CN105722990A - 发酵工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了通过增加通过乙酰乳酸的通量用于改变发酵的代谢产物谱的方法。该方法包括增加来源于乙酰乳酸的一种或多种产物的生产。本发明还提供的是通过气态底物的微生物发酵用于增加2,3?丁二醇的生产的方法，该方法包括给发酵提供化合物，所述化合物抑制将乙酰乳酸转化成支链氨基酸的一种或多种酶。本发明还提供了用于增加相对于其他发酵产物例如乙醇和乙酸的2,3?丁二醇生产的方法。
Description
与相关申请的交叉参考
本专利申请要求来自于2013年9月22日提交的临时申请号61/880,970的优先权，所述临时申请的内容以引用的方式在此并入。
技术领域
本发明涉及使用化合物用于改变发酵系统的代谢产物谱的方法。特别地，本发明涉及用于增加来源于乙酰乳酸的产物生产的方法。
背景技术
用于运输的生物燃料是吸引人的汽油替代物，并且作为低浓度掺和物快速渗透燃料市场。来源于天然植物来源的生物燃料比来源于化石资源的燃料(例如汽油)更具环境可持续性，其使用允许减少所谓的化石二氧化碳(CO2)气体水平，所述二氧化碳气体由于燃料燃烧而被释放到大气内。此外，生物燃料可在许多地区中局部产生，并且可作用于减少对输入的化石能源的依赖。适合于用作生物燃料的醇包括乙醇、丁醇和2,3-丁二醇。
乙醇正迅速地变成全世界主要的富氢液体运输燃料。2002年全世界的乙醇消耗估计为108亿加仑。由于欧洲、日本、美国和几个发展中国家对乙醇的兴趣增加，燃料乙醇工业的全球市场也预测在未来急剧增长。
丁二醇包括1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇和2,3-丁二醇，可视为具有超过乙醇的各种优点。如同乙醇，丁二醇可直接用作汽车燃料添加剂。它们还可相对容易地转化成许多其他潜在更高价值和/或更高能量的产物。例如，2,3-丁二醇可在两步工艺中容易地转化成可用作航空燃料的八碳二聚体。
2,3-丁二醇由其双功能主链获得其多用性，即2个羟基位于邻位C原子处，从而允许该分子相当容易地转化成诸如丁二烯、丁二酮、乙偶姻、甲基乙基酮等的物质。这些化学化合物用作制造广泛范围的工业生产的化学品的基础分子。
此外，2,3-丁二醇可用作内燃机中的燃料。它在几个方面更类似于汽油而不是乙醇。随着环境可持续性燃料生产和应用中的兴趣加强，对产生2,3-丁二醇(通常被称为生物丁醇)的生物过程中的关注已增加。
一氧化碳(CO)是有机材料例如煤炭或油和油衍生的产物不完全燃烧的主要副产物。尽管含碳前体的完全燃烧获得CO2和水作为唯一终产物，但一些工业工艺需要高温，从而有利于一氧化碳超过CO2的积累。一个例子是钢铁工业，其中需要高温来生成所需钢铁品质。例如，据报道澳大利亚的钢铁工业每年产生超过500,000吨CO且将其释放到大气内。
此外，CO也是合成气的主要组分，其中不同量的CO和H2通过含碳燃料的气化而生成。例如，合成气可通过分解废木料和木材的有机生物质来产生，以生成燃料和更复杂化学品的生产的前体。
CO释放到大气内可具有显著的环境影响。另外，可能需要缴纳排放税，从而增加工业工厂的成本。因为CO是反应能量富含分子，所以它可用作各种化学品生产的前体化合物。然而，这种有价值的原料未用于产生2,3-丁二醇。
已证实2,3-丁二醇可通过含碳水化合物原料的微生物发酵而产生(Syu MJ,ApplMicrobiol Biotechnol 55:10-18(2001)，Qin等人，Chinese J Chem Eng14(1):132-136(2006))。2,3-丁二醇还可通过来自作物例如甜菜、玉米、小麦和甘蔗的生物质的微生物发酵来产生。然而，这些碳水化合物原料的成本受其作为人类食物或动物饲料的价值影响，并且用于2,3-丁二醇生产的产淀粉或蔗糖作物的栽培在所有地区中并非经济可持续性的。因此，有利的是开发将成本更低和/或更丰富的碳资源转化成2,3-丁二醇的技术。
通过包含CO的气态底物的微生物发酵的2,3-丁二醇产生已得到证实。然而，2,3-丁二醇通过这些工艺的产生一直是次级产物。其他产物包括乙醇的产生在发酵中有利。丁二醇具有比此类发酵中产生的其他产物更大的价值。期望能够以这样的方式影响发酵，使得2,3-丁二醇的产生得到增加。先前已显示增加的2,3-丁二醇生产率受微生物培养物的氢消耗速率影响(WO2012131627)。
本领域存在以经济有益方式增加由工业气态底物产生有价值产物的能力的需要。存在相对于其他产物生产增强2,3-丁二醇生产的需要，所述其他产物在通过一氧化碳营养菌的气态底物发酵中常规产生。
发明内容
本发明提供了对本领域的需要的应答。本发明提供了用于改变发酵的代谢产物谱的方法。特别地，本发明提供了用于增加通过乙酰乳酸的通量的方法。在某些实施例中，本发明提供了用于增加来源于乙酰乳酸的一种或多种产物生产的方法。在特定实施例中，本发明提供了用于增加通过气态底物的微生物发酵的2,3-丁二醇生产的方法。本发明还提供了用于增加相对于其他发酵产物例如乙醇和乙酸的2,3-丁二醇生产的方法。
在第一个方面，本发明提供了增加来源于乙酰乳酸的至少一种产物的生产的方法。该方法包括给生物反应器提供气态底物，以产生至少一种发酵产物，所述生物反应器含有在液体营养培养基中的一种或多种一氧化碳营养产乙酸微生物的培养物。
在一个实施例中，该方法包括将至少一种化合物加入液体营养培养基。在一个实施例中，至少一种化合物影响发酵的代谢产物谱。在一个实施例中，至少一种化合物对液体营养培养基的添加抑制碳至支链氨基酸的通量。
在一个实施例中，化合物是抑制将乙酰乳酸转化成支链氨基酸的一种或多种酶的化合物。在一个实施例中，该化合物包含羧酸部分。
在一个实施例中，该化合物选自在结构上与2-羟基异丁酸(2-HIBA)、乙酰乳酸、2-氧代-3-羟基异戊酸和2,3-羟基-3-甲基丁酸(methylbutanoate)相关的化合物。在一个实施例中，至少一种化合物选自2-羟基异丁酸(2-HIBA)、2-羟基-2-甲基丁酸、2-羟基丁酸、2-羟基-3-甲基丁酸、2-酮-3-羟基异戊酸和2-酮异戊酸。
在一个实施例中，至少一种发酵产物选自乙酸、乙醇、2,3-丁二醇、2-丁酮、2-丁醇、乙偶姻、异丙醇、乳酸酯、琥珀酸酯、甲基乙基酮(MEK)、丙二醇、2-丙醇、乙偶姻、异丁醇、柠苹酸酯、丁二烯、聚乳酸、异丁烯、3-羟基丙酸酯(3HP)、丙酮和脂肪酸。
在一个实施例中，来源于乙酰乳酸的至少一种产物选自2,3-丁二醇、2-丁酮、2-丁醇和乙偶姻。
在一个实施例中，来源于乙酰乳酸的至少一种产物的生产速率增加至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少110％、或至少120％、或至少130％、或至少140％、或至少150％。
在第二个方面，本发明提供了增加2,3-丁二醇生产的方法。在一个实施例中，该方法包括给生物反应器提供气态底物，以产生2,3-丁二醇，所述生物反应器含有在液体营养培养基中的一种或多种一氧化碳营养产乙酸微生物的培养物。在一个实施例中，发酵产生至少一种其他发酵产物。
在一个实施例中，该方法还包括给液体营养培养基提供至少一种化合物。在一个实施例中，至少一种化合物抑制碳至支链氨基酸的通量。
在一个实施例中，化合物是抑制将乙酰乳酸转化成支链氨基酸的一种或多种酶的化合物。在一个实施例中，该化合物包含羧酸部分。
在一个实施例中，该化合物选自在结构上与2-羟基异丁酸(2-HIBA)、乙酰乳酸、2-氧代-3-羟基异戊酸和2,3-羟基-3-甲基丁酸相关的化合物。在一个实施例中，至少一种化合物选自2-羟基异丁酸(2-HIBA)、2-羟基-2-甲基丁酸、2-羟基丁酸、2-羟基-3-甲基丁酸、2-酮-3-羟基异戊酸和2-酮异戊酸。
在一个实施例中，至少一种其他发酵产物选自乙酸、乙醇、2-丁酮、2-丁醇、乙偶姻、异丙醇、乳酸酯、琥珀酸酯、甲基乙基酮(MEK)、丙二醇、2-丙醇、乙偶姻、异丁醇、柠苹酸酯、丁二烯、聚乳酸、异丁烯、3-羟基丙酸酯(3HP)、丙酮和脂肪酸。
在一个实施例中，至少一种其他发酵产物是至少乙醇。在一个实施例中，化合物的添加引起发酵的代谢产物谱中的转变。在一个实施例中，将化合物加入发酵增加2,3-丁二醇的产生。
在一个实施例中，2,3-丁二醇的生产速率增加至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少110％、或至少120％、或至少130％、或至少140％、或至少150％。
在第一个和第二个方面的实施例中，气态底物选自CO、CO2、H2、N2、CH4及其混合物。在特定实施例中，气态底物包含至少CO。
在第三个方面，本发明提供了增加2,3-丁二醇生产的方法。在一个实施例中，该方法包括给生物反应器提供气态底物，以产生至少2,3-丁二醇和乙醇，所述生物反应器含有在液体营养培养基中的一种或多种一氧化碳营养产乙酸微生物的培养物，并且使用一种或多种手段处理培养物以增加2,3-丁二醇的生产速率。
在一个实施例中，处理培养物的步骤包括将一种或多种化合物加入发酵中。在一个实施例中，化合物是抑制将乙酰乳酸转化成支链氨基酸的一种或多种酶的化合物。在一个实施例中，该化合物包含羧酸部分。在一个实施例中，一种或多种化合物选自在结构上与2-HIBA、乙酰乳酸、2-氧代-3-羟基异戊酸和2,3-二羟基-3-甲基丁酸相关的化合物。在一个实施例中，一种或多种化学化合物选自2-HIBA、2-羟基-2-甲基丁酸、2-羟基丁酸、2-羟基-3-甲基丁酸、2-酮-3-羟基异戊酸和2-酮异戊酸。
在一个实施例中，气态底物还包含选自CO2、H2、N2、CH4及其混合物的至少一种底物。
在一个实施例中，处理培养物的方法包括将2-HIBA加入培养物中。在一个实施例中，一个或多个进一步的处理步骤与将2-HIBA加入微生物培养物中结合进行。在一个实施例中，控制2-HIBA对发酵的添加，使得发酵液中的2-HIBA浓度维持在预定水平。在某些实施例中，2-HIBA的浓度维持在0.01至2.0g/L(0.096mM至19.2mM)。在一个实施例中，2-HIBA的浓度维持在0.05mM至50mM。
在一个实施例中，将2-HIBA加入发酵增加2,3-丁二醇的产生。在一个实施例中，2-HIBA的添加以有利于2,3-丁二醇而改善乙醇与2,3-丁二醇的比率。在特定实施例中，乙醇与2,3-BDO的比率是4:1、或3:1、或2:1、或1:1、或1:2。
在一个实施例中，2,3-丁二醇的生产速率增加至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少110％、或至少120％、或至少130％、或至少140％、或至少150％。
在特定实施例中，微生物能够利用CO以产生浓度为10g/L或更多的2,3-BDO。在特定实施例中，微生物能够利用CO以产生浓度大于12g/L、或大于16g/L、或大于20g/L的2,3-BDO。在一个实施例中，微生物能够以至少10g/L/天、或至少15g/L/天、或至少20g/L/天、或至少25g/L/天的速率产生2,3-丁二醇。
在特定实施例中，微生物能够利用CO以产生浓度为10g/L或更多的乙醇。在特定实施例中，微生物能够利用CO以产生浓度大于15g/L、或大于20g/L、或大于30g/L、或大于40g/L的乙醇。
在一个实施例中，发酵还产生乙酸。在特定实施例中，微生物能够利用CO以产生浓度在10g/L以下或更少的乙酸。
在第一个至第三个方面的实施例中，一种或多种一氧化碳营养产乙酸微生物选自梭菌属(Clostridium)、穆尔氏菌属(Moorella)、产醋杆菌属(Oxobacter)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、乙酸杆菌属(Acetobacterium)、真细菌属(Eubacterium)或丁酸杆菌属(Butyribacterium)。在各个实施例中，微生物选自自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahli)、食羰基化物梭菌(Clostridiumcarboxidivorans)、Clostridium drakei、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、乙酸梭菌(Clostridium aceticum)、蚁酸乙酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、大梭菌(Clostridium magnum)、甲基营养丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrphoicum)、伍氏乙酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴氏嗜喊菌(Alkalibaculum bacchii)、Blautiaproducta、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、热乙酸穆尔氏菌(Moorellathermoacetica)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata)、Sporomusa silvacetica、球形鼠孢菌、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)和凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacter kiuvi)。
在特定实施例中，微生物是自产乙醇梭菌或杨氏梭菌。在一个特定实施例中，微生物是自产乙醇梭菌。在一个特定实施例中，微生物具有登录号DSMZ10061或DSMZ23693的鉴定特征。
在第四个方面，本发明提供了用于增加来源于乙酰乳酸的至少一种产物的生产的方法，该方法包括给生物反应器提供气态底物，以产生至少一种发酵产物，所述生物反应器包含在液体营养培养基中的至少一种重组产乙酸一氧化碳营养微生物的培养物；其中所述至少一种重组微生物具有至少一种遗传修饰，以增加丙酮酸至乙酰乳酸的转化。
在一个实施例中，至少一种遗传修饰选自酮醇酸还原异构酶基因中的失活突变，以及适合提供乙酰乳酸合酶基因的过表达的修饰。
在一个实施例中，重组微生物具有提供与亲本微生物相比较的乙酰乳酸合酶的过表达的修饰；以及酮醇酸还原异构酶基因中的失活突变两者，其中酮醇酸还原异构酶的活性与亲本微生物相比较是减少的。
在一个实施例中，至少一种遗传修饰导致乙酰乳酸的产生增加。在一个实施例中，酮醇酸还原异构酶的活性减少抑制支链氨基酸的产生。在一个实施例中，乙酰乳酸合酶基因的增加活性增加了丙酮酸至乙酰乳酸的转化率。
在第五个方面，本发明提供了一氧化碳营养产乙酸微生物，其包含在酮醇酸还原异构酶基因中的失活突变。
在一个实施例中，在气态底物的生长和/或发酵后，与亲本微生物相比较，一氧化碳营养产乙酸微生物具有减少的将乙酰乳酸转化为支链氨基酸的能力。
在一个实施例中，一氧化碳营养微生物还包含适合提供乙酰乳酸合酶基因的过表达的一种或多种遗传修饰。
在第六个方面，本发明提供了一氧化碳营养产乙酸微生物，其包含适合增加乙酰乳酸合酶的活性水平的一种或多种遗传修饰。
在一个实施例中，适合增加乙酰乳酸合酶的水平的一种或多种遗传修饰选自内源性分解代谢乙酰乳酸合酶的过表达、内源性合成代谢乙酰乳酸合酶的过表达、内源性乙酰乳酸合酶由外源性分解代谢乙酰乳酸合酶的取代、内源性乙酰乳酸合酶由外源性合成代谢乙酰乳酸合酶的取代、以及内源性合成代谢合酶亚基的过表达，所述亚基对通过支链氨基酸的反馈抑制不敏感。
在一个实施例中，在气态底物的生长和/或发酵后，微生物具有与亲本微生物相比较更高的乙酰乳酸生产速率，和/或产生与亲本微生物相比较更高量的乙酰乳酸衍生产物。
在第四个至第六个方面的特定实施例中，亲本微生物是一氧化碳营养微生物。在各个实施例中，一氧化碳营养微生物选自梭菌属、穆尔氏菌属、产醋杆菌属、消化链球菌属、乙酸杆菌属、真细菌属或丁酸杆菌属。在各个实施例中，微生物选自自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、食羰基化物梭菌、Clostridium drakei、粪味梭菌、乙酸梭菌、蚁酸乙酸梭菌、大梭菌、甲基营养丁酸杆菌、伍氏乙酸杆菌、巴氏嗜喊菌、Blautia producta、粘液真杆菌、热乙酸穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、Sporomusa silvacetica、球形鼠孢菌、普氏产醋杆菌和凯伍热厌氧菌。
在特定实施例中，亲本微生物是自产乙醇梭菌或杨氏梭菌。在一个特定实施例中，亲本微生物是自产乙醇梭菌。在一个特定实施例中，亲本微生物具有登录号DSMZ10061或DSMZ23693的鉴定特征。
在一个实施例中，气体底物选自CO、CO2、H2、N2、CH4及其混合物。
在一个实施例中，与使用亲本微生物执行的方法相比较，通过本发明这个方面的方法产生的乙酰乳酸衍生产物的量高至少10％、高至少20％、高至少30％、高至少40％、高至少50％、高至少60％、高至少70％、高至少80％、高至少90％、高至少100％、高至少110％、高至少120％、高至少130％、高至少140％、高至少150％。在一个实施例中，通过本发明这个方面的方法产生的乙酰乳酸衍生产物的量高98％。
在特定实施例中，重组一氧化碳营养产乙酸微生物能够利用CO以产生浓度为10g/L或更多的2,3-BDO。在特定实施例中，微生物能够利用CO以产生浓度大于12g/L、或大于16g/L、或大于20g/L的2,3-BDO。在一个实施例中，微生物能够以至少10g/L/天、或至少15g/L/天、或至少20g/L/天、或至少25g/L/天的速率产生2,3-丁二醇。
在特定实施例中，重组一氧化碳营养产乙酸微生物能够利用CO以产生浓度为10g/L或更多的乙醇。在特定实施例中，微生物能够利用CO以产生浓度大于15g/L、或大于20g/L、或大于30g/L、或大于40g/L的乙醇。在特定实施例中，微生物能够利用CO2和H2以产生浓度在10g/L以下或更少的乙酸。
在特定实施例中，重组一氧化碳营养产乙酸微生物以4:1、或3:1、或2:1、或1:1、或1:2的乙醇与2,3-BDO的比率产生乙醇和2,3-丁二醇。
本发明还包括在本专利申请的说明书中个别或共同提及或指出的部分、元件和特征，所述部分、元件或特征的两个或更多个的任何或所有组合，并且当在本文中提及在本发明涉及的领域中具有已知等价物的特定整数时，此类已知等价物视为并入本文，如同它个别阐述一样。
附图说明
图1显示了2-HIBA添加对发酵的代谢产物谱的影响。
图2显示了基于液体稀释速率和细菌稀释速率的2-HIBA的指数洗出曲线。
图3显示了生物反应器的代谢产物谱，在所述生物反应器中，将2-HIBA连续加入发酵中，使得2-HIBA的浓度维持在0.5g/L(4.8mM)。
图4显示了生物反应器的代谢产物谱，其中连续加入发酵中的2-HIBA量增加至1.0g/L(9.6mM)。
图5显示了生物反应器的气体谱，在所述生物反应器中，将2-HIBA连续加入发酵中，使得2-HIBA的浓度维持在0.5g/L(4.8mM)。
图6显示了生物反应器的气体谱，其中连续加入发酵中的2-HIBA量增加至1.0g/L(9.6mM)。
图7显示了来自2反应器系统的代谢产物谱，在所述2反应器系统中，2-HIBA浓度从0.5g/L(4.8mM)增加至1.0g/L(9.6mM)。
图8：显示了不同的2-HiBA浓度对乙醇：2,3-BDO比率的影响。
图9：显示了在培养基中具有0.05g/L(0.48mM)2-HIBA的发酵的代谢产物谱。
图10：显示了在培养基中具有0.05g/L(0.48mM)2-HIBA的发酵的气体谱。
图11：显示了在100mg(0.96mM)HiBA添加后的支链氨基酸和生物质浓度。
图12：2-HIBA对LZ1561代谢的影响的图示。
图13显示了发酵的代谢产物谱，显示了15mM 2-羟基-2甲基丁酸添加的影响。
图14：显示了在2-HIBA添加前和添加后，在生物反应器中的比较碳平衡。
具体实施方式
本发明提供了通过气态底物的微生物发酵用于产生一种或多种产物的方法。
气态底物选自CO、CO2、H2、N2、CH4及其混合物。本发明提供了用于增加来源于乙酰乳酸的一种或多种产物的产生的方法。
定义
如本文使用的，术语“来源于乙酰乳酸的产物”或“乙酰乳酸衍生产物”或相似术语预期涵盖具有乙酰乳酸前体的发酵产物。这些产物包括但不限于2,3-丁二醇、2-丁酮、2-丁醇和乙偶姻。
术语“支链氨基酸”或相似术语预期涵盖亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。
术语“2,3-丁二醇”应解释为包括化合物的所有对映异构体和非对映异构体形式，包括(R,R)、(S,S)和内消旋形式，以外消旋、部分立体异构纯和/或基本上立体异构纯的形式。
术语“生物反应器”包括由一个或多个容器和/或塔或管道排列组成的发酵装置，所述发酵装置包括连续搅拌釜式反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、鼓泡塔、气升式发酵罐、静态混合器、环管反应器、膜反应器例如中空纤维膜生物反应器(HFM BR)、或者适合于气体-液体接触的其他容器或其他装置。如本文下文描述的，在一些实施例中，生物反应器可包括第一生长反应器和第二发酵反应器。像这样，当提及底物例如包含一氧化碳的底物对生物反应器或发酵反应的添加时，它应理解为包括适当时对这些反应器中任一或两者的添加。
术语“气态底物”和/或“底物”包括任何气体，其含有在发酵中由微生物用作碳源和任选的能源的化合物或元素。气态底物通常含有显著比例的CO、CO2、CH4、H2或其混合物中的任一种。
术语“包含一氧化碳的底物”和相似术语应理解为包括例如其中一氧化碳对一种或多种细菌菌株可用于生长和/或发酵的任何底物。
“包含一氧化碳的气态底物”包括含有一定水平的一氧化碳的任何气体。气态底物通常含有主要比例的CO，优选按体积计至少15％至95％CO。
“包含CO2的底物”包括含有一定水平的二氧化碳的任何底物流。然而，应了解气态底物可以替代形式提供。例如，含有CO2的气态底物可在液体中溶解提供。基本上，液体用含二氧化碳气体饱和，并且随后将该液体加入生物反应器中。这可使用标准方法来实现。例如，可使用微气泡分散体发生器(Hensirisak等人Scale-up of microbubble dispersiongenerator for aerobic fermentation；Applied Biochemistry and Biotechnology第101卷，Number 3/2002年10月)。作为进一步的例子，含有CO2和H2的气态底物可吸附到固体载体上。
如本文使用的，术语“产物”预期涵盖通过微生物发酵产生的物质。产物可包括醇类、酸类或其他化学品。产物还可包括通过微生物发酵工艺产生的气体。
当与发酵工艺相关使用时，术语“增加效率”、“增加的效率”等等包括但不限于增加下述中的一种或多种：催化发酵的微生物的生长速率、在升高的丁二醇浓度下的生长速率和/或产物生产速率、产生的所需产物的体积/消耗的底物体积、所需产物的生产速率或生产水平、以及与发酵的其他副产物相比较产生的所需产物的相对比例。
术语“生产力”或“生产速率”是产物的容产率。在连续系统中，容产率计算为产物的稳态浓度和液体停留时间的比率。在分批系统中，容产率计算为分批系统中的浓度和产生所述浓度所需的时间。容产率报告为g/L/天。
除非上下文另有要求，否则如本文使用的，短语“发酵”、“发酵工艺”或“发酵反应”等等预期涵盖工艺的生长期和产物生物合成期两者。
“亲本微生物”是用于生成本发明的重组微生物的微生物。亲本微生物可为在自然界中存在的微生物(即野生型微生物)，或先前已修饰但不表达或过表达本发明的主题酶中的一种或多种的微生物。相应地，本发明的重组微生物已进行修饰，以表达或过表达在亲本微生物中未表达或未过表达的一种或多种酶。
术语“外源的”指在它们引入其中的微生物外部起源的核酸。外源核酸可来源于任何适当源，包括但不限于：它们要引入其中的微生物(例如重组微生物来源于其的亲本微生物)，不同于它们要引入其中的生物的微生物菌株或菌种，或者它们可为人工或重组制备的。“外源的”还可用于指蛋白质。这指不存在于重组微生物来源于其的亲本微生物中的蛋白质。
如本文与重组微生物和核酸或蛋白质相关使用的，术语“内源的”指存在于重组微生物来源于其的亲本微生物中的任何核酸或蛋白质。
当与本发明相关使用时，“过表达(over-express)”、“过表达(over expression)”以及相似术语和短语应广泛理解为包括：与在相同条件下亲本微生物的蛋白质的表达水平相比较，一种或多种蛋白质的表达中的任何增加。它不应视为意指蛋白质以任何特定水平表达。
虽然下述说明书集中于本发明的特定实施例，即使用CO作为主要底物生产2,3-BDO，但应了解本发明可应用于生产替代醇类和/或酸类和使用替代底物，如本发明涉及领域普通技术人员已知的。更特别地，本发明可应用于使用选自CO、CO2、H2、CH4及其混合物的气态底物，生产来源于乙酰乳酸的产物。
包含一氧化碳的气态底物的微生物发酵以产生诸如乙醇和乙酸酯的产物的工艺是本领域广泛已知的。此类工艺提供了由包含CO的工业废气产生商业上有用的燃料的手段。
相应地，本发明人是设计通过包含CO的气态底物的微生物发酵，用于产生高浓度2,3-丁二醇的工艺的第一人。在第一个阶段，将包含CO的气态底物进料至生物反应器，所述生物反应器含有在液体营养培养基中悬浮的一种或多种微生物的培养物。使气态底物厌氧发酵，以产生一种或多种醇和/或一种或多种酸或其混合物。将化合物提供给发酵以改变发酵的代谢产物谱。
本发明人证实2-羟基异丁酸(2-HIBA)对生物反应器的添加诱导了增加的2,3-BDO生产。在特定实施例中，该工艺产生2,3-BDO和乙醇。通过本发明的方法产生的2,3-丁二醇与乙醇的比率为1:10至10:1。在特定实施例中，该工艺产生以1:4、或1:3、或1:2、或1:1、或1:2比率的2,3丁二醇和乙醇。
本发明人发现2-HIBA以0.01g/L–2.0g/L(0.096至19.2mM)的浓度对发酵的添加显著增加2,3-BDO浓度。2-HIBA的添加还显示显著改善乙醇：2,3-BDO比率。
本发明人已证实2-HIBA可以连续方式以0.01g/L/天–2.0g/L/天(0.096至19.2mM/天)浓度加入发酵系统中，以改善乙醇：2,3-BDO比率，而不影响总体发酵稳定性。
执行碳平衡测量以证实在2-HIBA添加后至增加的2,3-丁二醇生产的转变。碳平衡显示2,3-丁二醇生产中的明确增加，伴随乙醇、乙酸酯和生物质生产中的减少。图14显示了在2-HIBA添加前和添加后，在生物反应器中的比较碳平衡。
本发明人还发现2-HIBA不被细菌吸收或转化为产物。2-HIBA由本发明人证实为增加2,3-BDO的生产且改善乙醇：2,3-BDO比率，而不被发酵消耗。因为2-HIBA不被发酵消耗，所以能够回收离开生物反应器的2-HIBA且将其送回到生物反应器，以改善发酵效率。
2-HIBA的添加影响自产乙醇梭菌的代谢。图12是显示2-HIBA对自产乙醇梭菌代谢的影响的图示。在天然系统中，乙酰乳酸合酶IlvBN的表达和活性通过支链氨基酸合成下调。2-HIBA对发酵的添加抑制酮醇酸还原异构酶IlvC，支链氨基酸生物合成，其导致缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸浓度中的减少。因此，IlvBN酶通过缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的反馈抑制被去除。这引起乙酰乳酸生产中的增加。乙酰乳酸库的增加导致碳至2,3-丁二醇的溢流。乙酰乳酸和乙偶姻至2,3-BDO的转化并非速率限制的，并且至2,3-BDO的转化自由发生，而无需进一步上调负责乙酰乳酸至乙偶姻的转化和/或乙偶姻至2,3-BDO的转化的酶。
2-HIBA是C4羧酸和α羟酸。它是并非由自产乙醇梭菌合成且在自然界中很少发现的化学化合物。
酮醇酸还原异构酶被2-HIBA的存在抑制。考虑具有与2-HIBA和酶作用的底物(乙酰乳酸、2-氧代-3-羟基异戊酸和2,3-二羟基-3-甲基丁酸)相似的结构特征的其他化合物对酮醇酸还原异构酶具有相似作用。酮醇酸还原异构酶的抑制剂包括抑制一种或多种酶的化合物，所述一种或多种酶将乙酰乳酸转化为支链氨基酸。通常，该化合物抑制酮醇酸还原异构酶。
通常，该化合物包含羧酸部分，并且该化合物在对羧酸部分α的碳原子上由羟基或羰基取代。优选地，该化合物包含羧酸部分，并且该化合物在对羧酸部分α的碳原子上由羟基取代。更优选地，该化合物包含羧酸部分，该化合物在对羧酸部分α的碳原子上由羟基取代，并且该化合物在对羧酸部分α的碳原子上是分支的。这意指除了与对羧酸部分α的碳原子键合的羟基之外，还存在也与对羧酸部分α的碳原子键合的一个或两个非氢取代基。
含有一个或多个手性中心的式I的化合物可以对映异构体纯的形式，或异构体混合物的形式使用。为避免疑义，需要时，式I的化合物可以其盐和/或溶剂化物的形式使用。此外，为避免疑义，本发明的化合物可以任何互变异构体形式使用。
通常的盐形式包括具有金属和胺化合物的盐。具有金属的盐可包括具有碱金属(例如钠或钾)和碱土金属(例如钙或镁)的盐。具有胺的盐可包括具有烷基胺、芳烷基胺和杂环胺的盐。
通常，C1-C6烷基是C1-C4烷基，优选C1-C3烷基，在一些情况下，C1-C2烷基。C1-C6烷基的例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基和己基。甲基、乙基和异丙基是优选的。为避免疑义，当两个烷基部分存在于式(I)的化合物中时，烷基部分可为相同的或不同的。通常，烷基部分是未被取代的。
C1-C6羟烷基通常是由一个或多个羟基(-OH)取代的所述C1-C6烷基。通常，它由1、2或3个羟基，优选1或2个羟基，更优选一个羟基取代。通常，C1-C6羟烷基是C1-C4羟烷基，优选C1-C3羟烷基。优选的羟烷基是–C(OH)(CH3)2基团。通常，羟烷基是未被除上述羟基外的基团取代的。
通常，R1是直链或支链C1-C4烷基、直链或支链C1-C4羟烷基或者基团–(C＝O)R，其中R是直链或支链C1-C4烷基。优选地，R1是直链或支链C1-C3烷基、直链或支链C1-C3羟烷基或者基团–(C＝O)R，其中R是直链或支链C1-C3烷基。更优选地，R1是直链或支链C1-C3烷基、支链C3羟烷基或者基团–(C＝O)R，其中R是甲基。最优选地，R1是甲基、乙基、异丙基、–C(OH)(CH3)2基团或基团–(C＝O)R，其中R是甲基。
通常，R2是氢原子或者直链或支链C1-C4烷基、直链或支链C1-C4羟烷基或者基团–(C＝O)R，其中R是直链或支链C1-C4烷基。优选地，R2是氢原子或者直链或支链C1-C3烷基、或者直链或支链C1-C3羟烷基。更优选地，R2是氢原子或甲基或乙基。最优选地，R2是氢原子或甲基。
通常，R1是直链或支链C1-C4烷基、直链或支链C1-C4羟烷基或者基团–(C＝O)R，其中R是直链或支链C1-C4烷基，并且R2是氢原子或者直链或支链C1-C4烷基、直链或支链C1-C4羟烷基或者基团–(C＝O)R，其中R是直链或支链C1-C4烷基。优选地，R1是直链或支链C1-C3烷基、直链或支链C1-C3羟烷基或者基团–(C＝O)R，其中R是直链或支链C1-C3烷基，并且R2是氢原子或者直链或支链C1-C3烷基、或者直链或支链C1-C3羟烷基。更优选地，R1是直链或支链C1-C3烷基、支链C3羟烷基或者基团–(C＝O)R，其中R是甲基，并且R2是氢原子或甲基或乙基。最优选地，R1是甲基、乙基、异丙基、–C(OH)(CH3)2基团或基团–(C＝O)R，其中R是甲基，并且R2是氢原子或甲基。
通常，R1和R2不同时为如上定义的基团–(C＝O)R。通常，R1和R2不同时为如上定义的C1-C6羟烷基。因此，通常，R1如上定义；并且R2是氢原子或者直链或支链C1-C6烷基，优选氢原子或者直链或支链C1-C4烷基，更优选氢原子或甲基或乙基，最优选氢原子或甲基。
在某些情况下，可优选R1和R2均为烷基。在这种情况下，R1是直链或支链C1-C6烷基，并且R2是直链或支链C1-C6烷基。优选地，R1是直链或支链C1-C4烷基，并且R2是直链或支链C1-C4烷基。更优选地，R1是直链或支链C1-C3烷基，并且R2是直链或支链C1-C3烷基。甚至更优选地，R1是甲基或乙基，并且R2是甲基或乙基。最优选地，R1和R2为甲基。
特别优选的式I的化合物是2-羟基异丁酸、2-羟基-2-甲基丁酸、2-羟基丁酸和2-羟基-3-甲基丁酸。2-羟基异丁酸是尤其优选的。因此，特别优选的式I的化合物通常选自下述化合物：
通常，R3是直链或支链C1-C4烷基或者直链或支链C1-C4羟烷基。优选地，R3是直链或支链C1-C3烷基或者直链或支链C1-C3羟烷基。最优选地，R3是异丙基或–C(OH)(CH3)2。特别优选的式II的化合物是2-酮-3-羟基异戊酸和2-酮异戊酸。因此，特别优选的式II的化合物通常选自下述化合物：
酮醇酸还原异构酶抑制剂的例子包括但不限于酮β羟基异戊酸、羟丁酸、羟基α甲基丁酸、羟基异戊酸、酮异戊酸(Arfin等人，Purification and Properties of theAcetohydroxy Acid Isomeroreductase of Salmonella typhimurium.The Journal ofBiomedical Chemistry 1969，第244卷，No.5，第1118-1127页)和草酰异羟肟酸(Aulabaugh等人，Oxalyl Hydroxamates as Reaction-Intermediate Analogues for Ketol-AcidReductoisomerase,Biochemistry 1990,29，第2824-2830页)。影响IlvC途径的化合物的更多例子包括2-羟基-2-甲基丁酸、2-羟基丁酸、2-羟基-3-甲基丁酸、2-酮-3-羟基异戊酸和2-酮异戊酸。
所讨论的抑制性化合物中的一种或多种对发酵的添加增加通过上述支链氨基酸生产抑制的机制来增加乙酰乳酸的产生。乙酰乳酸库的增加导致碳至其他乙酰乳酸衍生产物包括2,3-丁二醇的流动增加。
将抑制性化合物加入液体营养培养基，其浓度足以引发对支链氨基酸生产的抑制性应答，并且增加来源于乙酰乳酸的其他产物的生产。化合物可以连续方式以0.05mM-50mM的浓度加入液体营养培养基中。与不添加化合物的发酵相比较，通过将化合物加入发酵产生的乙酰乳酸衍生产物的量高至少10％、高至少20％、高至少30％、高至少40％、高至少50％、高至少60％、高至少70％、高至少80％、高至少90％、高至少100％、高至少110％、高至少120％、高至少130％、高至少140％、高至少150％。
发酵可在任何合适的生物反应器中进行，例如固定化细胞反应器、气举式反应器、鼓泡塔反应器(BCR)、膜反应器例如中空纤维膜生物反应器(HFMBR)或滴流床反应器(TBR)。另外，在本发明的一些实施例中，生物反应器可包括微生物在其中进行培养的第一生长反应器和第二发酵反应器，来自生长反应器的发酵液可进料给所述第二发酵反应器并在其中可产生大多数发酵产物(例如乙醇和乙酸酯)。本发明的生物反应器适合接纳选自CO、CO2、H2及其混合物的气态底物。
在特定实施例中，微生物是一氧化碳营养菌。在各个实施例中，一氧化碳营养微生物选自梭菌属、穆尔氏菌属、产醋杆菌属、消化链球菌属、乙酸杆菌属、真细菌属或丁酸杆菌属。在各个实施例中，微生物选自自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、食羰基化物梭菌、Clostridiumdrakei、粪味梭菌、乙酸梭菌、蚁酸乙酸梭菌、大梭菌、甲基营养丁酸杆菌、伍氏乙酸杆菌、巴氏嗜喊菌、Blautia producta、粘液真杆菌、热乙酸穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、Sporomusasilvacetica、球形鼠孢菌、普氏产醋杆菌和凯伍热厌氧菌。
在特定实施例中，微生物是自产乙醇梭菌或杨氏梭菌。在一个特定实施例中，微生物是自产乙醇梭菌。在一个特定实施例中，微生物具有登录号DSMZ10061或DSMZ23693的鉴定特征。
用于抑制BCAA合成的重组微生物
本发明的一个方面是提供一氧化碳营养产乙酸微生物，其具有减少的将含碳气态底物转化为支链氨基酸的能力。其为酮醇酸还原异构酶的酶可通过突变失活，以部分或完全减少其活性。如果微生物天然地或通过修饰具有产生有用的来源于乙酰乳酸的含碳化合物的能力，则减少酮醇酸还原异构酶的能力导致有用化合物的积累。
参考图12，乙酰乳酸合酶IlvBN的表达和活性通过支链氨基酸下调。酮醇酸还原异构酶IlvC(催化支链氨基酸生物合成中的步骤的酶)的抑制导致缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸产生中的减少。因此，IlvBN编码基因的表达被活化，并且IlvBN酶通过支链氨基酸的反馈抑制被去除。这引起乙酰乳酸生产中的增加。乙酰乳酸库的增加导致碳至来源于乙酰乳酸的产物包括2,3-丁二醇、乙偶姻、2-丁醇和2-丁酮的通量增加。
可根据本发明进行修饰的微生物包括可制备乙酰乳酸衍生产物例如乙偶姻、丁二醇、丁酮和2-丁醇的任何微生物。微生物还必须具有酮醇酸还原异构酶的基因。酮醇酸还原异构酶可具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
失活突变可通过本领域已知的用于该特定微生物的任何手段进行。化学诱变、转座子诱变、病毒诱变、体外诱变是示例性手段。失活突变可部分减少或完全消除酮醇酸还原异构酶的活性。这些可为例如插入、缺失、取代或无义突变。突变可使微生物的酶活性减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。这可通过减少酶活性本身或减少酶的量来完成。
在某些实施例中，酮醇酸还原异构酶的活性可为完全失活的，如例如在基因敲除的情况下。如果酮醇酸还原异构酶的活性是完全失活的，则必须用支链氨基酸或其中间生物学前体补充发酵。
用于增加乙酰乳酸合成的重组微生物
本发明的一个方面是提供一氧化碳营养产乙酸微生物，其包含适合增加乙酰乳酸合酶活性水平的一种或多种遗传修饰。在气态含碳底物上生长和/或发酵后，微生物产生与亲本微生物相比较增加量的乙酰乳酸。乙酰乳酸合酶可具有根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
“乙酰乳酸合酶”意欲包括分解代谢乙酰乳酸合酶和合成代谢乙酰乳酸(或乙酰羟酸)合酶两者。
适合增加乙酰乳酸合酶水平的一种或多种遗传修饰可包含内源性分解代谢乙酰乳酸合酶的过表达、外源性分解代谢乙酰乳酸合酶的表达、外源性合成代谢乙酰乳酸合酶的表达、内源性合成代谢乙酰乳酸合酶的过表达、内源性乙酰乳酸合酶由外源性分解代谢乙酰乳酸合酶的取代、内源性乙酰乳酸合酶由外源性合成代谢乙酰乳酸合酶的取代、或内源性合成代谢合酶亚基的过表达，所述亚基对通过支链氨基酸的反馈抑制不敏感。
如本文之前提及的，“适合增加乙酰乳酸合酶活性的遗传修饰”应视为广泛包括任何遗传修饰，所述遗传修饰至少增加乙酰乳酸合酶表达、乙酰乳酸生物合成、乙酰乳酸合酶功能和/或乙酰乳酸合酶活性的水平。该短语应视为包括例如：编码一种或多种乙酰乳酸合酶的基因的修饰；对涉及编码乙酰乳酸合酶的基因表达中的遗传调节元件的修饰；编码乙酰乳酸合酶的核酸的引入；产生蛋白质(或增加蛋白质的表达水平、活性或功能)的核酸的引入，所述蛋白质增加乙酰乳酸合酶表达、乙酰乳酸生物合成、乙酰乳酸合酶功能和/或乙酰乳酸合酶活性的水平。技术人员容易了解可制备以实现乙酰乳酸合酶活性中的增加的其他遗传修饰。
以引用的方式全文并入本文的是同时随同提交且如下鉴定的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表：于2014年9月18日创建的名称为"LT97_ST25.txt"的ASCII(文本)文件。
可进行修饰的微生物包括但不限于产乙酸、一氧化碳营养菌，例如梭菌属菌种：自产乙醇梭菌、杨氏梭菌和拉氏梭菌(C.ragsdalei)。可使用的其他一氧化碳营养微生物包括食羰基化物梭菌、Clostridium drakei、粪味梭菌、乙酸梭菌、蚁酸乙酸梭菌、大梭菌、甲基营养丁酸杆菌、伍氏乙酸杆菌、巴氏嗜喊菌、Blautia producta、粘液真杆菌、热乙酸穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌(Moorella thermautotrophica)、卵形鼠孢菌、Sporomusasilvacetica、球形鼠孢菌、普氏产醋杆菌和凯伍热厌氧菌。在一个特定实施例中，微生物选自大肠杆菌(E.coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、C.saccharbutyricum、糖化丙酮丁醇梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)、丁酸梭菌(C.butyricum)、C.diolis、克氏梭菌(C.kluyveri)、巴斯德梭菌(C.pasterianium)、诺维氏梭菌(C.novyi)、艰难梭菌(C.difficile)、热纤梭菌(C.thermocellum)、解纤维素梭菌(C.cellulolyticum)、嗜纤维梭菌(C.cellulovorans)、C.phytofermentans、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。可根据本发明进行修饰的其他细菌包括来自下述属的那些：埃希氏菌属(Escherichia)、酵母属(Saccharomyces)、梭菌属、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、木霉属(Trichoderma)、乙酸杆菌属(Acetobacterium)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、沙门氏菌属(Salmonella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、乳杆菌属(Lactobacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alkaligenes)和短杆菌属(Brevibacterium)。
应注意到对本文描述的目前优选的实施例的各种变化和修饰对于本领域技术人员将是显而易见的。可制备此类变化和修饰而不背离本发明的精神和范围，并且不缩小其伴随优点。因此预期此类变化和修饰包括在本发明的范围内。
发酵
用于由气态底物(例如上文背景部分中所述的那些)产生乙醇及其他醇的工艺是已知的。示例性工艺包括例如WO 2007/117157和WO 2008/115080，以及美国专利号6,340,581、6,136,577、5,593,886、5,807,722和5,821,111中描述的那些，所述专利各自以引用的方式并入本文。
许多厌氧菌已知能够进行气态底物至醇包括正丁醇和乙醇以及乙酸的发酵，并且适用于本发明的工艺中。适用于本发明的此类细菌的例子包括梭菌属的细菌，例如杨氏梭菌菌株，包括WO 00/68407，EP 117309，美国专利号5,173,429、5,593,886和6,368,819，WO98/00558和WO 02/08438中所述的菌株，食一氧化碳梭菌菌株(Clostridiumcarboxydivorans)(Liou等人，International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology 33:第2085-2091页)，以及自产乙醇梭菌菌株(Abrini等人，Archives of Microbiology161:第345-351页)。其他合适的细菌包括穆尔氏菌属的那些细菌，包括穆尔氏菌属菌种HUC22-1(Sakai等人，Biotechnology Letters 29:第1607-1612页)以及一氧化碳嗜热菌属(Carboxydothermus)的那些细菌(Svetlichny,V.A.等人(1991),Systematic and Applied Microbiology 14:254-260)。这些出版物各自的公开内容以引用的方式并入本文。另外，其他一氧化碳营养厌氧菌可由本领域技术人员用于本发明的工艺中。还应了解在考虑本公开内容后，两种或更多种细菌的混合培养物可用于本发明的工艺中。
在本发明的方法中使用的细菌的培养可使用本领域已知用于培养和使用厌氧菌发酵底物的许多过程来进行。示例性技术在下文“实例”部分中提供。作为进一步例子，可利用使用气态底物用于发酵的一般在下述论文中描述的那些过程：(i)K.T.Klasson,等人(1991).Bioreactors for synthesis gas fermentations resources.Conservation andRecycling,5；145-165；(ii)K.T.Klasson,等人(1991).Bioreactor design forsynthesis gas fermentations.Fuel.70.605-614；(iii)K.T.Klasson,等人(1992).Bioconversion of synthesis gas intoliquid or gaseous fuels.Enzyme andMicrobial Technology.14；602-608；(iv)J.L.Vega,等人(1989).Study of GaseousSubstrate Fermentation:Carbon Monoxide Conversion to Acetate.2.ContinuousCulture.Biotech.Bioeng.34.6.785-793；(vi)J.L.Vega,等人(1989).Study of gaseoussubstrate fermentations:Carbon monoxide conversion to acetate.1.Batchculture.Biotechnology and Bioengineering.34.6.774-784；(vii)J.L.Vega,等人(1990).Design of Bioreactors for Coal Synthesis Gas Fermentations.Resources,Conservation and Recycling.3.149-160；所有这些参考文献均以引用的方式并入本文。
在一个实施例中，微生物或亲本微生物选自包括自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食羰基化物梭菌、Clostridium drakei、粪味梭菌、乙酸梭菌、蚁酸乙酸梭菌、大梭菌的一氧化碳营养梭菌。在一个进一步的实施例中，微生物来自包括菌种自产乙醇梭菌、杨氏梭菌和拉氏梭菌以及相关分离株的一氧化碳营养梭菌的簇。这些包括但不限于菌株自产乙醇梭菌JAI-1T(DSM10061)(Abrini,Naveau,&Nyns,1994)、自产乙醇梭菌LBS1560(DSM19630)(WO/2009/064200)、自产乙醇梭菌LBS1561(DSM23693)、杨氏梭菌PETCT(DSM13528＝ATCC55383)(Tanner,Miller,&Yang,1993)、杨氏梭菌ERI-2(ATCC 55380)(美国专利5,593,886)、杨氏梭菌C-01(ATCC55988)(美国专利6,368,819)、杨氏梭菌O-52(ATCC 55989)(美国专利6,368,819)、拉氏梭菌P11T(ATCC BAA-622)(WO 2008/028055)、相关分离株例如“C.coskatii”(US20110229947)和“梭菌属菌种”(Tyurin&Kiriukhin,2012)、或突变株例如拉氏梭菌OTA-1(Tirado-Acevedo O.Production of Bioethanol from Synthesis GasUsing Clostridium ljungdahlii.PhD论文,North Carolina State University,2010)。这些菌株在梭菌rRNA簇I内形成亚簇，并且其16S rRNA基因超过99％相同，具有约30％的相似低GC含量。然而，DNA-DNA再结合和DNA指纹图谱实验显示这些菌株属于不同种(WO 2008/028055)。
上述簇的所有种均具有相似的形态和大小(对数生长的细胞为0.5-0.7x3-5μm)，是嗜温的(最适生长温度为30-37℃)和严格厌氧菌(Abrini等人，1994；Tanner等人，1993)(WO 2008/028055)。此外，它们均共享相同主要系统发育性状，例如相同pH范围(pH 4-7.5，其中最适起始pH为5.5-6)，对含CO气体的强自养生长，伴随相似的生长速率和相似的代谢谱，具有乙醇和乙酸作为主要发酵终产物，以及在某些条件下形成的少量2,3-丁二醇和乳酸(Abrini等人，1994；等人，2011；Tanner等人，1993)(WO 2008/028055)。对于所有三个菌种还观察到吲哚产生。然而，菌种的区别在于多种糖(例如鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如葡糖酸、柠檬酸)、氨基酸(例如精氨酸、组氨酸)或其他底物(例如甜菜碱、丁醇)的底物利用。此外，发现一些菌种对于某些维生素(例如硫胺素、生物素)是营养缺陷型的，而其他菌种则不是。负责气体摄入的Wood-Ljungdahl途径基因的组构和数目已发现在所有菌种中均为相同的，尽管在核酸序列和氨基酸序列中存在差异(等人，2011)。羧酸还原为其相应的醇也已在一系列这些生物中显示(Perez,Richter,Loftus,&Angenent,2012)。这些性状因此并非对一种生物如自产乙醇梭菌或杨氏梭菌特异性的，而是一氧化碳营养、乙醇合成梭菌的相当一般的性状，并且可预料机制跨越这些菌株相似起作用，尽管在表现中可能存在差异(Perez等人，2012)。
适用于本发明的一种示例性微生物是自产乙醇梭菌。在一个实施例中，自产乙醇梭菌是具有在德国生物材料资源中心(German Resource Centre for BiologicalMaterial)(DSMZ)在鉴定保藏号19630下保藏的菌株的鉴定特征的自产乙醇梭菌。在另一个实施例中，自产乙醇梭菌是具有DSMZ保藏号DSM10061的鉴定特征的自产乙醇梭菌。
发酵可在任何合适的生物反应器中进行。在本发明的一些实施例中，生物反应器可包括微生物在其中进行培养的第一生长反应器和第二发酵反应器，来自生长反应器的发酵液进料给所述第二发酵反应器并在其中产生大多数发酵产物(例如乙醇和乙酸酯)。
气态底物
含CO底物
包含一氧化碳的底物，优选包含一氧化碳的气态底物，用于发酵反应中，以在本发明的方法中产生乙醇。气态底物可以是作为工业过程的副产物获得的废气，或来自一些其他来源例如来自内燃机(例如汽车)排烟的废气。在某些实施例中，工业过程选自铁金属产品制造例如钢铁厂、非铁产品制造、石油精炼过程、煤炭气化、电力生产、碳黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造。在这些实施例中，含CO气体可在它排放到大气内之前，使用任何方便的方法从工业过程中捕获。
取决于包含一氧化碳的气态底物的组成，还可期望在将其引入发酵之前处理其，以去除任何不需要的杂质例如尘粒。例如，气态底物可使用已知方法进行过滤或擦洗。
在本发明的其他实施例中，包含一氧化碳的气态底物可来源于生物质气化。气化过程涉及空气或氧气的受限供应中生物质的部分燃烧。所得的气体通常主要包含CO和H2，伴随小体积的CO2、甲烷、乙烯和乙烷。例如，在食品提取和加工期间获得的生物质副产物(例如来自甘蔗的糖，或者来自玉蜀黍或谷物的淀粉)或通过林业产业生成的非食物生物质废物可被气化，以产生适用于本发明的含CO气体。
含CO底物通常含有主要比例的CO，例如按体积计至少约15％至100％CO，按体积计40％至95％CO，按体积计40％至60％CO，以及按体积计45％至55％CO。在特定实施例中，底物包含按体积计25％、或30％、或35％、或40％、或45％、或50％CO、或55％CO、或60％CO。具有较低浓度例如6％CO的底物也可为适当的，特别当还存在H2和CO2时。
气态底物还可例如含有一些CO2，例如按体积计1％至80％，或按体积计1％至30％。在一个实施例中，它含有按体积计5％至10％。在另一个实施例中，气态底物含有按体积计大约20％CO2。
通常，一氧化碳将以气态添加到发酵反应中。然而，本发明不应视为限于这种状态的底物的添加。例如，一氧化碳可以液体提供。例如，液体可由含一氧化碳气体饱和，并且随后该液体被添加到所述生物反应器中。这可使用标准方法来实现。例如，可使用微泡分布发生器(Hensirisak等人Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobicfermentation；Applied Biochemistry and Biotechnology第101卷，Number3/October, 2002)。
在本发明的一个实施例中，两种或更多种不同底物的组合可用于发酵反应中。
另外，通常期望增加底物流的CO浓度(或气态底物中的CO分压)，并且因此增加其中CO是底物的发酵反应的效率。增加气态底物中的CO分压增加CO大量转移到发酵培养基内。用于进料发酵反应的气体流的组成可对该反应的效率和/或成本具有显著影响。例如，O2可降低厌氧发酵工艺的效率。在发酵前或发酵后发酵工艺阶段中不需要或不必要的气体的处理可增加对此类阶段的负担(例如，当气体流在进入生物反应器之前是压缩的时，不必要的能量可用于压缩在发酵中不需要的气体)。相应地，可期望处理底物流，特别是来源于工业源的底物流，以去除不需要的组分且增加所需组分的浓度。
含H2和CO2底物
包含二氧化碳和氢的底物用于发酵反应中，以依照本发明的某些实施例产生乙酸酯。气态底物可以是作为工业过程的副产物获得的废气，如上文与含CO底物相关讨论的。技术人员应理解CO2生产过程并不限于讨论的那些。CO2和H2可来源于任何合适源。CO2和H2可来源于相同源，或可替代地，CO2和H2可来源于不同源，并且随后掺和以产生包含CO2和H2的底物。
包含CO2和H2的底物可包含按体积计至少5％CO2、按体积计至少10％CO2、按体积计至少15％CO2、按体积计至少20％CO2、按体积计至少30％CO2或按体积计至少40％CO2。具有更高浓度例如按体积计至少70％CO2的底物也可为适当的。
包含CO2和H2的底物可包含按体积计至少30％H2、按体积计至少40％H2、按体积计至少50％H2、按体积计至少60％H2、按体积计至少70％H2或按体积计至少80％H2。具有更低浓度H2例如按体积计约5％H2、或按体积计约10％H2、或按体积计约15％H2、或按体积计约20％H2的底物也可为适当的。
作为发酵资源的工业废气
依照本发明的其他方面，工业废气用于发酵反应中，不伴随或仅伴随最低限度的用于使得气体适合于发酵反应的另外擦洗或预处理步骤。
废气可起因于任何数目的工业过程。本发明对支持由气态底物例如含高体积CO2/H2的工业废气的乙醇生产具有特别应用性。例子包括在下述工艺中产生的气体：铁金属产品制造、非铁产品制造、炼油工艺、石油精炼工艺、煤炭气化、生物质气化、电力生产、碳黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造。在某些实施例中，含有CO2/H2的底物来源于生物质或城市固体废物的气化。在本发明的一个特定实施例中，废气在用于制造钢铁的工艺期间生成。例如，本领域技术人员应了解在钢铁制造工艺的各个阶段期间产生的废气具有高CO2和H2浓度。
在钢铁渗碳期间产生的废气任选经过水，以在传递至用于将废气导入大气内的废气烟囱或烟道之前去除颗粒物质。通常，气体用一个或多个风扇驱动到废气烟囱内。
在本发明的特定实施例中，在钢铁脱碳期间产生的至少一部分废气通过合适的导管工具分流到发酵系统。例如，管道或其他转移工具可连接至来自钢铁厂的废气烟囱，以将至少一部分废气分流到发酵系统。再次，一个或多个风扇可用于将至少一部分废气分流到发酵系统内。在本发明的特定实施例中，导管工具适合将在钢铁脱碳期间产生的至少一部分废气提供给发酵系统。用于将气体进料给生物反应器的控制和工具对于本发明涉及领域普通技术人员将是显而易见的。
虽然钢铁厂可适合基本上连续生产钢铁和随后的废气，工艺的特定方面可为间歇性的。通常，钢铁的脱碳是持续几分钟到几小时的分批工艺。像这样，如果测定废气具有期望组成，则导管工具可适合将至少一部分废气，例如在钢铁脱碳期间产生的气体，分流到发酵系统。
在发酵工艺中使用的生物反应器的内容物的pH可根据需要进行调整。适当pH取决于特定发酵反应就使用的营养培养基和微生物而言所需的条件，如本发明涉及领域普通技术人员应了解的。在一个优选实施例中，在利用自产乙醇梭菌的含有CO2的气态底物的发酵中，pH可调整至大约4.5至6.5。进一步例子包括使用热乙酸穆尔氏菌用于产生乙酸的pH5.5至6.5、使用丙酮丁醇梭菌用于产生丁醇的pH 4.5至6.5、以及使用生氢氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus hygrogenaformans)用于产生氢的pH 7。本领域技术人员应知道用于将生物反应器维持在所需pH下的合适手段。然而，例如，水性碱例如NaOH和水性酸例如H2SO4可用于升高和降低发酵培养基的pH且维持所需pH。
本发明的另外益处在于：因为不存在或仅存在最低限度的在其用于发酵反应中之前对废气执行的擦洗和/或其他处理工艺，所以气体将含有起因于工业工艺的另外材料，所述另外材料可至少部分用作发酵反应的原料。
来源于天然气体的合成气也可用于发酵工艺中。存在用于改造天然气体流以产生合成气的众多已知方法。合成气的最终用途可决定最佳合成气性质。改造方法的类型和所使用的操作条件决定合成气浓度。像这样，合成气组成取决于选择的催化剂、转化炉操作温度和压力、以及天然气体与CO2、H2O和/或O2或者CO2、H2O和O2的任何组合的比率。本领域技术人员应理解众多改造技术可用于实现具有所需组成的合成气。
流的掺和
可期望将包含CO和H2的改造底物流与一个或多个进一步流掺和，以便改善发酵反应的效率、醇生产和/或总体碳捕获。不希望受理论束缚，在本发明的一些实施例中，一氧化碳营养菌根据下述将CO转化为乙醇：
6CO+3H2O→C2H5OH+4CO2
然而，在H2的存在下，总体转化可如下：
6CO+12H2→3C2H5OH+3H2O
相应地，具有高CO含量的流可与包含CO和H2的改造底物流掺和，以增加CO:H2比率来优化发酵效率。例如，工业废物流例如来自钢铁厂的废气具有高CO含量，但包括最低限度H2或不含H2。像这样，在将掺和的底物流提供给发酵罐之前，可期望将包含CO和H2的一个或多个流与包含CO的废物流掺和。发酵的总体效率、醇生产力和/或总体碳捕获将取决于掺和流中的CO和H2的化学计量学。然而，在特定实施例中，掺和的流可基本上包含以下述摩尔比的CO和H2：20:1、10:1、5:1、3:1、2:1、1:1或1:2。
另外，可期望在发酵的不同阶段提供以特定比率的CO和H2。例如，具有相对高H2含量(例如1:2CO:H2)的底物流可在开始和/或快速微生物生长的时期过程中提供给发酵阶段。然而，当生长期减慢使得培养物维持在基本上稳定的微生物密度时，CO含量可增加(例如至少1:1或2:1或更高，其中H2浓度可大于或等于零)。
流的掺和还可具有更多优点，特别是在其中包含CO的废物流在性质中是间歇性的情况下。例如，包含CO的间歇性的废物流可与包含CO和H2的基本上连续的改造的底物流掺和，且提供给发酵罐。在本发明的特定实施例中，基本上连续的掺和的流的组成和流速可依照间歇性流而改变，以便维持基本上连续的组成和流速的底物流对发酵罐的供应。
培养基
应了解为了使一种或多种微生物的生长和底物至乙醇和/或乙酸酯的发酵发生，除底物之外，将需要合适的营养培养基以进料给生物反应器。营养培养基含有足以允许所用的微生物生长的组分，例如维生素和矿物质。仅作为例子，适合于自产乙醇梭菌生长的厌氧培养基是本领域已知的，如例如由Abrini等人(Clostridium autoethanogenum,sp.Nov.,An Anaerobic Bacterium That Produces Ethanol From Carbon Monoxide；Arch.Microbiol.,161:345-351(1994))描述的。本文下文“实例”部分提供了合适培养基的更多例子。
生物反应器
发酵可在任何合适的生物反应器中进行，例如固定化细胞反应器、气举式反应器、鼓泡塔反应器(BCR)、膜反应器例如中空纤维膜生物反应器(HFMBR)或滴流床反应器(TBR)。另外，在本发明的一些实施例中，生物反应器可包括微生物在其中进行培养的第一生长反应器和第二发酵反应器，来自生长反应器的发酵液可进料给所述第二发酵反应器并在其中可产生大多数发酵产物(例如乙醇和乙酸酯)。本发明的生物反应器适合接纳含有CO2、H2和任选的CO的底物。
发酵
用于由气态底物产生乙醇及其他醇的工艺是已知的。示例性工艺包括例如WO2007/117157、WO2008/115080、WO2009/022925、WO2009/064200、US 6,340,581、US 6,136,577、US 5,593,886、US 5,807,722和US 5,821,111中描述的那些，所述专利各自以引用的方式并入本文。
发酵条件
发酵应期望地在底物至乙醇和/或乙酸酯的发酵发生的适当条件下进行。应考虑的反应条件包括温度、培养基流速、pH、培养基氧化还原电位、搅动速度(如果使用连续搅拌釜式反应器)、接种物水平、确保底物水平不变成限制性的最大底物浓度和底物对生物反应器的引入速率、以及避免产物抑制的最大产物浓度。
最佳反应条件将部分取决于所用的特定微生物。然而，一般而言，优选在高于环境压力的压力下进行发酵。在增加压力下的操作允许CO从气相到液相的转移速率得到显著提高，其中CO可被微生物作为碳源吸收，以用于乙醇生产。这依次又意指当生物反应器保持在高压而不是大气压力下时，可减少保留时间(定义为生物反应器中的液体体积除以输入气体流速)。
此外，因为给定的CO至产物的转化率部分是底物保留时间的函数，而且实现所需的保留时间依次又指定生物反应器的所需体积，所以加压系统的使用可极大减少所需生物反应器的体积，从而减少发酵设备的资金成本。根据美国专利号5,593,886中给出的例子，反应器体积可与反应器操作压力的增加成线性比例减小，即在10个大气压下操作的生物反应器只需为在1个大气压下操作的生物反应器体积的十分之一。
在高压下进行气体至产物发酵的益处也已在其他地方得到描述。例如，WO 02/08438描述了在30psig和75psig的压力下进行的气体至乙醇的发酵，分别提供150g/l/天和369g/l/天的乙醇生产率。然而，发现在大气压下使用类似的培养基和输入气体组合物进行的示例发酵每天每升产生10至20倍少的乙醇。
适合于包含CO底物厌氧发酵的发酵条件的例子在WO2007/117157、WO2008/115080、WO2009/022925和WO2009/064200中详述。认识到本文报告的发酵条件可依照本发明的方法容易地修改。
发酵产物
本发明的方法可用于产生各种烃产物中的任一种。这包括醇类、酸类和/或二醇类。更特别地，本发明可应用于发酵以产生丁酸酯、丙酸酯、己酸酯、乙醇、丙醇、丁醇、2,3-丁二醇、丙烯、丁二烯、异丁烯和乙烯。在一个实施例中，本发明可用于产生醇类包括但不限于丙醇和丁醇。醇随后可与乙酸酯反应，以产生包括乙酸丙酯或乙酸丁酯的产物。技术人员应理解本发明并不限于所述醇类和产物，任何适当的醇和或酸均可用于产生产物。
这些及其他产物可具有用于许多其他工艺的价值，所述其他工艺例如塑料、药物和农业化学品的产生。在一个实施例中，发酵产物用于产生汽油范围的烃(1-8个碳)、柴油烃(12个碳)或喷气发动机燃料的烃(12个碳)。
本发明的方法还可应用于好氧发酵、其他产物包括但不限于异丙醇的厌氧或好氧发酵。本发明的方法还可应用于好氧发酵、以及其他产物包括但不限于异丙醇的厌氧或好氧发酵。
本发明还提供了通过发酵产生的至少一部分烃产物在流改造工艺中再使用。这可执行是因为除CH4外的烃能够经过催化剂与流反应，以产生H2和CO。在一个特定实施例中，醇再循环以用作流改造工艺的原料。在一个进一步的实施例中，在用于流改造工艺中之前，使烃原料和/或产物经过预转化炉。经过预转化炉部分完成流改造工艺的流改造步骤，这可增加氢生产效率且减少流改造炉的所需容量。
本发明的方法还可应用于好氧发酵、以及其他产物包括但不限于异丙醇的厌氧或好氧发酵。
更特别地，本发明可应用于至乙醇和/或乙酸酯的发酵。这些产物随后可一起反应，以产生化学产物包括酯类。在本发明的一个实施例中，通过发酵产生的乙醇和乙酸酯一起反应，以产生乙酸乙酯。乙酸乙酯可具有用于许多其他工艺的价值，所述其他工艺例如溶剂包括表面涂层和稀释剂的产生以及药物与香料和香精的制造。
产物回收
发酵反应的产物可使用已知方法进行回收。示例性方法包括WO07/117157、WO08/115080、US 6,340,581、US 6,136,577、US 5,593,886、US 5,807,722和US 5,821,111中描述的那些。然而，简要地且作为例子，乙醇可通过诸如分馏或蒸发和萃取发酵的方法从发酵液中回收。
从发酵液中蒸馏乙醇获得乙醇和水的共沸混合物(即95％乙醇和5％水)。无水醇随后可通过使用分子筛乙醇脱水技术而获得，这也是本领域众所周知的。
萃取发酵操作涉及水混溶性溶剂的使用，以从稀释发酵液中回收乙醇，所述水混溶性溶剂对发酵生物呈现低毒性危险。例如，油醇是可在这类萃取工艺中使用的溶剂。将油醇连续引入发酵罐内，其后该溶剂上升，从而在发酵罐顶部形成层，所述层通过离心机被连续萃取且进料。水和细胞随后与油醇容易地分开且送回发酵罐，而充满乙醇的溶剂进料到闪蒸单元。大多数乙醇被蒸发且冷凝，而油醇是非挥发性的且回收用于在发酵中再使用。
可作为发酵反应中的副产物产生的乙酸酯也可使用本领域已知的方法从发酵液中回收。
例如，可使用涉及活性炭滤器的吸附系统。在这种情况下，优选微生物细胞首先使用合适的分离单元从发酵液中回收。生成无细胞发酵液用于产物回收的众多基于过滤的方法是本领域已知的。含有无细胞乙醇和乙酸酯的渗透物随后经过含有活性炭的柱，以吸附乙酸酯。以酸形式(乙酸)而不是盐(乙酸盐)形式的乙酸酯更容易被活性炭吸附。因此优选在发酵液经过活性炭柱之前，使发酵液的pH降低至小于3，以将大多数乙酸酯转化为乙酸形式。
吸附至活性炭的乙酸可使用本领域已知的方法通过洗脱进行回收。例如，乙醇可用于洗脱结合的乙酸酯。在某些实施例中，通过发酵工艺自身产生的乙醇可用于洗脱乙酸酯。因为乙醇的沸点为78.8℃，并且乙酸的沸点为107℃，所以乙醇和乙酸酯可使用基于挥发性的方法例如蒸馏容易地彼此分开。
用于从发酵液中回收乙酸酯的其他方法也是本领域已知的并且可使用。例如，美国专利号6,368,819和6,753,170描述了可用于从发酵液中萃取乙酸的溶剂和共溶剂系统。与对于乙醇的萃取发酵描述的基于油醇的系统的例子一样，美国专利号6,368,819和6,753,170中所述的系统描述了水不能混溶的溶剂/共溶剂，其可在发酵微生物的存在或不存在下与发酵液混合，以便萃取乙酸产物。含有乙酸产物的溶剂/共溶剂随后通过蒸馏与发酵液分开。第二蒸馏步骤随后可用于从溶剂/共溶剂系统中纯化乙酸。
发酵反应的产物(例如乙醇和乙酸酯)可通过下述从发酵液中回收：从发酵生物反应器中连续取出一部分发酵液，使微生物细胞与发酵液分开(方便地通过过滤)，并且同时或随后从发酵液中回收一种或多种产物。在乙醇的情况下，它可方便地通过蒸馏回收，并且乙酸酯可通过在活性炭上吸附而回收，使用上文描述的方法。分开的微生物细胞优选送回发酵生物反应器。在乙醇和乙酸酯已去除后剩余的无细胞渗透物也优选送回发酵生物反应器。另外的营养素(例如B族维生素)可加入无细胞渗透物，以在营养培养基送回生物反应器之前再补足它。另外，如果发酵液的pH如上所述进行调整以增强乙酸对活性炭的吸附，则在送回生物反应器之前，pH应再次调整至与发酵生物反应器中的发酵液的pH相似的pH。
从生物反应器中回收的生物质可经历在消化中的厌氧消化，以产生生物质产物，优选甲烷。该生物质产物可用作用于流改造工艺的原料，或用于产生补充热以驱动本文限定反应中的一种或多种。
一般
本发明的实施例通过举例的方式进行描述。然而，应了解在一个实施例中必要的特定步骤或阶段在另一个实施例中可能是不必要的。相反，在特定实施例的描述中包括的步骤或阶段可任选有利地用于它们在其中未具体提及的实施例中。
虽然本发明就可通过任何已知转移工具移动通过系统或围绕系统移动的任何类型的流而言进行广泛描述，但在某些实施例中，底物流和/或耗尽流是气态的。本领域技术人员应了解特定阶段可通过合适的导管工具等等联接，所述导管工具等等可配置为在系统各处接纳或传递流。可提供泵或压缩机以促进流对特定阶段的递送。此外，压缩机可用于增加提供给一个或多个阶段例如生物反应器的气体的压力。如上文讨论的，在生物反应器内的气体压力可影响本文执行的发酵反应的效率。因此，压力可进行调整，以改善发酵的效率。用于常见反应的合适压力是本领域已知的。
此外，本发明的系统或工艺可任选包括用于调整和/或控制其他参数的工具，以改善工艺的总体效率。一个或多个处理器可并入系统内，以调整和/或控制工艺的特定参数。例如，特定实施例可包括监控底物流和/或耗尽流的组成的测定工具。此外，如果测定工具测定流具有适合于特定阶段的组成，则特定实施例可包括用于控制底物流对特定系统内的特定阶段或元件的递送的工具。例如，在其中气态底物流含有低水平的CO2或H2或者高水平的O2(其对发酵反应可能是有害的)的情况下，则底物流可分流远离生物反应器。在本发明的特定实施例中，系统包括用于监控且控制底物流的目的地和/或流速的工具，使得具有所需或合适组成的流可递送到特定阶段。
此外，在工艺中的一个或多个阶段之前，或在工艺中的一个或多个阶段期间，可能必须加热或冷却特定系统部件或底物流。在此类情况下，可使用已知的加热或冷却工具。例如，热交换器可用于加热或冷却底物流。
此外，系统可包括一个或多个预处理/后处理步骤，以改善特定阶段的操作或效率。例如，预处理步骤可包括用于从气态底物流中去除颗粒物质和/或长链烃或焦油的工具。可进行的其他预操作或后操作包括从特定阶段例如生物反应器生产阶段中分离所需产物(例如通过蒸馏去除乙醇)。
仅作为例子，本发明现在将参考下述实例进行描述。
实例
材料与方法
表1：发酵培养基
生物反应器培养基制备：
用自产乙醇梭菌DSM23693的发酵在1.5L生物反应器中在37℃下进行。培养基根据表1进行制备。为了实现厌氧性，反应器容器用氮进行吹扫。在接种之前，将气体转变成含有H2(3％)、N2(30％)、CO(47％)和CO2(20％)的钢铁厂气体，或纯气体(50％CO、18–40％CO2，余量为N2)。气体流动最初设为67ml/分钟/L，在指数中期增加至200ml/分钟，而搅动从200rpm增加到800。将Na2S以0.25ml/小时注入生物反应器内。一旦OD600达到1.5，就将生物反应器转变成以2.0–1.6d-1的稀释速率和0.9–0.6d-1的细菌稀释速率的连续模式。在连续模式期间，气体和搅动调整至900–950rpm和800-900ml/分钟。Na2S增加至1.0ml/小时。
取样和分析操作：
液体培养物样品在经过发酵持续时间的不同间隔时获取。这些样品用于确定在600nm处的光密度(分光光度计)以及底物和产物的水平(高效液相色谱法-HPLC)。HPLC照常规用于定量乙酸酯、乙醇和2,3-丁二醇的水平。输入和输出气体组成使用气相色谱仪(GC)进行分析，从而允许测量培养物的CO和H2消耗以及CO2生产。
实例1：
在已就2,3-BDO生产进行优化的单一反应器系统上研究2-HIBA的影响。完成这个以确定这种化学品对高效系统具有的影响，并且获得关于不干扰总体发酵稳定性的合适浓度的信息。在第7.95天时，将0.5g/L(4.8mM)2-HIBA加入发酵罐中，来自该添加的结果显示于图1中。2-HIBA的添加改变发酵的代谢产物谱，从而增加2,3-丁二醇的生产，同时减少乙醇、乙酸酯和生物质的生产。
2,3-BDO浓度从6g/L增加到12g/L，从而将比率从4:1下降至低至1.4:1。该添加显示对气体摄入没有有害影响，尽管乙醇和生物质浓度由于添加而减少。2-HIBA的浓度在反应器液体流出中进行监控。这个的结果显示于图2中。曲线指示该初始洗出以类似于稀释速率1.8天-1的速率发生，而2-HIBA的总体洗出匹配细菌稀释速率0.7天-1。结果显示2-HIBA在反应器中不转化。2-HIBA根据细菌稀释速率洗出发酵罐。这是重要的，因为它显示2-HIBA不被细菌消耗。
实例2：
两反应器系统用于检查连续2-HIBA添加对代谢产物谱的影响。最初，仅将0.5g/L/天(4.8mM/天)2-HIBA加入R2，这增加了2,3-BDO的产生，但比率仅下降至低至1.9:1。2-HIBA以0.5g/L/天(4.8mM/天)的连续添加随后加入R1。因为2-HIBA不被细菌转化，所以假定对R1的添加显著增加2,3-BDO的总体产生。这将通过改善R1和R2两者中的浓度来实现，因为2-HIBA从R1转移到R2(通过液体流动)连同改善的2,3-BDO浓度。来自该连续添加的结果显示于图3-6中。2,3-BDO浓度在R1中从5.7g/L增加到14g/L，并且在R2中从16g/L增加到21g/L(参见图3和4)。乙醇：2,3-BDO的比率在R1中下降至1:1，并且在R2中下降至1.3:1，并且对于八天的时期保持稳定。比率的改善由于增加的2,3-BDO浓度和乙醇生产中的下降来实现。
随着时间过去，在2-HIBA添加后的乙醇浓度得到改善，而2,3-BDO的浓度保持稳定，这具有改善系统的总乙醇生产力的作用。如气体数据(图5和6)中所示，2-HIBA的添加不负面影响CO和氢摄入。所有参数均概括于表1和2中。表2显示了跨越八天的稳定操作，在连接的两发酵罐系统中关于R1和R2的代谢产物平均值。表3显示了跨越八天的稳定操作，在连接的两发酵罐系统中关于R1和R2的气体数据平均值。发酵系统由于R1控制单元中的机械故障而丧失稳定性，这导致搅动、温度和pH控制系统故障和发酵的崩溃。
表2：
表3：
实例3：
重复实例2中实现的结果，目的是改善2,3-BDO的总体滴度。在该实验中，2-HIBA浓度增加至1g/L/天(9.6mM/天)。与先前实验中实现的结果一样，气体摄入不受负面影响，并且R2中的乙醇：2,3-BDO比率对于七天的时期保持稳定在1.3:1。1g/L/天(9.6mM/天)添加导致总体2,3-BDO浓度中的改善，其达到高达23.9g/L(参见图7)。
实例4：
测定引发对2,3-丁二醇生产的影响所需的最小浓度
在实例1至3中，测试0.5g/L–1g/L(4.8–9.6mM)的浓度，并且显示显著影响2,3-丁二醇和乙醇的生产。为了理解生成相同效应所需的最小浓度，所用的浓度在一个例子中下降至0.1g/L(0.96mM)，并且在另一个例子中下降至0.05g/L(0.48mM)。两个发酵均具有气体增加，以使乙酸酯生产降到最低且使乙醇生产达到最大。将另外的CO2掺和到气体流内，以使2,3-BDO生产达到最大，所用的气体掺和物为50％CO、35％CO2、1.5％H2，余量为N2。将稀释速率和细菌稀释速率分别调整至1.8天-1和0.8天-1。一旦收集稳定数据，就开始通过培养基的连续2-HIBA添加，并且观察所得到的对代谢产物浓度的影响。关于每个例子在添加前和添加后的数据概括呈现于表4中。在两个例子中，在2-HIBA添加前的比率均为2:1，并且所得到的对乙醇：2,3-BDO比率的影响与所用的2-HIBA浓度成比例。在第一个例子中，当使用0.1g/L(0.96mM)时，比率改善至1:1，并且当浓度减半(在第二个例子中)时，应答是比率中仅至1.5:1的改善。
表4：不同的2-HiBA浓度对两种不同发酵的影响。
在两个进一步实验中，加入从0.01g/L到0.1g/L的浓度(0.096、0.24、0.48、0.72、0.96mM)，并且观察对代谢产物的影响。再次，发酵具有气体增加，以使乙酸酯生产降到最低且使乙醇生产达到最大，其中CO2掺和到气体流内以使2,3-BDO生产达到最大。将稀释速率和细菌稀释速率分别调整至1.8天-1和0.9天-1。所用的气体掺和物为42％CO、35％CO2、1.5％H2，余量为N2。收集来自所有四个实验的数据，显示对于加入稳定发酵中的每0.05g/L(0.48mM)，乙醇：2,3-BDO比率下降0.5单位。这些结果显示于图8中。这些结果显示2-HiBA的影响不依赖于起始乙醇：2,3-丁二醇比率，它还显示低至0.01g/L(0.096mM)的浓度影响2,3-丁二醇的生产。
实例5：
为了察看2-HIBA是否负面影响生长，发酵在0.05g/L(0.48mM)2-HIBA的存在下起始。在生长期间，气体和搅动如此增加，使得到第5.0天时，搅动已达到950rpm和气体流动800ml/分钟的最大值。在这时，稀释速率为1.8天-1，并且细菌稀释速率为0.85天-1。2-HIBA的存在对发酵的生长没有影响，但的确增加低乙醇：2,3-丁二醇比率可如何快速地实现。到第2.0天时，乙醇：2,3-BDO比率已达到2:1，并且随后继续缓慢下降，其中比率最终达到1.1:1，具有17g/L的平均乙醇浓度和15.5g/L的2,3-丁二醇浓度。关于该发酵的结果显示于图9和图10中。这些结果显示能够将2-HiBA加入发酵培养基中，而对生长没有负面影响，其中0.05g/L(0.48mM)足以实现在1:1范围内的乙醇：2,3-BDO比率。
实例6：
2-HIBA基因表达
为了理解2-HIBA对LZ1561代谢的影响，获取样品用于基因表达分析。反应器作为分批起始，并且在1天后，以D＝1.4天-1转为连续的。调整气体流动和搅动，以便使乙酸酯生产降到最低且使乙醇和2,3-BDO生产达到最大。到第7天时，乙醇：2,3-BDO比率小于5:1，并且气体已达到5–6mol/L/天的靶CO摄入。在第9.6天时，获取样品用于基因表达分析，从而代表不含2-HIBA的稳定数据。在第10.78天时，将0.5g/L(4.8mM_2-HIBA作为注射并且随后通过培养基瓶中的添加加入发酵中。在2-HIBA添加后，可见代谢产物中的特征性应答，这包括减少中的乙酸酯、乙醇和生物质，伴随增加中的2,3-BDO。在第13.8天时，获取代表稳定2-HIBA添加的另一份基因表达样品。表5指出其中收集数据用于基因表达分析的两个时间点。在2-HIBA添加前，乙醇：2,3-BDO比率为4:1，在添加后，比率达到1.5:1。发现基因的小子集是显著上调或下调的，这些基因显示于表6和表7中。关于该分析的结果非常明确地指出2-HIBA与支链氨基酸生物合成途径(BCAA)相互作用。根据结果，提出2-HIBA的作用模式，并且这在图11中示出且描述。
表5：获取用于差异基因表达分析的样品
表6：在0mM 2-HIBA添加和4.8mM 2-HIBA添加之间差异上调的基因，这些酶在图4中可见。
实例7：
表7：在0mM 2-HIBA添加和4.8mM 2-HIBA添加之间差异下调的基因
监控在2-HIBA添加期间的BCAA生产
为了生成2-HIBA与支链氨基酸生产相互作用的更多证据，在2-HIBA添加前和添加后直接监控这些氨基酸的浓度。图11示出结果；在2-HIBA添加后，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的浓度以及生物质立即下降。随着时间过去，生物质浓度变平坦，并且异亮氨酸的浓度看起来恢复，而亮氨酸和缬氨酸的浓度保持低于2-HIBA添加前的值。该数据看起来与显示2,3-BDO生产由于支链氨基酸途径的干扰而增加的基因表达数据协作。
其他已知抑制剂的添加
将2-羟基-2-甲基丁酸加入对于2,3-丁二醇生产进行优化的发酵中。基于其与2-HiBA的结构相关性及其在文献中作为ilvC的已知抑制剂的提及，来选择这种化学品。在第13.2天时，将2-羟基-2-甲基丁酸(15mM)的单次添加加入稳定反应器中，并且观察对代谢产物谱的结果。结果显示于图13中。添加看起来增加2,3-丁二醇的生产且下降乙醇：2,3-BDO比率。
实例8：
减少从乙酰乳酸到2,3-二羟基-2-甲基丁酸的通量
为了抑制从乙酰乳酸到2,3-二羟基-2-甲基丁酸的通量，消除酮醇酸还原异构酶基因。这可通过使用ClosTron系统(Heap等人2007)的基因破坏来实现。
酮醇酸还原异构酶基因的敲除要求发酵在补充性支链氨基酸的存在下进行操作，因为它是支链氨基酸的生物合成的所需基因，所述支链氨基酸是微生物生长必需的。支链氨基酸以限制水平加入，使得支链氨基酸生物合成的途径是上调和活性的。
可替代地，通过上述机制消除天然酮醇酸还原异构酶基因(SEQ ID No:1)，并且将具有比天然基因更低活性的外源性酮醇酸还原异构酶基因插入微生物内。外源性酮醇酸还原异构酶基因可为来自另一种生物的同源酶(其在宿主中具有较低的活性)，或具有较低活性的天然酶的突变体。减少活性的对活性位点的突变已在大肠杆菌中得到鉴定(Tyagi等人2005)，并且关键残基在自产乙醇梭菌中是保守的，从而允许这些突变复制以生成活性减少的天然酶的突变体。天然基因的消除和用活性较小基因的替代导致这样的菌株，其具有从乙酰乳酸朝向支链氨基酸的减少通量。可获得的乙酰乳酸库因而增加。
实例9
增加从丙酮酸到2-羟基-2-甲基-3-酮丁酸(乙酰乳酸)的通量
为了增加从丙酮酸到2-羟基-2-甲基-3-酮丁酸(乙酰乳酸)的通量，使天然分解代谢乙酰乳酸合酶过表达。
将天然分解代谢乙酰乳酸合酶基因(alsS)(SEQ ID No:2)克隆到pMTL83155(WO2013185123A1)的NdeI和NheI位点内，以生成过表达质粒，从而在磷酸转乙酰酶-乙酸激酶操纵子的启动子区的控制下表达alsS。
可使用来自另一种微生物的分解代谢乙酰乳酸合酶、天然合成代谢乙酰乳酸合酶、或来自另一种微生物的合成代谢乙酰乳酸合酶，类似地产生过表达质粒。
考虑来自另一种微生物的分解代谢乙酰乳酸合酶或来自另一种微生物的合成代谢乙酰乳酸合酶的使用，可具有朝向丙酮酸的更高亲和力和更快速的反应动力学。还考虑来自另一种微生物的合成代谢乙酰乳酸合酶可以是鉴定为对反馈抑制不敏感的酶。还考虑对反馈抑制不敏感的合成代谢乙酰乳酸合酶突变体的小亚基是过表达的。
将过表达质粒引入自产乙醇梭菌内。这导致适合增加从丙酮酸到乙酰乳酸的通量的自产乙醇梭菌菌株。
本发明已在本文中就某些优选实施例进行描述，以便允许读者无需过度实验而实践本发明。本领域技术人员应当理解本发明可以除具体描述那些外的大量变化和修饰进行实践。应当理解本发明包括所有此类变化和修饰。此外，提供题目、标题等等以帮助读者对本文的理解，而不应被理解为限制本发明的范围。本文引用的所有专利申请、专利和出版物的整体公开内容均以引用的方式并入本文。
更具体地，如本领域技术人员应当理解的，本发明的实施例的实现可包括一种或多种另外元件。仅在其多个方面理解本发明所需的那些元件可能已在具体例子或说明书中显示。然而，本发明的范围并不限于所述实施例，并且包括包含一个或多个另外步骤和/或一个或多个替代步骤的系统和/或方法，和/或省略一个或多个步骤的系统和/或方法。
本说明书中对任何现有技术的提及不是，也不应被视为承认或任何形式的暗示现有技术在任何国家构成努力领域中的公知常识的一部分。
本说明书和随后的任何权利要求自始至终，除非上下文另有说明，否则单词“包含”、“包括”、“含有”等等应以与排除含义相反的包括在内的含义加以解释，即在“包括但不限于”的含义内。
Claims (26)
1.一种增加来源于乙酰乳酸的至少一种产物的生产的方法，所述方法包括：
a.给生物反应器提供气态底物，以产生至少一种发酵产物，所述生物反应器包含在液体营养培养基中的至少一种产乙酸一氧化碳营养微生物的培养物；和
b.抑制碳至支链氨基酸的通量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中抑制碳至支链氨基酸的通量的步骤包括将至少一种化合物加入所述液体营养培养基中。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述至少一种化合物是抑制将乙酰乳酸转化成支链氨基酸的一种或多种酶的化合物；根据权利要求2所述的方法，其中所述至少一种化合物选自在结构上与2-羟基异丁酸(2-HIBA)、乙酰乳酸、2-氧代-3-羟基异戊酸和2,3-羟基-3-甲基丁酸相关的化合物。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述至少一种化合物选自2-羟基异丁酸(2-HIBA)、2-羟基-2-甲基丁酸、2-羟基丁酸、2-羟基-3-甲基丁酸、2-酮-3-羟基异戊酸和2-酮异戊酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种发酵产物选自乙酸、乙醇、2,3-丁二醇、2-丁酮、2-丁醇、乙偶姻、异丙醇、乳酸酯、琥珀酸酯、甲基乙基酮(MEK)、丙二醇、2-丙醇、乙偶姻、异丁醇、柠苹酸酯、丁二烯、聚乳酸、3-羟基丁酸酯、异丁烯、3-羟基丙酸酯(3HP)、丙酮和脂肪酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述来源于乙酰乳酸的至少一种产物选自2,3-丁二醇、2-丁酮、2-丁醇和乙偶姻。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述气态底物选自CO、CO2、CH4、H2及其混合物。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种产乙酸一氧化碳营养微生物选自梭菌属、穆尔氏菌属、产醋杆菌属、消化链球菌属、乙酸杆菌属、真细菌属或丁酸杆菌属。
9.根据权利要求9所述的方法，其中所述产乙酸一氧化碳营养微生物选自自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、食羰基化物梭菌、Clostridium drakei、粪味梭菌、乙酸梭菌、蚁酸乙酸梭菌、大梭菌、甲基营养丁酸杆菌、伍氏乙酸杆菌、巴氏嗜喊菌、Blautia producta、粘液真杆菌、热乙酸穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、Sporomusa silvacetica、球形鼠孢菌、普氏产醋杆菌和凯伍热厌氧菌。
10.一种增加2,3-丁二醇的生产的方法，所述方法包括：
a.给生物反应器提供包含CO的气态底物，以产生至少2,3-丁二醇，所述生物反应器包含在液体营养培养基中的至少一种产乙酸一氧化碳营养微生物的培养物；和
b.给所述液体营养培养基提供抑制碳至支链氨基酸的通量的至少一种化合物。
11.根据权利要求11所述的方法，其中所述发酵还产生选自下述的至少一种产物：乙酸、乙醇、2,3-丁二醇、2-丁酮、2-丁醇、乙偶姻、异丙醇、乳酸酯、琥珀酸酯、甲基乙基酮(MEK)、丙二醇、2-丙醇、乙偶姻、异丁醇、柠苹酸酯、丁二烯、聚乳酸、3-羟基丁酸酯、异丁烯、3-羟基丙酸酯(3HP)、丙酮和脂肪酸。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述至少一种化合物选自2-羟基异丁酸(2-HIBA)、2-羟基-2-甲基丁酸、2-羟基丁酸、2-羟基-3-甲基丁酸、2-酮-3-羟基异戊酸和2-酮异戊酸。
13.根据权利要求13所述的方法，其中所述至少一种化合物是2-HIBA。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述产乙酸一氧化碳营养微生物选自梭菌属、穆尔氏菌属、产醋杆菌属、消化链球菌属、乙酸杆菌属、真细菌属或丁酸杆菌属。
15.根据权利要求11所述的方法，其中2,3-丁二醇以至少10g/L/天的速率产生。
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述发酵还以4:1-1:2的乙醇与2,3-丁二醇比率产生乙醇。
17.一种增加来源于乙酰乳酸的至少一种产物的生产的方法，所述方法包括给生物反应器提供气态底物，以产生至少一种发酵产物，所述生物反应器包含在液体营养培养基中的至少一种重组一氧化碳营养产乙酸微生物的培养物；其中所述至少一种重组微生物具有增加丙酮酸至乙酰乳酸的转化的至少一种遗传修饰。
18.根据权利要求18所述的方法，其中所述至少一种遗传修饰选自酮醇酸还原异构酶基因中的失活突变，以及适合提供乙酰乳酸合酶基因的过表达的修饰。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述重组微生物具有
a.提供与亲本微生物相比较的乙酰乳酸合酶的过表达的修饰；和
b.酮醇酸还原异构酶基因中的失活突变，其中所述酮醇酸还原异构酶的活性与所述亲本微生物相比较是减少的。
20.一种一氧化碳营养产乙酸微生物，所述一氧化碳营养产乙酸微生物包含酮醇酸还原异构酶基因中的失活突变。
21.根据权利要求21所述的一氧化碳营养产乙酸菌，其中在包含CO的底物的生长和/或发酵后，所述微生物具有减少的将乙酰乳酸转化为支链氨基酸的能力。
22.经分离的根据权利要求21所述的产乙酸一氧化碳营养菌，其中所述菌选自自产乙醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌。
23.经分离的根据权利要求21所述的产乙酸一氧化碳营养菌，所述经分离的产乙酸一氧化碳营养菌还包含适合提供乙酰乳酸合酶基因的过表达的一种或多种遗传修饰。
24.一种一氧化碳营养产乙酸微生物，所述一氧化碳营养产乙酸微生物包含适合增加乙酰乳酸合酶的活性水平的一种或多种遗传修饰。
25.根据权利要求25所述的一氧化碳营养产乙酸微生物，其中在包含CO的底物的生长和/或发酵后，所述微生物产生与亲本微生物相比较更高的乙酰乳酸生产速率，和/或产生与亲本微生物相比较更高量的乙酰乳酸衍生产物。
26.根据权利要求25所述的一氧化碳营养产乙酸微生物，其中适合增加乙酰乳酸合酶的水平的所述一种或多种遗传修饰选自内源性分解代谢乙酰乳酸合酶的过表达、内源性合成代谢乙酰乳酸合酶的过表达、外源性分解代谢乙酰乳酸合酶的表达、外源性合成代谢乙酰乳酸合酶的表达、内源性乙酰乳酸合酶由外源性分解代谢乙酰乳酸合酶的取代、内源性乙酰乳酸合酶由外源性合成代谢乙酰乳酸合酶的取代、以及内源性合成代谢合酶亚基的过表达，所述亚基对通过支链氨基酸的反馈抑制不敏感。
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