CN105586312A - Hla-a0201限制性抗muc-1抗原特异性ctl的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术开发与应用研究领域，公开了HLA-A0201限制性抗MUC-1抗原特异性CTL的制备方法。该方法通过单采收集外周单个核细胞，富集纯化CD8+T淋巴细胞；用负载HLA-A0201限制性MUC-1抗原多肽的成熟树突状细胞刺激CD8+T淋巴细胞，用rhIL-2和rhIL-7促进T细胞生长；用Tetramer标记法和流式细胞分选术纯化目标CTL；用固相包被的抗人CD3单抗和IL-2刺激目标CTL生长；加γ射线辐照后的自体PBMC增强目标CTL的活化；加rhIL-15培育扩增，收集鉴定。本方法制备的目标CTL具备高纯度，高增殖能力，高杀伤活性，高比例CTL_-CM，用于肿瘤等免疫治疗。

Description

HLA-A0201限制性抗MUC-1抗原特异性CTL的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术开发与应用研究领域，涉及HLA-A0201限制性抗MUC-1抗原特异性CTL制备方法。

背景技术

一、肿瘤治疗的困境与机会

恶性肿瘤已成为人类第一号“杀手”，手术、放疗与化疗是治疗肿瘤的三大常规方法，能在短期内有效的减轻肿瘤负荷，但仍不能有效清除肿瘤细胞。微小残留病灶、对放疗、化疗的部分敏感和耐药是肿瘤复发及转移的根源，而复发与转移正是肿瘤患者死亡的主要原因。常规治疗方法已力不从心，开发新型的肿瘤治疗技术与产品迫在眉睫。

二、细胞免疫治疗技术的诞生与发展

上世纪80年代起免疫学与肿瘤学的迅速发展，1982年美国NIHRosenberg教授为首的研究小组研制出淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)免疫疗法，并在后续研究中对LAK细胞的临床应用进行了深入的探讨。但是LAK细胞杀伤力不够强，临床应用需要大量输注(3×10^10-11)，另一方面扩增能力有限，需要在输注细胞的同时大剂量应用白细胞介素-2(IL-2)(10万IU/kg，q8h)，因而产生了相关的不良反应。而后Rosenberg又提出了肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，其杀瘤能力较LAK有了明显提高，并且无需大剂量IL-2联合应用，但细胞需要从肿瘤组织中分离获得，这极大限制其广泛的临床应用。在以上的工作基础上，1991年Stanford大学的Schmidt-Wolf等采用干扰素γ(IFN-γ)、IL-2和鼠抗人CD3单克隆抗体(Mouseanti-HumanCD3mAb)共同诱导出了具有强大抗肿瘤活性的细胞群，命名为细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)。

树突状细胞(DCs)是迄今为止已知的体内功能最为强大的专职抗原递呈细胞(APC)，其表面存在丰富的抗原捕获分子，抗原递呈分子(MHCI类和MHCⅡ类分子)，免疫共刺激分子(CD80、CD83、CD86、CD40等)。经抗原刺激后的DC细胞向淋巴结迁移，将其携带的抗原信息传递给相应的T淋巴细胞，启动、激发CD4+/CD8+T细胞免疫应答，特异性地杀灭肿瘤细胞。同时经抗原刺激后的DCs可分泌白细胞介素-8(IL-8)、干扰素α(IFN-α)、白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等，增强机体非特异性免疫应答(天然免疫)，故DC有“天然免疫佐剂”的美称，其发现者RalphSteinman教授获得2011年诺贝尔医学奖。鉴于DC在机体免疫防御系统中所处的中心地位，基于DC开发的抗肿瘤疫苗已使之成为最先进、最有希望的肿瘤免疫治疗技术之一，近年来国内外学者对其进行了广泛的探索。1992年Stanford医学院的2位教授成立了世界上第一家以DC为基础的肿瘤疫苗公司(Dendreon，CA)，该公司的产品Provenge已于2010年4月29日获得FDA批准上市。但是DC在体内的功能受到患者本身免疫状态，肿瘤微环境的影响，而肿瘤患者体内存在大量抑制因子，因此DC的体内效果并不如体外效果理想。

细胞毒性T淋巴细胞(CTL)构建是近期兴起的免疫治疗技术，因其具有特异、直接杀伤肿瘤靶细胞的能力，因此成为研究的热点。

三、MUC-1在肿瘤免疫治疗中的作用

MUC-1粘蛋白家族成员，又称为多形上皮粘蛋白(poly-morphicepithelialmucin，PEM)、上皮膜抗原(epithelialmembraneantigen，EMA)、CD227及CA153等，其相对分子量大于400000，是一种主要分布于腺上皮细胞的跨膜糖蛋白，分为细胞外区、跨膜区和胞内区。

在恶性肿瘤组织中，如乳腺癌、胃癌、结肠癌、多发性骨髓瘤等多种肿瘤组织中，MUC-1的表达存在质与量的异常，主要体现在表达量增高为正常的10倍以上，且增加的程度与肿瘤的恶性程度成正比，极性分布消失，整个腺上皮细胞表面均表达MUC-1，胞浆中也表达，糖链的糖基化不全，导致肽链表位暴露，使MUC-1成为可被免疫系统识别的肿瘤抗原。

MUC-1是最先与机体免疫系统接触的细胞表面分子之一，它几乎表达于所有的上皮细胞腺癌中，且MUC-1可以通过非人类主要组织相容性复合体(MHC)限制性及MHC限制性两种方式诱导活化CTL，杀伤表达MUC-1的肿瘤细胞，因而MUC-1是肿瘤主动特异性免疫治疗理想的靶分子。

因此，开发新型针对MUC-1靶点的特异性CTL是一种发展方向。

四、CTL作用机理

1、机体T细胞免疫反应过程

机体存在庞大的T细胞库，通过其表面表达不同的T细胞受体(TCR)特异识别不同的外部抗原分子(细菌、病毒和肿瘤抗原多肽)，被活化为具有杀灭靶细胞的CTL，清除细菌、病毒的感染和肿瘤细胞，且能产生免疫记忆性CTL，防止细菌、病毒的再次入侵和肿瘤的复发。

CTL免疫应答大致分四个阶段：

(1)抗原识别：APC通过表面受体识别并捕获抗原(细菌、病毒、肿瘤细胞)；

(2)抗原加工与递呈：抗原经APC消化、裂解成多肽分子，后者与APC胞内丰富的MHC-Ⅰ类或Ⅱ类分子结合分别形成MHC-I-多肽或MHC-II-多肽复合物，并被转运至APC表面；

(3)T细胞激活(双信号学说)：APC与T细胞相遇，T细胞通过自身TCR识别APC递呈的MHC-I/II-多肽复合物，其中CD8+T细胞识别MHC-I-多肽复合物，CD4+T细胞识别MHC-II-多肽复合物，T细胞接受了抗原的刺激信号(第一信号)加上免疫共刺激信号(第二信号)开始活化，具有细胞毒性作用即CTL；

(4)靶细胞杀灭：活化CTL循环至抗原所在部位，通过CTL表面的TCR特异识别抗原表达细胞后进行杀伤和清除。

但，已发现肿瘤患者体内存在大量免疫抑制因子，影响CTL的有效活化和增殖，数量甚少，不足以与迅速增殖的肿瘤抗衡。若能在体外制备大量抗原特异性CTL并回输给患者，可直接、快速杀伤肿瘤细胞起到治疗作用，对常规治疗无法清除的残留肿瘤细胞进行杀灭，将可以防止肿瘤的复发和转移。

2、CTL表型与功能差异

根据CTL表面分子的表达种类可分为两型：中央记忆型CTL(CTL_-CM)和效应记忆型CTL(CTL_-EM)。

Klebanoff等研究发现：表型分析为CD3+CD45RO+CD62L+CCR7+的CTL_-CM具有更强的抗肿瘤能力；Johnson等比较了MART-1TCR基因修饰的CTL_-CM和CTL_-EM，结果发现前者消退恶性黑色素瘤细胞的能力是后者的10倍。Berger等研究结果还显示CTL_-CM输注后较表型为CD3+CD45RO+CD62L-CCR7-的CTL_-EM在体内能存活更长的时间。

3、CTL技术开发现状

综合国内、国外CTL体外制备技术可归类为三种方法与来源：

(1)肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)体外扩增法

从肿瘤患者肿瘤组织中分离TIL，加入白细胞介素-2(IL-2)培养，克隆稀释法筛选肿瘤抗原阳性的T细胞克隆，再加入鼠抗人CD3单克隆抗体和IL-2进行扩增培养获得。

Li等选择HLA-A201阳性的Ⅳ期恶性黑色素瘤患者，将其肿瘤组织制备成单细胞悬液后，加入IL-2培养，5周后筛选扩增细胞中CD8+T+MART-1+的阳性T细胞克隆，再加入鼠抗人CD3单克隆抗体和辐照后的PBMC饲养细胞扩增培养，次日加入IL-2，再培养12天可获得CTLs，能对负载MART-1多肽的T2细胞株特异性识别和杀伤。

(2)TCR基因修饰法

TCR是T细胞识别抗原、介导免疫应答的关键分子，包括α、β、γ、δ四条链，由二硫键连接成α/β和γ/δ两种异二聚体，其中α/β+T细胞占外周血T细胞的90-95％，是主要的免疫效应细胞。TCR基因修饰即通过外源质粒转染自体T淋巴细胞，导入能识别特异性抗原多肽的TCR基因，挑选阳性克隆，在体外扩增培养获得CTL。较为常用的质粒有逆转录病毒质粒或慢病毒质粒。

Morgan等采用抗CD3+CD28+磁珠激活CD8+T细胞，应用慢病毒质粒转染修饰MART-1或gp100特异性的TCR基因，采用鼠抗人CD3单克隆抗体和IL-2培养体系制备CTLs，在12天能扩增培养至10⁹个细胞，用于15例HLA-A2+的黑色素瘤患者的治疗，结果显示有2例患者出现了明显的临床疗效，1例52岁男性患者的腋窝转移病灶消失，肝转移病灶缩小了89％，无病生存期为21个月；1例30岁男性患者，肺部转移病灶消失，无病生存期为20个月。

Perro等采用白细胞介素-15(IL-15)和白细胞介素-21(IL-21)细胞因子组合促进TCR基因转染非增殖的T细胞，可以维持T细胞高表达CD62L和CD28。

(3)体外抗原致敏法

用人工APC(ArtificialAPC)，或抗原(蛋白质，多肽，或全细胞)体外反复刺激T细胞，获得抗原特异性CTL。

浙江大学的发明专利(专利号：CN102168066A)体外诱导乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法即采用该方法。将MHC-Ⅰ-Ig和抗CD28mAb包被磁珠构建人工APC，抗原表位肽负载APC后，体外致敏3-4周，再以磁珠吸附分离抗原特异性CTL，Tetramer染色鉴定。

上述三种方法的缺陷：

(1)TIL体外扩增法

①需要获得患者的新鲜肿瘤组织作为CTL来源，仅限于可手术的患者，且肿瘤组织来源有限；

②TIL分离，CTL克隆的获取与鉴定方法复杂，肿瘤组织中各种细胞成分较多，较复杂，分离细胞的时间长，一般都需要1个月以上；

③TIL中混有CD4+CD25+Treg亚群，其会抑制CTL扩增效率；

④由于体外分离扩增时间长，增加了污染的机会。

(2)TCR基因修饰法

①外源性质粒(逆转录病毒或慢病毒等)的引入，给临床应用带来一定的风险；

②内源性TCR干扰，导入的TCR基因可能并不能导入预期的位点，而与内源性的TCR发生错排，其能识别抗原不是预期设计的，且是未知的，存在很大的风险。

(3)体外人工APC负载抗原致敏法

①引入外源物质：人工APC，制备的CTL是否有人工APC残留仍是疑问；

②人工APC体外致敏CTL的周期较长，需要3-4周，获得CTL还需要扩增培养后才能满足临床治疗的需要，因此体外培养的周期长，污染的几率较大。

目前还没有文献报导过制备时间短、扩增倍数高、CTL纯度高且杀伤效果好的HLA-A0201限制性抗原特异性CTL的制备方法。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术问题提供一种制备时间短、扩增倍数高、CTL纯度高且杀伤效果好的HLA-A0201限制性抗MUC-1抗原特异性CTL的制备方法。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

HLA-A0201限制性抗MUC-1抗原特异性CTL的制备方法，该方法包括下列步骤：

a.第一步CTL前体细胞来源细胞的富集与纯化方法：

用自动单个核细胞采集仪(单采仪)采集外周单个核细胞(PBMC)作为细胞来源；采用临床级阴性磁珠分离法，从PBMC中富集、纯化CTL前体细胞即CD8+T淋巴细胞。

b.目标CTL诱导与第一轮扩增：

用负载HLA-A0201限制性MUC-1抗原多肽的自体成熟树突状细胞(mDC)刺激CD8+T淋巴细胞，不仅提供给T细胞活化的第一信号(抗原)，同时DC提供给T细胞活化必须的第二信号(免疫共刺激分子CD40、CD80、CD83等)；同时加入rhIL-2和rhIL-7两种细胞因子联合促进T细胞生长，抑制活化诱导的细胞凋亡反应(AICD)，延长活化细胞的生存周期。第二周再重复刺激一次，完成第一轮扩增。

c.目标CTL纯化方法：

在第一轮用负载抗原的mDC刺激并扩增目标CTL数量后，采用Tetramer标记方法和流式细胞分选术再一次纯化目标CTL(目标CTL是指表达识别MUC抗原多肽TCR的CD8+T，即Tetramer+CD8+T淋巴细胞)，即选择Tetramer+CD8+T，剔除非特异性扩增的T细胞，以减少其对目标CTL增殖的影响。

d.目标CTL的第二轮扩增：

采用固相包被的anti-human-CD3mAb和rhIL-2刺激目标CTL的生长与增殖；再加入经γ射线辐照的自体PBMC增强对目标CTL的活化；加入rhIL-15一方面可以促进记忆性T细胞的增殖，另一方面可抑制细胞的凋亡。

e.第二轮扩增后目标CTL表型鉴定：

采用流式细胞术对已制备的目标CTL进行表型分析，根据其表达的分子谱不同将其分为中心记忆性CTL(CTL_-CM：CD8+CD45RO+CD62L+CCR7+)和效应性CTL(CTL_-EM：CD8+CD45RO+CD62L-CCR7-)。

所述的制备方法，步骤b中的目标抗原为MUC-1抗原多肽长度优选9-15个氨基酸,进一步优选序列如SEQIDNO.1所示的HLA-A0201限制性MUC-1抗原多肽。

所述的制备方法，步骤b中负载目标抗原的自体成熟DC是通过下列方法制备得到的：PBMC贴壁后加入rhGM-CSF、rhIFNα、灭活的混合正常人AB血清和RPMI1640培养基培养三天，收获的DC再加入目标抗原孵育即得。

所述的制备方法，步骤c中用于目标CTL扩增的γ射线辐照的自体PBMC是通过下列方法制备得到的：留取部分单采获得的PBMC，经30-50GY的γ射线辐照后保存；保存液：含20％(V/V)DMSO和20％(V/V)正常人AB血清的RPMI1640培养液，保存温度：-80℃超低温保存。

所述的制备方法，步骤d中用于目标CTL扩增的CD3单抗克隆抗体(anti-human-CD3mAb，简称CD3单抗)是如下操作的：将CD3单抗固相包被于用于扩增细胞的容器表面，CD3单抗可与多个CTL表面的CD3分子结合，促进CTL细胞克隆的形成，促进细胞接触，快速进入增殖周期。

所述的制备方法，各步骤中刺激分子或细胞的用量分别为：

a.目标CTL第一轮扩增每次加入量：rhIL-2终浓度为500-750IU/ml，rhIL-7终浓度为50-75ng/ml，DC与起始T细胞数量比为1:5。

b.目标CTL第二轮扩增：rhIL-2终浓度为200-500IU/ml，rhIL-15终浓度为100-250ng/ml，CD3单克隆抗体包被浓度为1.0-2.5μg/ml，γ射线辐照的PBMC与起始CTL数量比为2:1。

所述的制备方法，各步骤操作后细胞数量与表型特征见表1。

表1

以下是对本发明制备方法的主要步骤的更为详细的说明：

1、CTL前体细胞纯化与富集方法：

通常采用外周PBMC作为CTL前体细胞即CD8+T淋巴细胞的来源，PBMC中含有CD4阳性T淋巴细胞(CD4+T)、CD8阳性T淋巴细胞(CD8+T)、B淋巴细胞、单核细胞(Mo)、自然杀伤细胞(NK)等多种细胞成份，其中CD8+T起始数量直接影响目标CTL的最终产量。

采用单采法一次性可采集大量外周PBMC，获得大量起始细胞，多余PBMC可辐照或冻存，用于多次CTL制备和应用，且方法操作简便。

采用临床级磁珠阴性选择法从PBMC中纯化CD8+T，剔除CD4+T、B、NK细胞，减少其快速扩增对CD8+T扩增生长的干扰。通过磁珠阴性选择法可将CD8+T的纯度提高2-4倍(提高至平均90％以上)，见附图1。

2、目标CTL诱导与第一轮扩增：

本发明专利采用三天成熟DC制备方法，DC制备简捷、时间短，其形态、表型与常规7-10天DC比较无明显差异，见附图2。

本发明用负载目标抗原的自体成熟DC，给予CD8+T活化的第一信号；同时DC富含免疫共刺激分子，给予CD8+T活化的第二信号，保证CD8+T在双信号作用下高效地被诱导分化成目标CTL。联合rhIL-2和rhIL-7对CD8+T进行扩增优于单一因子(IL-2)的作用，IL-7促进记忆性T细胞克隆的增殖，抑制因长时间IL-2活化T细胞后导致的AICD反应，延长T细胞生存周期。

3、目标CTL纯化与富集方法：

在第一轮诱导扩增后，CD8+T细胞中目标CTL即表达识别目标抗原(即HLA-A0201限制性Her2-neu抗原多肽)TCR的CD8+T只占部分比例，且比例不高，大量是非特异扩增的CD8+T，无识别、清除靶细胞的作用。本发明采用Tetramer标记方法和流式细胞分选术分离、纯化目标CTL，再一次富集能识别靶抗原的CTL，这些CTL才具备杀伤靶细胞的能力。

纯化后目标CTL的纯度达95％以上。而常规报导的几种方法大多采用有限稀释法，基因导入法等方法，时间花费较长，操作复杂，特异性相对较低。见附图3。

4、目标CTL第二轮扩增：

对T细胞扩增多采用液相的鼠抗人CD3/CD28单克隆抗体和IL-2组合进行扩增。本发明采用固相鼠抗人CD3单克隆抗体(anti-human-CD3mAb)包被技术，联合经γ射线辐照的自体PBMC和rhIL-15作为刺激T细胞增殖的多重信号。固相CD3-mAb可促进T细胞克隆形成，加快细胞生长；IL-15使CTL具有抗凋亡，促进记忆T细胞生长的能力；PBMC表面表达大量共刺激分子并分泌多种细胞因子提供CTL良好的生长环境，且经γ射线辐照后不会增殖而干扰CTL的生长，从而保证CTL的高效扩增。

与常规扩增体系比较：本方法制备的目标CTL产量高，CTL_CM比例高，杀伤靶细胞能力较强。见附图4-5。

本发明的有益效果：

本发明联合采用高效、简捷的单采和磁珠分选法获得比常规方法较多数量的CD8+T作为目标CTL前体细胞；用HLA-A0201限制性MUC-1抗原多肽负载的树突状细胞作为致敏原，联合rhIL-2和rhIL-7诱导CTL前体克隆向目标CTL分化和第一轮扩增；再经四聚体(tetramer)标记和流式细胞分选技术从致敏的混合CD8+T淋巴细群中分离出目标CTL，通过采用固相anti-human-CD3-mAb，γ射线辐照的PBMC作为饲养细胞，联合IL-2和IL-15对目标CTL进行第二轮高效扩增。采用本发明方法制备得到的目标CTL具备高纯度，高增殖能力，高杀伤活性，高比例CTL_-CM特点，可用于MUC-1相关恶性肿瘤的免疫治疗。

本发明采用不同方法通过对HLA-A0201限制性抗MUC-1抗原特异性CTL的二次纯化与富集，通过不同扩增体系对富集的目标CTL进行二轮扩增和功能的诱导，使目标CTL在纯度上、数量上和功能上均优于现有技术中的几种CTL获得方法，特别体现在以下几个方面：

1、本发明提供了天然的、高效的激活T细胞双信号

①抗原特异信号：DCs是公认的体内功能最强的专职抗原递呈细胞，本体系模仿、复制抗原在体内被DC捕获递呈的过程，选择显性抗原肽负载活体DC作为致敏原，提供最接近人体免疫应答过程中的MHC-多肽复合物空间结构，为T细胞活化提供特异性第一信号。

②共刺激信号：DC同时表达丰富的共刺激分子，为T细胞活化提供天然的第二信号。

2、本发明提供了高效、简捷的CTL前体与目标CTL富集与纯化方法

①CTL前体细胞的富集：采用单采和临床级阴性磁珠分选CTL前体细胞即CD8+T淋巴细胞，操作简便，起始数量充足，获得的CD8+T细胞纯度达到90％以上，为制备足够量、足够纯度目标CTL提供了基本保证。

②目标CTL细胞的纯化：采用Tetramer标记与流式分选技术，对目标CTL即Tetramer+CD8+T进行分离纯化，简捷、高效、省时(4-5小时)，纯度高达95％以上。

3、本发明提供了二轮、高效目标CTL扩增系统，以保证提供足够数量目标CTL

①第一轮诱导与扩增：采用多肽负载的DC，联合二种细胞因子IL-2和IL-7扩增体系，在二周内扩增倍数达30-50倍。

②第二轮目标CTL扩增：采用固相鼠抗人CD3单克隆抗体,联合细胞因子IL-15和自体PBMC扩增体系，10天左右扩增倍数平均40倍，最高达60倍。可获得10⁹个目标CTL细胞，达到临床应用的需要，而常规方法(背景技术提到三种方法体外诱导达到同样数量的CTL需要3-4周。

4、本发明制备的目标CTL体外杀伤活力较高

本发明制备的HLA-A0201限制性抗MUC-1抗原特异性CTL体外能特异性识别和杀伤表达相应抗原的靶细胞，且杀伤率高天常规方法，效靶比相同时杀伤率平均高出15％左右。见附图5。

M1为常规方法一：目标CTL第一轮扩增和分选纯化同本专利方法，目标CTL第二轮扩增时，用含10％灭活混合正常人AB血清的RPMI1640完全培养基重悬细胞，细胞密度为2×10⁶/ml，接种至75cm²细胞培养瓶中，每瓶30ml，加入终浓度为50ng/ml的鼠抗人CD3单克隆抗体(液相)和终浓度为500IU/ml的rhIL-2，轻轻混匀置于37℃，5％CO2细胞培养箱内培育。每日观察细胞的生长状态，适时补充新鲜培养基含10％灭活混合正常人AB血清、200IU/mlrhIL-2的RPMI1640完全培养基，细胞增殖到一定量扩瓶。培养至第10天收获细胞。用生理盐水洗涤2次和重悬，计算获得的细胞数量。取3×10⁵个左右细胞，加入抗人CD8、CD45RO、CD62L、CCR7单抗进行标记CTL，用流式细胞仪进行检测分析CD8+CD45RO+CD62L+CCR7+T的比例。以及对靶细胞的杀伤能力。平均获得CTL细胞总量为(0.9±0.4)×10⁹，CTL_CM比例平均为：38.5±4.1％，效靶比为30:1时CTL杀伤力平均为21.6±4.8％。

M2为常规方法二：目标CTL第一轮扩增和分选纯化同本专利方法，目标CTL第二轮扩增时，用含10％灭活混合正常人AB血清的RPMI1640完全培养基重悬细胞，细胞密度为2×10⁶/ml，接种至75cm²细胞培养瓶中，每瓶30ml，加入1.5×10⁷/ml抗CD3/28磁珠和终浓度为500IU/ml的rhIL-2，轻轻混匀置于37℃，5％CO2细胞培养箱内培育。每日观察细胞的生长状态，适时补充新鲜培养基含10％灭活混合正常人AB血清、200IU/mlrhIL-2的RPMI1640完全培养基，细胞增殖到一定量扩瓶。培养至第10天收获细胞。用生理盐水洗涤2次和重悬，计算获得的细胞数量。取3×10⁵个左右细胞，加入抗人CD8、CD45RO、CD62L、CCR7单抗进行标记CTL，用流式细胞仪进行检测分析CD8+CD45RO+CD62L+CCR7+T的比例，以及对靶细胞的杀伤能力。平均获得CTL细胞总量为(1.0±0.3)×10⁹，CTL_CM比例平均为：33.1±3.6％，效靶比为30:1时CTL杀伤力平均为24.2±4.4％。

M3为本专利方法，平均获得CTL细胞总量为(2.9±0.4)×10⁹，CTL_CM比例平均为：70.4±5.3％，效靶比为30:1时CTL杀伤力平均为40.1±3.9％。

5、本发明制备的目标CTL细胞中CTL_CM比例高

本发明制备的CTLs中表达CD3+CD45RO+CD62L+CCR7+表型的中心型记忆CTL比例高于常规方法，见附图4。

比较三种扩增体系制备的目标CTL的扩增能力、表型和杀伤力，结果显示：本专利诱导体系诱导的CTL扩增能力最强，细胞总量可达(2.9±0.4)×10⁹，其中CTL_CM比例可达70.4％，在效靶比为30:1时，对于靶细胞(负载HLA-A2-MUC-1多肽的T2细胞株)的杀伤能力平均可达40.1％。

附图说明

图1：CTL前体细胞纯化前后纯度的比较。

图A：单采PBMC流式细胞检测图谱(纯化前)

方法：分别取50μlPBMC(约3×10⁵个细胞)加入3支流式管内，第一管内再加入5μlFITC标记的抗人CD4抗体，5μlPE标记的抗人CD8抗体，5μlPerCP标记的抗人CD3抗体和5μlAPC标记的抗人CD56抗体；第二管内加入5μlAPC标记的抗人CD14抗体；第三管加入5μlAPC标记的抗人CD19抗体，充分混匀，4℃避光孵育30分钟，取出后每管加入1ml预冷的含2％(V/V)新生牛血清的生理盐水洗涤两遍并重悬后，用FACSCalibur流式细胞仪进行检测，采用Cellquest软件分析CD3+CD4+T％、CD3+CD8+T％、CD14+％、CD19+％、CD3-CD56+％比例。

结果：

CD14+％(Mo)：5.08％CD19+％(B)：0.96％

CD3+CD4+T％：14.84％CD3+CD8+T％：40.13％

CD3-CD56+％(NK)：0.66％

图B磁珠阴性选择后CTL前体细胞流式细胞检测图谱(纯化后)

方法：单采PBMC用CD4+CD19+CD16/56+T分选磁珠阴性选择，剔除CD4+T细胞、NK细胞和B细胞后，收集未结合磁珠细胞按照纯化前的流式染色方法进行染色，分析CD3+CD4+T％、CD3+CD8+T％、CD14+％、CD19+％、CD3+CD56+％、CD3-CD56+％比例的变化。结果显示，经过磁珠阴性选择后，CD3+CD8+T％比例达到97.45％，纯度提高了二倍。

结果：

CD3+CD4+T％：4.73％CD3+CD8+T％：97.45％

CD14+％(Mo)：0.10％CD19+％(B)：0.48％

CD3-CD56+％(NK)：0.00％

图2：两种不同方法诱导的DC表型比较

方法：分别取50μlrhGM-CSF+rhIFN-α诱导3天的DC(约3×10⁵个细胞)加入4支流式管中，第一管加入5μlPE标记的CD40、5μlPerCP标记的HLA-DR和5μlAPC标记的抗人CD11c抗体，第二管加入5μlPE标记的抗人CD80抗体、5μlPerCP标记的抗人HLA-DR抗体和5μlAPC标记的抗人CD11c抗体，第三管加入5μlPE标记的抗人CD83抗体、5μlPerCP标记的抗人HLA-DR抗体和5μlAPC标记的抗人CD11c抗体，第四管加入5μlPE标记的抗人CD86抗体、5μlPerCP标记的抗人HLA-DR抗体和5μlAPC标记的抗人CD11c抗体，充分混匀，4℃避光孵育30分钟，取出后每管加入1ml预冷的含2％(V/V)新生牛血清的生理盐水洗涤两遍并重悬后，用FACSCalibur流式细胞仪进行检测，采用Cellquest软件分析HLA-DR+CD11c+％、CD40+HLA-DR+CD11c+％、CD80+HLA-DR+CD11c+％、CD83+HLA-DR+CD11c+％、CD86+HLA-DR+CD11c+％比例。rhGM-CSF+rhIL-4诱导7天的DC用同样方法进行检测。结果显示，本专利采用的rhGM-CSF+rhIFN-α诱导3天的DC纯度表型(HLA-DR+CD11c+)为91.93％，成熟度表型(CD83+)为94.95％。rhGM-CSF+rhIL-4诱导7天的DC纯度表型为97.05％，成熟度表型为95.39％，两者无明显差异。

结果：

图A：rhGM-CSF+rhIFNα诱导3天DC表型流式检测图谱：

HLA-DR+CD11c+％：91.93％CD40+HLA-DR+CD11c+％：92.68％

CD80+HLA-DR+CD11c+％：86.82％CD83+HLA-DR+CD11c+％：94.95％

CD86+HLA-DR+CD11c+％：96.09％

图B：rhGM-CSF+rhIL-4诱导7天DC表型流式检测图谱：

HLA-DR+CD11c+％：97.05％CD40+HLA-DR+CD11c+％：88.33％

CD80+HLA-DR+CD11c+％：85.41％CD83+HLA-DR+CD11c+％：95.39％

CD86+HLA-DR+CD11c+％：97.05％

图3目标CTL第一轮扩增后流式检测图谱

图A：目标CTL第一轮扩增后细胞流式检测图谱(纯化前)

图B：目标CTL第一轮扩增后细胞流式检测图谱(纯化后)

方法：CTL第一轮扩增后用PE标记HLA-A2+MUC-1+的Tetramer和FITC标记的抗人CD8抗体对扩增的CTL进行标记，采用流式细胞仪分选Tetramer+CD8+CTL细胞，分选前Tetramer+CD8+T纯度为4.48％，分选后达到97.51％。

图4三种不同方法制备的CTL表型的比较

图A(M1)：液相鼠抗人CD3单克隆抗体+IL-2扩增体系制备的CTL表型流式检测图谱

图B(M2)：液相CD3/28磁珠，IL-2扩增体系制备的CTL表型流式检测图谱

图C(M3)：固相鼠抗人CD3单克隆抗体，IL-2，IL-7，IL-15，自体PBMC扩增体系制备的CTL表型流式检测图谱

方法：纯化后的目标CTL分为3份，第一份加入终浓度50ng/ml鼠抗人CD3单克隆抗体和500IU/mlIL-2进行扩增培养，第二份加入终浓度10μg/mlCD3/28磁珠和250IU/mlIL-2进行扩增培养，第三份加入鼠抗人CD3单克隆抗体2μg/ml预包被过夜的培养瓶，按照目标CTL：PBMC＝1:2的比例加入经γ射线辐照的PBMC，并加入终浓度500IU/ml的IL-2和终浓度25ng/mlIL-15进行扩增培养。培养至第7天收获CTL。取50μlCTL(约3×10⁵个细胞)加入2管流式管内，第一管加入5μlFITC标记的抗人CD62L抗体，5μlPE标记的抗人CCR7抗体，5μlAPC标记的抗人CD45RO抗体，第二管加入5μlPerCP标记的抗人CD3抗体和5μlPE标记的抗人CD8抗体，充分混匀，4℃避光孵育30分钟，取出后每管加入1ml预冷的含2％(V/V)新生牛血清的生理盐水洗涤两遍并重悬后，用FACSCalibur流式细胞仪进行检测，采用Cellquest软件分析CD3+CD8+T％、CD45RO+CD62L+％和CCR7+CD62L+％比例，获得CTL的表型流式图，本专利方法制备的CTL的CD3+CD8+T％为94.98％，其中CD45RO+CD62L+％达到70.02％，CCR7+CD62L+％达到70.28％，明显高于方法1和2。

图5不同方法制备的CTL杀伤能力的比较(以MUC-1_170-178CTL为例)。

图A(M1)液相鼠抗人CD3单克隆抗体+IL-2扩增体系制备的CTL杀伤能力

图B(M2)液相CD3/28磁珠，IL-2扩增体系制备的CTL杀伤能力

图C(M3)固相鼠抗人CD3单克隆抗体，IL-2，IL-7，IL-15，自体PBMC扩增体系制备的CTL杀伤能力

方法：靶细胞1：为负载MUC-1_170-178多肽的HLA-A2+T2细胞株，靶细胞2：为HLA-A2+T2空载细胞株，靶细胞3:K562(NK敏感细胞株)。

实施例1制备的CTL分别与上述3种靶细胞按照效靶比3：1、10：1和30：1的比例混合，MTT法检测CTL杀伤活性。结果显示，本发明方法制备的CTL对靶细胞的特异性杀伤活性在效靶比为10:1时，达到24.11％，明显高于方法1和2。

具体实施方法

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1MUC-1_170-178抗原多肽特异性CTL制备

1、HLA-A201+MUC-1+乳腺癌患者准备

抽取患者外周抗凝血1ml，加入FITC标记的HLA-A2-mAb，经流式检测HLA-A2(HLA-A201的简称，下同)表达情况；检测Her2-neu抗原表达水平。HLA-A2和MUC-1表达同时阳性者入选。

2、HLA-A201限制性MUC-1抗原多肽合成

位点为170-178，序列为STAPPVHNV(SEQIDNO.1)9肽，以下简称MUC-1_170-178多肽，通过化学合成(上海吉尔生化有限公司)，以无菌双蒸水充分溶解，多肽浓度为5mg/ml，分装保存于-80℃。

3、PBMC采集

用单采仪采集患者外周PBMCs，经Ficoll密度梯度离心法分离PBMCs，部分用于DC诱导，部分用于CTL前体细胞富集与纯化，部分经γ射线照射并冻存于-80℃。

4、DC诱导与抗原负载

贴壁法制备DC：将PBMCs悬浮于RPMI1640培养基中，细胞密度为3×10⁶/ml，接种细胞于75cm²培养瓶中，于5％CO₂，37℃培养箱内孵育90分钟，用预温生理盐水洗轻轻洗涤2-3次。贴壁细胞用于DC诱导。

DC诱导：于培养瓶中加入30mlDC诱导培养基含10％(体积比，下同)灭活的混合正常人AB血清、终浓度200ng/mlrhGM-CSF、终浓度500ng/mlrhIFN-α的RPMI1640完全培养基。诱导3天后收获DCs。

多肽DC负载：将收获的DC悬浮于RPMI1640培养基中，细胞密度为1×10⁶/ml并接种于细胞培养6孔板内，每孔3ml，于孔内加入MUC-1_170-178多肽至终浓度为10μg/ml，放置于37℃，5％CO₂培养箱内共育2小时后收获，用RPMI1640培养基洗涤DC二次，再用RPMI1640培养基重悬，细胞密度为1×10⁶/ml，用于目标CTL的刺激。

用于目标CTL扩增的γ射线辐照的自体PBMC是通过下列方法制备得到的：留取部分单采获得的PBMC，经30-50GY(平均40GY)的γ射线辐照后保存；保存液：含20％(V/V)DMSO和20％(V/V)正常人AB血清的RPMI1640培养液，保存温度：-80℃超低温保存。

5、CTL前体细胞的分离与纯化

于DC收获当天复苏冻存的PBMC，用预冷的含2％灭活混合正常人AB血清的PBS溶液洗涤细胞2次，并重悬细胞，调整细胞密度为2×10⁷/ml，于细胞中加入临床级CD4+CD19+CD16/56+T分选磁珠(MiltenyiCliniMACS)，共育30分钟后过柱，收集流出的CD8+T淋巴细胞，用预冷的RPMI1640培养基洗涤2次，将细胞重悬于含10％灭活混合正常人AB血清RPMI1640完全培养基中，细胞密度为1×10⁶/ml。

6、目标CTL第一轮扩增

将纯化的CD8+T接种于细胞培养6孔板中，每孔加入3ml，再加入0.6ml已负载多肽的DC(步骤4制备)，加入IL-2和IL-7使终浓度分别达到500IU/ml和50ng/ml，轻轻混匀后放入5％CO₂，37℃细胞培养箱内培育；每日观察细胞的生长状态，适时补充新鲜培养基(含10％灭活混合正常人AB血清RPMI1640完全培养基，500IU/mlIL-2和50ng/mlIL-7)。第七天，于每孔中再加入0.6ml已负载多肽的DC(同前)再次刺激。每日观察细胞的生长状态，适时补充新鲜培养基(同前)，细胞密度过大时进行扩瓶，细胞增殖到一定量后可移至75cm²培养瓶中继续扩增培育。

7、目标CTL分选纯化

负载MUC-1_170-178多肽的DC与CD8+T共育12-14天，收获细胞，用预冷的含2％灭活混合正常人AB血清的PBS溶液洗涤细胞2次，并重悬细胞，调整细胞密度为1×10⁷/ml，于细胞悬液中加入PE标记的HLA-A201+MUC-1_170-178Tetramer和FITC标记的CD8mAb，轻轻混匀后，于4℃冰箱中共育20分钟。用预冷的含2％灭活混合正常人AB血清的PBS溶液洗涤细胞2次，重悬细胞，调整细胞密度为1×10⁷/ml，将细胞进行流式分选，收获CD8+Tetramer+T淋巴细胞，离心后弃上清，用含10％灭活混合正常人AB血清的RPMI1640完全培养基重悬细胞，细胞密度为2×10⁶/ml。目标CTL第一轮扩增后流式检测图谱见图3。

8、目标CTL第二轮扩增

细胞培养瓶包被：在步骤7前一天，取75cm²细胞培养瓶，于其中加入2ml鼠抗人CD3单克隆抗体(浓度2μg/ml，厂家：美国R&D公司，目录号：59-MAB100，克隆号：C1UCHT1，下同)，密封后置4℃冰箱包被过夜。

在接种细胞前，取出包被培养瓶，吸弃培养瓶中多余CD3-mAb，每瓶加入30ml已分选CD8+Tetramer+T淋巴细胞，加入经γ射线辐照的PBMC(数量2倍于目标CTL),加入终浓度500IU/mlIL-2和终浓度250ng/mlIL-15，轻轻混匀置于37℃，5％CO₂细胞培养箱内培育。每日观察细胞的生长状态，适时补充新鲜培养基(含10％人灭活混合正常人AB血清，200IU/mlIL-2，100ng/mlIL-15的RPMI1640完全培养基)控制细胞密度；细胞增殖到一定量扩瓶。

9、目标CTL收获与表型检测

第二轮目标CTL扩增10天左右，收获细胞。用生理盐水洗涤2次，重悬于100ml生理盐水中，细胞密度为10⁷/ml，用于免疫治疗。

取3×10⁵个左右细胞，加入抗人CD8、CD45RO、CD62L、CCR7单抗进行标记CTL，用流式细胞仪进行检测分析CD8+CD45RO+CD62L+CCR7+T的比例，结果见图4C，本方法制备的CTL的CD3+CD8+T％为94.98％，其中CD45RO+CD62L+％达到70.02％，CCR7+CD62L+％达到70.28％。

各步骤操作后细胞数量和表型特征见表1。

10、目标CTL杀伤能力

将制备的目标CTL分别与负载MUC-1_170-178多肽的HLA-A2+T2细胞株、HLA-A2+T2空载细胞株以及K562(NK敏感细胞株)三种靶细胞按照效靶比3:1、10:1和30:1的比例混合，MTT法检测CTL杀伤活性。结果显示，本发明方法制备的CTL对靶细胞的特异性杀伤活性在效靶比为10:1时，达到24.11％，见图5C。

Claims (9)

1.HLA-A0201限制性抗MUC-1抗原特异性CTL制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

a.CTL前体细胞来源细胞的富集与纯化：

单采收集外周单个核细胞作为CTL前体细胞来源；采用临床级阴性磁珠分离法，从收集外周单个核细胞中富集、纯化CTL前体细胞即CD8+T淋巴细胞；

b.目标CTL诱导与第一轮扩增：

用负载HLA-A0201限制性MUC-1抗原多肽的成熟树突状细胞刺激CD8+T淋巴细胞，同时加入rhIL-2和rhIL-7两种细胞因子联合促进T细胞生长；第二周再重复刺激一次，完成第一轮扩增；

c.目标CTL纯化方法：

采用Tetramer标记方法和流式细胞分选术纯化目标CTL，即选择Tetramer+CD8+T淋巴细胞；

d.目标CTL第二轮扩增：

采用固相包被的anti-human-CD3mAb和rhIL-2刺激目标CTL的生长；加入经γ射线辐照后的自体外周单个核细胞增强对目标CTL的活化；加入rhIL-15继续培育，完成第二轮扩增，收集鉴定。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤b中HLA-A0201限制性MUC-1抗原多肽长度9-15个氨基酸。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的HLA-A0201限制性MUC-1抗原多肽序列如SEQIDNo.1所示。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤b中负载HLA-A0201限制性MUC-1抗原多肽的成熟树突状细胞是通过下列方法制备得到的：将外周单个核细胞贴壁后加入含rhGM-CSF、rhIFNα、灭活的混合正常人AB和RPMI1640培养基培养三天，收获DC再加入目标抗原孵育即得。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤d中用于目标CTL扩增的γ射线辐照的自体外周单个核细胞是通过下列方法制备得到的：留取部分权利要求1步骤a中单采获得外周单个核细胞，经30-50GY的γ射线辐照后保存；保存液：含20％(V/V)DMSO和20％(V/V)正常人AB血清的RPMI1640培养液，保存温度：-80℃超低温保存。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤d中用于目标CTL扩增的anti-human-CD3mAb是如下操作的：将anti-human-CD3mAb固相包被于用于扩增细胞的容器表面，anti-human-CD3mAb与多个CTL表面的CD3分子结合，促进CTL细胞克隆的形成，促进细胞接触，快速进入增殖周期。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于目标CTL是指表达识别MUC-1抗原多肽TCR的CD8+T，即Tetramer+CD8+T淋巴细胞。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于各步骤中刺激分子或细胞的用量分别为：

a.目标CTL第一轮扩增每次加入量：rhIL-2终浓度为500-750IU/ml，rhIL-7终浓度为50-75ng/ml，DC与起始CD8+T细胞数量比为1:5；

b.目标CTL第二轮扩增：rhIL-2终浓度为200-500IU/ml，rhIL-15终浓度为100-250ng/ml，anti-human-CD3mAb包被浓度为1.0-2.5ug/ml，γ射线辐照的外周单个核细胞与起始CTL数量比为2:1。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于各步骤操作后细胞数量与表型特征分别为：