HPLC峰会出现在比单-取代的A1-BOC-胰岛素-缀合物更短的保留时间。

步骤3

如步骤2所述A1-BOC-胰岛素已经与框架配体充分反应以后，然后在含有0.150MNaCl的20mMpH5.0HEPES缓冲盐水溶液中将该溶液超稀释10倍，随后用稀HCl调节pH至最终的pH8.0。首先使用适当的固相，通过尺寸排阻，纯化水溶液，用于希望的缀合的和未缀合的物质的分离。然后使用适当尺寸的超滤膜，将穿过柱空体积的溶液浓缩至大约10ml。使用制备反相HPLC（在WatersC8、7um、19x150mm柱上），进一步纯化该溶液，以得到希望的产物。缓冲液A是含有0.1%TFA的去离子水，缓冲液B是含有0.1%TFA的乙腈。在纯化之前，使用WatersDeltraPrep600系统，以15ml/分钟，用80%A/20%B流动相平衡柱。在2分钟时间段内，以15ml/分钟的流速，将大约5ml粗产物溶液注射到柱上，然后在接下来的5分钟内采用80%A/20%B至75%A/25%B的线性梯度，继之以在接下来的22分钟内75%A/25%B至62%A/38%B的更慢的线性梯度。目标峰的保留时间随使用的药物、框架和配体而异。收集后，旋转蒸发该溶液以去除乙腈，并低压冻干以得到纯的缀合物。

步骤4

在所有情况下，然后从缀合物去除保护基。在其中在步骤1中使用BOC保护基的情况下，如下去除BOC基团：将根据步骤3得到的冻干粉在4℃溶解在90%TFA/10%苯甲醚中1小时。如果在携带胺的药物上存在除了BOC以外的保护基，则采用适当的去保护条件替代TFA/苯甲醚。保护剂和去保护条件的列表可以参见，ProtectingGroupsinOrganicSynthesis,T.W.Greene和P.G.M.Wuts,第3版,JohnWiley&Sons,1999，如在定义部分中所述。去保护步骤之后，在含有0.150MNaCl的25mMHEPESpH8.2缓冲液中10倍超稀释。使用NaOH溶液，将pH调节至7.0-8.0，然后使物质穿过BiogelP2柱，以去除苯甲醚、BOC和去保护的其它低分子量副产物以及任意其它污染盐。然后，使用Amicon3K膜(Millipore,Billerica,MA)，浓缩去保护的、纯化的缀合物水溶液至大约66U胰岛素/ml(基于A280测量)，并在4℃储存备用。最终缀合物的身份通过LC-MS(HTLaboratories,SanDiego,CA)予以确认。B1缀合位点通过N-端测序(WesternAnalytical,St.Louis,MO)予以确认，所述N-端测序揭示存在>95%的Gly-A1-链末端，且存在<5%的Phe-B1-链末端，这是由于用含有配体的框架置换Phe-B1。

本领域普通技术人员会理解，使用与实施例78所述类似的方法，可以将其它胺-官能化的药物缀合到含有配体的框架上。本领域普通技术人员还理解，实施例78不仅与野生型胰岛素有关，而且与本文所述的胰岛素突变体有关。

根据实施例78的方法，可以制备下述的胰岛素-缀合物。

实施例79–体内半衰期/消除速率对比

为了测定在有或没有抑制性糖（诸如葡萄糖或a-MM）存在下I-6缀合物在体内从血清中清除的速率，进行下述实验。在每种情况下，，将可溶的缀合物(或作为对照的RHI)以0.4mg缀合物/kg体重的剂量施用至双颈静脉插管的雄性Sprague-Dawley大鼠(Taconic,JV/JV,350-400g,n=3)中。

为了测定在有升高的葡萄糖水平存在下的消除速率，在开始实验之前1小时，将1个大鼠插管连接至含有无菌的50%w/v葡萄糖溶液的注射器输液泵。由实验人员调节泵输注速率，以确保在实验期间的所有时间，动物中的血糖水平保持高于300mg/dL。使用可商业得到的测试条(PrecisionXtra,AbbottLaboratories,AbbottPark,IL)，测量血糖。在一个典型实验中，发现保持动物高于300mg/dL所需的泵输注速率通常大于85uL/min。在t=0min，采取血样，然后通过第2个大鼠插管，静脉内地注射无菌的缀合物溶液或对照胰岛素，随后立即注射肝素-盐水追加液，以确保所有缀合物剂量都施用进动物中。用肝素-盐水另外冲洗插管线以后，第2个插管用于在给药后t=1、2、4、8、15、30、60、90、120和180分钟收集血样。

为了测定在有a-MM存在下的消除速率，在开始实验之前1小时，将1个大鼠插管连接至含有无菌的25%w/va-MM溶液的注射器输液泵。由实验人员调节泵输注速率，但是通常设定在85uL/min。在t=0min，采取血样，然后通过第2个大鼠插管，静脉内地注射无菌的缀合物溶液或对照胰岛素，随后立即注射肝素-盐水追加液，以确保所有缀合物剂量都施用进动物中。用肝素-盐水另外冲洗插管线以后，第2个插管用于在给药后t=1、2、4、8、15、30、60、90、120和180分钟收集血样。

贯穿整个实验，使用可商业得到的测试条(PrecisionXtra,AbbottLaboratories,AbbottPark,IL)，测量血糖。在4℃离心来自每个时间点的血液，以收集血清，随后使用可商业得到的ELISA试剂盒(异胰岛素ELISA,Mercodia,Uppsala,Sweden)，测量血清胰岛素或血清缀合物浓度。根据两隔室模型（其中t1/2(a)=(ln2)/k_a，且t1/2(b)=(ln2)/k_b），使用2个独立衰减指数之和(C(t)=aexp(-k_at)+bexp(-k_bt))，最佳拟合相对于时间数据的胰岛素或缀合物血清浓度。结果如图46所示。左图证实了在没有a-MM或葡萄糖存在下，I-6缀合物比RHI明显更高的(>5x)消除速率。右图表明：在有葡萄糖存在下(G400输注)，消除速率稍微降低(~50%)，且在有a-MM存在下(a-MM输注)，降低幅度非常大(~400%)。

实施例80–I-6静脉内输注的葡萄糖-响应的PK

在本实施例中，将在实施例79中所述的静脉内消除速率实验从单次静脉内团注（bolus）0.4mg缀合物/kg体重修改成连续静脉内输注。本实验的目的是维持恒定的缀合物(或作为对照的RHI)的输入速率6小时，并在4小时时间点施用腹膜内注射的葡萄糖，以测定对血清缀合物(或RHI)浓度产生的影响。在每个实验中使用双颈静脉插管的雄性Sprague-Dawley大鼠(Taconic,JV/JV,350-400g,n=3)中，使得1条颈静脉线用于缀合物或RHI输注，另一条用于血液收集。

对于RHI，通过0.2um过滤膜，无菌过滤50mU/ml溶液，并在0.07ml/min输注，以提供3.5mU/min的恒定输入速率，持续整个6小时实验。在t=0min，采取血样，然后开始恒定静脉内输注。第2个插管用于在t=30、60、120、180和240min时收集血样。在t=240min，通过腹膜内注射，施用4g/kg剂量的葡萄糖，然后在t=255、270、300、330和360min进行血液收集。

对于I-6缀合物，通过0.2um过滤膜，无菌过滤150mU/ml溶液，并在0.10ml/min输注，以提供15mU/min的恒定输入速率，持续整个6小时实验。在t=0min，采取血样，然后开始恒定静脉内输注。第2个插管用于在t=30、60、120、180和240min时收集血样。在t=240min，通过腹膜内注射，施用1、2或4g/kg剂量的葡萄糖，然后在t=255、270、300、330和360min进行血液收集。

贯穿整个实验，使用可商业得到的测试条(PrecisionXtra,AbbottLaboratories,AbbottPark,IL)，测量血糖。在4℃离心来自每个时间点的血液，以收集血清，随后使用可商业得到的ELISA试剂盒(异胰岛素ELISA,Mercodia,Uppsala,Sweden)，测量血清胰岛素或血清缀合物浓度。

图47的前2幅图对比了在4g/kg腹膜内葡萄糖注射之前和之后，3.5mU/min输注RHI和15mU/min输注I-6的血糖和血清胰岛素/缀合物浓度特性。在葡萄糖注射之前，与I-6输注相比，RHI输注造成显著的低血糖症。在腹膜内葡萄糖注射之后，随着血糖浓度增加，测得的I-6的血清胰岛素浓度立即增加了超过300%，然后随着葡萄糖浓度降低，快速返回基线水平。另一方面，对于RHI而言，在相同的实验条件下，在腹膜内葡萄糖注射以后，测得的血清胰岛素浓度没有显著变化。图47的接下来的3幅图表明：在腹膜内葡萄糖注射期间测得的胰岛素浓度的增加程度与施用的葡萄糖的剂量和得到的血糖水平直接相关。例如，对于1g/kg葡萄糖注射，仅观察到血清胰岛素浓度的50%峰至基线变化，而对于4g/kg剂量，观察到300%峰至基线变化。

实施例81–含有和不含糖的胰岛素-缀合物的体内消除速率

为了测定在有或没有抑制性糖（诸如葡萄糖或a-MM）存在下I-9缀合物在体内从血清清除的速率，进行下述实验。在每种情况下，将可溶的缀合物(或作为对照的RHI)以0.4mg缀合物/kg体重的剂量施用进双颈静脉插管的雄性Sprague-Dawley大鼠(Taconic,JV/JV,350-400g,n=3)中。

为了测定在有升高的葡萄糖水平存在下的消除速率，在开始实验之前1小时，将1个大鼠插管连接至含有无菌的50%w/v葡萄糖溶液的注射器输液泵。由实验人员调节泵输注速率，以确保在实验期间的所有时间，动物中的血糖水平保持高于300mg/dL。使用可商业得到的测试条(PrecisionXtra,AbbottLaboratories,AbbottPark,IL)，测量血糖。在一个典型实验中，发现保持动物高于300mg/dL所需的泵输注速率通常大于85μL/min。在t=0min，采取血样，然后通过第2个大鼠插管，静脉内地注射无菌的缀合物溶液或对照胰岛素，随后立即注射肝素-盐水追加液，以确保所有缀合物剂量都施用进动物中。用肝素-盐水另外冲洗插管线以后，第2个插管用于在给药后t=1、2、4、8、15、30、60、90、120和180分钟收集血样。

贯穿整个实验，使用可商业得到的测试条(PrecisionXtra,AbbottLaboratories,AbbottPark,IL)，测量血糖。在4℃离心来自每个时间点的血液，以收集血清，随后使用可商业得到的ELISA试剂盒(异胰岛素ELISA,Mercodia,Uppsala,Sweden)，测量血清胰岛素或血清缀合物浓度。根据两隔室模型（其中t1/2(a)=(ln2)/k_a，且t1/2(b)=(ln2)/k_b），使用2个独立衰减指数之和(C(t)=aexp(-k_at)+bexp(-k_bt))，最佳拟合相对于时间数据的胰岛素或缀合物血清浓度。图48的第一幅图表明：在有糖(葡萄糖G400或a-MM)存在下，未修饰的胰岛素的消除速率未受影响。为了对比，从实施例79结果重新绘制图48的最后一幅图，它显示了具有糖输注的缀合物I-6。图48的中间的图表明，与I-6缀合物相比，在有葡萄糖存在下(G400输注)，具有糖输注的缀合物I-9显示出显著得多的消除速率降低(~350%相对于~50%)。与I-6缀合物相比，在有a-MM存在下(a-MM输注)，缀合物I-9也表现出更显著的消除速率降低(~700%相对于~400%)。

实施例82–在雏型猪中的机制验证和葡萄糖-响应性能

为了测定上述的葡萄糖-响应性的胰岛素-缀合物结果是否可以扩展至除了大鼠以外的其它物种，我们集中于探究在代表人的、非糖尿病的、雄性雏型猪(Yucatan品系，在本文中也称作“迷你猪”)中的糖-依赖性的体内消除速率。测试了在图49中总结的胰岛素-缀合物子集，以初步确定糖亲和力和多价对糖-依赖性的消除速率的影响。所述缀合物在图45中显示为I-7、I-6、I-11和II-2。根据在实施例20中描述的一般方法，合成在本研究中使用的所有缀合物。为了生产A1,B29-二取代的AETM-2胰岛素-缀合物II-2，使用与B29-单取代的AETM-2胰岛素-缀合物(I-6)合成相比每个胰岛素分子大约10倍量的多价活性酯框架和AETM配体。

在每个实验中，以0.1U/kg，将胰岛素-缀合物静脉内施用给非糖尿病的、配有双血管进入口的迷你猪，并在注射后，在常见的时间间隔，收集血液。为了测定在有葡萄糖存在下的血清消除速率，使用注射器泵将无菌的50%w/v葡萄糖溶液静脉内灌注进一个口中，在1小时后施用胰岛素-缀合物，并在整个实验中调节速率，以确保动物中的血糖水平保持在400mg/dl或附近(通常80-150ml/h)。为了测定在有a-MM存在下的血清消除速率，用无菌的25%w/va-MM溶液替换葡萄糖溶液，并在整个实验中，使泵输注速率保持恒定在80ml/h。在每种情况下，根据两隔室模型，使用2个独立衰减指数之和(C(t)=αexp(-k_αt)+βexp(-k_βt))，拟合得到的胰岛素-缀合物浓度相对于时间的数据。

在400mg/dl，高水平的内源性葡萄糖-诱导的猪胰岛素与我们的胰岛素-缀合物免疫测定交叉反应。这样，来自葡萄糖输注实验的PK结果需要减去从仅猪胰岛素试验得到的值，产生特别“噪音的”数据集合。由于a-MM不会诱导内源性猪胰岛素分泌，来自a-MM输注研究的数据被用作我们的胰岛素-缀合物半衰期的糖-响应性变化的主要指示剂。令人感兴趣地，在猪中，在有a-MM存在下，AETM-2胰岛素-缀合物(I-6)仅表现出t_1/2的适度的1.7倍增加（相对于在大鼠中4.0倍增加）(图56)。但是，在猪中，在有a-MM存在下，A1,B29-二取代的AETM-2胰岛素-缀合物(II-2)表现出t_1/2的几乎10倍增加(图50和51)。其它缀合物的列表结果如图57所示。

在有a-MM存在下，在静脉内施用二取代的AETM-2胰岛素-缀合物(II-2)的葡萄糖降低曲线上面的面积比没有糖时高大约2.6倍(图52)。图59对比了RHI、I-6和II-2(二取代的AETM-2胰岛素-缀合物)与II-3之间的生物活性差异。所有3种胰岛素-缀合物含有高亲和力AETM糖配体。在该选择的胰岛素-缀合物集合中，在糖-依赖性的半衰期和生物活性之间不存在关联。

在0.25、0.50和1.00U/kg的剂量，将缀合物II-2作为可溶溶液皮下注射给非糖尿病的、血糖正常的和四氧嘧啶-糖尿病的、高血糖的迷你猪，以测定它在糖尿病患者中降低葡萄糖的能力，而不在非糖尿病的动物中造成低血糖症。胰岛素-缀合物在糖尿病患者中表现出血糖水平的显著的剂量-依赖性的降低，在非糖尿病患者中绝对没有低血糖症或葡萄糖降低征象(图53)。相对比，在0.063和0.125U/kg注射的RHI在糖尿病的动物中造成显著的葡萄糖降低和显著的低血糖症，且在非糖尿病的动物中造成显著的葡萄糖降低和低血糖症(图54)。基于这些初步的结果，单次注射大约0.5U/kg的可溶的胰岛素-缀合物II-2，会在糖尿病的迷你猪中提供无低血糖症的葡萄糖控制6-8小时。在糖尿病的和正常的迷你猪中，测定皮下注射的II-2的血清消除速率(图58)。对于所有剂量，在糖尿病的和正常的患者中观察到类似的PK特性。

总之，这些早期的结果证实，在迷你猪中存在基于内源凝集素的机制，其可以用于选择糖亲和力和多价。与大鼠相比，具有更高亲和力和多价的胰岛素-缀合物似乎在迷你猪中会提供提高的无低血糖症的血糖控制。

实施例83–在雏型猪中的优化研究

基于图49中II-2相对于其它缀合物的性能的明显差异，希望将胰岛素缀合位点(A1相对于B29)的作用与糖亲和力和配价的作用分离开，并定量。因此，我们使用与生产图49中的胰岛素-缀合物所用的技术类似的缀合技术，已经合成了在图55中列出的胰岛素-缀合物阵列(在图45中显示为I-12、I-13、I-14、I-15、II-1、II-3和II-4)以及在图60中显示的对照化合物。根据在实施例20中描述的一般方法，合成要在该研究中使用的所有二取代的缀合物。为了生产A1,B29-二取代的胰岛素-缀合物，使用上述的条件，使用与B29-单取代的胰岛素-缀合物合成相比每个胰岛素分子大约10倍量的多价活性酯框架和糖亲和力配体。还根据实施例20所述的一般方法，制备仅A1取代的物质。但是，在该情况下，使用B29-单-BOC保护的胰岛素，其分离自使用半数当量的二-叔丁基-二碳酸酯的、实施例8所述的BOC保护合成。纯化后，使用在实施例12中描述的TFA/苯甲醚方法，从缀合物去除BOC基团。

一般而言，如下测定这些胰岛素-缀合物中每一种的糖-响应半衰期和葡萄糖降低效应。如上所述，以0.1U/kg，将每种胰岛素-缀合物静脉内施用给非糖尿病的、配有双血管进入口的迷你猪，并在注射后，在常见的时间间隔，收集血液。为了测定在有a-MM存在下的血清消除速率，使用注射器泵(80ml/h)将无菌的25%w/va-MM溶液静脉内灌注进一个口中，在1小时后施用胰岛素-缀合物，并在整个实验中使速率保持恒定。在每种情况下，根据两隔室模型，使用2个独立衰减指数之和(C(t)=αexp(-k_αt)+βexp(-k_βt))，拟合得到的胰岛素-缀合物浓度相对于时间的数据。对比含有和不含有a-MM输注的β-期消除速率，以鉴别合适的缀合物。

图61显示了当将各种胰岛素-缀合物静脉内注射进迷你猪中时葡萄糖水平的对比。缀合物I-12(用AETM-2进行A1取代)比缀合物I-6(用AETM-2进行B29取代)稍微更有效地降低葡萄糖。用聚环氧乙烷取代在A1位置的缀合物I-6，得到缀合物C3，会降低总生物活性，但是不会增加a-MM诱导的生物活性。用另一种TSAT-C6-AETM-2支架取代在A1位置的缀合物I-6，得到缀合物II-2，会降低总生物活性，但是增加a-MM诱导的生物活性。

图62显示了当将各种A1,B29二取代的胰岛素-缀合物静脉内注射进迷你猪中时葡萄糖水平的对比。用乙酰基(缀合物C7)或PEO(缀合物C4)基团对胰岛素进行A1,B29二-取代，基本上不会降低总生物活性。此外，C7和C4缀合物没有表现出可区分的a-MM-诱导的生物活性效应。缀合物II-3具有与缀合物C7和C4相比大幅降低的生物活性，但是在有a-MM存在下，它的生物活性实际上得到恢复。

其它实施方案

在考虑本文公开的本发明的说明或实践以后，本发明的其它实施方案对本领域技术人员是显而易见的。意图是说明和实施例应当视作仅是示例性的，本发明的真实范围和精神由下述的权利要求书指示。

序列表

<110>Lancaster,ThomasM.

Zion,ToddC.

<120>胰岛素-缀合物

<130>2005700-0040

<160>2

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>21

<212>PRT

<213>智人

<400>1

GlyIleValGluGlnCysCysThrSerIleCysSerLeuTyrGlnLeu

151015

GluAsnTyrCysAsn

20

<210>2

<211>30

<212>PRT

<213>智人

<400>2

PheValAsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyr

151015

LeuValCysGlyGluArgGlyPhePheTyrThrProLysThr

202530

Claims

1.缀合物，其包含缀合到一个或多个配体上的胰岛素分子，所述配体独立地选自：氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)、和氨基乙基岩藻糖(AEF)，其中所述一个或多个配体通过缀合物框架间接地缀合到该胰岛素分子上。

2.如权利要求1所述的缀合物，其中所述胰岛素分子通过A1氨基酸残基、通过B1氨基酸残基、通过Lys^B29的ε-氨基或通过Lys^B3的ε-氨基进行缀合。

3.如权利要求1所述的缀合物，其中所述胰岛素分子缀合到2个或更多个单独的配体上。

4.如权利要求3所述的缀合物，其中所述2个或更多个单独的配体缀合到单个缀合物框架上，所述框架也缀合到该胰岛素分子上。

5.如权利要求3所述的缀合物，其中所述2个或更多个单独的配体和胰岛素分子各自位于单个分支的缀合物框架的单独分支上。

6.如权利要求5所述的缀合物，其中所述2个或更多个单独的配体和胰岛素分子各自位于单个分支的缀合物框架的单独分支的末端上。

7.如权利要求3所述的缀合物，其中所述2个或更多个单独的配体通过2个或更多个不同的缀合点缀合到胰岛素分子上。

8.如权利要求7所述的缀合物，其中所述胰岛素分子通过A1氨基酸残基和Lys^B29的ε-氨基进行缀合。

9.如权利要求8所述的缀合物，其中所述胰岛素分子缀合到2个单独的缀合物框架上，所述框架各自缀合到一个或多个单独的配体上。

10.如权利要求8所述的缀合物，其中所述胰岛素分子缀合到2个单独的分支的缀合物框架上，所述框架各自缀合到2个配体上。

11.如权利要求10所述的缀合物，其中所述配体位于分支的缀合物框架的单独分支上。

12.如权利要求11所述的缀合物，其中所述配体位于分支的缀合物框架的单独分支的末端上。

13.如权利要求3-12中任一项所述的缀合物，其中所述2个或更多个单独的配体是氨基乙基葡萄糖(AEG)。

14.如权利要求3-12中任一项所述的缀合物，其中所述2个或更多个单独的配体是氨基乙基甘露糖(AEM)。

15.如权利要求3-12中任一项所述的缀合物，其中所述2个或更多个单独的配体是氨基乙基二甘露糖(AEBM)。

16.如权利要求3-12中任一项所述的缀合物，其中所述2个或更多个单独的配体是氨基乙基三甘露糖(AETM)。

17.如权利要求3-12中任一项所述的缀合物，其中所述2个或更多个单独的配体是β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)。

18.如权利要求3-12中任一项所述的缀合物，其中所述2个或更多个单独的配体是氨基乙基岩藻糖(AEF)。

19.如权利要求1所述的缀合物，其中所述胰岛素分子选自：人胰岛素、猪胰岛素、和牛胰岛素。

20.如权利要求1所述的缀合物，其中所述胰岛素分子选自：赖脯胰岛素、门冬胰岛素和谷赖胰岛素。

21.如权利要求1所述的缀合物，其中所述胰岛素分子是甘精胰岛素或地特胰岛素。