CN105586310B - Il-31在调控间充质干细胞增殖和分化中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开IL‑31在调控间充质干细胞增殖和分化中的应用。本发明是基于本发明发明人首次发现细胞因子IL‑31能促进MSCs的自我更新和多向分化潜能得到的成果。本发明通过基因工程的方法构建了IL‑31、shIL‑31、Oct4和shOct4的表达载体，通过慢病毒分别转染到MSCs中，发现IL‑31和作为阳性对照的Oct4能促进MSCs的增殖和多向分化潜能，而shIL‑31和作为阳性对照的shOct4抑制MSCs的增殖和多向分化潜能。因此，这些研究结果将为研究IL‑31在MSCs自我更新和多向分化潜能中的调控机理提供理论基础，为将MSCs用于细胞治疗奠定必要基础。
Description
技术领域
本发明涉及再生医学及基因工程领域，具体涉及IL-31在调控间充质干细胞增殖和分化中的应用。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)最早由Pittenger等分离于骨髓，后来在脐带和脂肪等组织中也能分离得到。MSCs具有如下优点：MSCs可塑性很高，在体内外诱导条件下能分化成软骨、骨、肌肉、肌腱、韧带和脂肪等组织；MSCs具有归巢能力，可以在生物体内向受损和炎症部位集中；MSCs能诱导或增加新血管的形成；MSCs缺乏显著的免疫原性，防止自身免疫；另外MSCs分离方便。近几年来，再生医学快速发展，由于胚胎干细胞用于细胞治疗受伦理道德的影响，并且有致癌的风险，所以MSCs取代胚胎干细胞用于细胞治疗已经成为一种趋势。但MSCs在再生医学和组织工程应用中也存在缺陷，例如：随着细胞传代次数的增加，MSCs的形态发生变化，增殖能力和多向分化潜能等都逐渐下降。如何提高MSCs的增殖能力和多向分化潜能已经成为急需解决的难题，解决这些问题将对MSCs应用于再生医学和组织工程产生重大影响。最近的研究发现，多能性基因Oct4，Sox2和Nanog等对MSCs的增殖和多向分化潜能起促进作用，抑制这些基因的表达能对MSCs增殖和多向分化潜能产生抑制作用。通过基因工程的手段提高MSCs增殖和多向分化潜能已经成为研究的热点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供IL-31在调控间充质干细胞增殖和分化中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：IL-31在调控间充质干细胞增殖和分化中的应用，基于本发明发明人首次发现转染IL-31能促进MSCs的增殖和成脂或成骨分化潜能。
所述的IL-31的氨基酸序列如下所示：
MASHSGPSTSVLFLFCCLGGWLASHTLPVRLLRPSDDVQKIVEELQSLSKMLLKDVEEEKGVLVSQNYTLPCLSPDAQPPNNIHSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIFQDAPETNISVPTDTHECKRFILTISQQFSECMDLALKSLTSGAQQATT。
所述的IL-31的编码核苷酸序列如下所示：
ATGGCCTCTCACTCAGGCCCCTCGACGTCTGTGCTCTTTCTGTTCTGCTGCCTGGGAGGCTGGCTGGCCTCCCACACGTTGCCCGTCCGTTTACTACGACCAAGTGATGATGTACAGAAAATAGTCGAGGAATTACAGTCCCTCTCGAAGATGCTTTTGAAAGATGTGGAGGAAGAGAAGGGCGTGCTCGTGTCCCAGAATTACACGCTGCCGTGTCTCAGCCCTGACGCCCAGCCGCCAAACAACATCCACAGCCCAGCCATCCGGGCATATCTCAAGACAATCAGACAGCTAGACAACAAATCTGTTATTGATGAGATCATAGAGCACCTCGACAAACTCATATTTCAAGATGCACCAGAAACAAACATTTCTGTGCCAACAGACACCCATGAATGTAAACGCTTCATCCTGACTATTTCTCAACAGTTTTCAGAGTGCATGGACCTCGCACTAAAATCATTGACCTCTGGAGCCCAACAGGCCACCACTTAA。
所述的调控为正调控，即促进作用。
所述的IL-31在调控间充质干细胞增殖和分化中的应用，是将IL-31蛋白或能表达IL-31的核酸序列制备为促进间充质干细胞增殖和分化的制剂。
所述的核酸序列优选为DNA序列。
所述的IL-31在调控间充质干细胞增殖和分化中的应用，是以IL-31基因为靶位点，将能促进IL-31基因转录和表达的物质制备为促进间充质干细胞增殖和分化的制剂。
所述的物质优选为Oct4转录因子。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明是基于本发明发明人首次发现转染IL-31能促进MSCs的增殖和成脂或成骨分化潜能得到的成果。本发明将含有IL-31、shIL-31、Oct4、shOct4和空质粒的慢病毒分别转染至MSCs中进行表达，发现转染Oct4或IL-31质粒都能促进MSCs的增殖和成脂或成骨分化潜能，而转染shOct4或shIL-31都能抑制MSCs的增殖和成骨或成脂分化潜能。Oct4促进MSCs的增殖和成骨或成脂分化潜能已经被报道，在本研究中被作为阳性对照。本发明揭示了细胞因子IL-31对MSCs的自我更新和多向分化潜能起着关键调节作用提供了理论依据，为将MSCs用于再生医学和组织工程奠定了必要的基础。
附图说明
图1是本发明实施例1中将含有Oct4、IL-31、shOct4、shIL-31的慢病毒重组载体和作为对照的慢病毒空质粒分别感染UC-MSCs后，采用MTT方法检测细胞因子IL-31对UC-MSCs增殖影响的结果图；其中，*P<0.01相对于不同天数的空质粒对照。
图2是本发明实施例2中将含有shOct4、shIL-31的慢病毒重组载体和作为对照的慢病毒空质粒分别感染UC-MSCs后，检测细胞因子IL-31对UC-MSCs的成脂或成骨分化作用的结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步的详细描述，但不用来限制本发明的范围。若未特别指出，实施例均参照常规实验条件，或者参照试剂盒制造厂商的说明书进行。实施例中所用到的工程菌、细胞株均为商业化的菌株或细胞株。大肠杆菌感受态细胞的制备按照《分子克隆》进行制备。
实施例1采用MTT方法检测IL-31对UC-MSCs增殖的影响。
(1)IL-31和shIL-31慢病毒表达载体的构建。
1)IL-31基因引物的设计。
用Primer 5.0软件设计扩增IL-31基因开放阅读框的引物，引物两端酶切位点分别为BamH I和HindⅢ，引物由上海生工生物有限公司合成，引物的序列如下：
IL-31正向引物：5’-TAGGATCCTCCCACACGTTGCCCGT-3’；
IL-31反向引物：5’-GCAAGCTTAGTGGTGGCCTGTTG-3’。
2)扩增IL-31基因。
以人Th2细胞(购自上海哈灵生物科技有限公司)的cDNA为模板扩增IL-31基因。
PCR扩增的反应体系如下：
PCR扩增的反应条件如下：
3)IL-31基因的回收。
将上述PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并用Gel Extraction Kit(Omega)对PCR产物回收，实验步骤按试剂盒说明书，略有改动，步骤如下：
A、用手术刀片切下含有目的片段的琼脂糖胶，尽量切除DNA片段周围多余的琼脂糖胶以减少凝胶体积。
B、将凝胶块置于1.5ml微量离心管中。加入与凝胶等体积的Binding buffer(×p2)。将混合物置于50-55℃，7min，直到凝胶完全溶解。
C、将HiBind DNA离心柱置于2ml收集管中，将700μl DNA/琼脂糖溶液加至HiBindDNA离心柱，室温下，10,000×g离心1min。
D、弃去液体，将HiBind DNA离心柱重新放回相同的收集管，向HiBind DNA离心柱中加入300μl Binding buffer(×p2)，室温下，10,000×g离心1min，洗HiBind DNA离心柱，弃去流出液并重新使用收集管。
E、加入700μl无水乙醇稀释的洗涤缓冲液洗涤HiBind DNA离心柱，室温下10,000×g离心1min。
F、弃去液体并最大转速空柱离心2min以干燥离心柱基膜。
G、将HiBind DNA离心柱置于干净的1.5ml离心管，向离心柱基膜中间滴加15-30μl洗脱缓冲液，室温放置1min后以13,000g离心1min洗脱DNA。
4)IL-31基因表达载体的构建。
将回收的IL-31 DNA片段和pGL3-Basic真核表达载体(Promega公司)经过BamHⅠ和HindⅢ双酶切处理，用T4 DNA连接酶将双酶切后的IL-31 DNA片段克隆至经双酶切的pGL3-Basic真核表达载体中，然后转染大肠杆菌DH5α感受态细胞，使用正向引物和反向引物对克隆进行筛选，将筛选得到的阳性克隆送去测序，DNA测序表明序列正确，命名为pGL3-IL-31。
5)IL-31慢病毒质粒的构建。
A、使用BamH I单酶切pGL3-IL-31及慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1(购买于汉恒生物科技有限公司)；
B、使用T4 DNA连接酶将IL-31 DNA片段亚克隆入BamH I单酶切线性化的慢病毒转移质粒pLVX-IRES-ZsGreen1，然后转染大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过限制性内切酶HindⅢ单酶切初步鉴定重组质粒，将鉴定正确的克隆送上海生工生物有限公司进行DNA测序，测序正确的克隆命名为pLVX-IL-31-ZsGreen1；大量提取质粒以备转染用。
6)shIL-31慢病毒质粒的构建。
在上海生工生物有限公司合成IL-31 shRNA颈环结构对应的DNA序列(含有XhoⅠ和NcoⅠ酶切位点)，使用XhoⅠ单酶切IL-31 shRNA颈环结构对应的DNA序列及慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1，使用T4 DNA连接酶将IL-31 shRNA颈环结构对应的DNA序列克隆入线性化的慢病毒质粒载体pLVX-IRES-ZsGreen1，命名为pLVX-shIL-31-ZsGreen1。IL-31 shRNA颈环结构对应的DNA序列如下：
5’-CTCGAGAGAGGGCTACCTGGAGACACCATTG-3’。
(2)Oct4和shOct4慢病毒表达载体的构建(在本实验中做为对照组)。
1)Oct4基因引物的设计。
用Primer 5.0软件设计扩增Oct4基因开放阅读框的引物，引物两端酶切位点分别为XhoⅠ和NcoⅠ。引物由上海生工生物有限公司合成，扩增Oct4的引物序列如下：
Oct4正向引物：5’-CCGCTCGAGAGGATGGCGGGACACCTGGCTT-3’；
Oct4反向引物：5’-CATGCCATGGAAGGGCAGGCACCTCAGTTTG-3’。
2)扩增Oct4基因。
以人胚胎干细胞的cDNA(购自上海斯丹赛生物技术有限公司)为模板扩增Oct4基因。PCR扩增的反应条件同上，PCR扩增的反应体系如下：
3)Oct4基因的回收。
将上述PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并对PCR产物回收纯化(步骤与上面IL-31基因的回收相同)。
4)Oct4表达载体的构建。
将回收的PCR产物通过XhoⅠ和NcoⅠ位点克隆至pGL3-Basic真核表达载体(Promega公司)，命名为pGL3-Oct4，DNA测序表明序列正确。
5)Oct4慢病毒质粒的构建。
A、使用XhoⅠ单酶切pGL3-Oct4及慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1(购买于汉恒生物科技有限公司)；
B、使用T4 DNA连接酶将Oct4 DNA片段与线性化慢病毒转移质粒pLVX-IRES-ZsGreen1连接，然后转染大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过限制性内切酶NcoⅠ单酶切初步鉴定重组质粒，将鉴定正确的克隆送上海生工生物有限公司进行DNA测序，命名为pLVX-Oct4-ZsGreen1。将测序正确的克隆大量提取质粒以备转染用。
6)shOct4慢病毒质粒的构建。
在上海生工生物有限公司合成Oct4 shRNA颈环结构对应的DNA序列(含有XhoⅠ和NcoⅠ酶切位点)，使用XhoⅠ单酶切Oct4 shRNA颈环结构对应的DNA序列及慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1，使用T4 DNA 连接酶将Oct4 shRNA颈环结构对应的DNA序列克隆入线性化慢病毒质粒载体pLVX-IRES-ZsGreen1，命名为pLVX-shOct4-ZsGreen1。Oct4 shRNA颈环结构对应的DNA序列如下：
5’-CTCGAGCCCTCACTTC ACTGCACTGCCATTG-3’。
(3)将含有目的基因的慢病毒转染UC-MSCs。
1)慢病毒的制备。
A、接种人肾上皮细胞系293T细胞(购自上海酶研生物科技有限公司)于多聚赖氨酸处理的100mm培养皿中，当细胞融合度达到80％时换液，将三质粒(pspax2，pMD2G，pLVX-IL-31-ZsGreen1、pLVX-shIL-31-ZsGreen1、pLVX-Oct4-ZsGreen1或者pLVX-shOct4-ZsGreen1)共转染293T细胞，培养6h后更换培养基；pspax2和pMD2G购买于优宝生物。
B、转染48h后收集病毒上清液，于4℃、4000r/min离心10min；收集离心后的上清液并过滤；
C、4℃、25000r/min离心2h后用无血清培养液溶解病毒沉淀；
D、使用有限稀释法测定病毒滴度，分装保存于-80℃冰箱中备用。
2)慢病毒的转染。
将脐带间充质干细胞(UC-MSCs，上海拜力生物科技有限公司)接种于六孔板中，当单层细胞生长密度达到80％～90％时加入1ml步骤1)得到的慢病毒颗粒(滴度为6×107TU/ml)，并加入聚凝胺至终浓度为8μg/ml以促进病毒吸附。按照以下5组进行转染：IL-31为转染IL-31质粒(即pLVX-IL-31-ZsGreen1)的UC-MSCs，shIL-31为转染IL-31 shRNA(即pLVX-shIL-31-ZsGreen1)的UC-MSCs，Oct4为转染Oct4质粒(即pLVX-Oct4-ZsGreen1)的UC-MSCs，shOct4为转染Oct4 shRNA(即pLVX-shOct4-ZsGreen1)的UC-MSCs，对照为转染空质粒的UC-MSCs。
(4)MTT检测UC-MSCs的增殖。
1)将上述5组UC-MSCs分别做MTT实验。
A、将转染后的5组UC-MSCs培养于37℃、5％CO2培养箱中；
B、每24h分别取出5组UC-MSCs中的3个平行样，分别加入20μL MTT液(MTT试剂盒购于上海哈灵生物有限公司)，继续培养4h；
C、小心吸去孔内培养基，每孔加入100μL DMSO，低速振荡10min，使结晶物充分溶解；
D、在酶标仪上490nm波长处测定各孔吸光度(A)值，用t检验统计分析。
结果显示：IL-31能促进UC-MSCs的增殖，shIL-31能抑制UC-MSCs的增殖(图1)。在此实验中采用Oct4作为阳性对照，Oct4也能促进UC-MSCs的增殖，sh Oct4也能抑制UC-MSCs的增殖。
实施例2检测IL-31对UC-MSCs成脂和成骨分化的作用。
(1)UC-MSCs的成脂分化及鉴定。
1)UC-MSCs的成脂分化；
A、采用含有shOct4或shIL-31的慢病毒分别转染UC-MSCs，采用含有空质粒的慢病毒转染作为对照；
B、将上述3种转染后的UC-MSCs按3×104cells/cm2的密度接种到含有生长培养基的48孔板中，生长培养基为含有10％(V/V)FBS的DMEM/F12(FBS购自广州宏新生物技术有限公司；DMEM/F12购自广州赛业生物科技有限公司)将接种好的培养板放在5％CO2的37℃培养箱中孵育；
C、培养24h后，从每个孔中轻轻吸掉UC-MSCs的生长培养基，加入200μlUC-MSCs成脂分化培养基A液，3天后换为成脂分化培养基B液，第4天又换回A液，如此循环，诱导分化21天(成脂试剂盒购自广州赛业生物科技有限公司)；
2)UC-MSCs成脂分化的鉴定；
A、上述UC-MSCs分化21天后，吸出成脂分化培养基，用PBS冲洗1次，然后用4％多聚甲醛溶液固定30min；
B、PBS冲洗两次，用200μl油红O染色30min；
C、用PBS冲洗2-3次；
D、在光学显微镜下观察和拍照图像。
(2)UC-MSCs的成骨分化及鉴定。
1)UC-MSCs的成骨分化；
A、加入足量的0.1％明胶溶液到48孔板中完全覆盖其底部，旋转直到明胶溶液覆盖整个培养板的底部，于室温下至少静置30min；
B、吸干明胶溶液，在超净台中放置30min，使剩余的溶液完全蒸发；
C、采用含有shOct4或shIL-31的慢病毒分别转染UC-MSCs，采用含有空质粒的慢病毒转染作为对照；
D、将上述3种转染后的UC-MSCs按3×104cells/cm2的密度接种到预先涂有明胶溶液的培养板中，生长培养基为含有10％(V/V)FBS的DMEM/F12；将接种好的培养板放在5％CO2的37℃培养箱中孵育；
E、培养24h后，从每个孔中轻轻吸掉生长培养基，加入200μl UC-MSCs成骨分化培养基(成骨试剂盒购自广州赛业生物科技有限公司)；诱导分化21天，每3天更换一次分化培养基；
2)UC-MSCs成骨分化的鉴定；
A、上述UC-MSCs分化21天后，吸出成骨细胞分化培养基，用PBS冲洗1次，然后用4％多聚甲醛溶液固定30min；
B、PBS冲洗两次，用200μl茜素红染色3-5min；
C、用PBS冲洗2-3次；
D、在光学显微镜下观察和拍照图像。
结果显示：shIL-31能降低UC-MSCs的成脂和成骨分化，表明IL-31能增强UC-MSCs的多向分化潜能(图2)。在此实验中采用shOct4作为阳性对照，shOct4也能降低UC-MSCs的成脂和成骨分化，表明Oct4也能增强UC-MSCs的多向分化潜能。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.IL-31在制备调控间充质干细胞增殖和分化的制剂中的应用，其特征在于：是将IL-31蛋白或能表达IL-31的核酸制备为促进间充质干细胞增殖和分化的制剂；
所述的分化为成脂分化和成骨分化。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的IL-31的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的IL-31的编码核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的调控为正调控。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的核酸为DNA序列。
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| IL-6 signaling in autoimmunity, chronic inflammation and inflammation-associated cancer;Markus F. Neurath and Susetta Finotto;《Cytokine & Growth Factor Reviews》;20110305;第22卷;第83-89页 * |
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