CN105749342B - 一种双相骨软骨修复支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医用材料技术领域，公开了一种双相骨软骨修复支架及其制备方法。所述制备方法为：对壳聚糖和透明质酸分别进行改性得到羧乙基壳聚糖和氧化透明质酸，分别溶于PBS缓冲液中后混合得到均匀的软骨层水凝胶；分别向羧乙基壳聚糖和氧化透明质酸溶液中加入纳米羟基磷灰石，超声分散均匀后混合得到均匀的软骨下骨层水凝胶；最后将软骨层水凝胶和软骨下骨层水凝胶横向切开，将两种水凝胶的新界面粘合在一起得到双相骨软骨修复支架。本发明的制备方法所用材料生物相容性好，操作简单，软骨层和软骨下骨层水凝胶能够牢固的结合在一起。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种双相骨软骨修复支架及其制备方法。
背景技术
关节软骨是一种高度分化的结缔组织，可以承受应力、减缓震荡，并为关节提供低摩擦的环境。但是，创伤和退行性骨关节炎等容易造成关节软骨的缺损，并且随着老龄化社会的到来，发病率逐年增加。关节软骨缺损包括软骨上层缺损、软骨全层缺损和骨软骨缺损三种情况。由于关节软骨具有无血管和神经、低代谢等特点，导致营养供应困难，使得软骨组织自我修复的能力十分有限。
目前临床上治疗软骨缺损的方法有：骨板钻孔术、关节镜下磨削及灌洗术、微骨折术和自体或异体软骨移植。前三种方法主要是利用软骨下骨的修复功能，生成性能较差的纤维软骨；最后一种则是利用自体软骨或者外源软骨移植到缺损部位进行修复，但是这种方法存在二次手术、来源有限等缺点。近年来，组织工程的迅猛发展为软骨缺损带来了新的治疗方法。
临床研究表明，软骨下骨在关节软骨修复中至关重要，具有骨/软骨多层结构的一体化移植治疗比单纯的软骨移植具有更好的治疗效果。目前关于骨软骨修复支架的设计主要包括两种方法：3D打印的多孔支架之间的层状组合以及水凝胶之间的层状组装。Hutmacher等(Macromol Biosci.2009,9:1049-1058)通过3D打印技术及光聚合制备具有分层结构的多孔纤维支架。Cohen等(Acta Biomater.2012,8:3283-3293)分别在水凝胶中包埋TGF-β1和BMP-2，然后通过不锈钢把两层水凝胶连接起来，构建骨软骨双相支架。Roy等(Biomaterials.2011,32:6946-6952)通过紫外光引发聚合的方法交联水凝胶，实现了三层水凝胶之间的层状组装。上述方法制备的骨软骨修复支架虽然能够模拟软骨组织的多层结构，但制备方法复杂、生物相容性较差。
发明内容
为了解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种双相骨软骨修复支架的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的双相骨软骨修复支架。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种双相骨软骨修复支架的制备方法，包括以下制备步骤：
(1)将壳聚糖加入到丙烯酸水溶液中，40～60℃下搅拌反应1～3d，反应液经透析、冷冻干燥，得到羧乙基壳聚糖；
(2)将透明质酸钠溶于水中得到透明质酸钠溶液，加入NaIO4室温下避光反应1～5h，然后加入乙二醇终止反应1～2h，反应液经透析、冷冻干燥，得到氧化透明质酸；
(3)分别将羧乙基壳聚糖和氧化透明质酸溶于PBS(磷酸缓冲盐溶液)中，充分溶解后，将两种溶液倒入圆柱形模具，在漩涡振荡器中混合均匀，得到圆柱状的软骨层水凝胶；
(4)分别将羧乙基壳聚糖和氧化透明质酸溶于PBS中，向两种溶液中加入纳米羟基磷灰石，超声分散，然后将两种溶液加入圆柱形模具，在漩涡振荡器中混合均匀，得到圆柱状的软骨下骨层水凝胶；
(5)将圆柱状的软骨层水凝胶和软骨下骨层水凝胶横向切开，将两种水凝胶的新界面粘合在一起，静置0～2h，得到双相骨软骨修复支架。
优选地，步骤(1)中所述丙烯酸水溶液的体积浓度为2～3％，所述壳聚糖与丙烯酸水溶液的质量体积比为1:(40～60)g/mL。
优选地，步骤(2)中所述透明质酸钠溶液的质量浓度为0.5～1％，透明质酸钠的重复单元与NaIO4的摩尔比为1:(0.5～1)，所述乙二醇的加入量为透明质酸钠溶液体积的0.5～1.5％。
优选地，步骤(1)中所述的透析是指用截留分子量为8000～14000的透析袋进行透析，步骤(2)中所述的透析是指用截留分子量为3500的透析袋进行透析。
优选地，步骤(3)和步骤(4)中所述羧乙基壳聚糖和氧化透明质酸的PBS溶液的质量体积浓度为1％～5％g/mL。
优选地，步骤(4)中所述纳米羟基磷灰石的质量体积浓度为0.1％～2％g/mL，所述超声分散的时间为10～60min。
一种双相骨软骨修复支架，通过上述方法制备得到。
本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果：
本发明制备的双相骨软骨修复支架，所用材料生物相容性好，利于细胞的生长。通过水凝胶的自愈合特性把软骨层和软骨下骨层水凝胶粘合成一个整体，避免使用传统技术中的不锈钢和有毒光引发剂，更好的模拟了天然软骨组织的结构。
附图说明
图1是实施例1中的软骨层水凝胶、软骨下骨层水凝胶、骨软骨修复支架的宏观照片图及双相复合水凝胶愈合界面的SEM图。
图2是实施例3中软骨层和软骨下骨层水凝胶包裹培养小鼠骨髓间充质干细胞24h后，live/dead检测细胞状态，其中A为软骨层水凝胶；B为软骨下骨层水凝胶(标尺＝100μm)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)1g壳聚糖加入到50ml 3％(v/v)的丙烯酸溶液中，50℃下搅拌反应3d，反应液用MWCO为8000～14000的透析袋透析3d，然后冻干得到羧乙基壳聚糖；
(2)1g透明质酸钠溶于100ml去离子水中，加入0.535g NaIO4，室温下避光反应3h，加入1.5ml乙二醇终止反应1h，反应液用MWCO为3500的透析袋透析3d，冻干得到氧化透明质酸；
(3)分别将羧乙基壳聚糖和氧化透明质酸溶于PBS中，配成2％g/mL的溶液，充分溶解后，将两种溶液等体积倒入圆柱形模具，在漩涡振荡器中混合均匀，得到圆柱状的软骨层水凝胶；
(4)分别将羧乙基壳聚糖和氧化透明质酸溶于PBS中，配成2％g/mL的溶液，充分溶解后，向两种溶液中分别加入1％(w/v)纳米羟基磷灰石，超声分散30min，然后将两种溶液等体积倒入圆柱形模具，在漩涡振荡器中混合均匀，得到圆柱状的软骨下骨层水凝胶；
(5)利用手术刀片把圆柱状的软骨层水凝胶和软骨下骨层水凝胶横向切开，将两种水凝胶的新界面粘合在一起，静置1h，得到双相骨软骨修复支架。
本实施例所得软骨层水凝胶、软骨下骨层水凝胶、骨软骨修复支架的宏观照片图及双相复合水凝胶愈合界面的SEM图如图1所示。
实施例2
(1)1g壳聚糖加入到50ml 3％(v/v)的丙烯酸溶液中，50℃下搅拌反应3d，反应液用MWCO为8000～14000的透析袋透析3d，然后冻干得到羧乙基壳聚糖；
(2)1g透明质酸钠溶于100ml去离子水中，加入0.535g NaIO4，室温下避光反应3h，加入1.5ml乙二醇终止反应1h，反应液用MWCO为3500的透析袋透析3d，冻干得到氧化透明质酸；
(3)分别将羧乙基壳聚糖和氧化透明质酸溶于PBS中，配成3％和5％g/mL的溶液，充分溶解后，将两种溶液等体积倒入圆柱形模具，在漩涡振荡器中混合均匀，得到圆柱状的软骨层水凝胶；
(4)分别将羧乙基壳聚糖和氧化透明质酸溶于PBS中，配成3％和5％g/mL的溶液，充分溶解后，向两种溶液中分别加入1％(w/v)纳米羟基磷灰石，超声分散30min，然后将两种溶液等体积倒入圆柱形模具，在漩涡振荡器中混合均匀，得到圆柱状的软骨下骨层水凝胶；
(5)利用手术刀片把圆柱状的软骨层水凝胶和软骨下骨层水凝胶横向切开，将两种水凝胶的新界面粘合在一起，静置1h，得到双相骨软骨修复支架。实施例3
(1)1g壳聚糖加入到50ml 3％(v/v)的丙烯酸溶液中，50℃下搅拌反应3d，反应液用MWCO为8000～14000的透析袋透析3d，然后冻干得到羧乙基壳聚糖；
(2)1g透明质酸钠溶于100ml去离子水中，加入0.535g NaIO4，室温下避光反应3h，加入1.5ml乙二醇终止反应1h，反应液用MWCO为3500的透析袋透析3d，冻干得到氧化透明质酸；
(3)分别将灭菌后的羧乙基壳聚糖和氧化透明质酸溶于无菌PBS中，配成3％和5％g/mL的溶液，充分溶解后，将小鼠骨髓间充质干细胞(ATCC公司，CRL-2623)加入到羧乙基壳聚糖溶液中，将两种溶液等体积倒入圆柱形模具，在漩涡振荡器中混合均匀，得到三维包埋细胞的圆柱状软骨层水凝胶；
(4)分别将灭菌后的羧乙基壳聚糖和氧化透明质酸溶于无菌PBS中，配成3％和5％g/mL的溶液，充分溶解后，向两种溶液中分别加入1％(w/v)纳米羟基磷灰石，超声分散30min，将小鼠骨髓间充质干细胞加入到羧乙基壳聚糖溶液中，然后将两种溶液等体积倒入圆柱形模具，在漩涡振荡器中混合均匀，得到圆柱状的软骨下骨层水凝胶；
(5)把软骨层和软骨下骨层水凝胶浸泡在含10％FBS的培养基中，24h后取出，采用live/dead试剂盒进行染色，并且在荧光显微镜下观察记录染色结果，结果如图2所示。由图2结果可以看出：荧光显微镜下没有发现死细胞，说明细胞能在水凝胶中很好的存活，材料具有良好的生物相容性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种双相骨软骨修复支架的制备方法，其特征在于包括以下制备步骤：
(1)将壳聚糖加入到丙烯酸水溶液中，40～60℃下搅拌反应1～3d，反应液经透析、冷冻干燥，得到羧乙基壳聚糖；
(2)将透明质酸钠溶于水中得到透明质酸钠溶液，加入NaIO4室温下避光反应1～5h，然后加入乙二醇终止反应1～2h，反应液经透析、冷冻干燥，得到氧化透明质酸；
(3)分别将羧乙基壳聚糖和氧化透明质酸溶于PBS中，充分溶解后，将两种溶液倒入圆柱形模具，在漩涡振荡器中混合均匀，得到圆柱状的软骨层水凝胶；
(4)分别将羧乙基壳聚糖和氧化透明质酸溶于PBS中，向两种溶液中分别加入质量体积浓度为0.1％～2％g/mL的纳米羟基磷灰石，超声分散，然后将两种溶液加入圆柱形模具，在漩涡振荡器中混合均匀，得到圆柱状的软骨下骨层水凝胶；
(5)将圆柱状的软骨层水凝胶和软骨下骨层水凝胶横向切开，将两种水凝胶的新界面粘合在一起，静置0～2h，得到双相骨软骨修复支架。
2.根据权利要求1所述的一种双相骨软骨修复支架的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述丙烯酸水溶液的体积浓度为2～3％，所述壳聚糖与丙烯酸水溶液的质量体积比为1:(40～60)g/mL。
3.根据权利要求1所述的一种双相骨软骨修复支架的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述透明质酸钠溶液的质量浓度为0.5～1％，透明质酸钠的重复单元与NaIO4的摩尔比为1:(0.5～1)，所述乙二醇的加入量为透明质酸钠溶液体积的0.5％～1.5％。
4.根据权利要求1所述的一种双相骨软骨修复支架的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的透析是指用截留分子量为8000～14000的透析袋进行透析，步骤(2)中所述的透析是指用截留分子量为3500的透析袋进行透析。
5.根据权利要求1所述的一种双相骨软骨修复支架的制备方法，其特征在于：步骤(3)和步骤(4)中所述羧乙基壳聚糖和氧化透明质酸的PBS溶液的质量体积浓度为1％～5％g/mL。
6.根据权利要求1所述的一种双相骨软骨修复支架的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述超声分散的时间为10～60min。
7.一种双相骨软骨修复支架，其特征在于：通过权利要求1～6任一项所述的方法制备得到。
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