CN105624116B - 利用多能干细胞制备神经前体细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用多能干细胞制备神经前体细胞的方法。首次揭示一种可显著提高多能干细胞向神经前体细胞分化效率的方法，通过采用组蛋白去乙酰化酶抑制剂作为诱导剂来提高多能干细胞分化为神经前体细胞的效率。此外，还揭示了通过在多能干细胞中下调HDAC3或SMRT的表达或活性的方式来提高分化效率的方法。

Description

利用多能干细胞制备神经前体细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明涉及利用多能干细胞制备神经前体细胞的方法。

背景技术

人多能干细胞(hPSCs；包括人胚胎干细胞hESCs和人诱导多能干细胞hiPSCs)是研究各种疾病尤其是神经退行性疾病的良好模型。由其分化的神经前体能够进一步分化为神经元和胶质细胞，对神经退行性疾病的疾病机制研究，药物筛选及疾病标志物的筛查，细胞移植治疗有很重要的作用。

目前人多能干细胞的神经分化方法主要有三种：

第一种方法是类胚体(embryoid body，EB)诱导。将培养的hESC或hiPSC消化为团块悬浮培养将形成EB。EB包含三个胚层的细胞，具有向各类细胞继续分化的能力。EB贴壁培养，逐渐会出现神经花环结构(rosette)的细胞团，将这类细胞挑出继续培养，则可得到神经前体。这些神经前体可增殖，并能向神经元，胶质细胞分化。在特定因子的诱导下可分化为特定类型的神经元。EB诱导方法的缺点是神经元分化效率低，EB的形成效率依赖于细胞状态，并不是每株细胞每次分化都能获得很多EB。而且EB包涵三个胚层的细胞，最后挑出的神经花环也是神经类细胞和胶质细胞的混合体，有很多非神经类的细胞。这些都会影响最后神经分化的效率。

第二种分化方法是与基质细胞共培养。在发育过程中神经元的分化由很多信号通路决定，参与的细胞并不是只有神经元本身，如胶质细胞，骨髓基质细胞等能分泌很多因子促进神经元的分化。常用的基质细胞有PA6，MS5，也可用原代胶质细胞。分化开始时先在培养皿底下铺一层基质细胞，再将hESC或hiPSC种上去，在一定培养液条件下可有导出成熟神经元。这种分化方法的缺点是，基质细胞分泌的因子是不确定的，也不稳定，所以不同批次分化效率都可能会有差异。而且不能获得神经前体。

第三种分化方法是单层细胞培养法(adherent monolayer culture system)。将hESC或hiPSC单层贴壁培养，通过添加不同诱导因子来诱导神经分化。这种方法是通过用各种细胞因子和小分子如shh，FGF8，RA，SB431542等来激活神经类细胞分化的通路或阻断非神经类细胞的分化通路的作用来达到促进神经分化的目的。

人多能干细胞的神经分化对神经退行性疾病的研究提供重要的模型，获得尽可能多的神经分化细胞对于科学及临床研究都很有必要。然而，上述人多能干细胞向神经分化的方法均存在一些缺点，包括效率低，耗时长，所得细胞不纯等。因此，本领域还有必要开发改进的技术，来提高分化效率或提高细胞纯度。

发明内容

本发明的目的在于提供利用多能干细胞制备神经前体细胞的方法。

在本发明的第一方面，提供一种制备神经前体细胞的方法，所述方法包括：

(1)以维甲酸(RA)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导培养多能干细胞，获得神经球；和

(2)培养(1)获得的神经球使之成熟，获得神经前体细胞。

在一个优选例中，所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括：丁酸钠(NaB)，丙戊酸钠(VPA)或MGCD0103或其组合。

在另一优选例中，丁酸钠的用量是：50μM-1mM；丙戊酸钠的用量是50μM-3mM；MGCD0103的用量是0.1-3μM。

在另一优选例中，丁酸钠的用量是60-200μM，如80μM，100μM，200μM，300μM。

在另一优选例中，丙戊酸钠的用量是100μM-2mM，如100μM，150μM，200μM，500μM。

在另一优选例中，MGCD0103的用量是0.2-2μM；更佳地为0.3-1μM；如0.4μM，0.5μM，0.8μM。

在另一优选例中，维甲酸的用量是2-50μM；较佳地，维甲酸的用量是4-30μM；更佳地为5-20μM；如8μM，10μM，12μM，15μM。

在另一优选例中，步骤(2)中还包括：从培养物中分离出神经前体细胞。

在另一优选例中，以Nestin和/或SOX1分子作为神经前体细胞的标志物， Nestin和/或SOX1分子阳性表明该细胞为神经前体细胞。

在另一优选例中，可采用流式细胞分选方法分离出神经前体细胞。

在另一优选例中，所述的从培养物中分离出神经前体细胞的方法是：

分选细胞表面Nestin分子和/或SOX1分子阳性的细胞群，所述的细胞群是纯的神经前体细胞的细胞群。

在另一优选例中，步骤(2)获得的Nestin和SOX1阳性的神经前体细胞占细胞培养物总细胞的94％或更高；Nestin阳性的神经前体细胞占细胞培养物总细胞的97％或更高；SOX1阳性的神经前体细胞占细胞培养物总细胞的99％或更高。

在另一优选例中，步骤(1)包括：将多能干细胞处理成500-1000个细胞的小克隆，以添加了维甲酸和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的干细胞维持培养基(feeder-free stem-cell maintenance medium；如mTeSR1)进行贴壁培养，培养时间为7±2天(较佳地为7±1天，更佳地为7±0.5天)。

在另一优选例中，步骤(2)包括：将步骤(1)的细胞处理成含500-1000个细胞的团块，在神经球培养液中进行悬浮培养11±2天(较佳地11±1天)。

在另一优选例中，前4±1天用KSR培养液培养，后7±1天用N2培养液培养，至神经球成熟。

在另一优选例中，所述的多能干细胞包括：胚胎干细胞或诱导多能干细胞。

在另一优选例中，所述的多能干细胞是人多能干细胞。

在另一优选例中，所述的胚胎干细胞是人胚胎干细胞。

在另一优选例中，所述的诱导多能干细胞是人诱导多能干细胞。

在另一优选例中，在步骤(1)之前，还包括：在所述的多能干细胞中降低HDAC3或SMRT的表达或活性。

在另一优选例中，利用RNA干扰的方法降低HDAC3或SMRT的表达。

在另一优选例中，利用干扰HDAC3表达的慢病毒载体转染多能干细胞，从而降低HDAC3的表达。

在另一优选例中，利用干扰SMRT表达的慢病毒载体(较佳地，所述的慢病毒载体中，用于干扰的siRNA序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)转染多能干细胞，从而降低SMRT的表达。

在本发明的另一方面，提供一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的用途，用于诱导多能干细胞分化为神经前体细胞。

在一个优选例中，所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂用于制备诱导多能干细胞分化为神经前体细胞的制剂。

在另一优选例中，所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括：丁酸钠(NaB)，丙戊酸钠(VPA)或MGCD0103或其组合。

在本发明的另一方面，提供一种用于制备神经前体细胞的培养基，所述的培养基包括：干细胞维持培养基以及2-50μM维甲酸；和50μM-1mM丁酸钠，50μM-3mM丙戊酸钠或0.1-3μM MGCD0103。

在一个优选例中，培养基中丁酸钠的量是60-200μM，如80μM，100μM，200μM，300μM。

在另一优选例中，培养基中丙戊酸钠的量是100μM-2mM，如100μM,150μM，200μM，500μM。

在另一优选例中，培养基中MGCD0103的量是0.2-2μM；更佳地为0.3-1μM；如0.4μM，0.5μM，0.8μM。

在本发明的另一方面，提供所述的培养基的用途，用于制备神经前体细胞。

在本发明的另一方面，提供一种HDAC3或SMRT下调剂的用途，用于促进多能干细胞分化为神经前体细胞。

在一个优选例中，所述的HDAC3或SMRT下调剂用于制备促进多能干细胞分化为神经前体细胞的制剂。

在另一优选例中，所述的HDAC3或SMRT下调剂是干扰HDAC3或SMRT转录或表达的试剂。

在另一优选例中，所述的HDAC3抑制剂是干扰HDAC3表达的慢病毒载体；或

所述的SMRT抑制剂是干扰SMRT表达的慢病毒载体(较佳地，所述的慢病毒载体中，用于干扰的siRNA序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)。

在本发明的另一方面，提供一种制备神经前体细胞的方法，所述方法包括：

(i)提供一种多能干细胞，该多能干细胞中HDAC3或SMRT的表达或活性被降低；以维甲酸(RA)诱导培养该多能干细胞，获得神经球；和

(ii)培养(i)获得的神经球使之成熟，获得神经前体细胞。

在一个优选例中，利用HDAC3或SMRT下调剂降低多能干细胞中HDAC3或SMRT的表达或活性；较佳地，所述的HDAC3或SMRT下调剂是干扰HDAC3或SMRT转录或表达的试剂。

在另一优选例中，步骤(i)中，维甲酸的用量是2-50μM。

在另一优选例中，维甲酸的用量是4-30μM；更佳地为5-20μM；如8μM，10μM，12μM，15μM。

将多能干细胞处理成500-1000个细胞的小克隆，以添加了维甲酸和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的干细胞维持培养基(feeder-free stem-cell maintenance medium；如mTeSR1)进行贴壁培养，培养时间为7±2天(较佳地为7±1天，更佳地为7±0.5天)。

在另一优选例中，步骤(ii)包括：将步骤(i)的细胞处理成含500-1000个细胞的团块，在神经球培养液中进行悬浮培养11±2天(较佳地11±1天)；更佳地，前4±1天用KSR培养液培养，后7±1天用N2培养液培养，至神经球成熟。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、培养H9人胚胎干细胞诱导分化为神经前体细胞，NaB和MGCD促进神经前体生成。

(A)神经分化的流程图。

(B)RA诱导7天后悬神经球，培养11天神经球成熟后，神经前体的鉴定(也即培养的第18天鉴定)。

(C)RA诱导7天，培养11天神经球成熟后，神经前体分化潜能鉴定。

(D)添加组蛋白去乙酰化酶处理后神经球的生成情况。

(E-F)不同浓度MGCD对神经球形成的影响。

(G-J)NaB处理7天(18D-NaB)或18天(18D-NaB)对神经球的形成的影响。

(K)NaB和MGCD处理之后获得的神经前体的数目。

图2、H9人胚胎干细胞诱导分化为神经前体细胞过程中，抑制剂不影响细胞增殖和凋亡。

(A-B)BrdU掺入法检测抑制剂对细胞的增殖的影响。

(C-D)AnnexinV/PI染色法检测抑制剂对细胞凋亡的影响。

(E)分化过程中的细胞数目的变化情况。

图3、H9人胚胎干细胞诱导分化为神经前体细胞过程中，组蛋白去乙酰化酶抑制剂促进人多能干细胞向神经外胚层的特化。

(A)分化过程(第0天D0，第3天D3和第7天D7)中经MGCD抑制剂处理组细胞(D3M，D7M)及未处理组(D3C，D7C)三个胚层标志物的表达情况的热点图。红色代表高表达，绿色代表低表达。

(B，C)实时定量PCR检测分化第7天三个胚层标志物的表达情况。

(D，E)免疫荧光染色检测神经外胚层标志物的细胞数目。

(F-I)分化第7天这些标志物的蛋白水平。

(J，K)分化第7天组细胞内蛋白乙酰化水平的检测。

(L)通过染色体免疫共沉淀(ChIP)检测乙酰化组蛋白与PAX6基因的启动子的结合情况。

图4、组蛋白去乙酰化酶抑制剂促进hiPSCs向神经前体分化。

(A-C)抑制剂增加N-iPSC-1的神经球的生成。

(D)分化第7天细胞的组蛋白乙酰化水平。

(E，F)免疫荧光染色检测神经外胚层标志物的细胞数目。

图5、敲低HDAC3或者SMRT可以促进神经前体的生成。

(A)HDAC1-3的敲低水平的检测。

(B)不同细胞系的神经球生成情况。

(C)蛋白免疫共沉淀检测HDAC3和SMRT的结合情况。

(D)SMRT的表达水平检测。

(E，F)敲低HDAC3或SMRT后，神经球的生成情况。

(G-H)敲低HDAC3或SMRT后，在分化第7天各胚层标志物的表达水平的变化情况。

具体实施方式

本发明人经过长期而广泛的研究，首次揭示一种可显著提高多能干细胞向神经前体细胞分化效率的方法，通过采用组蛋白去乙酰化酶抑制剂作为诱导剂来提供分化的效率。此外，本发明还揭示了通过在多能干细胞中下调HDAC3或SMRT的表达或活性的方式来提高分化效率的方法。

如本文所用，所述的“多能干细胞”包括了“胚胎干细胞”或“诱导多能干细胞”。所述的“多能干细胞”是哺乳动物来源的，也包括人来源的。早在1998年人胚胎干细胞和胚胎生殖细胞就已经建系成功，因此目前，“人胚胎干细胞”并不必须通过破坏胚胎的方式获得。

目前现有技术中，多能干细胞的定向分化的难点在于：①定向分化效率低；②分化的目的细胞纯度低，难于富集；③耗时长。本发明人针对这三个难题，对多能干细胞向神经前体细胞的诱导分化进行了深入探索和优化，找到了新型的诱导试剂，使分化效率大大提高。

本发明建立的单层细胞神经分化的方法，在RA诱导的基础上添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂。本发明的这种分化方法避免EB诱导方法的低效率和非神经类细胞太多的缺点，也避免共培养的方法的不稳定不确定因素。在神经分化的过程中，通过抑制去乙酰化可以促进人多能向神经外胚层分化，抑制了它们向中胚层和内胚层的分化。本发明的方法极大地提高了神经前体的生成效率，与普通RA诱导的神经分化的方法相比，本发明人的这种神经前体的生成效率提高了10倍之多。

作为本发明的优选方式，所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括：丁酸钠(NaB)，丙戊酸钠(VPA)或MGCD0103，或它们其中的两种或三种的组合。其它也能实现本发明的技术效果的组蛋白去乙酰化酶抑制剂也包括在本发明内。

本发明人还进一步发现HDAC3及SMRT形成抑制复合物参与了神经前体分化，敲低其中任一组分都能提高神经前体的生成效率。提示NaB或MGCD主要是通过作用于HDAC3及其复合物来提高神经前体的生成。

基本本发明人的新发现，本发明还提供了HDAC3或SMRT下调剂的用途，用于促进多能干细胞分化为神经前体细胞。

如本文所用，所述的HDAC3或SMRT下调剂包括了抑制剂、拮抗剂、阻滞剂、阻断剂等。

所述的HDAC3或SMRT下调剂是指任何可降低HDAC3或SMRT蛋白的活性、降低HDAC3或SMRT基因或蛋白的稳定性、下调HDAC3或SMRT蛋白的表达、减少HDAC3或SMRT蛋白有效作用时间、或抑制HDAC3或SMRT基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调HDAC3或SMRT有用的物质。例如，所述的HDAC3或SMRT下调剂是干扰HDAC3表达的慢病毒载体；或是干扰SMRT表达的慢病毒载体。

本发明还提供了一种用于制备神经前体细胞的培养基，所述的培养基含有：干细胞维持培养基；以及2-50μM维甲酸；和50μM-1mM丁酸钠，50μM-3mM丙戊酸钠或0.1-3μMMGCD0103。作为本发明的优选方式，培养基中丁酸钠的用量是60-200μM，如80μM，100μM，200μM，300μM。丙戊酸钠的用量是100μM-2mM，如100μM，150μM，200μM。MGCD0103的用量是0.3-1μM；如0.4μM，0.5μM，0.8μM。

所述的干细胞维持培养基是本领域人员已知的培养基，例如mTeSR 1培养液。

本发明所述的培养基中，各组分均可以通过商购的途径获得。因此，根据本发明人提供的配方，可以方便地配制出所述的培养基。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明首次揭示一种利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导多能干细胞向神经前体细胞分化的方法，重复性良好，诱导效率高。

(2)本发明的方获得的分化产物中神经前体细胞的纯度很高，其它分化倾向的细胞非常少。

(3)本发明的方法所获得的神经前体细胞能够进一步分化为神经元和胶质，为构建疾病模型，药物筛选和细胞移植治疗提供了便捷。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

1.1实验材料

实施例中使用的主要实验材料如表1。

表1

1.2主要实验方法

1.2.1、人多能干细胞的培养和传代

H9细胞系和N-iPSC-1细胞系用mTeSR1培养液培养在Matrigel包被的培养皿里。每天换液。6天后传代，传代时用Dispase酶消化7分钟，然后用DMEM/F1洗两遍。用移液管划“井”字，将细胞克隆划成小块。1:6传到新的培养皿中。

1.2.2、克隆构建与慢病毒包装

敲低HDAC1的慢病毒载体(shHDAC1-1，shHDAC1-2)、敲低HDAC2的慢病毒载体(shHDAC2-1，shHDAC2-2)、敲低HDAC3的慢病毒载体(shHDAC3-1，shHDAC3-2)以及含有无关序列的对照慢病毒载体(shNC)均购自上海思路迪公司。

SMRT的siRNA退火后连接到PLKO.1的AgeI和EcoRI位点，这两个siRNA 的序列如下5’-GCT TCA CAA CAC AGG CAT GAA-3’(SEQ ID NO:1)和5’-GCA GCG CAT CAA GTT CATCAA-3’(SEQ ID NO:2)。

慢病毒制备方法为：取15μg构建好的PLKO.1病毒载体、10μg psPAX2载体(包装质粒)和5μg PMD.G(包膜蛋白质粒)载体混合，用磷酸钙法转染培养于10cm培养皿的293FT细胞中。转染12hr后，用PBS清洗两次，更换为新鲜的DMEM完全培养基继续培养。转染48hr和72hr后，分别收集培养液，于1500g离心5min，上清液用0.45μm孔径的滤器过滤去除细胞及其它碎片。

慢病毒上清液使用PEG8000浓缩法浓缩纯化。配置5×PEG8000母液：称取8.766gNaCl和50g PEG8000溶解在200ml ddH₂O中，高压灭菌后保存在4℃。每30ml过滤后的病毒初始液，加入5×PEG-8000母液7.5ml。每20-30min颠倒混匀一次，共进行3-5次，然后置于4℃过夜。第二天4℃，8000g离心20min。吸去上清，静置管子1～2min，尽量去除残存的液体。通常每10ml病毒浓缩至50μL后保存于-80℃。

1.2.3、RNA抽提

细胞使用TRIzol试剂进行总RNA抽提。每10cm²培养皿中的细胞加入1ml TRIzol裂解，吸出置1.5ml的EP管中。加入0.2倍体积的氯仿，振荡混匀，室温放置5min后4℃，12000g离心15min。小心吸取上清，移至另一EP管中，加入0.5倍体积的异丙醇，室温静置20min。4℃，12000g离心10min，弃去上清。加入75％乙醇500μl，振荡混匀，洗涤沉淀。4℃，7500g离心5min，去除乙醇，重复1次。晾干后每管溶于30μl去RNA酶的ddH₂O中，取1μl测量OD_260/280比值，计算RNA浓度，用于反转录。

1.2.4、反转录

RNA反转录使用ReverTra Ace qPCR RT Kit试剂盒进行。方法如下：取2μg RNA于65℃水浴变性5min，置于冰上1min。加入RT反应体系(反转录酶混合物0.5μl，5×反转录缓冲液2μl，引物混合物0.5μl以及去RNA酶的ddH₂O至总体积10μl)，37℃水浴反应15min，95℃灭活5min，所得的cDNA用于PCR检测。

1.2.5、实时定量PCR(Real-time PCR)

Real-time PCR引物由上海铂尚生物公司合成，所用的序列见表2。PCR反应使用SYBR premix Ex TaqTM II试剂盒进行，反应体系如下：2×SYBR Mix 10μl，50×ROX 0.4μl，引物(5μM)2μl，cDNA模板1μl，最后加入ddH₂O至总量20μl。PCR反应在ABI7500实时定量PCR仪上检测，最终数据采用2^-ΔΔCt法进行相对定量分析。

1.2.6、Western blot

培养的细胞加入0.5ml RIPA细胞裂解液裂解，超声破碎使匀浆(2秒ON/2秒OFF共10秒)，冰上孵育30min。4℃，12000g离心15min，行SDS-PAGE分离，然后将蛋白质电转至PVDF膜上(预先用甲醇浸湿并在转膜缓冲液中平衡)。电转在快速转膜缓冲液中进行，于4℃、150V恒压电转30～60min。电转后的PVDF膜用5％脱脂牛奶室温封闭1小时。然后加入一抗于4℃杂交过夜:H3(1:2,000；Cell Signaling，Danvers，MA，USA)，acH3K9(1:1,000；CellSignaling)，PAX6(1:1,000；Millipore)，SOX2(1:1,000；Cell Signaling)，HDAC1(1:1,000；Cell Signaling)，HDAC3(1:1,000；Cell Signaling)，SMRT(1:100，sigma)和β-actin(1:30,000；Sigma)。用Tris缓冲液(TBST溶液)洗膜3次，每次15分钟。分别用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(1：2000，Cell Signaling)于室温杂交2hr，用TBST溶液洗膜3次，每次15分钟。最后用Super Signal Detection试剂盒显色发光，并在化学发光检测仪上成像。

1.2.7、免疫荧光染色

接种在玻片上的细胞经4％PFA固定30分钟，用含3％山羊血清和0.3％Triton-X-100封闭液封闭30分钟，之后加一抗4℃孵育过夜：OCT4(1:400，Cell Signaling)，PAX6(1:400；Millipore)，SOX2(1:400；Cell Signaling)，NESTIN(1:800；Millipore)，MAP2(1:1000；Sigma)，NeuN(1:500；Millipore)和Ac-H3K9(1:400；Cell Signaling)。第二天用PBS洗10分钟，洗三遍。加入相应的荧光二抗Alexa fluor-488/555(1:400；Invitrogen)，室温下避光孵育2小时，PBS洗3次，每次10分钟。最后加入Hoechst染核液5分钟，PBS洗5分钟，荧光显微镜下观察染色情况。每个玻片拍摄至少4个随机视野的图片。

1.2.8、BrdU掺入检测细胞增殖

分化第3天的细胞加入10μM的BrdU，在培养箱中孵育30分钟，然后消化成单细胞，用4％PFA固定10分钟。然后加入2M HCL在37℃孵育30分钟。然后PBS洗一遍。接着用含0.5％的BSA和0.1％Triton-X的PBS封闭30分钟。最后用Alexa-fluor-647mouse-anti-BrdU(1:100，Sigma)室温孵育30分钟。PBS洗三遍后用200μl PBS重悬细胞，通过流式细胞仪检测。

1.2.9、Annexin V-PI染色检测细胞凋亡

采用Annexin V凋亡检测试剂盒(eBioscience，88-8005-72)进行Annexin V-PI染色检测细胞凋亡。收集分化三天的细胞用1×PBS和1×结合缓冲液洗涤一次。加入100ul 1×结合缓冲液悬浮细胞，每毫升细胞数为5×10⁶，然后加入5ul Annexin V和5ul PI，室温避光孵育15分钟。离心弃上清以终止染色反应，细胞沉淀用1×结合缓冲液洗涤1次，离心，最后用200ul 1×结合缓冲液重悬细胞，在4小时内用流式细胞仪分析染色情况。

1.2.10、染色质免疫共沉淀(ChIP)

ChIP实验使用Pierce Agarose ChIP试剂盒进行，简要步骤如下：分化第7天的H9细胞中加入37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％，37℃孵育10min。加甘氨酸至终浓度为0.125M，在室温下放置5min以终止交联。吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。将细胞刮下细胞皿，离心收集细胞沉淀。按照细胞量(2×10⁶)，加入100μl裂解缓冲液1裂解细胞，涡旋，于9000g离心3min，去除上清。加入100μl MNase Digestion Buffer和0.25μlMicrococcal Nuclease重悬，于37℃消化15min，离心沉淀。用50μl裂解缓冲液2重悬离心，回收消化的染色质。取5μl上清作为Input样品，剩余上清溶于1×IP Dilution Buffer中，加入4μg anti-acH3K9(1:50；Cell Signaling)抗体于4℃翻转孵育过夜。加入20μlProtein A/G plus agarose于4℃翻转反应1hr。离心后分别用IP洗涤缓冲液1，IP洗涤缓冲液2和IP洗涤缓冲液3清洗沉淀复合物。加入150μl 1×IP洗提缓冲液在65℃孵育30min。加入750μl DNA结合缓冲液，过柱回收结合的DNA。用半定量PCR检测PAX6启动子上acH3K9的结合丰度。PAX6PCR引物序见表2。

1.2.11、蛋白质免疫共沉淀(CoIP)

为了验证H9细胞中是否有HDAC3和SMRT的相互结合。本发明人将3 个大皿的H9细胞加入2ml含1％PMSF的IP细胞裂解液在冰上裂解30分钟。然后加入40μl的protein A/Gagarose(Santa Cruz，Dallas，TX，USA)，在4℃旋转孵育30分钟，之后5000g离心5分钟取上清。这一步骤(preclear)有降低背景的作用。然后分别放在每毫升裂解加入1μg anti-HDAC3(Cell Signaling)或2μg anti-SMRT(Santa Cruz)或者1μg兔抗IgG(Cellsignaling)，4℃旋转孵育1小时，然后加入30μl蛋白A/G Agarose，旋转孵育过夜。之后离心弃上清，然后用裂解液洗沉淀五次。左后加入50μl 1XSDS蛋白上样缓冲液，进行westernblot检测。

1.2.12、引物

实施例中所应用的引物如表2所示。

表2

1.2.13、统计方法

实施例中所有数据均来源于3次或以上独立重复实验。所有数据以均数±标准误表示(Mean±SEM)。使用GraphPad Prism 5软件，进行Student’s t test检验。p<0.05视为有统计学差异。

实施例1、培养获得神经前体细胞的方法

首先将1×10⁶数量的H9人胚胎干细胞或N-iPSC-1人诱导多能干细胞用1mg/ml的Dispase酶消化，然后轻轻吹打成500-1000个细胞的小克隆，贴于Matrigel胶包被的6cm中皿里。用添加下组成分的mTeSR 1培养液培养7天：

(1)添加10μM RA(Con)，或

(2)添加10μM RA+100μM NaB，或

(3)添加10μM RA+0.5μM MGCD，或

(4)添加10μM RA+500μM VPA。

接着，再将这些细胞用Dispase酶消化成含500-1000个细胞的团块，悬浮培养在神经球培养液(KSR培养液和N2培养液)里，其中前4天用Knockout血清替代培养液(KSR培养液)培养，后7天用N2培养液培养。

在第18天，神经球成熟，将其消化为单细胞进行SOX2及NESTIN免疫荧光染色，有94％甚至更多的细胞为SOX2和NESTIN双阳性，为典型的神经前体细胞。

其中，培养液配方如下：

KSR培养液(其中的百分数为体积百分数)：DMEM/F12，20％KSR添加物，1％NEAA，1％谷氨酸，1％青霉素/链霉素，0.1％巯基乙醇。

N2培养液(其中的百分数为体积百分数)：DMEM/F12，1％N2，1％NEAA，1％谷氨酸，1％青霉素/链霉素，0.1％巯基乙醇，8μg/ml的肝素(heparin)，20ng/ml表皮生长因子(EGF)和20ng/ml的bFGF。

实施例2、组蛋白去乙酰化酶抑制剂增加神经球的生成

本发明人使用RA诱导的方法分化H9人胚胎干细胞(添加方法如实施例1中“(1)添加10μM RA”)。首先RA诱导7天，然后悬神经球(图1A)。经鉴定，神经球的细胞有94％都是神经前体，能够共表达神经前体的标志物SOX2和NESTIN(图1B)，而且具有分化为神经元和胶质的能力(图1C)。

但是，本发明人观察到，在分化第7天悬神经球时，会有大量的细胞死亡，只有少量细胞存活并最终分化为了神经前体。

为了克服上述问题，本发明人在RA诱导的阶段分别添加了不同类型的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。其中NaB和VPA能够抑制第一类HDACs(HDAC1，HDAC2，HDAC3和HDAC8)和第二类HDACs(HDAC4，HDAC5，HDAC6和HDAC9)；Tubastatin A(TubA)和PCI-34051(PCI)分别抑制HDAC6和HDAC8；MGCD抑制HDAC1，HDAC2和HDAC3。

结果发现，添加了NaB，VPA和MGCD的三组(添加和培养方法如实施例1中第(2)～(4)组)的神经球明显多并且大于未处理组(图1D)。因此，选择NaB和MGCD用于后续的验证实验。

由于MGCD的抑制效果是浓度依赖性的，本发明人发现：的确是随着MGCD的浓度的增加，神经球的体积也会变大(图1E-F)。在RA诱导和悬神经球两个阶段持续添加NaB(18D-NaB)，神经球的数量和体积与只在RA诱导阶段添加(7D-NaB)的效果差不多(图1G-H)。说明在RA诱导结果添加抑制剂已经 足够产生促进神经球生成的效果。由于神经球的细胞即为神经前体，它形态的变化也就代表了神经前体生成效率的变化。在同样的起始分化细胞数目的情况下，最后比较生成神经前体的数目，结果显示抑制剂处理组的神经前体数目是未处理组的10倍之多(图1K)。

上述结果表明，组蛋白去乙酰化酶抑制剂能通过增加神经球的生成来提高神经前体的产量。

实施例3、组蛋白去乙酰化酶抑制剂不影响细胞的增殖和凋亡

在分化前7天添加NaB或MGCD能够促进干细胞分化为神经前体。鉴于此，本发明人进一步验证这两种抑制剂是如何发挥效果的。

首先，本发明人验证它们是否影响的分化过程中细胞的增殖和凋亡。H9人胚胎干细胞诱导分化为神经前体细胞过程中，采用BrdU掺入检测细胞增殖。结果显示，在分化第3天细胞增殖(图2A，B)和凋亡(图2C，D)都不受影响。在分化过程中，细胞的数目是与未处理组差不多的(图2E)。说明这些抑制剂不是通过影响细胞的增殖或凋亡来促进神经前体的生成。

实施例4、组蛋白去乙酰化酶抑制剂促进人多能干细胞向神经外胚层特化

接着，本发明人通过芯片分析和实时定量PCR发现，添加抑制剂后，H9人胚胎干细胞诱导分化为神经前体细胞过程中，在RA诱导阶段外胚层的标志物的表达升高了，中胚层和内胚层的标志物表达水平降低了(图3A-C)，表明抑制剂很有可能协助RA将人多能干细胞向外胚层的方向诱导。免疫荧光染色也显示分化7天后表达神经外胚层的细胞数目变多(图3D，E)。这些标志物的蛋白水平也升高了(图3F-I)。

这些结果都说明，在分化开始以后，人多能干细胞会向三个胚层特化，逐渐被赋予了不同细胞命运。抑制剂能够促进它们向外胚层分化，最后导致具有神经外胚层的细胞也相应增多，从而增加了神经球的形成。NaB和MGCD可通过抑制去乙酰化来提高细胞乙酰化水平，本发明人也证明添加抑制剂之后细胞的组蛋白乙酰化水平增高(图3J，K)。组蛋白的乙酰化水平的变化可以影响其靶基因的表达水平，本发明人发现添加抑制剂后PAX6基因的启动子与乙酰化组蛋白ac-H3K9结合的明显变多(图3L)。

结合前面的结果，提示组蛋白乙酰化水平的增高是外胚层基因表达升高的 原因之一。

实施例5、组蛋白去乙酰化酶抑制剂促进人多能干细胞向神经前体分化

以上结果显示组蛋白去乙酰化酶抑制剂能促进人胚胎干细胞向神经前体分化，接着本发明人验证这些抑制剂在人诱导多能干细胞(hiPSCs)中是否能发挥相同效果。hiPSCs(命名为N-iPSC-1)诱导分化为神经前体细胞的操作过程同人胚胎干细胞。

结果显示，抑制剂也能增加hiPSCs的神经球的数量和体积(图4A-C)。在分化第7天时细胞的乙酰化水平也有升高(图4D)，同时表达PAX6，SOX2，NESTIN的细胞也有所增加(图4E-F)。

这些结果都与在人胚胎干细胞中的结果相似。说明组蛋白去乙酰化酶抑制剂可促进人多能干细胞向神经前体分化。

实施例6、敲低HDAC3或SMRT能提高神经前体的生成

前面结果显示，抑制HDAC1-3有更好的促进神经前体分化的效果。接下来本发明人验证哪一个有更主要的作用。

本发明人用shRNA(HDAC1，HDAC2和HDAC3的慢病毒载体)将多能干细胞的三个HDAC的表达敲低(图5A)；敲低的细胞仍然以前面实施例1相同的方法诱导培养(乙酰化酶抑制剂选择MGCD，con仅以RA诱导不添加乙酰化酶抑制剂)和使神经球成熟。结果显示，降低HDAC3的表达能增加神经球的生成(图5B)。

蛋白质免疫共沉淀实验发现，在多能干细胞中HDAC3和SMRT蛋白有相互作用(图5C)。通过RNA干扰的手段敲低SMRT也可以提高神经前体的生成(图5D-H)。该结果提示，组蛋白去乙酰化酶抑制剂通过作用于这个蛋白复合物来提高神经前体的生成效率。

综上，本发明人揭示了一种新型高效的人多能干细胞向神经前体分化的方法。只需在RA诱导阶段添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂NaB或MGCD即可提高神经前体的生成效率。本发明的方法有利于促进人多能干细胞在神经退行性疾病中的研究以及在细胞治疗中的应用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (17)

1.一种制备神经前体细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)以维甲酸和组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导培养人多能干细胞，获得神经球；所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂为MGCD0103；其中，MGCD0103的用量是0.1-3μM，维甲酸的用量是2-50μM；和

(2)培养(1)获得的神经球使之成熟，获得神经前体细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，MGCD0103的用量是0.2-2μM。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，MGCD0103的用量是0.3-1μM。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，维甲酸的用量是4-30μM。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中还包括：从培养物中分离出神经前体细胞。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：将人多能干细胞处理成500-1000个细胞的小克隆，以添加了维甲酸和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的干细胞维持培养基进行贴壁培养，培养时间为7±2天。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：将步骤(1)的细胞处理成含500-1000个细胞的团块，在神经球培养液中进行悬浮培养11±2天。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的人多能干细胞包括：胚胎干细胞或诱导多能干细胞。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)之前，还包括：在所述的人多能干细胞中降低HDAC3或SMRT的表达或活性。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，利用RNA干扰的方法降低HDAC3或SMRT的表达。

11.组蛋白去乙酰化酶抑制剂以及维甲酸的用途，用于诱导人多能干细胞分化为神经前体细胞；所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂为MGCD0103；其中，MGCD0103的用量是0.1-3μM，维甲酸的用量是2-50μM。

12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的人多能干细胞是降低HDAC3或SMRT的表达或活性的人多能干细胞。

13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的降低HDAC3或SMRT的表达或活性通过干扰HDAC3或SMRT转录或表达来进行。

14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，以干扰HDAC3表达的慢病毒载体降低HDAC3或SMRT的表达或活性；或

以干扰SMRT表达的慢病毒载体降低HDAC3或SMRT的表达或活性。

15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述的慢病毒载体中，用于干扰的siRNA序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。

16.一种用于制备神经前体细胞的培养基，其特征在于，所述的培养基包括：干细胞维持培养基以及2-50μM维甲酸和0.1-3μM MGCD0103。

17.权利要求16所述的培养基的用途，其特征在于，用于制备神经前体细胞。

Images