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CN105603028A - 酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法 - Google Patents

酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法 Download PDF

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CN105603028A CN201610167664.6A CN201610167664A CN105603028A CN 105603028 A CN105603028 A CN 105603028A CN 201610167664 A CN201610167664 A CN 201610167664A CN 105603028 A CN105603028 A CN 105603028A
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Abstract

本发明公开了一种酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法，该方法包括步骤：(1)利用GshF酶和Adk酶在反应罐中生成谷胱甘肽和腺苷酸；(2)在反应罐中分离固定化的GshF和Adk酶，或使用过滤设备分离游离的GshF酶和Adk酶；以及(3)分离产物GSH及AMP。本发明的制备方法优化了GSH生产的反应条件，使GSH生成浓度达到30-50g/L，氨基酸利用率也较高；同时，使用Adk酶对反应中消耗的ATP进行部分再生，降低了ATP的消耗量；且本发明的方法能同时制备GSH和AMP。

Description

酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法
技术领域
本发明涉及谷胱甘肽的制备方法，特别涉及一种酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法。
背景技术
谷胱甘肽广泛存在于动植物和微生物中，是生物体内最重要的非蛋白巯基化合物之一，具有还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，生物体内大量存在并起主要作用的是GSH，广泛用于治疗肝脏疾病、肿瘤、氧中毒、衰老和内分泌疾病，并作为生物活性添加剂及抗氧化剂用于食品领域。
GSH由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)经肽键缩合而成的三肽。相对分子质量为307.32，等电点为5.93，常温下为白色晶体，易溶于水、低浓度乙醇水溶液、液氨和二甲基甲酰胺。
目前谷胱甘肽的主要制备方法有：溶剂萃取法、化学合成法、生物发酵法和酶法。从谷物胚芽中提取GSH，由于GSH得率低、成本高、有机溶剂污染严重、纯度不高，而且消耗大量粮食，现已较少使用。化学合成法合成GSH，由于活性产物不易分离，需要化学拆分，产品纯度不高，难以推广。目前国内外GSH生产基本采用发酵法，原理是将编码GSH合成酶系的基因克隆到大肠杆菌或酵母中，使用微生物发酵生产GSH。酵母发酵法，工艺较成熟，但生产周期长，产量偏低，且过多的副产物使下游工艺处理复杂。
近年来酶法生产GSH技术逐步提高，使大规模生产变为可能。经典的酶法生产GSH依赖于γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GshI)和谷胱甘肽合成酶(GshII)两种酶，GshI催化L-谷氨酸和L-半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸，GshII催化γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成GSH。在GSH合成过程中，由于GshI催化过程受到终产物GSH的反馈抑制，因此使生成γ-谷氨酰半胱氨酸的第一步反应成为整个GSH合成的限速步骤。
随着进一步研究，人们在单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)等十几种细菌中都发现了一种双功能谷胱甘肽合成酶(GshF酶)。该酶同时具有GshI与GshII的活性，可一步催化GSH合成，且该酶反馈抑制作用较小，非常适和应用于酶法合成谷胱甘肽。
酶法合成GSH的最大问题是三磷酸腺苷(ATP)的大量消耗，生产1kgGSH至少需使用3-5kg的ATP，成本过高。为了解决这方面的问题，可使用酵母糖酵解再生ATP的方法与之偶联，专利CN201210201691.2中使用该方法再生ATP，效果稳定。但使用酵母会在反应体系中引入色素等杂质，给进一步纯化增加难度，使用酶系再生ATP是近年来的研究方向。此外，专利CN201510762184.X中使用多聚磷酸盐酶系再生ATP，取得了很好的效果。该酶系包含多聚磷酸盐激酶(Ppk)、腺苷酸激酶(Adk)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(Pap)。其中，Ppk与Pap酶在反应过程需添加多聚磷酸盐，对GSH反应转化率、能达到的最大浓度及后期纯化均有影响。因此，如何使用Adk酶优化GSH的生产，降低ATP的使用量，且在保证产物GSH易于纯化及分离的基础上，能同时制备得到其它有经济效益的产物，如腺苷酸(AMP)，成为目前的研究重点。
发明内容
本发明提供了一种酶法同时制备谷胱甘肽(GSH)和腺苷酸(AMP)的方法，从而克服现有技术的上述缺陷。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法，该方法包括以下步骤：
(1)利用GshF酶和Adk酶在反应罐中生成GSH和AMP：
在反应体系中添加ATP、GshF酶和Adk酶，反应生成GSH和AMP，其中所述反应体系为含有底物ATP、谷氨酸(Glu)或其盐、半胱氨酸(Cys)或其盐、甘氨酸(Gly)或其盐、以及镁离子和锰离子的一种或两种的水溶液。另外，反应体系中还可包含钾离子、钠离子、铵离子和Tris和磷酸根离子的一种或几种。本发明添加的底物、酶及各类盐可一次性加入反应体系，也可按照工业生产工艺流程分批次流加补入。
(2)分离GshF酶和Adk酶：
固定化的GshF酶和Adk酶在反应罐中直接分离。上述分离可通过滤袋分离，也可在反应柱中直接分离。
游离的GshF酶和Adk酶通过滤器中超滤膜分离。其中，过滤器具有进料口、出料口和回流口，内设截留分子量小于20kDa的超滤膜。经过滤器的截留液为回收的酶液，滤出液为分离出酶之后的反应液；以及
(3)分离产物GSH及AMP：
通过离子交换法，从上述步骤(2)的滤出液中分离产物GSH，经离子交换后的穿出液中主要含有另一产物AMP。
优选地，上述技术方案中，还包括以下步骤：
(4)步骤(2)中分离的GshF酶和Adk酶的循环利用：
即将分离的GshF酶和Adk酶添加至反应罐中生成GSH和AMP及再生ATP的连续反应。
(5)GshF酶和Adk酶的连续分离：
即连续分离固定化的GshF酶和Adk酶或使用过滤设备连续分离游离的GshF酶和Adk酶。
优选地，上述技术方案中，还包括以下步骤：
(6)产物GSH的连续分离。反应生成的GSH通过过滤或离子交换方法分离。
(7)产物AMP的连续分离。反应生成的AMP通过过滤或离子交换方法分离。
优选地，本发明的上述技术方案中，步骤(1)至步骤(3)可以重复至少一次。优选重复多次，例如重复2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50次等。
优选地，上述技术方案中，步骤(1)在反应罐中生成GSH和AMP的反应条件如下：
反应温度为25-55℃，优选温度为30-50℃；
反应pH为5-10，优选pH为6-9。
优选地，上述技术方案中，GshF酶、Adk酶为游离或者固定化的酶和/或再生酶，按反应最优条件计算，两种酶添加质量比例优选为GshF:Adk＝(0.2-30):1，更优选为(0.5-20):1。GshF酶添加浓度优选为0.002-1g/L。上述的GshF酶、Adk酶可来源于任何生物，或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。
优选地，上述技术方案中，氨基酸或其盐均为L型氨基酸或其盐。按其经济成本及反应最优条件计算，三种氨基酸添加质量比例优选为Glu:Cys:Gly＝(1-2.5):1:(0.5-1.5)，更优选为Glu:Cys:Gly＝(1.2-2):1:(0.8-1.5)。半胱氨酸添加浓度优选为1-50g/L。
优选地，上述技术方案中，本发明添加的ATP浓度为1-150g/L；镁离子浓度为0.01-0.1M；锰离子浓度为0.01-0.1M；钾离子浓度为0.01-0.3M；钠离子浓度为0.01-0.3M；铵离子浓度为0.005-0.2M；Tris浓度为1-12g/L、磷酸盐浓度为1-15g/L。
优选地，上述技术方案中，镁离子选自于氯化镁、硫酸镁、亚硫酸镁和硝酸镁中的一种或多种；锰离子选自于氯化锰和硫酸锰中的一种或多种；钾离子选自于氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、氢氧化钾、亚硫酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、醋酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和柠檬酸钾中的一种或多种；钠离子选自于氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、氢氧化钠、亚硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和柠檬酸钠中的一种或多种；铵离子选自于氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、氨水、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵和醋酸铵中的一种或多种。
优选地，上述技术方案中，步骤(2)中固定化酶通过下列方式固定于固定化载体：吸附、交联、共价结合、包埋或其组合。GshF和Adk两种酶可分别固定或按比例混合后一起固定。固定化载体选自于高分子载体、无机载体和磁性高分子微球载体的一种或多种。
其中，高分子载体选自于纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多聚氨基酸、聚苯乙烯、聚丙烯酸、海藻酸钠、壳聚糖、淀粉、聚乙烯醇、明胶、卡拉胶、尼龙和合成高聚物的一种或多种组合；无机载体选自多孔玻璃、氧化硅、活性炭、硅胶和硅藻土的一种或多种组合。当进行酶促反应时，可将固定化酶分散在反应液中直接进行反应，反应结束后通过过滤方式回收酶；或者将固定化酶装填入反应柱中，按一定流速将反应液泵入通过柱体进行酶促反应。
优选地，上述技术方案中，本发明方法步骤(2)中采用的超滤膜选自于醋酸纤维素膜、聚砜膜、聚丙烯腈膜、聚氯乙烯膜、聚偏氟乙烯膜、聚酰胺膜或陶瓷膜。
与现有技术相比，本发明技术具有以下有益效果：
1)优化了GSH生产的反应条件，可以大大提高底物浓度，使GSH生成浓度达到30-50g/L，其中，当GSH生成量达30-40g/L时，氨基酸利用率可达到75-90％。且该方法由于初始底物浓度高，反应速率快，节省了反应时间；
2)使用Adk酶能够对反应中消耗的ATP进行部分再生。单独使用GshF酶生产GSH时，生产1kgGSH至少需使用3-5kg的ATP，添加Adk酶后，生产1kg的GSH需要约1.5-2.5kg的ATP，大大降低了ATP的消耗量；另外，再生反应不需添加如多聚磷酸盐之类的其它底物，不影响GshF酶催化的生成GSH的酶促反应，保证GSH的生成量及反应速率；
3)经Adk酶催化后，反应体系中仅极少量ADP剩余，95％以上的ADP一部分转化为ATP继续使用，降低了ATP的消耗量，另一部分生成大量AMP。AMP与GSH在纯化过程中易于分离，纯化过程简单，可作为另一产物在制备GSH过程中同时制备。通过市场价格以及成本分析，此方法经济实用；
4)建立了适合GshF酶和Adk酶的稳定回收体系，无论固定化还是游离的GshF酶和Adk酶组合都可以应用于大规模连续生产；
5)本制备方法操作简易可行，放大效果良好，可放大至吨级。
附图说明
图1为本发明所表达的GshF酶的SDS-PAGE图。
图2为本发明所表达的Adk酶的SDS-PAGE图。
图3为本发明方法使用游离酶制备GSH和AMP的工艺流程图。
图4为本发明方法使用固定酶制备GSH和AMP的工艺流程图。
图5为本发明使用GshF酶和Adk酶进行反应的HPLC图谱。
图6为本发明方法达到不同GSH生成量时底物与生成物关系图。
图7为本发明仅使用GshF酶进行反应的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。
实施例1GshF酶的制备
本发明方法中的GshF酶可以商购获得，或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。
GshF酶的制备过程如下：
根据gshF基因序列(GenBank:NC_008532)，设计一对扩增引物，由中美泰和生物技术有限公司合成，引物序列如下：
GshF正义引物：5’-CCATATGACATTAAACCAACTTCTTCAAAAACTG-3’；和
GshF反义引物：5’-CGAATTCTTAAGTTTGACCAGCCACTATTTC-3’；
提取噬热链球菌(Streptococcusthermophilus)菌株(CGMCC1.6472)DNA，以其为模板，通过PCR扩增出gshF基因片段，并将其分别连接至pET22b载体(购于Invitrogen公司)，经测序正确后，分别转入E.coliBL21(DE3)菌株(购于天根生化科技有限公司)。
将转化后的E.coliBL21(DE3)单克隆接入LB培养基，培养至对数期后，加入1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导5小时后，收集菌体，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)筛选高表达菌株。
将筛选出的高表达菌株在无菌条件下接入种子培养基，培养至对数生长期后接入含5L发酵培养基的发酵罐中，培养至对数生长期后接入含50L发酵培养基的发酵罐中，培养5小时后加入1mMIPTG诱导5小时后，离心收集菌体约1000g。
其中LB培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉和1％NaCl；种子培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉和1％氯化钠；发酵培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠、5％磷酸氢二钠、1％磷酸二氢钠、0.01％硫酸镁和1％甘油。
收获的菌体经超声或高压匀浆破菌后，离心收集上清。通过硫酸铵沉淀、酸碱沉淀及二价金属离子沉淀方法可得到初步纯化的GshF酶。
图1为所制备酶的SDS-PAGE图，如图所示：泳道1为蛋白标志物14.4-116kDa(购于北京中科瑞泰生物技术有限公司)；泳道2为含GshF酶的菌体，GshF酶约85kDa；泳道3、泳道4为初步纯化后的GshF酶；泳道5为纯化浓缩后的GshF酶。
使用现有技术记载的公知的测定GshF酶活性的方法，检测到1mg/mlGshF酶活性约为3000U，其中将1μM底物在1分钟内完全转化定义为1个活性单位(U)。
实施例2Adk酶的制备
本发明方法中的Adk酶可以商购获得，或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。
Adk酶的制备过程如下：
根据adk基因序列(GenBank:NC_000913)，设计一对扩增引物，由中美泰和生物技术有限公司合成，引物序列如下：
adk正义引物：5’-CCATATGCGTATCATTCTGCTTGGCGCTCCGG-3’；和
adk反义引物：5’-CGGATCCTTAGCCGAGGATTTTTTCCAGATC-3’；
提取大肠杆菌(Escherichiacoli)K12菌株(购于天根生化科技有限公司)DNA，以其为模板，通过PCR扩增出adk基因片段，并将其连接至pET22b载体(购于Invitrogen公司)序列经测序正确后，转入E.coliBL21(DE3)菌株(购于天根生化科技有限公司)。
将转化后的E.coliBL21(DE3)单克隆接入LB培养基，培养至对数期后，加入1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导5小时后，收集菌体，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)筛选高表达菌株。
将筛选出的高表达菌株在无菌条件下接入种子培养基，培养至对数生长期后接入含5L发酵培养基的发酵罐中，培养至对数生长期后接入含50L发酵培养基的发酵罐中，培养5小时后加入1mMIPTG诱导5小时后，离心收集菌体约1000g。
其中LB培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉和1％NaCl；种子培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉和1％氯化钠；发酵培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠、5％磷酸氢二钠、1％磷酸二氢钠、0.01％硫酸镁和1％甘油。
收获的菌体经超声或高压匀浆破菌后，离心收集上清。然后加40-60％饱和的硫酸铵，离心收集沉淀。经Tris缓冲液pH8.0溶解后，使用G25柱(购于通用电气医疗生物科学有限公司)脱盐，再经DEAE-SepharoseFF(购于通用电气医疗生物科学有限公司)层析可得到初步纯化的Adk酶。
图2为所制备酶的SDS-PAGE图，如图所示：泳道1为蛋白标志物14.4-116kDa(购于北京中科瑞泰生物技术有限公司)；泳道3为Adk酶，约24kDa。
使用现有技术记载的公知的测定酶活性的方法，检测到1mg/mlAdk酶活性约为1000U，其中将1μM底物在1分钟内完全转化定义为1个活性单位(U)。
实施例3使用游离酶制备GSH和AMP
图3为本发明方法使用游离酶制备GSH的工艺流程图。参见图3，根据本发明制备GSH的工艺流程图使用游离酶按照如下步骤制备GSH和AMP：
(1)在反应罐中生成GSH和AMP：
在反应罐中，100L无菌水的反应体系为含有底物2.8kg谷氨酸、1.8kg半胱氨酸和2.0kg甘氨酸，以及5.1kgATP、1.2kg磷酸氢二钠、0.7kg氯化钾、0.6kg氯化钠、0.1kg氯化铵和1.0kg六水氯化镁的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至约7.0，在反应体系中添加0.01kgGshF酶及0.001kgAdk酶开始反应。反应期间控制pH值为7.0，温度为37℃。
反应6小时后，高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量约为30g/L，95％以上ATP耗尽，转化为AMP，AMP生成量约为30g/L。请一并参见图5，其为反应6小时10倍稀释反应液的HPLC图谱，图中未标出峰为氨基酸。HPLC检测条件为：KromasilC18色谱柱(购于AKZONOBEL公司)(150×4.6mm)，检测波长210nm，检测温度30℃。流动相为含有6.8g/L磷酸二氢钾、2.0g/L庚烷磺酸钠和3％甲醇的水溶液，pH＝3.0。
(2)在过滤器中分离GshF酶及Adk酶：
通过超滤方法，将步骤(1)的反应体系的反应液经过过滤器过滤分离GshF酶和Adk酶，过滤器内装膜包(购于Pall公司，截留分子量8kDa)，滤出液为分离出酶之后的反应液。
使用实施例1中描述方法，检测1mg/mlGshF酶的活性约为2600-2900U。
使用实施例2中描述方法，检测1mg/mlAdk酶的活性分别约为850-950U。
(3)分离产物GSH和AMP：
使用盐酸调节滤出液的pH值至3.0，在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附，穿出液中主要含有AMP，可简单脱盐后直接浓缩结晶，产量约2.8kg。
使用0-0.8MNaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的GSH，GSH产量约2.6-2.8kg，收率约90％。
(4)反应罐生成GSH和AMP的连续反应，即步骤(1)的连续反应：
将步骤(2)中分离出的酶经由过滤器的回流口添加至反应罐，并添加原酶量5-15％的新酶进行反应。反应液配制方法同上述步骤(1)。
在37℃、pH为7.0的条件下进行生成GSH和AMP的连续反应；6小时后，HPLC检测GSH的生成量约为30g/L，95％以上ATP转化为AMP，AMP生成量约为30g/L。HPLC检测条件同上述步骤(1)。在该步骤中，酶被循环利用。
实施例4酶的固定
GshF酶和Adk酶以商业化的环氧基固定化载体LX1000EP固定。
将上述实施例1与2中所述GshF酶和Adk酶按照质量比约10:1混合配成混合酶液。在恒温搅拌反应罐中加入LX1000EP湿载体与上述酶液按照固定化载体与酶质量比为30:1混合，在20℃条件下，150rpm搅拌12小时。过滤收集载体，用0.02MpH8.0磷酸钾缓冲液清洗2遍，即得固定化混合酶。
GshF酶和Adk酶固定化后，活性均降低至原活性的约30％。
实施例5使用固定酶制备GSH和AMP
图4为本发明方法使用固定酶制备GSH的工艺流程图。参见图4，根据本发明制备GSH的工艺流程图使用固定酶按照如下步骤制备GSH和AMP：
(1)在反应柱中生成谷胱甘肽GSH和AMP：
配制反应液，每100L含有底物2.8kg谷氨酸、1.8kg半胱氨酸和2.0kg甘氨酸，以及5.1kgATP、1.2kg磷酸氢二钠、0.7kg氯化钾、0.6kg氯化钠、0.1kg氯化铵和1.0kg六水氯化镁，配制时均匀搅拌防止出现沉淀，调节pH值至约7.5，温度升为37-40℃。
将上述实施例4中的混合固定酶50kg装入反应柱设备，排尽气泡后制得酶反应柱。使用恒流泵将反应液以16-20L/h流速由下而上缓慢泵入通过酶反应柱，反应期间控制温度为37℃。反应约6小时后，收集反应液，高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量约为30g/L，95％以上ATP耗尽，转化为AMP，AMP生成量约为30g/L。HPLC检测条件同实施例3步骤(1)。
(2)分离产物GSH和AMP：
使用盐酸调节上述收集的反应液的pH值至3.0，在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附，穿出液中主要含有AMP，可简单脱盐后直接浓缩结晶，产量约2.8kg。
使用0-0.8MNaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的GSH，GSH产量约2.6-2.8kg，收率约90％。
(3)反应柱生成GSH和AMP的连续反应，即步骤(1)的连续反应：
配制步骤(1)中所述相同反应液，连续以16-20L/h流速由下而上缓慢泵入通过酶反应柱，反应期间控制温度为37℃。
HPLC检测GSH的生成量约为30g/L，95％以上ATP转化为AMP，AMP生成量约为30g/L。HPLC检测条件同实施例3步骤(1)。在该步骤中，酶被循环利用。
固定化酶循环反应20次以上或者-4℃储存时间一月以上，酶活性降低约10％，需按比例补加或更换部分新酶。
实施例6底物浓度对GSH生成量的影响
在100L反应体系中，固定磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钠、氯化铵和六水氯化镁的添加量分别为1.2kg、0.7kg、0.6kg、0.1kg和1.0kg，固定添加酶的量为0.01kgGshF酶及0.001kgAdk酶。添加不同浓度的ATP及氨基酸底物，其中添加的氨基酸质量比例固定为：Glu:Cys:Gly＝1.6:1:1.1。调节pH值至约7.0，反应期间控制pH值为6.5-7.0，温度为35-38℃。
通过分析多次反应结果，总结出当GSH生成量能达到不同值时，反应中添加的底物ATP和氨基酸(以Cys来计算)用量以及GSH转化率的关系。图6为本发明方法达到不同GSH生成量时底物与生成物关系图，当GSH生成量依次达到约为10、20、30、40及50g/L时，所需ATP量约为GSH生成量的1.5-2.5倍。随着所需氨基酸(以Cys来计算)用量的逐步增大，反应转化率依次降低，为90.2％、88.0％、86.5％、78.6％及57.4％，可以看出，当GSH生成量达30-40g/L时，氨基酸利用率可达75-90％，GSH生成量达50g/L时，反应可正常进行，氨基酸利用率仍可达50％以上。
实施例7制备GSH和AMP
参见图3，根据本发明制备GSH的工艺流程图使用游离酶按照如下步骤制备GSH和AMP：
(1)在反应罐中生成谷胱甘肽GSH和AMP：
在反应罐中，100L无菌水的反应体系为含有底物0.25kg谷氨酸、0.1kg半胱氨酸和0.15kg甘氨酸，以及0.1kgATP、0.1kgTris、0.075kg氯化钾、0.059kg氯化钠、0.03g氯化铵、0.20kg六水氯化镁和0.17kg一水氯化锰的溶液，搅拌均匀。调节pH值至约10.0，在反应体系中添加0.0002kgGshF酶及0.001kgAdk酶开始反应。反应期间控制pH值为10.0，温度为55℃。
反应6小时后，高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量约为0.6g/L，90％以上ATP耗尽，转化为AMP，AMP生成量约为0.5g/L。HPLC检测条件同实施例3步骤(1)。
(2)在过滤器中分离GshF酶及Adk酶：
通过超滤方法，将步骤(1)的反应体系的反应液经过过滤器过滤分离GshF酶和Adk酶，过滤器内装膜包(购于Pall公司，截留分子量8kDa)，滤出液为分离出酶之后的反应液。
(3)分离产物GSH和AMP：
使用盐酸调节滤出液的pH值至3.0，在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附，穿出液中主要含有AMP，产量约50g。
使用0-0.8MNaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的GSH，GSH产量约55g，收率约90％。
(4)反应罐生成GSH和AMP的连续反应，即步骤(1)的连续反应：
将步骤(2)中分离出的酶经由过滤器的回流口添加至反应罐，并添加原酶量5-15％的新酶进行反应。反应液配制方法同上述步骤(1)。
在55℃、pH为10.0的条件下进行生成GSH和AMP的连续反应；6小时后，HPLC检测GSH的生成量约为0.6g/L，90％以上ATP转化为AMP，AMP生成量约为0.5g/L。HPLC检测条件同实施例3步骤(1)。在该步骤中，酶被循环利用。
实施例8制备GSH和AMP
参见图3，根据本发明制备GSH的工艺流程图使用游离酶按照如下步骤制备GSH和AMP：
(1)在反应罐中生成谷胱甘肽GSH和AMP：
在反应罐中，100L无菌水的反应体系为含有底物5.0kg谷氨酸、5.0kg半胱氨酸和2.5kg甘氨酸，以及15kgATP、1.5kg磷酸氢二钠、2.24kg氯化钾、1.76kg氯化钠、1.07kg氯化铵、2.03kg六水氯化镁和1.7kg一水氯化锰的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至约5.0，在反应体系中添加0.1kgGshF酶及0.0033kgAdk酶开始反应。反应期间控制pH值为5.0，温度为25℃。
反应7小时后，高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量约为30g/L，70％左右ATP耗尽，转化为AMP，AMP生成量约为60g/L。HPLC检测条件同实施例3步骤(1)。
(2)在过滤器中分离GshF酶及Adk酶：
通过超滤方法，将步骤(1)的反应体系的反应液经过过滤器过滤分离GshF酶和Adk酶，过滤器内装膜包(购于Pall公司，截留分子量8kDa)，滤出液为分离出酶之后的反应液。
(3)分离产物GSH和AMP：
使用盐酸调节滤出液的pH值至3.0，在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附，穿出液中主要含有AMP，产量约6kg。
使用0-0.8MNaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的GSH，GSH产量约2.8kg，收率约90％。
(4)反应罐生成GSH和AMP的连续反应，即步骤(1)的连续反应：
将步骤(2)中分离出的酶经由过滤器的回流口添加至反应罐，并添加原酶量5-15％的新酶进行反应。
在25℃、pH为5.0的条件下进行生成GSH和AMP的连续反应；7小时后，HPLC检测GSH的生成量约为30g/L，70％左右ATP转化为AMP，AMP生成量约为60g/L。HPLC检测条件同实施例3步骤(1)。在该步骤中，酶被循环利用。
实施例9制备GSH和AMP
参见图3，根据本发明制备GSH的工艺流程图使用游离酶按照如下步骤制备GSH和AMP：
(1)在反应罐中生成谷胱甘肽GSH和AMP：
在反应罐中，100L无菌水的反应体系为含有底物2.8kg谷氨酸、1.8kg半胱氨酸和2.0kg甘氨酸，以及5.1kgATP和0.83kg一水氯化锰的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至约7.0，在反应体系中添加0.01kgGshF酶及0.001kgAdk酶开始反应。反应期间控制pH值为7.0，温度为37℃。
反应6小时后，高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量约为28g/L，95％以上ATP耗尽，转化为AMP，AMP生成量约为30g/L。HPLC检测条件同实施例3步骤(1)。
(2)在过滤器中分离GshF酶及Adk酶：
通过超滤方法，将步骤(1)的反应体系的反应液经过过滤器过滤分离GshF酶和Adk酶，过滤器内装膜包(购于Pall公司，截留分子量8kDa)，滤出液为分离出酶之后的反应液。
(3)分离产物GSH和AMP：
使用盐酸调节滤出液的pH值至3.0，在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附，穿出液中主要含有AMP，可简单脱盐后直接浓缩结晶，产量约2.8kg。
使用0-0.8MNaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的GSH，GSH产量约2.6kg，收率约90％。
(4)反应罐生成GSH和AMP的连续反应，即步骤(1)的连续反应：
将步骤(2)中分离出的酶经由过滤器的回流口添加至反应罐，并添加原酶量5-15％的新酶进行反应。反应液配制方法同上述步骤(1)。
在37℃、pH为7.0的条件下进行生成GSH和AMP的连续反应；6小时后，HPLC检测GSH的生成量约为28g/L，95％以上ATP转化为AMP，AMP生成量约为30g/L。HPLC检测条件同实施例3步骤(1)。在该步骤中，酶被循环利用。
实施例10制备GSH和AMP
参见图4，根据本发明制备GSH的工艺流程图使用固定酶按照如下步骤制备GSH和AMP：
(1)在反应柱中生成谷胱甘肽GSH和AMP：
配制反应液，每100L含有底物2.8kg谷氨酸、1.8kg半胱氨酸和2.0kg甘氨酸，以及5.1kgATP、1.2kg磷酸氢二钠和1.0kg六水氯化镁，配制时均匀搅拌防止出现沉淀，调节pH值至约7.5，温度升为37-40℃。
将上述实施例4中的混合固定酶50kg装入反应柱设备，排尽气泡后制得酶反应柱。使用恒流泵将反应液以16-20L/h流速由下而上缓慢泵入通过酶反应柱，反应期间控制温度为37℃。反应约6小时后，收集反应液，高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量约为27g/L，95％以上ATP耗尽，转化为AMP，AMP生成量约为30g/L。HPLC检测条件同实施例3步骤(1)。
(2)分离产物GSH和AMP：
使用盐酸调节上述收集的反应液的pH值至3.0，在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附，穿出液中主要含有AMP，可简单脱盐后直接浓缩结晶，产量约2.9kg。
使用0-0.8MNaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的GSH，GSH产量约2.5kg，收率约90％。
(3)反应柱生成GSH和AMP的连续反应，即步骤(1)的连续反应：
配制步骤(1)中所述相同反应液，连续以16-20L/h流速由下而上缓慢泵入通过酶反应柱，反应期间控制温度为37℃。
HPLC检测GSH的生成量约为27g/L，95％以上ATP转化为AMP，AMP生成量约为30g/L。HPLC检测条件同实施例3步骤(1)。在该步骤中，酶被循环利用。
固定化酶循环反应20次以上或者-4℃储存时间一月以上，酶活性降低约10％，需按比例补加或更换部分新酶。
实施例11使用氨基酸盐制备GSH和AMP
参见图3，根据本发明制备GSH的工艺流程图使用游离酶按照如下步骤制备GSH和AMP：
(1)在反应罐中生成谷胱甘肽GSH和AMP：
在反应罐中，100L无菌水的反应体系为含有底物3.2kg谷氨酸钠、2.3kg半胱氨酸盐酸盐和2.6kg甘氨酸钠，以及5.1kgATP、1.2kg磷酸氢二钠、0.7kg氯化钾、0.6kg氯化钠、0.1kg氯化铵和1.0kg六水氯化镁的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至约7.0，在反应体系中添加0.01kgGshF酶及0.001kgAdk酶开始反应。反应期间控制pH值为7.0，温度为37℃。
反应6小时后，高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量约为30g/L，95％以上ATP耗尽，转化为AMP，AMP生成量约为30g/L。HPLC检测条件同实施例3步骤(1)。
(2)在过滤器中分离GshF酶及Adk酶：
通过超滤方法，将步骤(1)的反应体系的反应液经过过滤器过滤分离GshF酶和Adk酶，过滤器内装膜包(购于Pall公司，截留分子量8kDa)，滤出液为分离出酶之后的反应液。
(3)分离产物GSH和AMP：
使用盐酸调节滤出液的pH值至3.0，在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附，穿出液中主要含有AMP，可简单脱盐后直接浓缩结晶，产量约2.8kg。
使用0-0.8MNaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的GSH，GSH产量约2.6-2.8kg，收率约90％。
(4)反应罐生成GSH和AMP的连续反应，即步骤(1)的连续反应：
将步骤(2)中分离出的酶经由过滤器的回流口添加至反应罐，并添加原酶量5-15％的新酶进行反应。反应液配制方法同上述步骤(1)。
在37℃、pH为7.0的条件下进行生成GSH和AMP的连续反应；6小时后，HPLC检测GSH的生成量约为30g/L，95％以上ATP转化为AMP，AMP生成量约为30g/L。HPLC检测条件同实施例3步骤(1)。在该步骤中，酶被循环利用。
从结果可以看出：使用谷氨酸盐、半胱氨酸盐和甘氨酸盐替代相同摩尔浓度的谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸对反应结果没有影响。生产中可使用谷氨酸盐、半胱氨酸盐及甘氨酸盐替代谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸。
对比例1
在反应罐中，100L无菌水的反应体系为含有底物2.8kg谷氨酸、1.8kg半胱氨酸和2.0kg甘氨酸，以及10.0kgATP、1.2kg磷酸氢二钠、0.7kg氯化钾、0.6kg氯化钠、0.1kg氯化铵和1.0kg六水氯化镁的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至约7.0，在反应体系中添加0.01kgGshF酶开始反应。反应期间控制pH值为7.0，温度为37℃。
反应6小时后，高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量约为28g/L，70％左右ATP耗尽，转化为ADP及AMP。请一并参见图7，其为反应6小时10倍稀释反应液的HPLC图谱，图中未标出峰为氨基酸。HPLC检测条件同实施例3步骤(1)。
从结果可以看出：对比例1中没有偶联Adk酶，因此反应体系需要的ATP量增加。且相同时间内GSH生成量降低。另外，反应生成大量ADP，这无疑增加了纯化的难度。
相对于对比例1来说，本发明的制备方法优化了反应条件，可使产物GSH的生成量从10-20g/L提高至30-50g/L，并保持较高的转化率。反应过程中添加的Adk酶可使生成GSH时产生的一部分ADP转化为ATP继续使用，ATP用量可降低30-50％，大幅降低ATP的消耗量，同时，可催化另一部分ADP生成大量AMP，易于后期的纯化，反应过程中同时制备得到大量的AMP。AMP在医药方面，有显著的周围血管扩张和降压作用；在食品添加方面，可作为苦味掩盖剂使用，有一定的市场价值。
虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)利用GshF酶和Adk酶，在反应罐中生成谷胱甘肽和腺苷酸；
(2)在反应罐中分离固定化的GshF酶和Adk酶，或使用过滤设备分离游离的GshF酶和Adk酶；以及
(3)分离产物谷胱甘肽和腺苷酸。
2.根据权利要求1所述的酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤：
(4)所述步骤(2)中分离的GshF酶和Adk酶的循环利用，即将分离的GshF酶和Adk酶添加至反应罐中生成谷胱甘肽和腺苷酸及再生ATP的连续反应；以及
(5)GshF酶和Adk酶的连续分离，即连续分离固定化的GshF酶和Adk酶或使用过滤设备连续分离游离的GshF酶和Adk酶。
3.根据权利要求2所述的酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤：
(6)产物谷胱甘肽的连续分离。
(7)产物腺苷酸的连续分离。
4.根据权利要求3所述的酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法，其特征在于，循环利用GshF酶和Adk酶，即重复所述步骤(4)至所述步骤(7)至少一次或重复多次。
5.根据权利要求3或4所述的酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法，其特征在于，步骤(6)和步骤(7)反应生成的谷胱甘肽和腺苷酸通过过滤或离子交换方法分离。
6.根据权利要求1所述的酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)中在反应罐中生成谷胱甘肽和腺苷酸的反应条件如下：
反应温度为25-55℃；
反应pH为5-10的条件下；
反应体系包括以下底物：ATP、谷氨酸或其盐、半胱氨酸或其盐以及甘氨酸或其盐；
反应体系包括以下离子：镁离子和锰离子的一种或两种组合；
在上述反应体系中添加GshF酶和Adk酶，在反应罐中生成谷胱甘肽和腺苷酸。
7.根据权利要求6所述的酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法，其特征在于，所述反应体系还包括以下离子：钾离子、钠离子、铵离子、Tris和磷酸根离子的一种或几种。
8.根据权利要求6所述的酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法，其特征在于，所述GshF酶和Adk的质量比为(0.2-30):1，所述GshF酶浓度为0.002-1g/L。
9.根据权利要求6所述的酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法，其特征在于，所述谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸添加的质量比为(1-2.5):1:(0.5-1.5)，所述半胱氨酸浓度为1-50g/L。
10.根据权利要求1所述的酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法，其特征在于，所述步骤(2)中固定化的GshF酶和Adk酶通过吸附、交联、共价结合和包埋的一种或多种方式固定于固定化载体；所述固定化载体选自于高分子载体、无机载体和磁性高分子微球载体的一种或多种组合。
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