CN105670942A - 一种快速深层液态发酵生产中国被毛孢菌粉的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速深层液态发酵生产中国被毛孢菌粉的方法，该方法是将中国被毛孢菌种采用半连续发酵工艺快速获取富含大量的菌丝体的发酵液，然后将发酵液通过微滤膜处理分离得到中国被毛孢的菌丝体。本发明改变了传统中国被毛孢间歇性的分批发酵工艺，并且菌丝体的分离采用高效的陶瓷膜微滤替代离心机分离方式。半连续发酵工艺克服了传统分批发酵工艺的工艺环节多，中间间隙时间长，设备效率低等缺点；而采用高效的陶瓷膜过滤发酵液，能够减少进入滤液的菌丝体，既能提高菌丝体的收率，降低滤液的COD，降低污水处理量，又不破坏细胞本身，保证胞内有效成分的全部回收。与传统的工艺相比，本发明具有显着的经济效益、社会效益和环保效益。

Description

一种快速深层液态发酵生产中国被毛孢菌粉的方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种快速利用深层液态发酵技术生产真菌菌丝体的方法，更确切地说是一种快速深层液态发酵生产中国被毛孢菌粉的方法。

背景技术

微生物发酵可分为分批、补料分批、半连续、连续等多种模式。分批发酵的人力、物力消耗较大，每批发酵都需要进行装料、灭菌、接种、放料、清洗等操作，工序繁琐，发酵周期较长，生产效率较低；补料分批发酵虽可通过补料补充养分或前体的不足，但是由于有害代谢产物的不断积累，产物合成最终难免受到阻遏；连续发酵较分批发酵和补料分批发酵生产强度大大提高，但容易遭受杂菌的污染，菌种易退化，设备投资较大，且发酵产物浓度较低；半连续发酵过程中，通过放掉部分发酵液再补入新鲜培养基，不仅可以补充养分和前体，而且代谢有害物被稀释，从而有利于产物的继续合成。

半连续发酵工艺的应用可以起到缓解产物抑制和避免代谢副产物积累的作用，改善了微生物的培养环境，有助于保持菌体活力的稳定，并且对于某些次级代谢产物，其最高的生产速率仅在某些瞬态条件下才能达到。采用半连续发酵工艺不仅可以使这种瞬态条件反复出现，而且还可以提高设备的利用率，因此半连续发酵工艺在次级代谢产物的生产方面有着重要的应用。

中国被毛孢菌粉即发酵冬虫夏草菌粉，是从青海新鲜冬虫夏草中分离得到的麦角菌科真菌冬虫夏草的无性世代--中国被毛孢菌种经液体发酵培养所得菌丝体的干燥粉末。主要用于补肺肾，益精气以及肺肾两虚引起的咳嗽、气喘、咯血、腰背酸痛等病及慢性支气管炎的辅助治疗。

传统中国被毛孢液态发酵工艺多为间隙性的分批发酵工艺，而分批发酵工艺的人力、物力消耗较大，每批发酵都需要进行装料、灭菌、接种、放料、清洗等操作，工序繁琐，非发酵周期较长，生产效率较低；而后续的分离工艺传统多用离心机进行分离，该方式因受制于离心机分离因子影响，分离过程中菌丝体遭到剪切力破坏，部分有效成分流失到滤液中导致产品质量和收率下降，分离所得滤液较浑浊，里面含有较多的碎菌丝，导致外排滤液COD偏高，该滤液若达到污水排放标准，需要经过复杂的污水处理，污水处理系统工作量太大，给企业带来了严重的经济负担。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述中国被毛孢菌粉生产的不足，从而设计了一种快速深层液态发酵生产中国被毛孢菌粉的绿色新方法，该方法采用半连续发酵工艺既能减少了工艺环节，缩短了非发酵时间，提高了设备利用率，降低了生产成本；同时又采用高效的陶瓷膜过滤，提高菌丝体的收率，减少进入滤液的菌丝体，降低滤液的COD，降低污水处理量；又不破坏细胞本身，保证胞内有效成分的全部回收。该发明不但能快速得到高品质的中国被毛孢的菌丝体，又提高了分离过程中菌丝体的收率，增加了经济效益；又降低了废水中COD，减轻了污水处理系统压力，增加了社会效益。

本发明目的主要是通过以下方式实现的：

一种快速深层液态发酵生产中国被毛孢菌粉的方法，该方法按照下述步骤进行：

1)中国被毛孢半连续发酵液制备：将中国被毛孢种子液接种到灭菌后的发酵培养基进行深层液态发酵得到中国被毛孢发酵培养液，所述的深层液态发酵接种量为体积含量的10～20％，通风比为1：0.5-1.5vvm，罐压0.02～0.05Mpa，在15～20℃下发酵培养10-30天后，放出培养器容积的10-50％的发酵液，补入同等体积的灭菌后的发酵培养基，继续发酵1-10天；如此不断放料、补料，每次补料继续发酵1-10天，反复多次，操作周期可以根据次数调整为12-70天，得到中国被毛孢发酵液；将中国被毛孢菌种子液接种到灭菌后的发酵培养基之前可以将将中国被毛孢菌菌株以常规方法活化后制备得到中国被毛孢菌种子液；优选发酵条件为通风比为1：0.5vvm，罐压0.04Mpa，在20℃下发酵培养25天；

2)中国被毛孢发酵液陶瓷膜过滤：将步骤1)中所得的中国被毛孢发酵液通过微滤膜得到发酵液的微滤透析液和菌丝体，收集得到菌丝体；

3)低温真空烘干：将步骤2)中所得的菌丝体在真空度为-0.065～-0.095Mpa，60～75℃条件下进行干燥。

所述的中国被毛孢种子液是通过以下方法制备得到的：中国被毛孢种子培养基组成为葡萄糖1-3％、蛋白胨0.5-2％、奶粉0.1-1％、麸皮1-3％、磷酸二氢钾0.1-0.5％、七水硫酸镁0.1-0.5％、消泡剂0.01-0.05％；调节pH值5.5-6.5；培养条件为：通风比为1：0.5-1.5vvm，罐压0.02～0.05Mpa，培养温度15～20℃，培养周期5-15天。

优选中国被毛孢种子液是通过以下方法制备得到的：将经活化摇瓶中国被毛孢菌菌种接入种子培养基，中国被毛孢种子培养基组成为葡萄糖2％、蛋白胨0.8％、奶粉0.5％、麸皮1.5％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.3％、消泡剂0.02-0.03％；调节pH值5.5-6.5；培养条件为：通风比为1：0.5-1vvm，罐压0.03～0.04Mpa，培养温度18～20℃，培养周期5-10天。

中国被毛孢发酵培养基组成为葡萄糖1-3％、玉米粉1-3％、蛋白胨0.5-2％、酵母粉0.1-1％、麸皮1-3％、磷酸二氢钾0.1-0.5％、七水硫酸镁0.1-0.5％、消泡剂0.01-0.05％；调节pH值5.5-6.5。

该方法步骤2)所述的微滤膜为陶瓷膜或有机膜，其孔径在0.05～0.5μm，操作温度为50～60℃，工作压力：进压为2～4bar，出压为0～5bar。

优选该方法步骤2)所述的微滤膜为陶瓷膜或有机膜，其孔径在50nm，操作温度为50～60℃，工作压力：进压为3bar，出压为1bar。

本发明适用于任何中国被毛孢菌种(Ophiocordycepssinensis)，如保藏于由中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号CICC14088、14099、14114等均可以使用。

本发明所采用的中国被毛孢菌株不限于某个具体生产厂家，市售均可使用。

本发明为快速深层液态发酵生产中国被毛孢菌粉提供了一种新的方法。该方法具有以下几个突出的优点：

1、发酵周期短：传统的分批发酵工艺，每批发酵都需要进行装料、灭菌、接种、放料、清洗等操作，工序繁琐，总发酵周期长，而采用半连续发酵工艺减少了工艺环节，缩短了非发酵时间和发酵时间，提高了设备利用率和发酵强度，降低了生产成本。

2、提高收率：采用微滤膜孔径0.05～10μm，显著提高了菌丝体得率。

3、提高产品质量：传统离心机分离过程中中国被毛孢菌丝体遭到剪切力破坏，部分有效成分流失到滤液中导致菌丝体有效成分降低，该工艺采用微滤膜过滤，操作过程中不会产生剪切力，有效保证菌丝体有效成分。

3、降低滤出液COD，减轻环保压力：传统卧螺分离由于菌丝体截留率低，部分菌丝体进入滤液，导致滤液中COD含量增高，本方法分离因子高，对菌丝体截留率大大增加，滤液澄清，滤液中菌丝体少，得到的透析液COD大大降低，其COD指标可以达到直接排放标准，仅污水处理每天就为企业减少30吨处理量，大大降低了污水处理费用。

4、清洁连续生产，能耗低：本发明方法可连续生产，膜及其配套设备使用寿命长，装置维护方便，投资少，操作过程无噪声污染，易清洁。

附图说明

图1为实施例所述传统工艺路线图。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发明，不应理解为对本发明总的技术方案的限定。

实施例1

1)中国被毛孢菌株(Ophiocordycepssinensis)由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供并鉴定，保藏编号CICC14088。将培养好的中国被毛孢菌株种子液种到种子培养基，接种量是10％，种子培养基组成为葡萄糖2％、蛋白胨0.8％、奶粉0.5％、麸皮1.5％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.3％、消泡剂0.02％，调节pH值6.0；培养条件为：通风比为1：0.5vvm，罐压0.03Mpa，培养温度18～20℃，培养7天左右即可得到种子液。将培养好种子液接种到灭菌后50L发酵培养基，接种量15％，发酵培养基组成为葡萄糖2％、玉米粉1.5％、蛋白胨1％、酵母粉0.5％、麸皮2％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.3％、消泡剂0.03％；调节pH值6.0；通风比为1：0.5vvm，罐压0.04Mpa，在20℃下发酵培养25天后，放出20L的发酵液，补入20L灭菌后的发酵培养基，继续发酵10天；如此不断放料、补料，反复3次，发酵结束可得发酵液115L，发酵周期为55天。

2)微滤过滤：分别将四次发酵后的中国被毛孢发酵液20L、20L、20L和55L通过微滤过滤，分别得到中国被毛孢湿菌丝体2.2kg、2.15kg、2.10kg、5.5kg(含水量75％左右)，微滤透析液17.8Kg、17.85Kg、17.9Kg和49.5Kg，透析液的透光率为82-85％，COD为40-60mg/L。微滤过滤所用的膜材料是孔径为50nm的陶瓷膜，具体工艺条件是：操作温度为50～60℃，进压为3.0bar，出压为1.0bar，压力差为2.0bar。

3)低温干燥：将步骤2得到的2.2kg、2.15kg、2.10kg、5.5kg中国被毛孢湿菌丝体进入真空烘箱进行烘干，得到0.567kg、0.554kg、0.541kg和1.418kg水分含量3％左右的中国被毛孢菌丝体，该菌丝体腺苷为0.12-0.16％，甘露醇含量10-13％，氨基酸含量在35-40％。依据WS₃-181(Z-60)-2006(Z)-2010标准方法检验。具体干燥工艺条件是：干燥温度65℃，真空度为-0.085Mpa。

传统生产工艺与本发明实施例1工艺产品产量、质量对比表

从上述表格可以看出采用传统工艺64天发酵2个批次，可获得菌丝体2.836kg；而采用本发明工艺总发酵周期为55天，可获得4个批次的菌丝体3.08kg，发酵周期为传统工艺的86％，而获得菌丝体产量是传统的111.5％，并且菌丝体产品质量要高于传统工艺生产。因此采用本发明工艺既可缩短发酵周期，提高产量和质量，降低生产成本。

实施例2

1)中国被毛孢菌株(Ophiocordycepssinensis)由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供并鉴定，保藏编号CICC14114。将培养好的中国被毛孢菌株种子液种到种子培养基，接种量是10％，种子培养基组成为葡萄糖2％、蛋白胨0.8％、奶粉0.5％、麸皮1.5％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.3％、消泡剂0.02％，调节pH值6.0；培养条件为：通风比为1：0.5vvm，罐压0.03Mpa，培养温度18～20℃，培养7天左右即可得到种子液。将培养好种子液接种到灭菌后100L发酵培养基，接种量15％，发酵培养基组成为葡萄糖2.5％、玉米粉2％、蛋白胨1％、酵母粉0.7％、麸皮2.5％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.3％、消泡剂0.03％；调节pH值6.5；通风比为1：0.5vvm，罐压0.04Mpa，在20℃下发酵培养25天后，放出40L的发酵液，补入40L灭菌后的发酵培养基，继续发酵10天；如此不断放料、补料，反复3次，发酵结束可得发酵液230L，发酵周期为55天。

2)微滤过滤：分别将四次发酵后的中国被毛孢发酵液40L、40L、40L和110L通过微滤过滤，分别得到中国被毛孢湿菌丝体4.4kg、4.3kg、4.2kg、11kg(含水量75％左右)，微滤透析液35.6Kg、35.7Kg、35.8Kg和99Kg，透析液的透光率为83-87％，COD为40-60mg/L。微滤过滤所用的膜材料是孔径为50nm的陶瓷膜，具体工艺条件是：操作温度为50～60℃，进压为3.0bar，出压为1.0bar，压力差为2.0bar。

3)低温干燥：将步骤2得到的4.4kg、4.3kg、4.2kg、11kg中国被毛孢湿菌丝体进入真空烘箱进行烘干，得到1.135kg、1.108kg、1.08kg和2.842kg水分含量3％左右的中国被毛孢菌丝体，该菌丝体腺苷为0.12-0.16％，甘露醇含量10-13％，氨基酸含量在35-40％。依据WS₃-181(Z-60)-2006(Z)-2010标准方法检验。具体干燥工艺条件是：干燥温度65℃，真空度为-0.085Mpa。

传统生产工艺与本发明实施例2工艺产品产量、质量对比表

从上述表格可以看出采用传统工艺64天发酵2个批次，可获得菌丝体5.522kg；而采用本发明工艺总发酵周期为55天，可获得4个批次的菌丝体6.165kg，发酵周期为传统的86％，而获得菌丝体产量是传统的111.6％，并且菌丝体产品质量要高于传统工艺生产。因此采用本发明工艺既可缩短发酵周期，提高产量和质量，降低生产成本。

Claims (7)

1.一种快速深层液态发酵生产中国被毛孢菌粉的方法，其特征是该方法包括下述步骤：

1)中国被毛孢半连续发酵液制备：将中国被毛孢种子液接种到灭菌后的发酵培养基进行深层液态发酵得到中国被毛孢发酵培养液，接种量为体积含量的10～20％，通风比为1：0.5-1.5vvm，罐压0.02～0.05Mpa，在15～20℃下发酵培养10-30天后，放出培养器容积的10-50％的发酵液，补入同等体积的灭菌后的发酵培养基，继续发酵1-10天；如此不断放料、补料，每次补料继续发酵1-10天，反复多次，得到中国被毛孢发酵液；

2)中国被毛孢发酵液陶瓷膜过滤：将步骤1)中所得的中国被毛孢发酵液通过微滤膜得到发酵液的微滤透析液和菌丝体，收集菌丝体；

3)低温真空烘干：将步骤2)中所得的菌丝体在真空度为-0.065～-0.095Mpa，70～85℃条件下进行干燥。

2.根据权利要求1所述的快速深层液态发酵生产中国被毛孢菌粉的方法，其特征是步骤1)所述的发酵条件为通风比为1：0.5vvm，罐压0.04Mpa，在20℃下发酵培养25天。

3.根据权利要求1所述的快速深层液态发酵生产中国被毛孢菌粉的方法，其特征是所述的中国被毛孢种子液是通过以下方法制备得到的：中国被毛孢种子培养基组成为葡萄糖1-3％、蛋白胨0.5-2％、奶粉0.1-1％、麸皮1-3％、磷酸二氢钾0.1-0.5％、七水硫酸镁0.1-0.5％、消泡剂0.01-0.05％；调节pH值5.5-6.5；培养条件为：通风比为1：0.5-1.5vvm，罐压0.02～0.05Mpa，培养温度15～20℃，培养周期5-15天。

4.根据权利要求3所述的快速深层液态发酵生产中国被毛孢菌粉的方法，其特征是所述的中国被毛孢种子液是通过以下方法制备得到的：将经活化摇瓶中国被毛孢菌菌种接入种子培养基，中国被毛孢种子培养基组成为葡萄糖2％、蛋白胨0.8％、奶粉0.5％、麸皮1.5％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.3％、消泡剂0.02-0.03％；调节pH值5.5-6.5；培养条件为：通风比为1：0.5-1vvm，罐压0.03～0.04Mpa，培养温度18～20℃，培养周期5-10天。

5.根据权利要求1所述的快速深层液态发酵生产中国被毛孢菌粉的方法，其特征是中国被毛孢发酵培养基组成为葡萄糖1-3％、玉米粉1-3％、蛋白胨0.5-2％、酵母粉0.1-1％、麸皮1-3％、磷酸二氢钾0.1-0.5％、七水硫酸镁0.1-0.5％、消泡剂0.01-0.05％；调节pH值5.5-6.5。

6.根据权利要求1所述的快速深层液态发酵生产中国被毛孢菌粉的方法，其特征是该方法所述的微滤膜为陶瓷膜或有机膜，其孔径在0.05～0.5μm，操作温度为50～60℃，工作压力：进压为2～4bar，出压为0～5bar。

7.根据权利要求6所述的快速深层液态发酵生产中国被毛孢菌粉的方法，其特征是该方法所述的微滤膜为陶瓷膜或有机膜，其孔径在50nm，操作温度为50～60℃，工作压力：进压为3bar，出压为1bar。