CN105695524B

CN105695524B - 一种利用木质纤维素原料生产生物柴油的方法

Info

Publication number: CN105695524B
Application number: CN201610263482.9A
Authority: CN
Inventors: 龚志伟; 赵觅
Original assignee: Wuhan University of Science and Technology WHUST
Current assignee: Suzhou Weixian Sugar Technology Co ltd
Priority date: 2016-04-26
Filing date: 2016-04-26
Publication date: 2020-07-24
Anticipated expiration: 2036-04-26
Also published as: CN105695524A

Abstract

本发明适用于生物质能源领域，提供一种利用木质纤维素原料生产生物柴油的方法，包括：将微生物油脂经一步碱催化转酯化制备生物柴油产生的碱‑甘油‑甲醇混合溶液预处理木质纤维素原料；原料原位蒸发及冷凝回收甲醇后，加水至适当固液比，酸中和后添加适量的酶进行水解，固液分离获得水解液；接入产油酵母，产油酵母利用水解液中的碳水化合物和甘油合成油脂；收集含油微生物菌体，提取胞内油脂，采用一步碱催化转酯化制备生物柴油，加正己烷萃取，上层获得生物柴油，下层为碱‑甘油‑甲醇溶液，这里碱‑甘油‑甲醇溶液再循环用于木质纤维素的预处理。本方法中，强碱、副产物甘油和甲醇被用于预处理木质纤维素，同时甘油还作为产油微生物的碳源被原位整合再利用，大大降低了成本，具有显著的经济效益。

Description

一种利用木质纤维素原料生产生物柴油的方法

技术领域

本发明属于生物炼制与生物能源技术领域，尤其涉及一种利用木质纤维素原料生产生物柴油的方法。

背景技术

自然界中某些微生物在特定条件下，能够以碳水化合物、碳氢化合物、二氧化碳等为碳源，在体内合成并贮存大量油脂，凡是可以在胞内积累油脂并超过细胞干重20％(w/w，这里w/w表示质量比，下同)的微生物称为产油微生物。某些产油微生物胞内积累的油脂甚至超过其细胞干重的70％。微生物油脂，尤其是产油真菌产生的油脂，其主要成份是甘油三酯，脂肪酸组成与商品化的动植物油脂相似，以C₁₄-C₂₂长链脂肪酸为主。相对于动植物油脂，微生物油脂生产周期短，不受季节与气候限制，原料来源广，基本不占用额外耕地资源，易于实现规模生产，是极具潜力的新型油脂资源。微生物油脂不仅可以作为食用油或其他功能性油脂的替代品，还可以为生物柴油产业可持续发展提供原料。

木质纤维素材料来源广泛、是自然界中最丰富的可再生资源之一，据测算年总产量高达1500亿吨，其化学成份主要是纤维素、半纤维素和木质素，蕴藏着巨大的碳水化合物资源。纤维素完全水解主要产物为葡萄糖；半纤维素水解可得到木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等的混合物。廉价的木质纤维素原料主要有以玉米秸秆、玉米芯、稻草和麦秆为代表的农业废弃物，以树木、枝杈和锯末为代表的林业废弃物，以甘蔗渣和甜高粱渣等为代表的工业废弃物等。目前我国对木质纤维素资源的利用尚不完善，大部分未得到合理开发利用。利用木质纤维素水解液培养产油微生物，有望大幅度降低原料成本，并使规模化制备微生物油脂的原材料得到保障。

然而，目前木质纤维素基原料的经济性不如传统的糖质原料，主要是由于生物质抗降解特性(biomass recalcitrance)，导致很难通过经济、高效的方式降解木质纤维素获取产油微生物利用的可发酵性糖。木质纤维素通常需要先经过物理、化学、物理化学或生物的方法进行预处理，破坏木质纤维素的抗降解结构，降低纤维素的结晶度、增加原料的孔隙率、提高酶的可及度和脱除木质素的保护作用，从而提高木质纤维素的酶解效率。预处理通常需要加入化学试剂或者较高的能耗，成本高。另外，诱发产油酵母过量积累油脂，通常需要培养基中的碳水化合物过量，而缺乏产油酵母生长繁殖的其它必要成分，包括氮、磷、硫、铁、锌和溶氧等。氮限制是微生物调控油脂积累最常用的策略，较高的C/N比有利于油脂积累。然而，木质纤维素原料通常氮含量较高，另外其降解过程中添加水解酶，也会引入一定量的氮源，导致水解液C/N比较低，产油微生物以菌体增殖为主，油脂产量和油脂得率较低。

通过木质纤维素原料为碳源培养产油微生物，然后进行碱催化转酯化制备生物柴油有望从根本上解决制备生物柴油的油脂资源问题。然而，当前该技术路线存在着生产成本高、油脂产量低、副产物资源化利用困难、废水处理的突出问题。绿色、经济、高效地利用木质纤维素制备生物柴油是目前能源生物技术领域的研究难点和热点。

发明内容

鉴于上述问题，本发明的目的在于提供一种利用木质纤维素原料生产生物柴油的方法，旨在解决现有方法生产成本高、油脂产量低、副产物难资源化利用的突出问题。

产油微生物积累的胞内油脂主要为中性脂，其主要成分为三酰甘油，游离脂肪酸含量非常低，可通过简单的一步碱催化转酯化制备生物柴油。转酯化反应后产生副产物甘油的同时，残留大量的碱催化剂和未反应的甲醇。本发明提出一种利用木质纤维素原料生产生物柴油的方法，可以充分利用碱催化转酯化的副产物甘油以及残余碱催化剂和未反应的甲醇，以提木质纤维素转化制备生物柴油的技术经济性，大大降低了成本，具有显著的经济效益。本发明方法具体包括如下步骤：

取微生物油脂经一步碱催化转酯化制备得到的生物柴油，加正己烷萃取并静置分层，上层液通过蒸发除去正己烷收获生物柴油产品，下层液获得含碱催化剂、副产物甘油和未反应甲醇的混合溶液；

将木质纤维素原料与所述混合溶液按固液质量比5％～50％混合均匀，并高温预处理，然后原位蒸发及冷凝回收甲醇，原料加水至固液质量比5％～25％，采用酸中和，添加适量的木质纤维素降解酶进行水解，固液分离后获得水解液，调整水解液的pH值至4～9，最后灭菌处理，所述水解液中包含有由木质纤维素降解得的可发酵性生物质糖；

取产油微生物并在种子培养基中培养，得到产油微生物种子液，将所述产油微生物种子液接种至所述水解液中，接种量为2％-20％，于20℃-37℃通气培养，直至发酵液中残余碳水化合物和甘油的浓度总和低于5g/L，终止发酵，固液分离收集产油微生物菌体，所述接种量为体积比；

提取所述产油微生物菌体的胞内油脂，采用一步碱催化转酯化制备生物柴油，制备得到的生物柴油中包含碱催化剂、副产物甘油和甲醇的溶液，用于循环预处理木质纤维素。

本发明的有益效果是：本发明将微生物油脂制备生物柴油过程中的碱催化剂-副产物甘油-未反应甲醇溶液作为预处理介质处理木质纤维素原料，可显著提高木质纤维素的酶可及性，葡萄糖得率可达95％以上，木糖得率可达到80％以上；强碱和甲醇可先后用于碱催化转酯化和木质纤维素的预处理，降低了试剂成本；甘油可先后作为木质纤维素的预处理介质和产油酵母的碳源被转化为微生物油脂，整个生物柴油生产方法没有副产物甘油的净产出；高糖得率，以及预处理的甘油，提高了水解液中C/N比，使微生物能够更好地将碳源导向油脂合成，显著提高油脂的产量。因此，本发明提供的利用木质纤维素原料生产生物柴油的工艺，实现了原料循环，可大大降低成本，具有非常好的应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例提供的利用木质纤维素原料生产生物柴油的方法的流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明是将微生物油脂经一步碱催化转酯化制备生物柴油过程中的碱催化剂-副产物甘油-未反应甲醇的混合溶液用于木质纤维素的预处理，酶水解获得大量可发酵性糖，糖和甘油可作为碳源，强化油脂发酵过程，生产微生物油脂。

结合图1所示，本发明方法具体包括如下步骤：

步骤S101、获取强碱-甘油-甲醇的混合溶液。

取微生物油脂采用一步碱催化转酯化方法制备生物柴油，加入一定量的正己烷充分震荡，萃取并静置分层，上层液通过蒸发除去正己烷收获生物柴油产品，下层液获得含碱催化剂、副产物甘油和未反应甲醇的混合溶液。所述碱催化剂为KOH或NaOH。所述强碱-甘油-甲醇的混合溶液中，碱催化剂的质量浓度为0.2％～2％，副产物甘油的质量浓度为1％～5％，甲醇的质量浓度为80％～90％，余量为油脂、皂、无机盐和微量水等。

步骤S202、预处理木质纤维素原料。

将木质纤维素原料与所述混合溶液按固液质量比5％～50％混合均匀，优选为10％-50％混合，并高温预处理，温度为80℃～180℃，时间为15min～4h，显著提高原料的酶可及性。本发明所适用的木质纤维素为主要成份为纤维素、半纤维素和木质素的生物质材料。包括玉米秸秆、玉米芯、稻草、稻壳和麦秆等农业生物质，树木、枝杈和锯末等林业生物质，甘蔗渣、甜菜渣和甜高粱渣等工业生物质，水葫芦和稗子等杂草，柳枝稷和芒草等能源植物中的一种或二种以上组合。

步骤S203、制备木质纤维素水解液。

预处理后的原料原位蒸发及冷凝除甲醇，回收得到的甲醇用于碱催化转酯化反应的原料反复使用。然后加水稀释至固液质量比5％～25％(w/v)，采用酸中和，这里使用硫酸、盐酸、磷酸、醋酸或柠檬酸调节pH值至4.5～5.5，再添加适量的木质纤维素降解酶进行降解，将预处理的木质纤维素中的纤维素和半纤维素降解成可发酵性生物质糖，水解液中包括但不限于甘油、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、纤维寡糖、木寡糖、半乳糖醛酸等。固液分离，调整水解液的pH值至4～9，最后灭菌处理备用。另外，在调整水解液pH值前，也可以少量添加其它微生物培养常用的营养物质，包括氮源、磷源、硫源、无机盐、维生素或它们的组合，制备产油微生物培养基。所述木质纤维素降解酶为具有降低碳水化合物聚合物的聚合度的酶，包括纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、果胶酶等的一种或它们的组合。

步骤S204、培养产油微生物。

取产油微生物并在种子培养基中培养，温度设置为30℃，200rpm振荡培养24h，得到产油微生物种子液。将所述产油微生物种子液接种至所述水解液中，接种量为2％-20％，于20℃-37℃通气培养，直至发酵液中残余碳水化合物和甘油的浓度总和低于5g/L，终止发酵，固液分离收集产油微生物菌体，所述接种量为体积比。

所述产油微生物为经发酵后菌体油脂含量可超过细胞干重20％的产油酵母，它们包括但不限于下列之一：油脂酵母(如斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi)、红酵母(如圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides、粘红酵母Rhodotorula glutinis和掷孢酵母Sporobolomyces roseus)、丝孢酵母(如皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum和发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans)、隐球酵母(如白色隐球酵母Cryptococcus albidus和弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus)。这些菌株可以直接从中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、美国典型培养物保藏中心(ATCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)、或英国国家菌株保藏中心(UKNCC)等菌种保藏机构购买或从自然界中分离，也可以使用与原来菌株性状不同的人工或自然突变菌株。

步骤S205、碱催化转酯化制备生物柴油。

提取所述产油微生物菌体的胞内油脂，具体的，将步骤S204发酵终止后的发酵液经离心、洗涤，收集菌体沉淀。菌体在105℃干燥至恒重，即得干菌体，使用酸热-有机溶剂法抽提获得油脂，计算菌体油脂含量。采用一步碱催化转酯化制备生物柴油。然后转至步骤S101，获得强碱-甘油-甲醇混合溶液，再循环用于木质纤维素的预处理。这里微生物油脂主要为长链脂肪酸及其衍生物的甘油酯，经转酯化后，可制成生物柴油。微生物油脂含有的不饱和脂肪酸还可用于制备其他高附加值产品。

本发明将微生物油脂经一步碱催化转酯化制备生物柴油过程中，得到的碱催化剂-副产物粗甘油-未反应甲醇的混合溶液作为预处理介质，处理木质纤维素类生物质原料，原料原位蒸发及冷凝回收甲醇后，加水至适当固液比，采用硫酸中和，添加适量的酶进行水解，固液分离获得水解液，水解液灭菌后接入产油酵母，产油酵母利用水解液中的碳水化合物和甘油合成油脂，提取的微生物油脂，采用一步碱催化转酯化制备生物柴油，获得碱性粗甘油甲醇溶液，再循环用于木质纤维素的预处理。该方法中，强碱-甘油-甲醇混合溶液为生物柴油生产过程中的副产物，被用于预处理木质纤维素，能够显著提高木质纤维素的酶水解得率，获得大量可发酵性糖，且可大大降低预处理的成本；副产物甘油还作为产油酵母的碳源被原位整合再利用，另外，高的糖化率和预处理的甘油，可提升木质纤维素水解液的C/N比，有利于微生物油脂大量合成，提高油脂得率。该方法，显著提高了木质纤维素转化制备生物柴油的技术经济性，大大降低了成本，具有显著的经济效益。

下面通过具体实施例来对本发明进行说明。以下实施例选取了典型的利用木质纤维素原料生产生物柴油的工艺例子，有助于了解本发明，但不以任何形式限制将本发明应用于其他材料或产油菌株。

对比例1

1)玉米秸秆水解液的制备：称取50g过40目筛的玉米秸秆，加入2％(w/w)的稀H₂SO₄溶液中，固液比10％(w/w)，于120℃预处理60min；调整固液比至8％(w/w)，添加纤维素酶15FPU/g、β-葡萄糖苷酶30CBU/g和木聚糖酶50U/g，调整pH至4.8，于水浴摇床中50℃、200rpm水解48h，得水解液；水解液煮沸10min，真空抽滤得水解上清液，得到培养基，其中葡萄糖和木糖浓度分别为23.2g/L和14.4g/L，C/N比28，调整pH至6.0后于121℃灭菌15min后备用；

2)在种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨3g/L)中接入弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus ATCC 20509(购自美国典型微生物菌种保藏管理中心)，30℃，200rpm振荡培养24h，得种子液；

3)向步骤1)所得培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量10％(v/v)，在30℃下通气培养72h；

4)终止发酵，此时发酵液中已检测不到葡萄糖和木糖；固液分离收集菌体，得干菌体14.8g/L，油脂量3.7g/L，油脂含量25.2％(w/w)。

5)一步碱催化转酯化：对获得的微生物油脂，加入2％KOH-甲醇溶液40mL，65℃下反应1h，加入正己烷萃取生物柴油，静置，上层液蒸发除正己烷收获生物柴油，得率为94％。

对比例2

1)稻草水解液的制备：称取20g过20目筛的稻草，加入2％(w/w)的KOH水溶液中，固液比12.5％(w/w)，于80℃预处理2h；调整固液比至5％(w/w)，添加纤维素酶20FPU/g、β-葡萄糖苷酶40CBU/g和木聚糖酶100U/g，调整pH至4.5，于水浴摇床中50℃、200rpm水解72h，得水解液；水解液煮沸10min，真空抽滤得水解上清液，得到培养基，其中葡萄糖和木糖浓度分别为12.1g/L和6.3g/L，C/N比30，调整pH至5.5后于121℃灭菌15min后备用；

2)在种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨3g/L)中接入圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides AS 2.1389(购自中国微生物菌种保藏管理中心)，30℃，200rpm振荡培养24h，得产油微生物种子液；

3)向步骤1)所得培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量10％(v/v)，在30℃下通气培养48h；

4)终止发酵，此时发酵液中已检测不到葡萄糖和木糖；固液分离收集菌体，得干菌体7.5g/L，油脂量2.4g/L，油脂含量31.8％(w/w)。

5)一步碱催化转酯化：对获得的微生物油脂，加入2％KOH-甲醇溶液50mL，70℃下反应1h，加入正己烷萃取生物柴油，静置，上层液蒸发除正己烷收获生物柴油，得率为92％。

实施例1

1)玉米秸秆预处理及水解液的制备：称取50g过40目筛的玉米秸秆，加入200gKOH-甘油-甲醇溶液(KOH 2g，甘油4g，甲醇194g)，固液比25％(w/w)，于预处理罐中180℃处理15min；原位蒸发及冷凝回收甲醇，加水调整固液比至10％(w/w)，加H₂SO₄调整pH至4.8，添加纤维素酶15FPU/g、β-葡萄糖苷酶30CBU/g和木聚糖酶100U/g，于水浴摇床中50℃、200rpm水解48h，得水解液；水解液煮沸10min，真空抽滤得水解上清液，其中葡萄糖、木糖和甘油浓度分别为30.1g/L、18.5g/L和15.8g/L，C/N比72，调整pH至6.0后于121℃灭菌20min后备用；

2)在种子培养基(甘油20g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨3g/L)中接入弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus ATCC 20509(购自美国典型微生物菌种保藏管理中心)，30℃，200rpm振荡培养24h，得产油微生物种子液；

3)向水解液中接入产油微生物种子液，接种量10％(v/v)，在30℃下通气培养120h；

4)终止发酵，此时发酵液中已检测不到葡萄糖、木糖和甘油；固液分离收集菌体，得干菌体22.8g/L；酸热法提取微生物油脂，得油脂量12.2g/L，油脂含量53.2％(w/w)。

5)一步碱催化转酯化：对获得的微生物油脂，加入2％KOH-甲醇溶液200mL，65℃下反应1h，加入正己烷萃取生物柴油，静置，上层液蒸发除正己烷收获生物柴油，得率为92％；下层液获得含碱催化剂、副产物甘油和未反应甲醇的混合溶液，调整三者的相对比例，再循环用于木质纤维素的预处理。

实施例2

1)稻草预处理及水解液的制备：称取20g过20目筛的稻草，加入40g KOH-甘油-甲醇溶液(KOH 0.2g，甘油2g，甲醇37.8g)，固液比50％(w/w)，于预处理罐中80℃处理2h；原位蒸发除去甲醇，加水调整固液比至5％(w/w)，加H₂SO₄调整pH至4.5，添加纤维素酶20FPU/g、β-葡萄糖苷酶40CBU/g和木聚糖酶100U/g，于水浴摇床中50℃、200rpm水解72h，得水解液；水解液煮沸10min，真空抽滤得水解上清液，其中葡萄糖、木糖和甘油浓度分别为14.5g/L、8.4g/L和4.8g/L，C/N比62，调整pH至5.5后于121℃灭菌15min后备用；

3)向水解液中接入产油微生物种子液，接种量10％(v/v)，在30℃下通气培养72h；

4)终止发酵，此时发酵液中已检测不到葡萄糖、木糖和甘油；固液分离收集菌体，得干菌体10.9g/L；酸热法提取油脂，得油脂量5.5g/L，油脂含量50.8％(w/w)。

5)碱催化转酯化：对获得的油脂，加入0.2％KOH-甲醇溶液100mL，70℃下反应1h，加入正己烷萃取生物柴油，静置，上层蒸发除正己烷收获生物柴油，得率为96％；下层获得含碱催化剂、副产物甘油和未反应甲醇的溶液，调整三者的相对比例，再循环用于木质纤维素的预处理。

实施例3

1)棉花秆预处理及水解液的制备：称取10g过40目筛的棉花秆，加入100g NaOH-甘油-甲醇溶液(NaOH 2g，甘油2.5g，甲醇90g)，固液比10％(w/w)，于预处理罐中140℃处理2h；原位蒸发除去甲醇，加水调整固液比至25％(w/w)，加H₃PO₄调整pH至5.5，添加纤维素酶15FPU/g、β-葡萄糖苷酶30CBU/g和木聚糖酶100U/g，于水浴摇床中50℃、200rpm水解72h，得水解液；水解液煮沸10min，真空抽滤得水解上清液，其中葡萄糖、木糖和甘油浓度分别为81.1g/L、54.5g/L和60.8g/L，C/N比102，调整pH至6.0后于121℃灭菌15min后备用；

2)斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1560(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)接种在种子培养基(甘油20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨3g/L)中，28℃，200rpm振荡培养48h，得产油微生物种子液；

3)向水解液中接入产油微生物种子液，接种量10％(v/v)，在30℃下通气培养240h；

4)终止发酵，此时发酵液中残余甘油、葡萄糖和木糖浓度分别为0g/L、0g/L和3.1g/L；固液分离收集菌体，得干菌体70.6g/L，油脂量37.8g/L，油脂含量53.6％(w/w)。

5)碱催化转酯化：对获得的油脂，加入2％NaOH-甲醇溶液150mL，所用甲醇源自预处理后回收的甲醇，65℃下反应2h，加入正己烷萃取生物柴油，静置，上层蒸发除正己烷收获生物柴油，得率为94％；下层获得含碱催化剂、副产物甘油和未反应甲醇的溶液，调整三者的相对比例，再循环用于木质纤维素的预处理。

实施例4

1)稻壳预处理及水解液的制备：称取50g过40目筛的稻壳，加入100gKOH-甘油-甲醇溶液(KOH 2g，甘油5g，甲醇80g)，固液比50％(w/w)，于预处理罐中160℃处理1h；原位蒸发及冷凝回收甲醇，加水调整固液比至5％(w/w)，加醋酸调整pH至4.8，添加纤维素酶10FPU/g、β-葡萄糖苷酶20CBU/g和木聚糖酶80U/g，于水浴摇床中50℃、200rpm水解48h，得水解液；水解液煮沸5min，真空抽滤得水解上清液，其中葡萄糖、木糖和甘油浓度分别为17.5g/L、11.4g/L和4.8g/L，C/N比72，调整pH至6.0后于121℃灭菌15min后备用；

2)掷孢酵母Sporobolomyces roseus IAM 13481(购自日本JCM菌株保藏中心)接种在种子培养基(葡萄糖30g/L，硫酸铵5g/L，酵母粉0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L)中，30℃，200rpm振荡培养24h，得产油微生物种子液；

3)向水解液中接入产油微生物种子液，接种量15％(v/v)，在30℃下通气培养72h；

4)终止发酵，此时发酵液中检测不到甘油、葡萄糖和木糖；固液分离收集菌体，得干菌体10.9g/L，油脂量6.1g/L，油脂含量56.1％(w/w)。

5)碱催化转酯化：对获得的油脂，加入5％KOH-甲醇溶液100mL，65℃下反应2h，加入正己烷萃取生物柴油，静置，上层蒸发除正己烷收获生物柴油，得率为95％；下层获得含碱催化剂、副产物甘油和未反应甲醇的溶液，调整三者的相对比例，再循环用于木质纤维素的预处理。

实施例5

1)甘蔗渣预处理及水解液的制备：称取50g过80目筛的甘蔗渣，加入125g KOH-甘油-甲醇溶液(KOH 2g，甘油4g，甲醇102g)，固液比40％(w/w)，于预处理罐中100℃处理4h；原位蒸发及冷凝回收甲醇，加水调整固液比至20％(w/w)，加柠檬酸调整pH至4.8，添加纤维素酶20FPU/g、β-葡萄糖苷酶40CBU/g和木聚糖酶100U/g，于水浴摇床中50℃、200rpm水解72h，得水解液；水解液煮沸10min，真空抽滤得水解上清液，其中葡萄糖、木糖和甘油浓度分别为70.1g/L、42.5g/L和15.8g/L，C/N比122，调整pH至6.0后于121℃灭菌15min后备用；

2)皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum AS 2.571(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)接种在液体种子培养基(甘油20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L)中，32℃，200rpm振荡培养20h，得产油微生物种子液；

3)向水解液中接入产油微生物种子液，接种量20％(v/v)，在32℃下通气培养192h，得种子液；

4)终止发酵，此时发酵液中已检测不到葡萄糖和甘油，木糖残余2.8g/L；固液分离收集菌体，得干菌体34.8g/L，油脂量23.4g/L，油脂含量67.2％(w/w)。

5)碱催化转酯化：对获得的油脂，加入1％KOH-甲醇溶液300mL，65℃下反应1h，加入正己烷萃取生物柴油，静置，上层蒸发除正己烷收获生物柴油，得率为93％；下层获得含碱催化剂、副产物甘油和未反应甲醇的溶液，调整三者的相对比例，再循环用于木质纤维素的预处理。

实施例6

1)小麦秆预处理及水解液的制备：称取50g过40目筛的小麦秸秆，加入200g NaOH-甘油-甲醇溶液(NaOH 4g，甘油9g，甲醇180g)，固液比25％(w/w)，于预处理罐中180℃处理30min；原位蒸发除去甲醇，加水调整固液比至10％(w/w)，加H₂SO₄调整pH至4.8，添加纤维素酶15FPU/g、β-葡萄糖苷酶30CBU/g和木聚糖酶100U/g，于水浴摇床中50℃、200rpm水解72h，得水解液；水解液煮沸10min，真空抽滤得水解上清液，其中葡萄糖、木糖和甘油浓度分别为32.1g/L、16.5g/L和17.8g/L，C/N比72，调整pH至5.0后于121℃灭菌15min后备用；

2)白色隐球酵母Cryptococcus albidus ATCC 56298(购自美国典型培养物保藏中心)接种在YEPD种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L)中，20℃，200rpm振荡培养28h，得产油微生物种子液；

3)向水解液中接入产油微生物种子液，接种量12％(v/v)，在20℃下通气培养180h；

4)终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖、木糖和甘油的浓度分别为0g/L，1.5g/L和0.4g/L；固液分离收集菌体，得干菌体20.9g/L，油脂量12.2g/L，油脂含量58.8％(w/w)。

5)碱催化转酯化：对获得的油脂，加入2％NaOH-甲醇溶液250mL，70℃下反应1h，加入正己烷萃取生物柴油，静置，上层蒸发除正己烷收获生物柴油，得率为96％；下层获得含碱催化剂、副产物甘油和未反应甲醇的溶液，调整三者的相对比例，再循环用于木质纤维素的预处理。

实施例7

1)锯末预处理及水解液的制备：称取50g过40目筛的锯末，加入168g KOH-甘油-甲醇溶液(KOH 3g，甘油6g，甲醇150g)，固液比30％(w/w)，于预处理罐中170℃处理45min；原位蒸发及冷凝回收甲醇，加水调整固液比至8％(w/w)，加H₂SO₄调整pH至4.8，添加纤维素酶15FPU/g、β-葡萄糖苷酶30CBU/g和木聚糖酶100U/g，于水浴摇床中50℃、200rpm水解72h，得水解液；水解液煮沸10min，真空抽滤得水解上清液，其中葡萄糖、木糖和甘油浓度分别为26.1g/L、15.5g/L和9.5g/L，C/N比85，调整pH至6.0后于121℃灭菌15min后备用；

2)圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides AS 2.1389(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)接种在种子培养基(甘油20g/L，玉米浆5g/L)中，37℃，200rpm振荡培养24h，得产油微生物种子液；

3)向水解液中接入产油微生物种子液，接种量20％(v/v)，在37℃下通气培养102h；

4)终止发酵，此时发酵液中检测不到葡萄糖、木糖和甘油；固液分离收集菌体，得干菌体18.7g/L，油脂量9.5g/L，油脂含量50.8％(w/w)。

5)碱催化转酯化：对获得的油脂，加入1.5％KOH-甲醇溶液250mL，65℃下反应1h，加入正己烷萃取生物柴油，静置，上层蒸发除正己烷收获生物柴油，得率为96％；下层获得含碱催化剂、副产物甘油和未反应甲醇的溶液，调整三者的相对比例，再循环用于木质纤维素的预处理。

实施例8

1)云杉预处理及水解液的制备：称取20g过80目筛的云杉，加入200g KOH-甘油-甲醇溶液(KOH 3g，甘油10g，甲醇180g)，固液比10％(w/w)，于预处理罐中80℃处理3h；原位蒸发及冷凝回收甲醇，加水调整固液比至8％(w/w)，加H₂SO₄调整pH至5.0，添加纤维素酶15FPU/g、β-葡萄糖苷酶30CBU/g和木聚糖酶100U/g，于水浴摇床中50℃、200rpm水解72h，得水解液；水解液煮沸10min，真空抽滤得水解上清液，其中葡萄糖、木糖和甘油浓度分别为27.1g/L、14.5g/L和38.8g/L，C/N比120，调整pH至6.0后于121℃灭菌15min后备用；

2)粘红酵母Rhodotorula glutinis AS 2.703(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)接种在YEPD种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L)中，30℃，200rpm振荡培养28h，得种子液，得产油微生物种子液；

3)向水解液中接入产油微生物种子液，接种量2％(v/v)，在30℃下通气培养160h；

4)终止发酵，此时发酵液中残余木糖0.5g/L；固液分离得干菌体24.1g/L，油脂量15.6g/L，油脂含量64.8％。

5)碱催化转酯化：对获得的油脂，加入1.5％KOH-甲醇溶液250mL，65℃下反应1h，加入正己烷萃取生物柴油，静置，上层蒸发除正己烷收获生物柴油，得率为94％；下层获得含碱催化剂、副产物甘油和未反应甲醇的溶液，调整三者的相对比例，再循环用于木质纤维素的预处理。

实施例9

1)柳枝稷预处理及水解液的制备：称取100g过20目筛的柳枝稷，加入675g NaOH-甘油-甲醇溶液(NaOH 10g，甘油30g，甲醇600g)，固液比15％(w/w)，于预处理罐中180℃处理15min；原位蒸发及冷凝回收甲醇，加水调整固液比至10％(w/w)，加H₂SO₄调整pH至4.8，添加纤维素酶15FPU/g、β-葡萄糖苷酶30CBU/g和木聚糖酶100U/g，于水浴摇床中50℃、200rpm水解72h，得水解液；水解液煮沸10min，真空抽滤得水解上清液，其中葡萄糖、木糖和甘油浓度分别为36.1g/L、21.5g/L和29.4g/L，C/N比72，调整pH至6.0后于121℃灭菌15min后备用；

2)弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus ATCC 20509(购自美国典型培养物保藏中心)接种在种子培养基(甘油20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨3g/L)中，28℃，200rpm振荡培养24h，得产油微生物种子液；

3)向水解液中接入产油微生物种子液，接种量5％(v/v)，在28℃下通气培养180h；

4)终止发酵，此时发酵液中残余甘油1.5g/L；固液分离收集菌体，得干菌体28.1g/L，油脂量16.5g/L，油脂含量58.7％(w/w)。

5)碱催化转酯化：对获得的油脂，加入1％NaOH-甲醇溶液1000mL，70℃下反应1h，加入正己烷萃取生物柴油，静置，上层蒸发除正己烷收获生物柴油，得率为94％；下层获得含碱催化剂、副产物甘油和未反应甲醇的溶液，调整三者的相对比例，再循环用于木质纤维素的预处理。

实施例10

1)甜高粱渣预处理及水解液的制备：称取50g过40目筛的甜高粱渣，加入250gKOH-甘油-甲醇溶液(KOH 5g，甘油20g，甲醇200g)，固液比20％(w/w)，于预处理罐中120℃处理2h；原位蒸发及冷凝回收甲醇，加水调整固液比至15％(w/w)，加H₂SO₄调整pH至4.8，添加纤维素酶25FPU/g、β-葡萄糖苷酶50CBU/g和木聚糖酶100U/g，于水浴摇床中50℃、200rpm水解72h，得水解液；水解液煮沸10min，真空抽滤得水解上清液，其中葡萄糖、木糖和甘油浓度分别为52.1g/L、34.5g/L和58.6g/L，C/N比132，调整pH至9.0后于115℃灭菌30min后备用；

2)发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans CICC 1368(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)接种在种子培养基(甘油20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L)中，32℃，200rpm振荡培养28h，得产油微生物种子液；

3)向水解液中接入产油微生物种子液，接种量12％(v/v)，在32℃下通气培养144h；

4)终止发酵，此时发酵液中残余甘油2.7g/L，最终得干菌体40.7g/L，油脂量27.8g/L，油脂含量68.3％(w/w)。

5)碱催化转酯化：对获得的油脂，加入2％KOH-甲醇溶液300mL，65℃下反应2h，加入正己烷萃取生物柴油，静置，上层蒸发除正己烷收获生物柴油，得率为93％；下层获得含碱催化剂、副产物甘油和未反应甲醇的溶液，调整三者的相对比例，再循环用于木质纤维素的预处理。

上述对比例和实施例中，油脂量乘以生物柴油得率即可得到最终的生物柴油含量。

上述对比例1、2和实施例1-14的结果如下表所示：

比较对比例1、实施例1，以及比较对比例2和实施例2的实验结果发现，本发明将微生物油脂经一步碱催化转酯化制备生物柴油过程中，得到的碱催化剂-粗甘油-甲醇的混合溶液，对木质纤维素进行预处理，再通过适量的酶进行水解，固液分离获得水解液中，可以得到更多量的葡萄糖和木糖，可见，通过强碱-粗甘油-甲醇混合溶液预处理木质纤维素可深度破坏木质纤维素紧密结构，更有利于纤维素和半纤维素的酶水解。

此外，结合实施例3-10，两个对比例中C/N比(摩尔比)较低，而十个实施例中，由于预处理介质中存在甘油，以及较高的糖化率，使得水解液中C/N比适中，使得最终生物量(即干菌体含量)、油脂量产量和生物柴油产量都显著提高，水解液中的主要碳水化合物葡萄糖和木糖基本可被彻底利用，总的油脂得率也明显提高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种利用木质纤维素原料生产生物柴油的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

取微生物油脂经一步碱催化转酯化制备得到的生物柴油，加正己烷萃取并静置分层，上层液通过蒸发除去正己烷收获生物柴油产品，下层液获得含碱催化剂、副产物甘油和未反应甲醇的混合溶液，调整混合溶液中碱催化剂、副产物甘油和甲醇的相对比例，使得碱催化剂质量浓度为0.2%~2%，副产物甘油的质量浓度为1%~5%，甲醇的质量浓度为80%~90%；

将木质纤维素原料与调整比例后的混合溶液按固液质量比5%~50%混合均匀，并高温预处理，然后原位蒸发及冷凝回收甲醇，回收的甲醇用作碱催化转酯化的原料反复使用，加水至固液质量比5%~25%，采用酸中和，添加适量的木质纤维素降解酶进行水解，固液分离后获得水解液，调整水解液的pH 值至 4~9，最后灭菌处理，所述水解液中包含有由木质纤维素降解得的可发酵性生物质糖；

取产油微生物并在种子培养基中培养，得到产油微生物种子液，将所述产油微生物种子液接种至所述水解液中，接种量为2%-20%，于20℃-37℃通气培养，直至发酵液中残余碳水化合物和甘油的浓度总和低于5 g/L，终止发酵，固液分离收集产油微生物菌体，所述接种量为体积比；

提取所述产油微生物菌体的胞内油脂，采用一步碱催化转酯化制备生物柴油，制备得到的生物柴油中包含碱催化剂、副产物甘油和甲醇的溶液，用于循环预处理木质纤维素，这里所述产油微生物为经发酵培养后菌体油脂含量超过细胞干重20%的产油酵母。

2.如权利要求1 所述方法，其特征在于，所述木质纤维素原料与所述混合溶液的固液质量比10%~50%，预处理温度为80℃~180℃，时间为15 min~4 h。

3.如权利要求1 所述方法，其特征在于，所述木质纤维素为含有纤维素、半纤维素和木质素的生物质材料。

4.如权利要求1 所述方法，其特征在于，所述酸中和采用硫酸、盐酸、磷酸、醋酸、柠檬酸之一。

5.如权利要求1-4 任一项所述方法，其特征在于，所述木质纤维素降解酶为具有降低碳水化合物聚合物的聚合度的酶。

6.如权利要求1-4 任一项所述方法，其特征在于，所述碳水化合物主要成分为葡萄糖和木糖，另外还含有阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、纤维二糖和半乳糖醛酸。