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CN105713875B - Nk细胞的分选方法 - Google Patents

Nk细胞的分选方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于细胞生物学领域，公开了一种NK细胞的分选方法。本发明提供了一种NK细胞的分选方法，取单个核细胞加入血小板提取物和乙硫醇磷酸酯，然后加入磁珠液混匀后孵育；取孵育后的混合液加入血小板提取物，放入磁珠对应磁极中进行分选，静置后收集上清液。本发明所述分选方法通过添加血小板提取物、乙硫醇磷酸酯，对磁珠、搅拌等外界的损伤作用能起到很好的缓冲保护作用，同时不会影响细胞的分选效率以及NK细胞分选后的培养。实验结果显示采用本发明所述NK细胞的分选方法得到的NK细胞，细胞活率高、增殖速度快，可以获得更高纯度的NK细胞，得到的NK细胞杀伤效果也明显高于常规的分选方法分选得到NK细胞。

Description

NK细胞的分选方法
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种NK细胞的分选方法。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。NK细胞主要分布于外周血中，占PBMC(单个核细胞)5％～10％，淋巴结和骨髓中也有NK活性，但水平较外周血低。由于NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，因此称为自然杀伤活性。NK细胞作用于靶细胞后杀伤作用出现早，在体外1小时、体内4小时即可见到杀伤效应。NK细胞的靶细胞主要有某些肿瘤细胞(包括部分细胞系)、病毒感染细胞、某些自身组织细胞(如血细胞)、寄生虫等，因此NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素，也参与第II型超敏反应和移植物抗宿主反应。
NK细胞是免疫细胞中的一种，在临床的免疫细胞治疗中发挥重要作用，然而从血液中分离的淋巴细胞中的NK细胞含量很低，只有10％左右，即便常规的NK细胞诱导培养，其浓度也仅维持在30％～40％左右，所以在免疫细胞治疗中不能发挥NK细胞很好的光谱杀瘤特点。
细胞分选是一种很好的解决NK细胞纯度不高问题的一种方法。细胞分选是把一种细胞从多细胞群样品中分离出来的一种方法，通常采用抗体标记细胞，同时抗体被荧光标记或连接免疫磁珠，利用荧光和免疫磁珠的特性来分离细胞。一般分正选和负选，正选是标记需要得到的细胞，直接分选需要的细胞，负选是标记不需要的细胞，分选出不要的细胞，从而得到需要的细胞。
现有多种细胞分选试剂盒可适用于NK细胞的分选，现有较优的细胞分选方法如下：
1.样品放入。将包含有目标细胞、标记磁珠和杂散细胞的浑浊液放入样杯中，样杯远离磁场；
2.搅拌混匀：拌头向下插入样杯，缓慢加速旋转，使磁珠与目标细胞充分结合；
3.静置分选。停止搅拌，将样杯放置于分选设备磁场的磁铁上方，调节样杯与磁铁的距离，采用磁力计监测样杯底部磁场强度，调节适合高度，静置5-15分钟，移除上清液，得到分选细胞。
然而上述分选技术中，磁珠的加入，特别是搅拌、离心等过程中伴随着对细胞较大的机械损伤，分选后得到的目标细胞活率偏低以及细胞活性明显降低，对分选细胞的直接应用或后续培养造成很大的影响。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种NK细胞的分选方法。本发明所述分选方法通过添加血小板提取物、乙硫醇磷酸酯，对磁珠、搅拌等外界的损伤作用能起到很好的缓冲保护作用，同时不会影响细胞的分选效率以及NK细胞分选后的培养。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种NK细胞的分选方法，包括
步骤1、取单个核细胞加入血小板提取物和乙硫醇磷酸酯，然后加入磁珠液混匀后孵育；
步骤2、取孵育后的混合液加入血小板提取物，放入磁珠对应磁极中进行分选，静置后收集上清液。
乙硫醇磷酸酯又名氨磷汀，氨磷汀属注射剂，可作为肿瘤放疗或细胞毒性化疗的辅助治疗剂，主要用于各种癌症的辅助治疗。在对肺癌、卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌、骨肿瘤、消化道肿瘤、血液系统肿瘤等多种癌症患者进行化疗前应用乙硫醇磷酸酯，可明显减轻化疗药物所产生的肾脏、骨髓、心脏、耳及神经系统的毒性。
本发明所述分选方法通过添加血小板提取物和乙硫醇磷酸酯，对磁珠、搅拌等外界的损伤作用能起到很好的缓冲保护作用。
其中，在一些实施方案中，步骤1所述血小板提取物的加入量为按每1×106单个核细胞量加入0.02mL-0.1mL血小板提取物。
在一些实施方案中，所述乙硫醇磷酸酯的加入量为按每1×106单个核细胞量加入0.02mL-0.05mL的乙硫醇磷酸酯。
本发明所述分选方法步骤1所述孵育时间优选为5min-10min。
在一些实施方案中，步骤2所述血小板提取物与孵育后的混合液的体积比为1:2-1:3。即步骤2所述血小板提取物的加入量为孵育后的混合液的体积的1/3～1/2。
本发明所述分选方法步骤2所述静置时间优选为5min-15min。
本发明所述分选方法中所述单个核细胞可以由外周血或脐带血分离得到。
在一些实施方案中，所述单个核细胞的制备方法为外周血或脐带血加入生理盐水稀释，缓慢加入到含淋巴细胞分离液的离心管中，使稀释的血液与淋巴细胞分离液分层清晰，400-700g离心15-30min，收集中间白膜层细胞。
优选的，所述生理盐水与外周血或脐带血的体积比为1:1。
优选的，所述淋巴细胞分离液与生理盐水稀释的血液的体积比为1:2。
本发明所述分选方法中所述乙硫醇磷酸酯可以通过商业渠道购买得到。
本发明所述分选方法中所述血小板提取物可以由通过商业渠道购买的血小板提取获得。
在一些实施方案中，所述血小板提取物的制备方法为pH 7.2的磷酸盐缓冲液重悬血小板后，-80℃/37℃反复冻融5次以上，然后4℃下8000g离心30min以去除血小板膜和其他细胞残片，收集上清液。
在一些实施方案中，所述血小板可以从外周血或脐带血中分离得到。所述血小板的制备方法具体为外周血或脐带血加入生理盐水稀释，缓慢加入到含淋巴细胞分离液的离心管中，使稀释的血液与淋巴细胞分离液分层清晰，400-700g离心15-30min，收集上层血浆，200-400g离心5min，取上清1200-1500g离心，收集下层富集的血小板。
进一步的，在一些实施方案中，本发明所述分选方法还包括分选后的培养步骤。
本发明所述分选后的培养具体为分选得到的NK细胞接种X-VIVO15无血清培养基，并添加OKT-3、IL-2、IL-15、IL-21和灭活过滤血浆培养NKT细胞。
在一些实施方案中，所述分选后的培养中所述分选得到的NK细胞接种X-VIVO15无血清培养基的接种量为1×106/mL-2×106/mL。
本发明所述分选后的培养加入了一些细胞因子，包括OKT-3、IL-2、IL-15、IL-21。
在一些实施方案中，本发明所述分选后的培养中所述OKT-3的终浓度为100U/mL-1000U/mL、IL-2的终浓度为100U/mL-1000U/mL、IL-15的终浓度为100U/mL-1000U/mL、IL-21的终浓度为100-1000U/mL。
本发明所述分选后的培养中还添加了灭活过滤血浆。
所述灭活过滤血浆可以通过商业渠道购买或从外周血或脐带血中分离得到。
在一些实施方案中，所述灭活过滤血浆的制备方法为外周血或脐带血加入生理盐水稀释，缓慢加入到含淋巴细胞分离液的离心管中，使稀释的血液与淋巴细胞分离液分层清晰，400-700g离心15-30min，收集上层血浆，56℃灭活后经0.22μm滤器过滤。
在一些实施方案中，本发明所述分选后的培养中所述灭活过滤血浆的添加量为5v/v％。
本发明所述分选后的培养的培养时间优选为14天以上。
进一步的，在一些实施方案中，本发明所述分选后的培养的每隔2-3天补液一次。
其中，每次补液细胞密度为0.5×106/mL-2×106/mL，并添加OKT-3、IL-2、IL-15、IL-21和灭活过滤血浆。
优选的，每次补液OKT-3的终浓度为100U/mL-1000U/mL、IL-2的终浓度为100U/mL-1000U/mL、IL-15的终浓度为100U/mL-1000U/mL、IL-21的终浓度为100U/mL-1000U/mL、灭活过滤血浆的终浓度为5v/v％。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种NK细胞的分选方法，取单个核细胞加入血小板提取物和乙硫醇磷酸酯，然后加入磁珠液混匀后孵育；取孵育后的混合液加入血小板提取物，放入磁珠对应磁极中进行分选，静置后收集上清液。本发明所述分选方法通过添加血小板提取物、乙硫醇磷酸酯，对磁珠、搅拌等外界的损伤作用能起到很好的缓冲保护作用，同时不会影响细胞的分选效率以及NK细胞分选后的培养。实验结果显示采用本发明所述NK细胞的分选方法得到的NK细胞，细胞活率高、增殖速度快，可以获得更高纯度的NK细胞，得到的NK细胞杀伤效果也明显高于常规的分选方法分选得到NK细胞。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示试验例2各组增殖曲线；其中示对比例1分选得到NK细胞、示实施例3分选得到NK细胞、示实施例4分选得到NK细胞、实施例5分选得到NK细胞；
图2示试验例2中对比例1分选得到NK细胞培养14天后细胞表面标记物CD3+CD56+表达情况图；
图3示试验例2中实施例5分选得到NK细胞培养14天后细胞表面标记物CD3+CD56+表达情况图；。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。其中所述乙硫醇磷酸酯(氨磷汀)购自上海辰玺生物科技有限公司。
实施例1：单个核细胞的分离
采集外周血20mL，加入10mL生理盐水稀释，缓慢加入到含淋巴细胞分离液15mL的离心管中，使稀释的血液与淋巴细胞分离液分层清晰，400g-700g离心力，升降速为0，离心15-30min，提取中间白膜层细胞，即得单个核细胞，加生理盐水清洗两遍，计数，细胞量为2×107个-4×107个。
实施例2、血小板提取物的制备
采集外周血20mL，加入10mL生理盐水稀释，缓慢加入到含淋巴细胞分离液15mL的离心管中，使稀释的血液与淋巴细胞分离液分层清晰，400g-700g离心力，升降速为0，离心15-30min，收集上层血浆，200-400g离心5min，取上清1200-1500g离心，收集下层富集的血小板。
pH 7.2的磷酸盐缓冲液重悬血小板后，-80℃/37℃反复冻融5次以上，然后4℃下8000g离心30min，收集上清液-80℃冻存备用。
实施例3、本发明所述NK细胞的分选方法
取实施例1制备得到的单个核细胞(PBMC)4×107个，按每1×106细胞量加入0.02mL血小板提取物和0.02mL的乙硫醇磷酸酯，然后加入德国美天妮的磁珠，孵育5min后加入孵育后的混合液1/3体积的血小板提取物，放入对应的德国美天妮的磁极进行分选，静置15min后收集上清液得到NK细胞。
实施例4、本发明所述NK细胞的分选方法
取实施例1制备得到的单个核细胞(PBMC)4×107个，按每1×106细胞量加入0.1mL血小板提取物和0.05mL的乙硫醇磷酸酯，然后加入德国美天妮的磁珠，孵育10min后加入孵育后的混合液1/2体积的血小板提取物，放入对应的德国美天妮的磁极进行分选，静置5min后收集上清液得到NK细胞。
实施例5、本发明所述NK细胞的分选方法
取实施例1制备得到的单个核细胞(PBMC)4×107个，按每1×106细胞量加入0.05mL血小板提取物和0.03mL的乙硫醇磷酸酯，然后加入德国美天妮的磁珠，孵育8min后加入1/3体积的血小板提取物，放入对应的德国美天妮的磁极进行分选，静置10min后收集上清液得到NK细胞。
对比例1、
取单个核细胞(PBMC)4×107个，加入德国美天妮的磁珠，采用德国美天妮分选试剂盒进行分选，得到NK细胞。
试验例1、细胞活率和流式检测
取实施例1制备得到的单个核细胞、实施例3-5及对比例1分选得到NK细胞进行细胞活率及流式检测，结果见表1。
表1细胞活率及流式检测
组别 细胞活率 CD3-CD56+表达率
PBMC(实施例1) 99.8％ 8.6％
实施例3得到的NK细胞 97.9％ 98.9％
实施例4得到的NK细胞 97.8％ 98.8％
实施例5得到的NK细胞 97.2％ 98.8％
对比例1得到的NK细胞 90.7％ 98.8％
结果显示，初始分离的PBMC中NK细胞含量为8.6％，经分选后，NK细胞比例都达到了99％左右；初始分离的PBMC细胞活率高达99％以上，经分选后，对比例1得到的NK细胞的活率降低明显，在90％左右，而实施例3-5得到的NK细胞的细胞活率仍然有97％以上，明显优于对比例1。
试验例2、分选后NK细胞的诱导培养实验
对实施例3-5及对比例1分选得到NK细胞分别进行诱导培养。
其中，诱导培养的方法具体为：分选得到NK细胞加入1640培养基稀释，400g离心5min，加X-VIVO15无血清培养基重悬，根据细胞量，控制接种密度为1×106/mL-2×106/mL，并添加OKT-3 100U/mL-1000U/mL、IL-2 100U/mL-1000U/mL、IL-15 100U/mL-1000U/mL、IL-21 100-1000U/ml和5v/v％的灭活过滤血浆；每3天补液一次，补液细胞密度为0.5×106/mL-2×106/mL，并添加OKT-3 100U/mL-1000U/mL、IL-2 100U/mL-1000U/mL、IL-15 100U/mL-1000U/mL、IL-21 100U/mL-1000U/mL和5v/v％的灭活过滤血浆，培养至14天收集NK细胞。
每3天进行一次细胞计数，14天后收集培养的细胞进行CD3-CD56+流式细胞检测和对K562细胞的杀伤试验。结果如表2-3及图1-3所示。
表2细胞增殖情况
表3细胞的杀伤结果
注：效靶比为效应细胞NK细胞与靶细胞K562细胞的比例
由表2和图1结果可见，实施例3-5分选得到NK细胞培养后增殖速度明显优于对比例1分选得到NK细胞，且对比例1分选得到NK细胞在培养至第12天开始，细胞开始不增值现象。
由表3和图2和3结果可见，实施例5分选得到NK细胞培养后比例明显高于对比例1分选得到NK细胞，杀伤效率也明显优于对比例1分选得到NK细胞。
实施例3和实施例4分选得到NK细胞培养后杀伤效率也明显优于对比例1分选得到NK细胞。

Claims (9)

1.一种NK细胞的分选方法，其特征在于，包括
步骤1、取单个核细胞加入血小板提取物和氨磷汀，然后加入磁珠液混匀后孵育；
步骤2、取孵育后的混合液加入血小板提取物，放入磁珠对应磁极中进行分选，静置后收集上清液；
其中，所述血小板提取物的制备方法为pH 7.2的磷酸盐缓冲液重悬血小板后，-80℃/37℃反复冻融5次以上，然后4℃下8000g离心30min，收集上清液。
2.根据权利要求1所述的分选方法，其特征在于，步骤1所述血小板提取物的加入量为按每1×106单个核细胞量加入0.02mL-0.1mL血小板提取物。
3.根据权利要求1或2所述的分选方法，其特征在于，所述氨磷汀的加入量为按每1×106单个核细胞量加入0.02mL-0.05mL的氨磷汀。
4.根据权利要求1或2所述的分选方法，其特征在于，步骤1所述孵育时间为5min-10min。
5.根据权利要求1或2所述的分选方法，其特征在于，步骤2所述血小板提取物与孵育后的混合液的体积比为1:2-1:3。
6.根据权利要求1或2所述的分选方法，其特征在于，步骤2所述静置时间为5min-15min。
7.根据权利要求1或2所述的分选方法，其特征在于，所述单个核细胞的制备方法为外周血或脐带血加入生理盐水稀释，缓慢加入到含淋巴细胞分离液的离心管中，使稀释的血液与淋巴细胞分离液分层清晰，400-700g离心15-30min，收集中间白膜层细胞。
8.根据权利要求1所述的分选方法，其特征在于，所述血小板的制备方法为外周血或脐带血加入生理盐水稀释，缓慢加入到含淋巴细胞分离液的离心管中，使稀释的血液与淋巴细胞分离液分层清晰，400-700g离心15-30min，收集上层血浆，200-400g离心5min，取上清1200-1500g离心，收集下层富集的血小板。
9.根据权利要求1或2所述的分选方法，其特征在于，还包括分选后的培养步骤，将分选得到的上清液加入1640培养基稀释，400g离心5min，加X-VIVO15无血清培养基重悬，根据细胞量，控制接种密度为1×106/mL-2×106/mL，并添加OKT-3 100U/mL-1000U/mL、IL-2 100U/mL-1000U/mL、IL-15 100U/mL-1000U/mL、IL-21 100-1000U/mL和以体积比为5％的灭活过滤血浆；每3天补液一次，补液细胞密度为0.5×106/mL-2×106/mL，并添加OKT-3 100U/mL-1000U/mL、IL-2 100U/mL-1000U/mL、IL-15 100U/mL-1000U/mL、IL-21 100U/mL-1000U/mL和以体积比为5％的灭活过滤血浆，培养至14天收集NK细胞。
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