CN1056383C - 栝楼蛋白，其制备方法和在制药中的应用 - Google Patents
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Abstract
提供一种新的具有抑制HIV的活性的核糖体失活蛋白-栝楼蛋白，同时提供其制备方法。栝楼蛋白粗品和纯品均显著地抑制HIV-1诱导C8166合胞体的形成；在急性感染中，栝楼蛋白显著地抑制了HIV-1P24抗原的表达，化合物浓度为0.04μg/ml时，94P73CMI和94P75CMI对P24抗原表达抑制率分别为54.8%和52.6%(即EC50均低于0.04μg/ml)。HIV-1抗原阳性细胞减少了47.0%；在慢性感染中，栝楼蛋白对HIV-1 IIIB的复制无影响，即使在毒性浓度下，P24抗原表达水平也变化不大。
Description
本发明属于抗艾滋病药物领域，尤其涉及栝楼蛋白在制备治艾滋病的药中的应用。
艾滋病(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的破坏机体免疫系统的致死疾病。由于目前尚无可预防的有效疫苗，抗AIDS药物成为防治AIDS的主要手段。当前临床用抗AIDS药物均为化学合成药，往往毒副作用大，易产生耐药性等缺点。从传统药物和天然资源中寻找新的抗AIDS药物或先导化合物的研究，是当前国内外新药研制中的重要研究方面和非常活跃的领域。从天然资源中至少已发现几十种化合物具有抗HIV的活性。此外，对以天花粉蛋白为代表的核糖体失活蛋白(Ribosomeinactivating proteins，RIP)的抗AIDS活性的研究已成为目前国内外研究的重点。RIP是一类作用于真核细胞核糖体，抑制蛋白质合成的毒蛋白，而其中的代表天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是从葫芦科植物栝楼(Trichosanthes kirilowii)球根中提取的一种由247个氨基酸组成的碱性单链蛋白，分子量为27KDa，pI为9.4，不含半胱氨酸和糖基[Chow et al，1990；Collin et al，1990]。TCS具有RNA N-糖苷酶活性[Zhang and Liu，1992]。TCS是我国自己创制的为数不多的新药之一。
本发明的目的是基于上述现有技术基础，提供一种新的具有抑制HIV的活性的核糖体失活蛋白-栝楼蛋白(Trichobitacin)，同时提供其制备方法。
为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：
栝楼蛋白，为一种从栝楼植物的块根压完汁后的残渣中分离得到的单链核糖体失活蛋白，分子量27，228Da，等电点9.6，糖含量0.7-0.9％，具有RNA N-糖苷酶活性，N-端和C-端氨基酸是门冬氨酸和丙氨酸，N-端38个氨基酸的序列，除31位为异亮氨酸外，与天花粉蛋白一样。
本发明还提供了制备上述栝楼蛋白的方法，取栝楼块根，压完汁后的残渣用生理盐水浸泡后，用丙酮沉淀，收集沉淀冷冻干燥后，用Sephadex G-50或G-75和CM-Sephadex C-50纯化，取柱层析分离出的峰I即可。然后用高效液相色谱HPLC，SDS-凝胶电泳SDS-PAGE和高效毛细管电泳HPCE等方法鉴定其纯度，以电子处旋-质谱ES-MS测定其分子量，等电点聚焦电泳测定等电点，酶解后用自动测序仪测定部分氨基酸序列。
本发明还提供了栝楼蛋白作为制备治艾滋病药的应用。
下面用本发明的栝楼蛋白的药理实验结果来说明本发明的药效作用和有益效果：
1、栝楼蛋白对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体的抑制作用：
在96孔平底细胞培养板上，将待测化合物用完全培养基进行5倍倍比稀释，共七个稀释度，每孔100μl，设3个重复孔，同时设置正常细胞对照，HIV感染细胞对照。每孔滴加3×105/ml的C8166细胞100μl，然后每孔加入200 TCID50的HIV-1 IIIB上清。即感染复数为0.007，每孔的总体积为300μl。置37℃，5％CO2培养箱内培养。感染后第3天观察待测化合物对合胞体形成的影响。在100倍的倒置显微镜下，选取5个不重叠的视野，计数HIV-1 IIIB诱导C8166细胞形成的合胞体数。EC50为抑制合胞体形成达50％时的药物浓度。CC50是对50％宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度，选择指数(SI)为CC50/EC50的比值。表1栝楼蛋白抑制HIV-1 IIIB诱导C8166形成合胞体和对C8166的细胞毒性作用
| 化合物 | EC50(μg/ml) | CC50(μg/ml) | SI |
| 栝楼蛋白粗品(93P62盐沉淀)栝楼蛋白粗品(XBP94P23)栝楼蛋白(XBP94P27)栝楼蛋白(93P10CM-I)栝楼蛋白(93P18CM-I)栝楼蛋白(94P70CMI)栝楼蛋白(94P70CMII)栝楼蛋白(94P73CMI)栝楼蛋白(94P75CMI) | 0.010.00520.0140.01180.00450.0230.002730.0050.001 | 1.240.552.13.394.231.710.842.00.6 | 124105.8150287.3940.074.4307.7400600 |
从表1可见，栝楼蛋白粗品及不同批号的纯化栝楼蛋白均有显著的体外抑制HIV-1 IIIB诱导C8166细胞形成合胞体的作用。
2、栝楼蛋白对HIV感染细胞融合的阻断作用
按Walker等(1987)；Johnson和Waker(1990)所述方法改良进行。在96孔细胞培养板上，将待测化合物按5倍倍比稀释，共4个稀释度，每个稀释度设3个重复孔，每孔100μl。同时设置不含待测化合物的对照孔。每孔滴加6×105/ml的对数生长期C8166细胞50μl和2×105/ml的HIV-1 IIIB慢性感染的H9细胞50μl，即HIV-1 IIIB感染细胞与未感染的C8116细胞数之比为1∶3。置37℃，5％CO2培养箱内培养24小时后，在倒置显微镜下通过观察细胞融合形成的合胞体数量来推断化合物是否阻断病毒与细胞的结合过程。“-”表示化合物未阻断细胞融合的形成；“+”表示化合物完全阻断了细胞融合的形成。
表2栝楼蛋白对HIV-1 IIIB与细胞结合的影响
| 化合物 | 浓度(μg/ml) | 融合抑制 |
| 栝楼蛋白(93P10CMI)栝楼蛋白(93P18CMI)栝楼蛋白(94P70CMI)栝楼蛋白(94P73CMI)栝楼蛋白(94P75CNI) | 13.213.86.04.355.85 | ----- |
感染细胞表面的HIV-1与未感染细胞表面的CD4受体结合后，可导致细胞融合形成合胞体。作用于该靶点的药物将阻断融合的发生。从表2可见，栝楼蛋白均不能阻断感染细胞的融合。
3、栝楼蛋白对HIV-1急性感染细胞中病毒复制的影响
参照Lee-Huang等(1990)和Walker等(1987)方法略作改良。
将待测化合物用完全培养基稀释，设4个稀释度，每个稀释度三孔，每孔100μl。同时设置不含化合物的对照孔。收集对数生长期C8166细胞悬液50μl，即每孔含5×104个细胞。置37℃，5％CO2培养箱中培养，使化合物与细胞预作用60分钟。每孔加入含200 TCID50的HIV-1 IIIB 50μl。即MOI为0.004。置37℃，5％CO2培养箱中培养72小时。以0.8％的台酚蓝染料排斥法计数，计算存活细胞数。收集细胞悬液，TGL-16C台式离心机3000rpm，离心5分钟。收集培养上清用于ELISA测定P24抗原水平。每450μl上清加5％Triton X-100溶液50μl灭活和裂解病毒。然后置～20℃保存，备用。以50μl培养基重悬细胞沉淀物，将细胞悬液滴加到8孔玻片的孔中，干燥后，用冷丙酮固定15分钟，然后置-20℃保存。用于间接免疫荧光染色检测HIV阳性细胞。
表3栝楼蛋白对急性感染HIV复制的作用
| 化合物 | 浓度(μg/ml) | 细胞存活数(实验与对照的百分比) | HIV抗原阳性细胞减少率(％) | P24抗原表达抑制率(％) |
| 栝楼蛋白(94P73CMI)(批号1) | 5.01.00.20.04 | 41.981.4102.399.7 | 73.864.953.047.0 | 86.381.358.254.8 |
| 栝楼蛋白(94P75CMI) | 5.01.00.20.04 | 51.274.476.779.1 | 92.658.959.447.0 | 84.180.161.752.6 |
在HIV-1 IIIB感染C8166的急性感染体系中，首先使化合物预处理C8166细胞90分钟，然后用HIV-1 IIIB进行感染。通过检测HIV抗原阳性细胞百分率和HIV P24抗原表达水平的变化来判断核糖体失活蛋白对HIV复制的影响。从表3可见，栝楼蛋白均能显著地抑制HIV-1 IIIB在急性感染C8166细胞中的复制。HIV抗原阳性细胞和P24抗原的表达有一定的相关性。4、栝楼蛋白对HIV-1慢性感染细胞表达P24抗原的影响参照Kinchington等(1992)方法进行。
将待测化合物在96孔微量培养板上用完全培养基进行倍比稀释，每个化合物设4个稀释度，每个稀释度设三孔，每孔100μl。同时设置不含化合物的对照孔。收集复苏后第四天的HIV-1 IIIB慢性感染的H9细胞，调细胞浓度至4×105/ml，每孔加感染细胞悬液100μl。即每孔含4×104细胞数。置37℃，5％CO2培养箱中培养96小时。每孔小心吸取150μl上清，5％Triton X-100灭活后用于ELISA测定HIV P24抗原水平。用MTT方法测定化合物对H9/HIV-1 IIIB细胞的毒性作用。
表4栝楼蛋白对慢性感染细胞表达P24抗原水平的影响
| 化合物 | 浓度(μg/ml) | 细胞存活数(实验与对照的百分比) | P24抗原表达水平(实验与对照的百分比) |
| 栝楼蛋白(94P73CMI) | 5.01.00.20 04 | -0.513.543.388.2 | 66.083.4118.2116.2 |
| 栝楼蛋白(94P75CMI) | 5.01.00.20.04 | 0.29.026.568.8 | 57.752.298.494.5 |
理想的药物应该既能抑制急性感染又能抑制慢性感染的HIV复制。现在绝大多数的临床用抗HIV药物均不能达到这个目的。从表4可见，核糖体失活蛋白不影响HIV-1 IIIB在慢性感染H9细胞内的复制。
从上述实验结果可得出本发明栝楼蛋白的有益效果在于：
栝楼蛋白粗品和纯品均显著地抑制HIV-1诱导C8166合胞体的形成；在急性感染中，栝楼蛋白显著地抑制了HIV-1 P24抗原的表达，化合物浓度为0.04μg/ml时，94P73CMI和94P75CMI对P24抗原表达抑制率分别为54.8％和52.6％(即EC50均低于0.04μg/ml)。HIV-1抗原阳性细胞减少了47.0％；在慢性感染中，栝楼蛋白对HIV-1IIIB的复制无影响，即使在毒性浓度下，P24抗原表达水平也变化不大。因此，本发明的栝楼蛋白是一种新的具有抗HIV活性的核糖体失活蛋白。
下面结合附图用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
图1为本发明栝楼蛋白的Sephadex G-75柱层析图
图2为本发明栝楼蛋白的离子交换柱CM-Sephadex C-50柱层析图
实施例一：
1.制备栝楼蛋白：取栝楼(Trichosanthes kirilowii Maxim(Cucurbitaceae)块根，压完汁后的残渣用生理盐水浸泡后，用丙酮沉淀，收集沉淀冷冻干燥后，用分子筛Sephadex G-50或G-75和离子交换柱CM-Sephadex C-50纯化，在离子交换柱层析时，出现二个峰，峰I即为栝楼蛋白(Trichobitacin)。
然后用HPLC，SDS-PAGE和HPCE等方法鉴定其纯度，以ES-MS测定其分子量，等电点聚焦电泳测定等电点，酶解后用自动测序仪测定部分氨基酸序列。
2，栝楼蛋白的胰蛋白酶酶解：取19mg栝楼蛋白，加入0.6ml 8mol/l尿素，在100℃沸水中加热2分钟，加0.6ml双蒸水和0.6ml 0.4mol/l NH4HCO3，在搅拌下加入0.3mg经过TPCK处理过的胰蛋白酶水溶液0.6ml，振荡，37℃酶解24小时。
3.胰蛋白酶酶解栝楼蛋白后的混合肽质量的测定：将上述酶解后的溶液冷冻干燥，分别用MALDI-TOF-MS和FAB-MS测定混合肽质量，MALDI-TOF-MS分别选用2，5-二羟基苯甲酸(2，5-Dihydroxybenzoic acid，DHB)和α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA)作基质，FAB-MS用甘油作基质。
4.栝楼蛋白经胰蛋白酶酶解的肽段用HPLC分离：栝楼蛋白酶解24小时后，离心，上清液直接用高效液相色谱HPLC反相柱(μBondapak C18，10mm×30cm)分离；沉淀部分经pH8.1的N-甲基吗啉洗涤几次，用65％TFA溶解，离心，清液用HPLC分离，然后按以下条件洗脱即可。
洗脱液：A：0.1％TFA-H2O B：0.08％TFA+80％CH3CN
洗脱梯度：时间0-43-50-55-58min
B％ 0-65-100-100-0
流速：2mL/min 检测波长：230nm
5.部分肽段的序列分析：经HPLC分离纯化后的肽段用自动顺序仪、DABITC/PITC双偶合法手工测序，以及用质谱法比较栝楼蛋白与天花粉蛋白相同肽段，从而确定相应肽的序列。
通过上述方法制备的栝楼蛋白，是一种单链核糖体失活蛋白，分子量27，228Da，等电点9.6，糖含量0.7-0.9％，具有RNA N-糖苷酶活性，N-端和C-端氨基酸是门冬氨酸和丙氨酸，N-端38个氨基酸的序列，除31位为异亮氨酸外，与天花粉蛋白一样。
Claims (3)
1、栝楼蛋白，其特征是从栝楼植物的块根压完汁后的残渣中分离得到的一种单链核糖体失活蛋白，分子量27，228Da，等电点9.6，糖含量0.7-0.9％，具有RNA N-糖苷酶活性，N-端和C-端氨基酸是门冬氨酸和丙氨酸，N-端38个氨基酸的序列，除31位为异亮氨酸外，与天花粉蛋白一样。
2、制备权利要求1栝楼蛋白的方法，其特征是取栝楼块根，压完汁后的残渣用生理盐水浸泡后，用丙酮沉淀，收集沉淀冷冻干燥后，用Sephadex G-50或G-75和CM-Sephadex C-50纯化，取柱层析分离出的峰I即可。
3、权利要求1栝楼蛋白作为制备治艾滋病药的应用。
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| EP0256907A1 (fr) * | 1986-07-15 | 1988-02-24 | Sanofi S.A. | Inhibiteur de la synthèse protéique, procédé d'isolement, utilisation et compositions pharmaceutiques en contenant |
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- 1997-11-29 CN CN97115693A patent/CN1056383C/zh not_active Expired - Fee Related
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