CN105647996A

CN105647996A - 固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法

Info

Publication number: CN105647996A
Application number: CN201610165471.7A
Authority: CN
Inventors: 于铁妹; 刘珊珊; 黄庆军; 秦永发
Original assignee: Shenzhen Gute Xinsheng Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Tiankai Yida Biological Science & Technology Co ltd
Priority date: 2016-03-22
Filing date: 2016-03-22
Publication date: 2016-06-08
Anticipated expiration: 2036-03-22
Also published as: CN105647996B

Abstract

本发明公开了一种固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法，包括以下步骤：(1)将ATP生产酶固定于固定化载体上，制备固定化ATP生产酶；(2)利用固定化ATP生产酶，催化制备三磷酸腺苷反应液；以及(3)分离产物三磷酸腺苷(ATP)。本发明采用新型Ppk、Adk、Pap三种ATP生产酶，只需两步酶促反应即可合成ATP，反应过程更简单，反应更容易控制，产品质量更加稳定；采用固定化酶催化的方法制备ATP，固定化酶可连续、反复多次使用，大幅的降低了生产成本。同时避免了使用酵母引入的大量蛋白、色素等杂质，更加易于纯化；建立了适用于大规模生产ATP的间歇搅拌反应及酶反应柱连续反应体系。

Description

固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法

技术领域

本发明涉及三磷酸腺苷的制备方法，特别涉及一种固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法。

背景技术

三磷酸腺苷(ATP)是一种由一个腺嘌呤，一个核糖和三个磷酸基团组成的高能化合物，分子式C₁₀H₁₆N₅O₁₃P₃，分子量为507。它是生物体内的能量转换器和贮存器，在人体能量代谢中起着重要的作用，作为代谢的中间体、辅酶参与生物体内脂肪、蛋白质、糖类和核酸等的代谢。在临床应用上，ATP已作为治疗试剂，对进行性肌肉萎缩、中风后遗症、心肌梗塞、心肌炎、冠状动脉硬化、肝炎等病症具有良好的治疗和辅助治疗作用。近年来国外学者结合ATP和腺苷(Ado)、环化腺苷酸(cAMP)的构效关系，及其受体的生理作用，认为ATP在防治肿瘤，调节神经等方面具有明显作用。因此，ATP的生物体外合成研究和临床应用实验，无论在生理医学还是工业应用上都具有重要意义。

ATP的合成主要有化学合成法、酶催化合成、光合磷酸化和氧化磷酸化、微生物酶系催化合成等方法。利用酵母菌的糖酵解途径，以腺苷Ado或腺苷酸(AMP)为底物，进行基质水平磷酸化合成ATP是最常用的方法，也是目前工业化生产ATP普遍采用的方法。然而，经酵母细胞酶系催化合成ATP的反应过程复杂，参与催化反应的酶系众多，反应过程不易控制，产品批次间质量差异较大。同时酵母酶系质量常因供应的厂家不同、批次不同、甚至季节不同而有很大差异。酵母细酶系质量不稳定，酶活力下降快，使用寿命短，一般是一次性使用。反应过程需要加入大量的酵母细胞酶液，引入了大量的蛋白、色素等杂质给后期纯化带来了很大的困难。目前，我国ATP生产水平总体还比较低，产品的产量、成本控制、产品质量等方面还有所欠缺。面对以上的技术问题，急需开发新型稳定的反应工艺，简化反应过程提高产品的质量。

研究表明，在某些细菌体内存在着依赖于多聚磷酸盐的酶系，可利用ADP或AMP生成ATP。该酶系包含多聚磷酸激酶(EC2.7.4.1，Ppk)、AMP激酶(EC2.7.4.3，Adk)、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶(EC2.7.4.-，Pap)，本发明中统称三种酶为“ATP生产酶”。其中，Ppk催化ADP与聚磷酸盐类化合物反应生成ATP，Adk催化2分子ADP生成1分子ATP和1分子AMP，Pap则催化AMP与聚磷酸盐类化合物反应生成ADP，三种酶的合理组合均可用于合成ATP(参见图1)。为解决酵母酶系生产ATP存在的一系列问题，本发明利用ATP生产酶制备ATP，生产工艺更简单。在实际应用中酶的成本昂贵，利用游离酶生产ATP，酶活下降迅速，无法有效的回收利用，势必会导致生产成本过高，影响了实际应用价值。本发明将ATP生产酶固定化，可实现酶的重复和连续利用，大大降低了生产成本，同时固定化酶的使用，产物更容易纯化产品质量更加稳定。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法，从而克服现有技术的上述缺陷。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种固定化酶制备三磷酸腺苷的方法，包括以下步骤：

(1)制备固定化ATP生产酶：

将ATP生产酶固定于固定化载体上，制得固定化ATP生产酶。

(2)固定化ATP生产酶制备ATP：

利用固定化ATP生产酶，以AMP或ADP为底物，以聚磷酸类化合物为磷酸供体，催化制备获得ATP反应液。

(3)分离产物三磷酸腺苷(ATP)：

ATP反应液经层析分离结晶干燥，得到ATP成品。

优选地，上述技术方案中，步骤(1)所述的ATP生产酶选自多聚磷酸激酶(EC2.7.4.1，Ppk)、腺苷酸激酶(EC2.7.4.3，Adk)、多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(EC2.7.4.-，Pap)中的任意两种酶或三种酶的组合。

其中，当选用Ppk与Pap两种酶组合时，Ppk与Pap的质量比例为(20-0.05)：1，优选的为(10-0.1)：1。

其中，当选用Pap与Adk两种酶组合时，Pap与Adk质量比例为(20-0.2)：1，优选的为(20-0.5)：1。

其中，当选用Ppk与Adk两种酶组合时，Ppk与Adk质量比例为(20-0.2)：1，优选的为(20-0.5)：1。

其中，当选用Ppk、Pap与Adk三种酶组合时，Ppk、Pap与Adk质量比例为(20:0.2)：(20-0.2)：1，优选的为(20-0.5)：(20-0.5)：1。

上述的Ppk、Adk、Pap可以来源于任何生物、或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。其中，Ppk酶包括Ppk1酶与Ppk2酶。

优选地，上述技术方案中，步骤(1)所述固定化载体选自高分子载体、无机载体、磁性高分子微球载体中的一种或多种。其中高分子载体选自纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多聚氨基酸、聚苯乙烯、聚丙烯酸、海藻酸钠、壳聚糖、淀粉、聚乙烯醇、明胶、卡拉胶、尼龙、合成高聚物等；无机载体选自多孔玻璃、氧化硅、硅胶、活性炭、硅藻土等。

优选地，上述技术方案中，所述高分子载体中含有酯基或芳香氨基、羟基、羧基、羧甲基、醛基、环氧基和氨基功能基团中的至少一个基团。所述的固定化ATP生产酶通过下列方式固定于固定化载体：吸附、包埋、共价、结合、交联或其组合。Pap、Adk、Ppk三种酶可分别固定或按比例混合后一起固定。

优选地，上述技术方案中，步骤(2)催化制备三磷酸腺苷反应液的反应条件为：反应温度为25-60℃；反应pH为5-10的条件下；反应体系包括：聚磷酸类化合物和镁离子；在反应体系中添加AMP或ADP，利用固定化ATP生产酶催化反应生成ATP反应液。另外，反应体系中还可包含铵离子、锰离子、钾离子、钠离子和Tris或磷酸根离子。本发明添加的底物、酶及各类盐可一次性加入反应体系，也可按照工业生产工艺流程分批次流加补入。

优选地，上述技术方案中，聚磷酸类化合物选自多聚偏磷酸或其盐及多聚磷酸或其盐中的一种或多种。

优选地，上述技术方案中，所述催化反应为在反应罐中添加固定化ATP生产酶进行搅拌反应；或是将固定化ATP生产酶装入酶反应柱(简称：酶柱)中，将AMP或ADP底物溶液通过酶反应柱进行间歇或连续反应。

优选地，上述技术方案中，所述反应体系中AMP或ADP的浓度为2mM-80mM、聚磷酸类化合物(以磷酸根计)浓度为4mM-1M、镁离子浓度为2mM-150mM。

优选地，上述技术方案中，所述的固定化载体与ATP生产酶的质量比例为1:1-150:1，优选的为2:1-100:1。

优选地，上述技术方案中，所述搅拌反应中固定化ATP生产酶的添加量为5-200g/L，优选的为10-100g/L。

优选地，上述技术方案中，所述搅拌反应中固定化ATP生产酶采用过滤、离心方式回收。

优选地，上述技术方案中，所述底物溶液通过所述酶反应柱的流量为酶柱体积的0.01-50倍体积/小时，优选为酶柱体积的0.2-5倍体积/小时。根据酶柱穿出液的底物转化率情况，决定是否继续通过酶柱循环反应还是后续处理。反应过程通过高效液相色谱检测底物浓度及转化率。

本发明利用固定化ATP生产酶制备ATP的技术方案还可用于ATP的再生，可用于其他任何需要ATP提供能量的酶催化反应体系中，将AMP、ADP再生为ATP。

本发明上述技术方案，具有如下有益效果：

(1)采用新型Ppk、Adk、Pap三种ATP生产酶，只需两步酶促反应即可合成ATP，与传统啤酒酵母生产ATP繁琐的工艺过程相比，反应过程更简单，反应更容易控制，产品质量更加稳定。

(2)采用固定化酶催化的方法制备ATP，固定化酶可连续、反复多次使用，大幅的降低了生产成本。同时避免了使用酵母引入的大量蛋白、色素等杂质，更加易于纯化。

(3)建立了适用于大规模生产ATP的间歇搅拌反应及酶反应柱连续反应体系。

附图说明

图1为本发明Pap、Adk、Ppk生成ATP的催化原理图。

图2为本发明所表达的Pap、Adk、Ppk酶的SDS-PAGE图。

图3A为本发明固定化ATP生产酶生成ATP的搅拌反应工艺流程图。

图3B为本发明固定化ATP生产酶生成ATP的酶反应柱工艺流程图。

图4为本发明实施例2经酶反应后反应液的HPLC图谱。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。

实施例1Ppk、Adk和Pap酶的制备

本发明方法中的Ppk、Adk和Pap酶可以商购获得，或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。

Ppk、Adk和Pap酶的制备过程如下：

根据下列基因的序列，设计三对扩增引物，由中美泰和生物技术有限公司合成，引物序列如下：

ppk正义引物：5’-CCATATGGGTCAGGAAAAGCTATACATCG-3’；

ppk反义引物：5’-CGGATCCTTATTCAGGTTGTTCGAGTGATT-3’；

adk正义引物：5’-CCATATGCGTATCATTCTGCTTGGCGCTCCGG-3’；

adk反义引物：5’-CGGATCCTTAGCCGAGGATTTTTTCCAGATC-3’；

pap正义引物：5’-GCCATGGATACAGAAACGATCGCCAGTGCAG-3’；和

pap反义引物：5’-CGGATCCTTAATCCGTGTCGCGATCCGCTT-3’；

提取大肠杆菌(Escherichiacoli)K12菌株(购于天根生化科技有限公司)DNA，以其为模板，通过PCR扩增出ppk与adk基因片段，并将其分别连接至pET22b载体(购于Invitrogen公司)；提取约氏不动杆菌(Acinetobacterjohnsonii)菌株(CGMCC1.8030)DNA，以其为模板，通过PCR扩增出pap基因片段，并将其连接至pET22b载体(购于Invitrogen公司)。三段连接序列经测序正确后，分别转入E.coliBL21(DE3)菌株(购于天根生化科技有限公司)。

将转化后的E.coliBL21(DE3)单克隆接入LB培养基，培养至对数期后，加入1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导5小时后，收集菌体，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)筛选高表达菌株。

将筛选出的高表达菌株在无菌条件下接入种子培养基，培养至对数生长期后接入含5L发酵培养基的发酵罐中，培养至对数生长期后接入含50L发酵培养基的发酵罐中，培养5小时后加入1mMIPTG诱导5小时后，离心收集菌体约1000g。

其中LB培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉和1％NaCl；种子培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉和1％氯化钠；发酵培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠、5％磷酸氢二钠、1％磷酸二氢钠、0.01％硫酸镁和1％甘油。

图1为所制备酶的SDS-PAGE图，如图所示：泳道1为蛋白标志物14.4-116kDa(购于北京中科瑞泰生物技术有限公司)；泳道2为Ppk酶，约60kDa；泳道3为Adk酶，约24kDa；泳道4为Pap酶，约56kDa。

实施例2固定化ATP生产酶制备三磷酸腺苷

按实施例1分别制备高表达Ppk、Pap菌株，经发酵完成后离心收集菌体。分别取含Pap的菌体2.0kg，含Ppk的菌体2.0kg，用20L0.1MpH7.5Tris盐酸缓冲液混溶悬浮后，用高压均质机破碎菌，离心收集上清即得ATP生产酶。

在恒温搅拌反应罐中加入含氨基合成高聚物载体LX1000HA5kg与上述ATP生产酶20L混合(折合固定化载体与酶质量比为25:1)，在20℃条件下，150rpm搅拌12h。过滤收集载体，用0.02MpH8.0磷酸钾缓冲液清洗2遍，即得固定化ATP生产酶。

在200L反应罐中配制总体积100L的反应液，含AMP40mM，含六偏磷酸0.75M(以磷酸根计)，含硫酸镁25mM(以镁离子计)，余量为水。使用NaOH调节反应液的pH至7.0。加入上述固定化ATP生产酶5kg(50g/L)，在37℃下150rpm开始搅拌反应，反应5h后，经高效液相色谱(HPLC)检测ATP的生成量约为36mM，其中90％AMP转化为ATP。HPLC检测条件为：KromasilC18色谱柱(购于AKZONOBEL公司)(150×4.6mm)，检测波长210nm。流动相为含有6.8g/L磷酸二氢钾、2.0g/L庚烷磺酸钠和3％甲醇的水溶液，pH＝2.0。反应后的溶液经滤袋回收固定化ATP生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得三磷酸腺苷干品1.7kg，纯度99.5％。

将回收固定化ATP生产酶置于30℃条件下恒温，每天取一定量测定酶活，连续考察10天，以第一天固定化酶活为基准，考察酶活稳定性。第10天时，活性为第一天的70％。

实施例3固定化ATP生产酶制备三磷酸腺苷

按实施例1分别制备高表达Pap、Adk菌株，经发酵完成后离心收集菌体。分别取含Pap的菌体1.6kg，含Adk的菌体0.4g，用20L磷酸缓冲液混溶悬浮后，用高压均质机破碎菌，离心收集上清，即得ATP生产酶液。

在恒温搅拌反应罐中加入含环氧基聚丙烯酸载体4kg与16L上述ATP生产酶液混合(折合固定化载体与酶蛋白质量比为40:1)。在25℃条件下，150rpm搅拌5h。过滤收集载体，用0.01MpH8.0磷酸钾缓冲液清洗2遍。将固定化ATP生产酶置于50mM甘氨酸溶液中30min，再用0.01MpH8.0磷酸钾缓冲液清洗2遍即得固定化ATP生产酶。

在200L反应罐中配制总体积100L的反应液，含AMP40mM，含六偏磷酸钠750mM(以磷酸根计)，含氯化镁25mM(以镁离子计)。搅拌下用KOH调节反应液的pH至7.5。加入上述固定化ATP生产酶4kg(40g/L)，在37℃下搅拌反应，反应5h后，经HPLC检测ATP的生成量约为28mM，其中70％AMP转化为ATP。反应后的溶液经滤袋回收固定化ATP生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得三磷酸腺苷干品1.3kg，纯度99.3％。按实施例2的方法考察回收酶的酶活稳定性，第10天时，酶活性为第一天的75％。

实施例4固定化ATP生产酶制备三磷酸腺苷

按实施例1分别制备高表达Ppk、Adk菌株，经发酵完成后离心收集菌体。分别取含Pap的菌体8.0kg，含Adk的菌体4.0kg，用60L磷酸缓冲液混溶悬浮后，用高压均质机破碎菌，离心收集上清，即得ATP生产酶液。

取上述ATP生产酶液60L，加入0.6kg含羧基的纤维素固定化载体(折合固定化酶载体与酶蛋白质量比为1:1)，搅拌进行固定化，获得固定化ATP生产酶。

在200L反应罐中配制总体积100L的反应液，含ADP40mM，含四聚磷酸钠0.75M(以磷酸根计)，含七水硫酸镁25mM(以镁离子计)，含硫酸铵10mM(以铵离子计)、含氯化钾20mM(以钾离子计)。搅拌下用NaOH调节反应液的pH至8.0。加入上述固定化ATP生产酶0.6kg(6g/L)，在37℃下搅拌反应，反应12h后，经HPLC检测三磷酸腺苷的生成量约为26mM，其中65％ADP转化为ATP。反应后的溶液经滤袋回收固定化ATP生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得三磷酸腺苷干品1.1kg，纯度99.2％。按实施例2的方法考察回收酶的酶活稳定性，第10天时，酶活性为第一天的72％。

实施例5固定化ATP生产酶制备三磷酸腺苷

按实施例2制备固定化ATP生产酶，用磷酸缓冲液混悬后装入中压玻璃柱，制得酶反应柱。酶反应柱包括玻璃柱、顶部紧固件、下部紧固件，500目筛网。柱内径3.5cm，柱高100cm。柱体积960mL，装酶量800mL。

配制2000ml底物反应液，反应液含60mMAMP，含800mM三聚磷酸钠(磷酸根计)，20mM氯化镁，用NaOH调节反应液pH至7.5。用恒流泵将底物反应液以500mL/h流量通过酶反应柱，25℃下进行反应，反应3h取样测定AMP的转化率为75％。收集反应液，并用200ml纯水置换柱中残留的反应液。反应液经层析分离结晶干燥后，获得ATP干品43g，纯度99.4％。以同一酶反应柱相同的条件下连续反应3天，酶活仍为初始酶活的90％以上。

实施例6固定化ATP生产酶制备三磷酸腺苷

按实施例1分别制备高表达Ppk、Adk菌株，经发酵完成后离心收集菌体。分别取含Pap的菌体2.5kg，含Ppk的菌体0.125kg，用13L0.1MpH7.5Tris盐酸缓冲液混溶悬浮后，用高压均质机破碎菌，离心收集上清即得ATP生产酶。

在恒温搅拌反应罐中加入含氨基的琼脂糖载体20kg与上述ATP生产酶13L混合(折合固定化载体与酶质量比为150:1)，在25℃条件下，150rpm搅拌5h。过滤收集载体，用0.02MpH8.0磷酸钾缓冲液清洗2遍，即得固定化ATP生产酶。

在200L反应罐中配制总体积100L的反应液，含AMP80mM，含多聚磷酸钠(由75个磷酸根聚合)1M(以磷酸根计)，含硫酸镁2mM(以镁离子计)，余量为水。使用Tris调节反应液的pH至5.0。加入上述固定化ATP生产酶20kg(200g/L)，在60℃下150rpm开始搅拌反应，反应10h后，经高效液相色谱(HPLC)检测ATP的生成量约为8mM，其中20％AMP转化为ATP。反应后的溶液经滤袋回收固定化ATP生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得三磷酸腺苷干品0.62kg，纯度99.5％。

实施例7固定化ATP生产酶制备三磷酸腺苷

按实施例2制备固定化ATP生产酶。在200L反应罐中配制总体积100L的反应液，含AMP2mM，含三聚磷酸钠4mM(以磷酸根计)，含氯化镁150mM(以镁离子计)，余量为水。使用NaOH调节反应液的pH至10.0。加入上述固定化ATP生产酶0.5kg(5g/L)，在25℃下150rpm开始搅拌反应，反应20h后，经高效液相色谱(HPLC)检测，ATP的生成量约为0.5mM，其中25％AMP转化为ATP。反应后的溶液经滤袋回收固定化ATP生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得三磷酸腺苷干品20g，纯度99.2％。

实施例8固定化ATP生产酶制备三磷酸腺苷

按实施例1分别制备高表达Ppk、Adk菌株，经发酵完成后离心收集菌体。分别取含Ppk的菌体1.0kg，含Adk的菌体0.2kg，用4L0.1MpH7.5Tris盐酸缓冲液混溶悬浮后，用高压均质机破碎菌，离心收集上清即得ATP生产酶。

取聚乙烯醇0.8kg、卡拉胶0.04kg，加入8L纯水混匀后在110℃下保温20min至全部溶化，取出后置37℃水浴保温，加入上述4LATP生产酶混合均匀，之后将混合液缓慢加入KCl饱和硼酸溶液中，制成球状颗粒。用0.02MpH7.0磷酸盐缓冲液清洗2遍，即得固定化ATP生产酶。

将该酶用磷酸缓冲液混悬后装入中压玻璃柱，制得酶反应柱。酶反应柱包括玻璃柱、顶部紧固件、下部紧固件，500目筛网。柱内径3.5cm，柱高100cm。柱体积960mL，装酶量800mL。

配制2000ml底物反应液，反应液含60mMAMP，含800mM三聚磷酸钠(磷酸根计)，20mM氯化镁，用NaOH调节反应液pH至7.5。用恒流泵将底物反应液以500mL/h流量通过酶反应柱，35℃下进行反应，反应3h取样测定AMP的转化率为60％。收集反应液，并用200ml纯水置换柱中残留的反应液。反应液经层析分离结晶干燥后，获得ATP干品30g，纯度99.0％。

实施例9固定化ATP生产酶制备三磷酸腺苷

按实施例2制备ATP生产酶。

固定化载体处理：取280g壳聚糖溶于4.5L1％甲酸溶液，在40℃水浴中搅拌1h过滤，滤液中加硅胶4.2kg，室温振荡过夜，水洗三次，加4.2％的戊二醛水溶液8.0L，室温振荡3h，抽滤水洗三次，60℃烘箱中干燥4h得固定化载体。取上述处理后固定化载体4.2kg与上述ATP生产酶20L混合，在4℃条件下，震荡12h。过滤收集载体，用0.02MpH8.0磷酸钾缓冲液清洗2遍，即得固定化ATP生产酶。

在200L反应罐中配制总体积100L的反应液，含AMP40mM，含多磷酸钠(由35个磷酸根聚合)750mM(以磷酸根计)，含氯化镁25mM(以镁离子计)，含硫酸锰0.5g/L、含磷酸二氢钠2g/L，余量为水。初始用NaOH调节反应液pH至5.5，继续用Tris调节反应液的pH至8.0。加入上述固定化ATP生产酶4kg，在37℃下搅拌反应，反应5h后，经HPLC检测ATP的生成量约为30mM，其中75％AMP转化为ATP。反应后的溶液经滤袋回收固定化ATP生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得三磷酸腺苷干品1.4kg，纯度99.3％。

实施例10固定化ATP生产酶制备三磷酸腺苷

按实施例1分别制备高表达Pap、Ppk、Adk菌株，经发酵完成后分别收集菌体。取含Pap的菌体0.4kg，用2L0.1MpH7.5磷酸钾溶液混悬后，用高压均质机破碎菌，离心收集上清。在上清酶液中加入含氨基合成高聚物LX1000HA载体0.5kg在4℃条件下，150rpm搅拌8h。过滤收集载体，用0.02MpH8.0磷酸钾缓冲液清洗2遍，即得固定化Pap酶。按相同的方法制备固定化Ppk酶、固定化Adk酶。将固定化Pap酶0.5kg、固定化Ppk酶0.5kg、固定化Adk酶0.2kg混合均匀即得固定化ATP生产酶。

在200L反应罐中配制总体积100L的反应液，含AMP40mM，含二偏磷酸750mM(以磷酸根计)，含氯化镁25mM(以镁离子计),含氯化钾10mM(以钾离子计)。搅拌下用NaOH调节反应液的pH至7.5。分别加入上述固定化ATP生产酶，在37℃下搅拌反应，反应8h后，经HPLC检测ATP的生成量约为28mM，其中70％AMP转化为ATP。反应后的溶液经滤袋回收固定化ATP生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得三磷酸腺苷干品1.25kg，纯度99.3％。

本发明采用新型的Ppk、Adk、Pap三种ATP生产酶，只需两步酶促反应即可合成ATP。与传统啤酒酵母生产ATP繁琐的工艺过程相比，反应过程更简单，反应更容易控制，产品质量更加稳定；采用固定化酶催化的方法制备ATP，固定化酶可连续、反复多次使用，大幅的降低了生产成本，同时避免了使用酵母引入的大量蛋白、色素等杂质，更加易于纯化；建立了适用于大规模生产ATP的间歇搅拌反应及酶反应柱连续反应体系。

虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims

1.一种固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将ATP生产酶固定于固定化载体上，制备固定化ATP生产酶；

(2)利用固定化ATP生产酶，催化制备三磷酸腺苷反应液；以及

(3)分离产物三磷酸腺苷(ATP)。

2.根据权利要求1所述的固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法，其特征在于，所述固定化载体选自于高分子载体、无机载体和磁性高分子微球载体中的一种或多种组合。

3.根据权利要求2所述的固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法，其特征在于，所述高分子载体选自于纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多聚氨基酸、聚苯乙烯、聚丙烯酸、海藻酸钠、壳聚糖、淀粉、聚乙烯醇、明胶、卡拉胶、尼龙、合成高聚物的一种或多种组合；所述无机载体选自于多孔玻璃、氧化硅、活性炭、硅胶和硅藻土的一种或多种组合。

4.根据权利要求2所述的固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法，其特征在于，所述ATP生产酶通过吸附、包埋、共价、结合、交联或其组合的方式固定于固定化载体；所述固定化载体与所述ATP生产酶的质量比为1:1-150:1。

5.根据权利要求1所述的固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法，其特征在于，所述步骤(2)催化制备三磷酸腺苷反应液的反应条件为：

反应温度为25-60℃；

反应pH为5-10的条件下；

反应体系包括以下底物和离子：聚磷酸类化合物和镁离子；

在反应体系中添加AMP或ADP，利用固定化ATP生产酶催化反应生成ATP反应液。

6.根据权利要求1、4或5所述的固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法，其特征在于，所述ATP生产酶选自于多聚磷酸激酶(Ppk)、腺苷酸激酶(Adk)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(Pap)的任意两种或三种的组合。

7.根据权利要求5所述的固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法，其特征在于，所述反应体系还包含以下离子：铵离子、锰离子、钾离子、钠离子、Tris和磷酸根离子的一种或多种组合。

8.根据权利要求5所述的固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法，其特征在于，所述聚磷酸类化合物选自于多聚偏磷酸或其盐、多聚磷酸或其盐的一种或多种组合。

9.根据权利要求5或7所述的固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法，其特征在于，所述催化反应为在反应罐中添加固定化ATP生产酶、AMP或ADP、底物和离子进行搅拌反应；或是将固定化ATP生产酶装入酶反应柱中，将AMP或ADP、底物和离子通过酶反应柱进行间歇或连续反应。

10.根据权利要求5所述的固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法，其特征在于，所述反应体系中AMP或ADP的浓度为2mM-80mM、聚磷酸类化合物浓度为4mM-1M、镁离子浓度为2mM-200mM、固定化ATP生产酶的添加量为5-200g/L。