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CN105688274A - 一种聚己内酯/明胶电纺复合支架的制备工艺 - Google Patents

一种聚己内酯/明胶电纺复合支架的制备工艺 Download PDF

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CN105688274A CN201610036207.3A CN201610036207A CN105688274A CN 105688274 A CN105688274 A CN 105688274A CN 201610036207 A CN201610036207 A CN 201610036207A CN 105688274 A CN105688274 A CN 105688274A
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Abstract

本发明公开了一种聚己内酯/明胶电纺复合支架的制备工艺，属于生物组织工程支架技术领域，它依次包括仿生细胞外基质支架材料聚己内酯/明胶纳米纤维电纺膜的制备工艺、涂覆有羟基磷灰石晶体的电纺膜的制备方法和电纺复合支架的构建方法。本发明通过将涂覆有羟基磷灰石晶体的电纺膜与PCL/GE电纺膜结合构建了一种类似天然骨组织的细胞外基质（ECM）结构。制备的电纺复合支架无明显细胞毒性，内部支架结构与天然骨组织的ECM成分类似，外层结构可阻止外周结缔组织的侵入。且具有良好的生物相容性，可有效促进骨组织再生；既能为新骨再生提供稳定的环境，还能模拟正常骨组织细胞外基质的结构和功能。

Description

一种聚己内酯/明胶电纺复合支架的制备工艺
技术领域
本发明涉及生物组织工程支架技术领域，具体涉及是一种聚己内酯/明胶电纺复合支架的制备工艺。
背景技术
严重创伤、肿瘤切除、感染、先天性畸形等所造成的骨缺损的治疗是现代医学面临的难题和巨大挑战，一直是人类几个世纪以来不断深入研究和探索的重要课题。目前临床上常用的修复手段有自体骨移植、异体骨移植以及使用人工骨等，但以上方法均存在一定缺陷：自体骨移植是公认的骨组织修复的金标准，但是患者要经受自体组织移植手术的创伤，而且供区有限，因此，自体骨移植不能视为理想的骨缺损的修复方法；异体骨移植存在免疫排斥反应、疾病传播等风险，有时甚至危及病人生命；人工骨植入容易导致异物排斥反应、感染等。因此，有必要寻找一种新的骨缺损的修复手段。
在此情况下，组织工程学的兴起和发展，为骨缺损的修复提供了新的可能，为弥补目前骨缺损治疗方法的缺陷带来了希望。骨组织工程学是应用生命科学和工程学的原理及技术，构建、培育活组织，研制生物替代物，以修复或重建骨的天然结构、维持或改善其功能。骨组织工程包括支架、细胞和生长因子这三要素。支架为细胞的生长代谢提供场所；种子细胞增殖分化后形成新生组织；生长因子是具有诱导和刺激细胞增殖、维持细胞表型、控制细胞分化等生物学效应的蛋白类物质，其对促进细胞增殖、组织或器官的再生修复都具有重要的作用。三者相互依存，缺一不可。
组织工程支架是骨组织工程的核心环节之一。它为细胞的生长，营养和气体交换、废物排泄和生长代谢提供场所。支架不仅影响细胞的附着、增殖和分化，而且决定着移植后，组织工程骨能否与自体骨组织相适应并融合在一起，修复缺损骨组织并发挥功能。
一个理想的骨组织工程支架应该模拟天然细胞外基质的纤维状结构以及组织特定的生物学功能。因此，理想的骨组织工程支架应具备以下条件：
1.良好的生物相容性，即无明显的细胞毒性、不致畸形，降解产物对细胞无毒害作用，不引起炎症反应和免疫排斥，还要有利于种子细胞的粘附、增殖，更重要的是能激活细胞特异的基因表达，维持正常细胞的表型表达；
2.可降解性和降解速率的可控性，即与细胞、组织生长速率相适应的降解吸收速率；
3.适宜的孔尺寸、高的孔隙率和相连的孔形态，较大的比表面积。这种结构可以提供宽大空间，以利于大量细胞的粘附、细胞和组织的生长、细胞外基质的形成、氧气和营养的传输、代谢物的排泄以及血管和神经的内生长；
4.特定的三维外形，以获得所需的组织或器官形状；
5.一定的机械强度和韧性，即与植入部位组织的力学性能相匹配的结构强度，以在体内生物力学微环境中保持结构稳定性和完整性，并为植入细胞提供合适的微应力环境，为新生组织提供支持；
6.易加工、易塑形、易于消毒和保存。
目前骨组织工程支架材料包括无机材料和有机材料两大类。
有机材料在硬组织修复替代领域最早应用于骨骼，并被广泛用作骨修复材料，主要包括聚乳酸（PLA）、聚乙酸（PGA）、聚乙交酯-丙交酯共聚物（PLGA）、聚ε-己内酯(PCL)、聚酸酐、聚磷腈、聚原酸酯等。有机材料中研究较多的是聚羟基酸类（主要包括PLA、PGA、PLGA）。这一类高分子聚合物由于其良好的生物相容性已获得美国FDA批准，广泛应用于医学领域。其中，PLGA是由PLA和PGA形成的高分子共聚物，改变PLA与PGA的比例，可调节PLGA的力学强度及其在体内的降解时间。PLGA具有很好的组织相容性，已被美国FDA批准用于临床，是迄今应用最多的骨修复材料之一。但PLGA机械强度较差、降解产物略呈酸性，易引起体内炎症反应，而且由于PLGA表面亲水性差，分子链中缺乏活性功能基团，其生物活性稍差，使其与特定细胞相互作用变得比较困难。
用于骨组织工程支架的无机材料主要包括羟基磷灰石（HA）、磷酸三钙（TCP）以及其他种类的陶瓷材料等。这类生物陶瓷材料由于其具有良好的生物活性和生物相容性，成为广泛应用的植骨代用品。尽管其具有良好的生物相容性及一定的降解性、较高的化学稳定性和较强的骨传导及骨诱导性等优点。但是这种材料具有不易塑形、强度不足、脆性大、降解率低等缺点。羟基磷灰石（hydroxyapatite，HAp）是人体骨骼及牙体硬组织中主要的无机物成分，具有良好的生物相容性和安全性。人工合成的HAp广泛应用于骨充填材料与生物材料涂层中，能起到促进骨组织再生的作用。但是HAp在自然骨组织中是以纳米颗粒有序的沉积与骨胶原中，而常见的人工HAp具有粒径大、降解时间长、机械强度差等特点。研究显示根据仿生学原理，将具有成骨活性的材料浸泡于模拟体液(simulatedbodysolution,SBF)可以在材料表面形成纳米级的类骨羟基磷灰石。
明胶是I型胶原蛋白水解的产物，具有良好的生物相容性、无细胞毒性、可完全降解，并且降解产物无毒性，因此国内外许多研究将明胶作为组织工程支架材料。
由于有机、无机的单一材料都存在一些不足，很难满足理想的骨组织工程支架所要求的特性，所以可以通过合适的方法将几种单一材料复合，形成复合型材料，取长补短，以解决理想的骨支架的问题。生物复合材料是指由两种或两种以上不同材料复合而成的生物材料。研究表明，几乎所有的生物体组织都是由两种或两种以上的材料所构成。利用不同性质的单一材料复合形成复合材料，不仅兼具单一材料的性质，而且还可能得到单一材料所不具备的新的特性。
目前，将复合材料运用于骨组织工程研究，制备新型的复合生物材料，是国内外生物医用材料领域的研究热点和难点之一。比如，合成材料可以容易地加工成不同的形态和结构，设计制造过程中能对材料的许多性能进行控制，包括机械强度、亲水性、降解速率等。与之相比，天然材料不易加工，物理性能受限，但天然材料具有特殊的生物活性，并且通常不易引发受体的免疫排斥反应。因此实现材料优化设计的途径之一，是将合成材料与天然成分复合在一起形成复合材料，这对于构建较理想的骨组织工程支架具有重要作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种聚己内酯/明胶电纺复合支架的制备工艺，通过将涂覆有羟基磷灰石晶体的电纺膜与PCL/GE电纺膜结合构建了一种类似天然骨组织的细胞外基质(ECM)结构。制备的电纺复合支架无明显细胞毒性，内部支架结构与天然骨组织的ECM成分类似，外层结构可阻止外周结缔组织的侵入。在动物实验中显示骨组织工程支架具有良好的生物相容性，可有效促进骨组织再生；既能为新骨再生提供稳定的环境，还能模拟正常骨组织细胞外基质（Extracellularmatrix，ECM）的结构和功能。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：
本发明所述的一种聚己内酯/明胶电纺复合支架的制备工艺，它依次包括仿生细胞外基质支架材料聚己内酯/明胶纳米纤维电纺膜的制备工艺、涂覆有羟基磷灰石晶体的电纺膜的制备方法和电纺复合支架的构建方法。
优选地，所述仿生细胞外基质支架材料聚己内酯/明胶纳米纤维电纺膜的制备工艺具体包括如下步骤：
A1.分别称取一定量的聚已内酯和B型明胶，将聚已内酯和B型明胶分别溶于一定体积的三氟乙醇中；
A2.将完全溶解于三氟乙醇中的聚已内酯和B型明胶混合成均质溶液；
A3.将步骤（2）所得均质溶液转入接有注射泵的微量注射器内，注射针头接有18KV的高压电源正极，电源负极连接10×10cm锡箔用于接收电纺纤维；
A4.调节微量注射器的推进速率和电源正负电极间的距离；
A5.开启高压电源，一定时间后将聚己内酯/明胶电纺纤维膜经戊二醛蒸汽熏蒸交联1.5h，得到仿生细胞外基质支架材料聚己内酯/明胶纳米纤维电纺膜。
优选地，步骤A1中所述聚已内酯和B型明胶分别与三氟乙醇按质量比均为1:14。
优选地，步骤A4中调节微量注射器的推进速率至1-1.5ml/h，电源正负电极间的距离调节至12cm。
优选地，所述涂覆有羟基磷灰石晶体的电纺膜的制备方法具体包括如下步骤：
B1.十倍模拟体液（10×SBF）的制备：在800ml蒸馏水中依顺序加入58.443gNaCl、0.373gKCl、3.675gCaCl2·2H2O、1.017gMgCl2·6H2O、1.120gNaH2PO4，完全溶解后，定容至1000ml得到PH为4.1的10×SBF准备液，4℃保存备用；
B2.用NaHCO3调节所述步骤B1所得的10×SBF准备液的PH至6.5，得到10×SBF工作液；
B3.将所述步骤A5所得的电纺膜浸入10×SBF溶液中，浸泡1-3h；
B4.用双蒸水漂洗所述步骤B3所得产物2遍，然后常温下自然风干，即得到涂覆有羟基磷灰石晶体的电纺膜。
优选地，所述步骤B3中将步骤A5所得的电纺膜浸入10×SBF溶液中，优选浸泡时间为2h。
优选地，所述电纺复合支架的构建方法具体包括如下步骤：
C1.将质量体积分数为15%的B型明胶加入到甲基丙烯酸酐中，50℃水浴反应1h；
C2.将所述步骤C1中水浴后的产物在去离子水中透析48小时；
C3.将所述步骤C2中透析后的产物冷冻干燥24h，将冻干后的材料溶解为0.1g/ml的明胶-甲基丙烯酰胺溶液；
C4.将所述步骤B4中得到的涂覆有羟基磷灰石晶体的电纺膜裁剪成10×8mm规格后浸入所述步骤C3所得的明胶-甲基丙烯酰胺溶液中；
C5.向所述步骤C4所得浸有涂覆羟基磷灰石晶体的电纺膜的明胶-甲基丙烯酰胺溶液中依次加入摩尔浓度为200-2000mmol/L的四甲基乙二胺溶液和摩尔浓度为200-2000mmol/L的过硫酸铵溶液，迅速搅拌，形成最终明胶-甲基丙烯酰胺反应体系，继续于37℃下反应5min，形成厚度为4.8-5.2mm的内层支架；
C6.将步骤B4中得到的涂覆有羟基磷灰石晶体的电纺膜裁剪成12×10mm规格后浸入50%的聚乙二醇溶液中，再与所述步骤C5所得的内层支架交联形成复合支架；
C7将步骤C6所得的复合支架于70%酒精中浸泡1h后无菌干燥，即得聚己内酯/明胶电纺复合支架成品。
优选地，所述步骤C1中B型明胶与甲基丙烯酸酐按50-100:1的质量比混合。
优选地，所述步骤C5中浸有纳米纤维电纺膜的最终明胶-甲基丙烯酰胺反应体系，反应体系中四甲基乙二胺和过硫酸铵溶液的浓度为15-150mmol/l。
优选地，所述步骤C5中浸有纳米纤维电纺膜的明胶-甲基丙烯酰胺溶液、四甲基乙二胺溶液和过硫酸铵溶液的体积比为34：3:3。
本发明的有益效果在于，
（1）本发明通过使用10×SBF（模拟体液）来加速羟基磷灰石晶体的形成。扫描电镜显示在PCL（聚已内酯）/GE（明胶）电纺膜的表面形成了针状纳米羟基磷灰石，这种纳米级的羟基磷灰石与人体骨骼中的羟基磷灰石晶体类似，具有良好的生物活性。并将涂覆有羟基磷灰石晶体的电纺膜与PCL/GE电纺膜结合构建了一种类似天然骨组织的细胞外基质(ECM)结构。通过与MC3T3-E1细胞共培养，并通过CCK-8检验复合支架的细胞毒性。结果显示培养至第7天，实验组中的细胞活性与对照组无明显差异。说明制备的PCL/GE复合电纺支架具有良好的生物安全性和生物相容性；
（2）本发明中使用APS/TEMED（过硫酸铵/四甲基乙二胺）对明胶-甲基丙烯酰胺（GelMA）水凝胶进行交联，这种交联相对与其它交联方式具有以下优点：①成胶环境温和，在37℃下即可成胶；②交联只针对甲基丙烯酸酯化的明胶，对水凝胶中的其他有机物影响小，如：生长因子、种子细胞等；③APS/TEMED用量少，细胞毒性低。交联后的GelMA水凝胶与明胶相比在体内具有较高的稳定性；
（3）本发明制备的复合支架的外层结构由电纺膜浸泡PEG（聚乙二醇）形成，PEG也是一种具有良好生物相容性与生物安全性的高分子聚合物，但PEG在体内环境中降解时间长，不利于细胞粘附。电纺膜浸泡PEG交联后形成了致密的外层结构，在体内可以组织外部结缔组织向内侵入，可为新骨再生提供稳定的微环境；
（4）本发明制备的电纺复合支架无明显细胞毒性，内部支架结构与天然骨组织的ECM成分类似，外层结构可阻止外周结缔组织的侵入。在动物实验中显示骨组织工程支架具有良好的生物相容性，可有效促进骨组织再生；
（5）本发明中PCL（聚已内酯）和PEG（聚乙二醇）作为人工合成的高分子聚合物材料，具有良好的生物安全性能和降解性能。明胶经过甲基丙基酸酯化后形成明胶-甲基丙烯酰胺（Gelatin-methacrylamide，GelMA）。GelMA可以通过多种方式交联形成水凝胶，可以提高明胶在体内环境的稳定性，从而能为新骨再生提供稳定的环境，还能模拟正常骨组织细胞外基质（Extracellularmatrix，ECM）的结构和功能。
附图说明
图1是本发明中涂覆有羟基磷灰石晶体的电纺膜的扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施实例对本发明做进一步详细说明。
实施例1
一种聚己内酯/明胶电纺复合支架的制备工艺，它依次包括仿生细胞外基质支架材料聚己内酯/明胶纳米纤维电纺膜的制备工艺、涂覆有羟基磷灰石晶体的电纺膜的制备方法和电纺复合支架的构建方法。
所述仿生细胞外基质支架材料聚己内酯/明胶纳米纤维电纺膜的制备工艺具体包括如下步骤：
A1.分别称取一定量的聚已内酯和B型明胶，将聚已内酯和B型明胶分别溶于一定体积的三氟乙醇中；
A2.将完全溶解于三氟乙醇中的聚已内酯和B型明胶混合成均质溶液；
A3.将步骤（2）所得均质溶液转入接有注射泵的微量注射器内，注射针头接有18KV的高压电源正极，电源负极连接10×10cm锡箔用于接收电纺纤维；
A4.调节微量注射器的推进速率和电源正负电极间的距离；
A5.开启高压电源，一定时间后将聚己内酯/明胶电纺纤维膜经戊二醛蒸汽熏蒸交联1.5h，得到仿生细胞外基质支架材料聚己内酯/明胶纳米纤维电纺膜。
值得注意的是，步骤A1中所述聚已内酯和B型明胶分别与三氟乙醇按质量比均为1:14。
在本实施例中，步骤A4中调节微量注射器的推进速率至1-1.5ml/h，电源正负电极间的距离调节至12cm。
所述涂覆有羟基磷灰石晶体的电纺膜的制备方法具体包括如下步骤：
B1.十乘模拟体液（10xSBF）的制备：在800ml蒸馏水中依顺序加入58.443gNaCl、0.373gKCl、3.675gCaCl2·2H2O、1.017gMgCl2·6H2O、1.120gNaH2PO4，完全溶解后，定容至1000ml得到PH为4.1的10×SBF准备液，4℃保存备用；
B2.用NaHCO3调节所述步骤B1所得的10×SBF准备液的PH至6.5，得到10×SBF工作液；
B3.将所述步骤A5所得的电纺膜浸入10×SBF溶液中，浸泡2h；
B4.用双蒸水漂洗所述步骤B3所得产物2遍，然后常温下自然风干，即得到涂覆有羟基磷灰石晶体的电纺膜。
图1在电镜下观察涂覆有羟基磷灰石晶体的电纺膜的表面形态可看出，涂覆有羟基磷灰石晶体的电纺膜浸泡10×SBF2小时后可见在电纺纤维表面形成许多均匀分布的针状纳米羟基磷灰石。
所述电纺复合支架的构建方法具体包括如下步骤：
C1.将质量体积分数为15%的B型明胶加入到甲基丙烯酸酐中，50℃水浴反应1h；所述B型明胶与甲基丙烯酸酐按50-100:1的质量比混合；
C2.将所述步骤C1中水浴后的产物在去离子水中透析48小时；
C3.将所述步骤C2中透析后的产物冷冻干燥24h，将冻干后的材料溶解为0.1g/ml的明胶-甲基丙烯酰胺溶液；
C4.将所述步骤B4中得到的涂覆有羟基磷灰石晶体的电纺膜裁剪成10×8mm规格后浸入所述步骤C3所得的明胶-甲基丙烯酰胺溶液中，具体为将电纺膜裁剪成10×8mm，将三块电纺膜浸入170ul明胶-甲基丙烯酰胺（GelMA）溶液中；
C5.向所述步骤C4所得浸有涂覆羟基磷灰石晶体的电纺膜的明胶-甲基丙烯酰胺溶液中依次加入摩尔浓度为200-2000mmol/L的四甲基乙二胺溶液和摩尔浓度为200-2000mmol/L的过硫酸铵溶液，迅速搅拌，形成最终明胶-甲基丙烯酰胺反应体系，继续于37℃下反应5min，形成厚度为4.8-5.2mm的内层支架；所述步骤C5中浸有纳米纤维电纺膜的最终明胶-甲基丙烯酰胺反应体系，反应体系中四甲基乙二胺和过硫酸铵溶液的浓度为15-150mmol/l；所述步骤C5中浸有纳米纤维电纺膜的明胶-甲基丙烯酰胺溶液、四甲基乙二胺溶液和过硫酸铵溶液的体积比为34:3:3；具体为向所述步骤C4所得浸有涂覆羟基磷灰石晶体的电纺膜的明胶-甲基丙烯酰胺溶液170ul中依次加入400mmol/L的四甲基乙二胺溶液15ul和400mmol/L的过硫酸铵溶液15ul；
C6.将步骤B4中得到的涂覆有羟基磷灰石晶体的电纺膜裁剪成12×10mm规格后浸入50%的聚乙二醇溶液中，再与所述步骤C5所得的内层支架交联形成复合支架；
C7将步骤C6所得的复合支架于70%酒精中浸泡1h后无菌干燥，即得聚己内酯/明胶电纺复合支架成品。
本发明通过使用10×SBF（模拟体液）来加速羟基磷灰石晶体的形成。扫描电镜显示在PCL（聚已内酯）/GE（明胶）电纺膜的表面形成了针状纳米羟基磷灰石，这种纳米级的羟基磷灰石与人体骨骼中的羟基磷灰石晶体类似，具有良好的生物活性。并将涂覆有羟基磷灰石晶体的电纺膜与PCL/GE电纺膜结合构建了一种类似天然骨组织的细胞外基质(ECM)结构。通过与MC3T3-E1细胞共培养，并通过CCK-8检验复合支架的细胞毒性。结果显示培养至第7天，实验组中的细胞活性与对照组无明显差异。说明制备的PCL/GE复合电纺支架具有良好的生物安全性和生物相容性；且本发明中使用APS/TEMED（过硫酸铵/四甲基乙二胺）对明胶-甲基丙烯酰胺（GelMA）水凝胶进行交联，这种交联相对与其它交联方式具有以下优点：①成胶环境温和，在37℃下即可成胶；②交联只针对甲基丙烯酸酯化的明胶，对水凝胶中的其他有机物影响小，如：生长因子、种子细胞等；③APS/TEMED用量少，细胞毒性低。交联后的GelMA水凝胶与明胶相比在体内具有较高的稳定性；本发明制备的复合支架的外层结构由电纺膜浸泡PEG（聚乙二醇）形成，PEG也是一种具有良好生物相容性与生物安全性的高分子聚合物，但PEG在体内环境中降解时间长，不利于细胞粘附。电纺膜浸泡PEG交联后形成了致密的外层结构，在体内可以组织外部结缔组织向内侵入，可为新骨再生提供稳定的微环境；本发明制备的电纺复合支架无明显细胞毒性，内部支架结构与天然骨组织的ECM成分类似，外层结构可阻止外周结缔组织的侵入。在动物实验中显示骨组织工程支架具有良好的生物相容性，可有效促进骨组织再生；本发明中PCL（聚已内酯）和PEG（聚乙二醇）作为人工合成的高分子聚合物材料，具有良好的生物安全性能和降解性能。明胶经过甲基丙基酸酯化后形成明胶-甲基丙烯酰胺（Gelatin-methacrylamide，GelMA）。GelMA可以通过多种方式交联形成水凝胶，可以提高明胶在体内环境的稳定性，从而能为新骨再生提供稳定的环境，还能模拟正常骨组织细胞外基质（Extracellularmatrix，ECM）的结构和功能。
实施例2
同实施例1所不同的是所述步骤B3中将步骤A5所得的电纺膜浸入10×SBF溶液中浸泡3h。
实施例3
同实施例1所不同的是所述步骤B3中将步骤A5所得的电纺膜浸入10×SBF溶液中浸泡1h。
由技术常识可知，本发明可以通过其他的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明所包含。

Claims (10)

1.一种聚己内酯/明胶电纺复合支架的制备工艺，其特征在于，依次包括仿生细胞外基质支架材料聚己内酯/明胶纳米纤维电纺膜的制备工艺、涂覆有羟基磷灰石晶体的电纺膜的制备方法和电纺复合支架的构建方法。
2.根据权利要求1所述的一种聚己内酯/明胶电纺复合支架的制备工艺，其特征在于，所述仿生细胞外基质支架材料聚己内酯/明胶纳米纤维电纺膜的制备工艺具体包括如下步骤：
A1.分别称取一定量的聚已内酯和B型明胶，将聚已内酯和B型明胶分别溶于一定体积的三氟乙醇中；
A2.将完全溶解于三氟乙醇中的聚已内酯和B型明胶混合成均质溶液；
A3.将步骤（2）所得均质溶液转入接有注射泵的微量注射器内，注射针头接有18KV的高压电源正极，电源负极连接10×10cm锡箔用于接收电纺纤维；
A4.调节微量注射器的推进速率和电源正负电极间的距离；
A5.开启高压电源，一定时间后将聚己内酯/明胶电纺纤维膜经戊二醛蒸汽熏蒸交联1.5h，得到仿生细胞外基质支架材料聚己内酯/明胶纳米纤维电纺膜。
3.根据权利要求2所述的一种聚己内酯/明胶电纺复合支架的制备工艺，其特征在于，步骤A1中所述聚已内酯和B型明胶分别与三氟乙醇按质量比均为1:14。
4.根据权利要求2所述的一种聚己内酯/明胶电纺复合支架的制备工艺，其特征在于，步骤A4中调节微量注射器的推进速率至1-1.5ml/h，电源正负电极间的距离调节至12cm。
5.根据权利要求1和2所述的一种聚己内酯/明胶电纺复合支架的制备工艺，其特征在于，所述涂覆有羟基磷灰石晶体的电纺膜的制备方法具体包括如下步骤：
B1.10×SBF的制备：在800ml蒸馏水中依顺序加入58.443gNaCl、0.373gKCl、3.675gCaCl2·2H2O、1.017gMgCl2·6H2O、1.120gNaH2PO4，完全溶解后，定容至1000ml得到PH为4.1的10×SBF准备液，4℃保存备用；
B2.用NaHCO3调节所述步骤B1所得的10×SBF准备液的PH至6.5，得到10×SBF工作液；
B3.将所述步骤A5所得的电纺膜浸入10×SBF溶液中，浸泡1-3h；
B4.用双蒸水漂洗所述步骤B3所得产物2遍，然后常温下自然风干，即得到涂覆有羟基磷灰石晶体的电纺膜。
6.根据权利要求5所述的一种聚己内酯/明胶电纺复合支架的制备工艺，其特征在于，所述步骤B3中将步骤A5所得的电纺膜浸入10×SBF溶液中，优选浸泡时间为2h。
7.根据权利要求1和5所述的一种聚己内酯/明胶电纺复合支架的制备工艺，其特征在于，所述电纺复合支架的构建方法具体包括如下步骤：
C1.将质量体积分数为15%的B型明胶加入到甲基丙烯酸酐中，50℃水浴反应1h；
C2.将所述步骤C1中水浴后的产物在去离子水中透析48小时；
C3.将所述步骤C2中透析后的产物冷冻干燥24h，将冻干后的材料溶解为0.1g/ml的明胶-甲基丙烯酰胺溶液；
C4.将所述步骤B4中得到的涂覆有羟基磷灰石晶体的电纺膜裁剪成10×8mm规格后浸入所述步骤C3所得的明胶-甲基丙烯酰胺溶液中；
C5.向所述步骤C4所得浸有涂覆羟基磷灰石晶体的电纺膜的明胶-甲基丙烯酰胺溶液中依次加入摩尔浓度为200-2000mmol/L的四甲基乙二胺溶液和摩尔浓度为200-2000mmol/L的过硫酸铵溶液，迅速搅拌，形成最终明胶-甲基丙烯酰胺反应体系，继续于37℃下反应5min，形成厚度为4.8-5.2mm的内层支架；
C6.将步骤B4中得到的涂覆有羟基磷灰石晶体的电纺膜裁剪成12×10mm规格后浸入50%的聚乙二醇溶液中，再与所述步骤C5所得的内层支架交联形成复合支架；
C7将步骤C6所得的复合支架于70%酒精中浸泡1h后无菌干燥，即得聚己内酯/明胶电纺复合支架成品。
8.根据权利要求5所述的一种聚己内酯/明胶电纺复合支架的制备工艺，其特征在于，所述步骤C1中B型明胶与甲基丙烯酸酐按50-100:1的质量比混合。
9.根据权利要求5所述的一种聚己内酯/明胶电纺复合支架的制备工艺，其特征在于，所述步骤C5中浸有纳米纤维电纺膜的最终明胶-甲基丙烯酰胺反应体系，反应体系中四甲基乙二胺和过硫酸铵溶液的浓度为15-150mmol/l。
10.根据权利要求5所述的一种聚己内酯/明胶电纺复合支架的制备工艺，其特征在于，所述步骤C5中浸有纳米纤维电纺膜的明胶-甲基丙烯酰胺溶液、四甲基乙二胺溶液和过硫酸铵溶液的体积比为34:3:3。
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