CN105572388A - 一种晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞egfr的检测方法 - Google Patents
一种晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞egfr的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR的检测方法：利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期结直肠癌患者外周血中的CTC，运用细胞蜡块技术制作薄层切片，进而检测无法获取组织标本的晚期结直肠癌患者外周血CTC的EGFR表达情况。通过该技术方法，不用结直肠癌组织即可检测到无法获取组织标本的晚期结直肠癌患者EGFR表达情况。该技术属于微创，并能够实时检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测EGFR的新方法，尤其是检测晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR的方法。
背景技术
晚期结直肠癌患者，靶向联合化疗可以明显延长晚期结直肠癌无病无进展生存期和总生存期。晚期结直肠癌患者临床目前应用的靶向药物中。西妥西单抗是一种靶向EGFR的IgG1单克隆抗体，已在临床上应用，并取得一定疗效。
EGFR是配体激活受体酪氨酸激酶erB-B家族成员之一，其参与肠黏膜的生长、增殖和再生，并在结直肠癌的发展过程中起着至关重要的作用。在50％-85％的结直肠癌标本中EGFR呈阳性表达，并且其表达程度与临床分期、有无淋巴结转移、无病生存期、总生存期、5年复发率等密切相关。
人EGF受体(humanepidermalgrowthfactorreceptor，HER)家族由4个成员组成，分别称为HER1(EGFerbB)、HER2(Neu/erbB2)、HER3(erbB3)和HER4(erbB4)，均属于I型酪氨酸激酶受体基因家族。其蛋白质结构可以分为3个区域：细胞表面的配体结合区、跨膜区和细胞内的酪氨酸激酶区。EGFR在缺乏特异性配体时以单体形式存在，但与配体结合后发生聚合。二聚体形式改变了蛋白质构象，导致酪氨酸激酶活化和受体自身磷酸化，后者通过JAK-STAT和PI3K-Akt等转导途径将信号传递到细胞核内，从而促进细胞增殖，血管生成、转移和抑制细胞凋亡。EGFR与恶性细胞的生长有关，激活EGFR可以促进肿瘤的生长和进展。
目前常用的EGFR检测方法为免疫组织化学方法，通过检测结直肠癌组织标本中的EGFR蛋白表达情况判定EGFR状态。免疫组化法是以肿瘤组织为检测对象，而对于晚期无法获取组织标本的结直肠癌患者，EGFR表达状态评估变得困难。
发明内容
循环肿瘤细胞(Circulatingtumorcell，CTC)是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。
研究表明，外周血循环肿瘤细胞与原发瘤细胞活性存在一定的一致性。目前对于晚期无法获得临床标本结直肠癌患者的治疗仍采用经验用药，为了避免无法获取组织标本的晚期结直肠癌患者无法检测EGFR表达，进而不能评估患者EGFR状态的不足，本发明提供了一种晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR的检测方法：利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期结直肠癌患者外周血中的CTC，运用细胞蜡块技术制作薄层切片，进而检测无法获取组织标本的晚期结直肠癌患者外周血CTC的EGFR表达情况。
本发明采用的技术方案如下：
一、利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期结直肠癌患者外周血中的CTC：
1、采集晚期结直肠癌患者外周血：肘正中静脉血5ml；
2、外周血样预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液成分：1mmol/lEDTA+0.1％BSA,稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25％；
3、利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血循环肿瘤细胞：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；
4、过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入B液，1ml，染色2min，纯水1ml,冲洗2次,取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC。
二、运用细胞蜡块技术制作薄层切片：
1、脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液，所述脱色液为：95％酒精与100％二甲苯按容积比1:1混匀。
2、包裹：浸泡结束后取出滤膜，用显微镜擦镜纸或滤纸包裹；
3、固定：将包裹物置于10％中性福尔马林中，固定4-6h；
4、浸蜡包埋：固定结束后取出包裹物，脱水后置于石蜡包埋盒中，浸蜡包埋制作细胞石蜡块；
5、薄层切片：用切片机将细胞石蜡块连续切片，制成厚度为4μm的薄层切片。
三、检测晚期结直肠癌患者外周血CTC的EGFR表达情况：
1、将CTC蜡块薄层切片在染色缸中按以下步骤进行脱蜡和水化：二甲苯溶液浸泡3次，每次10分钟；无水乙醇溶液浸泡3次，每次5分钟；95％乙醇溶液浸泡5分钟；85％乙醇溶液浸泡5分钟；75％乙醇溶液浸泡5分钟；蒸馏水浸泡2次，每次3分钟；PH＝7.4的PBS浸泡3次，每次3分钟。
2、采用柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法对组织抗原进行修复：取pH＝6.0柠檬酸盐缓冲液800-1500ml于压力锅中，大火加热直至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温不锈钢切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，锅盖继续加热至喷汽开始计时，喷汽1-2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用pH＝7.2-7.4的PBS冲洗两次，每次各3分钟；
3、3％H2O2去离子水孵育5分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次，每次3分钟；
4、滴加EGFR一抗，室温或37℃孵育1-2小时或4℃过夜，PBS冲洗3次，每次5分钟；
5、滴加通用型生物素化二抗，室温或37℃孵育60分钟，PBS冲洗3次，每次2分钟；
6、应用DAB溶液显色：甩去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察5-10分钟；
7、蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片：蒸馏水冲洗2次，每次3分钟；苏木素复染1分钟；0.1％盐酸酒精分化；0.1％氨水溶液返蓝；50％、70％、85％、95％、无水乙醇脱水干燥；二甲苯透明，中性树脂胶封片；
8、细胞病理学专家阅片，根据细胞着色程度判定EGFR表达情况。
步骤中所述的膜过滤分离肿瘤细胞装置，包括滤器、血样容器、废液缸和铁架台，所述铁架台设有底座、立架和支架，所述血样容器通过支架设置于铁架台上部，血样容器的下方为滤器，滤器通过输液器联通至废液缸，废液缸设置于底座上。
所述滤器包括滤器上口、滤膜、载滤膜平台和滤器下口，滤膜置于载滤膜平台上；滤器上口接血样容器，滤器下口通过输液器接废液缸。
所述滤膜为疏水材料制成，其上均匀布满口径为10微米的滤孔。
本发明的有益效果是：通过该技术方法，不用结直肠癌组织即可检测到无法获取组织标本的晚期结直肠癌患者EGFR表达情况。该技术属于微创，并能够实时检测。
附图说明
图1为本发明的膜过滤装置结构示意图；
图2为本发明膜过滤装置的滤器的结构示意剖视图；
图3为本发明膜过滤装置的滤器滤膜的结构示意图；
图4为晚期结直肠癌患者外周血分离获取的循环肿瘤细胞影像图；
图5为晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR免疫组化染色图像。
图中：1铁架台、2血样容器、3滤器、4输液器、5废液缸、6滤器上口、7滤膜、8载滤膜平台、9滤器下口、10滤孔、11底座、12立架、13支架。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明阐述如下。
运用此技术方法分离获取并鉴定8例晚期结直肠癌患者(同时检测8例正常人样本做阴性对照)外周血循环肿瘤细胞的实施例。
一、利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期结直肠癌患者外周血中的CTC：
采集各样本外周血5ml，用45ml稀释液(成分：1mmol/lEDTA+0.1％BSA)稀释外周血，然后加入3ml的4％多聚甲醛固定稀释后的血样10分钟。
在固定的间期，组装膜过滤装置：如附图1、图2、图3所示，该过滤装置由滤器3、滤膜7、血样容器2、废液缸5、铁架台1构成。用10mlPBS润湿滤器3，然后将固定好的外周血样加入到膜过滤装置的血样容器2中，使其依靠重力自然过滤，CTC被截留在滤膜7上。
肿瘤细胞直径一般大于15微米，而血细胞(包括红细胞、白细胞)直径一般小于10微米，因此当含有CTC的外周血经过滤后，血细胞因直径小于滤孔能够被滤过，而CTC因直径大于滤孔被截留在滤膜上。
过滤结束后，从过滤装置中取下滤器3，打开并移走滤器上口6，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入B液，1ml，染色2min，纯水1ml。
PBS缓冲液将滤器3冲洗干净，用眼科镊子取下滤膜7，细胞面朝上，放置在载玻片上。
将滤膜7适当干燥后在显微镜下观察,确定是否存在CTC。
检测结果：通过实验检测，8例健康志愿者均未查到循环肿瘤细胞；4例晚期结直肠癌患者未检测到循环肿瘤细胞，本次检测阳性率为50％(表1)。
二、运用细胞蜡块技术制作薄层切片：
将上述载玻片上带有CTC的滤膜取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液(脱色液为：95％酒精与100％二甲苯按体积比1:1混匀)；浸泡结束后取出滤膜7，用吸水纸包裹；将包裹物置于10％中性福尔马林中，固定4-6h；固定结束后取出包裹物，脱水后置于石蜡包埋盒中，浸蜡包埋制作细胞石蜡块；用切片机将细胞石蜡块连续切片，制成厚度为4μm的薄层切片。
三、检测晚期结直肠癌患者外周血CTC的EGFR表达情况：
1、将CTC蜡块薄层切片在染色缸中按以下步骤进行脱蜡和水化：二甲苯溶液浸泡3次，每次10分钟；无水乙醇溶液浸泡3次，每次5分钟；95％乙醇溶液浸泡5分钟；85％乙醇溶液浸泡5分钟；75％乙醇溶液浸泡5分钟；蒸馏水浸泡2次，每次3分钟；PH＝7.4的PBS浸泡3次，每次3分钟。
2、采用柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法对组织抗原进行修复：取pH＝6.0柠檬酸盐缓冲液800-1500ml于压力锅中，大火加热直至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温不锈钢切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，锅盖继续加热至喷汽开始计时，喷汽1-2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用pH＝7.2-7.4的PBS冲洗两次，每次各3分钟；
3、3％H2O2去离子水孵育5分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次，每次3分钟；
4、滴加EGFR一抗，室温或37℃孵育1-2小时或4℃过夜，PBS冲洗3次，每次5分钟；
5、滴加通用型生物素化二抗，室温或37℃孵育60分钟，PBS冲洗3次，每次2分钟；
6、应用DAB溶液显色：甩去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察5-10分钟；
7、蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片：蒸馏水冲洗2次，每次3分钟；苏木素复染1分钟；0.1％盐酸酒精分化；0.1％氨水溶液返蓝；50％、70％、85％、95％、无水乙醇脱水干燥；二甲苯透明，中性树脂胶封片；
8、由细胞病理学专家阅片，根据细胞着色程度判定EGFR表达情况。
实施例检测结果：8例健康志愿者均未查到循环肿瘤细胞；4例晚期结直肠癌患者未检测到循环肿瘤细胞(表1)。本次检测阳性率为50％，所检测的循环肿瘤细胞应用免疫组化证实EGFR的表达并与结直肠癌大体标本EGFR结果对比，指导晚期结直肠癌的靶向治疗，为晚期结直肠癌靶向治疗提供新的思路。
图4为晚期结直肠癌患者外周血分离获取的循环肿瘤细胞影像图，其细胞核较大，细胞核形状不规则；高核质比。
图5为晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR免疫组化染色图像(根据其染色分布和强度判定阳性程度：根据其染色分布和强度判定阳性程度，细胞着色占细胞小于10％为(-)，着色10％-25％为(+)，着色25％-50％为(++)，着色大于50％为(+++)，见表1)。
表1实施例检测结果
Claims (7)
1.一种晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR的检测方法，其特征在于，检测方法步骤如下：利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期结直肠癌患者外周血中的CTC，运用细胞蜡块技术制作薄层切片，进而检测无法获取组织标本的晚期结直肠癌患者外周血CTC的EGFR表达情况。
2.根据权利要求1所述的晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR的检测方法，其特征在于，所述的膜过滤装置包括滤器(3)、血样容器(2)、废液缸(5)和铁架台(1)，所述铁架台(1)设有底座(11)、立架(12)和支架(13)，所述血样容器(2)通过支架(13)设置于铁架台(1)上部，血样容器(2)的下方为滤器(3)，滤器(3)通过输液器(4)联通至废液缸(5)，废液缸(5)设置于底座(11)上。
3.根据权利要求2所述的晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR的检测方法，其特征在于：所述滤器(3)包括滤器上口(6)、滤膜(7)、载滤膜平台(8)和滤器下口(9)，滤膜(7)置于载滤膜平台8上；滤器上口(6)接血样容器(2)，滤器下口(9)通过输液器(4)接废液缸(5)。
4.根据权利要求3所述的晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR的检测方法，其特征在于：所述滤膜(7)为疏水材料制成，其上均匀布满口径为10微米的滤孔(10)。
5.根据权利要求1所述的晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR的检测方法，其特征在于，所述的利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期结直肠癌患者外周血中的CTC，方法步骤如下：
1)采集晚期结直肠癌患者外周血：肘正中静脉血5ml；
2)外周血样预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液成分：1mmol/lEDTA+0.1％BSA,稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25％；
3)利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血循环肿瘤细胞：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器(2)中，使其依靠重力自然过滤；
4)过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器(3)，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器(3)中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入B液，1ml，染色2min，取下滤膜(7)，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC。
6.根据权利要求1所述的晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR的检测方法，其特征在于，所述的运用细胞蜡块技术制作薄层切片，步骤如下：
1)脱色：将带有CTC的滤膜(7)从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液，所述脱色液为：95％酒精与100％二甲苯按1:1混匀。
2)包裹：浸泡结束后取出滤膜(7)，用显微镜擦镜纸或滤纸包裹；
3)固定：将包裹物置于10％中性福尔马林中，固定4-6h；
4)浸蜡包埋：固定结束后取出包裹物，脱水后置于石蜡包埋盒中，浸蜡包埋制作细胞石蜡块；
5)薄层切片：用切片机将细胞石蜡块连续切片，制成厚度为4μm的薄层切片。
7.根据权利要求1所述的晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR的检测方法，其特征在于，所述的检测无法获取组织标本的晚期结直肠癌患者外周血CTC的EGFR表达情况，步骤如下：
1)将CTC蜡块薄层切片在染色缸中按以下步骤进行脱蜡和水化：二甲苯溶液浸泡3次，每次10分钟；无水乙醇溶液浸泡3次，每次5分钟；95％乙醇溶液浸泡5分钟；85％乙醇溶液浸泡5分钟；75％乙醇溶液浸泡5分钟；蒸馏水浸泡2次，每次3分钟；PH＝7.4的PBS浸泡3次，每次3分钟。
2)采用柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法对组织抗原进行修复：取pH＝6.0柠檬酸盐缓冲液800-1500ml于压力锅中，大火加热直至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温不锈钢切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，锅盖继续加热至喷汽开始计时，喷汽1-2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用pH＝7.2-7.4的PBS冲洗两次，每次各3分钟；
3)3％H2O2去离子水孵育5分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次，每次3分钟；
4)滴加EGFR一抗，室温或37℃孵育1-2小时或4℃过夜，PBS冲洗3次，每次5分钟；
5)滴加通用型生物素化二抗，室温或37℃孵育60分钟，PBS冲洗3次，每次2分钟；
6)应用DAB溶液显色：甩去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察5-10分钟；
7)蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片：蒸馏水冲洗2次，每次3分钟；苏木素复染1分钟；0.1％盐酸酒精分化；0.1％氨水溶液返蓝；50％、70％、85％、95％、无水乙醇脱水干燥；二甲苯透明，中性树脂胶封片；
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