CN105567723B

CN105567723B - 一种提高普鲁兰酶活性的方法

Info

Publication number: CN105567723B
Application number: CN201610039333.4A
Authority: CN
Inventors: 焦国宝; 邱立友; 王景冒; 王明道; 孙利鹏; 刘仲敏
Original assignee: HENAN YANGSHAO BIOCHEMICAL ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: Henan new Yangshao biological enzyme preparation Co., Ltd.
Priority date: 2016-01-21
Filing date: 2016-01-21
Publication date: 2018-03-06
Anticipated expiration: 2036-01-21
Also published as: CN105567723A

Abstract

本申请属于生物发酵工程技术领域，具体涉及一种提高普鲁兰酶活性的方法。该方法为在利用生物发酵工程制备普鲁兰酶时，通过基因工程操作手段在普鲁兰酶基因的5’端增加SD序列，和/或在普鲁兰酶基因的3’端增加3t茎环结构序列，重组构建新的普鲁兰酶基因序列，将该基因序列转化表达；可以提高普鲁兰酶活性，并获得较高表达量。本发明创新性的将两个保守序列单独或共同连接于普鲁兰酶基因时，都能较好地提高普鲁兰酶的活性，表现出了较好地应用效果。本发明不仅对于提高普鲁兰酶产量、改进普鲁兰酶的应用具有较好地应用前景，同时也为其他基因改造工程提供了较好地借鉴意义。

Description

一种提高普鲁兰酶活性的方法

技术领域

本申请属于生物发酵工程技术领域，具体涉及一种提高普鲁兰酶活性的方法。

背景技术

普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)不仅能够专一性地水解支链淀粉分支点中的α-1,6糖苷键，并且能将最小单位的支链分解；在将其与淀粉酶和糖化酶配合使用时，可大幅度提高液化后淀粉的水解速度和糖化率；在将其与β-淀粉酶联合作用时，可大大提高麦芽糖得率；由于这些优良特性，因而普鲁兰酶广泛应用于高葡萄糖浆、超高麦芽糖浆、啤酒及改性淀粉等的生产中。

尽管我国在普鲁兰酶产生菌资源筛选和分子改造及基因工程等方面的研究取得了一定的进展，但无论是从自然界筛选的菌株还是工程菌株，均存在酶活力低、酶学性质差等问题，至今尚未实现工业化生产，市场被少数大型跨国公司所垄断，价格昂贵，难以满足国内食品与发酵等行业的迫切需要。因而提高普鲁兰酶产量或活性是当前急需解决的技术问题之一。

就现有普鲁兰酶生产而言，通过基因工程对普鲁兰酶表达基因进行改造，然后通过生物发酵工程获得高产普鲁兰酶是较为现实和可行的技术手段。就基因改造设计而言，现有研究一般认为，几乎所有生物的mRNA的稳定性都影响基因的表达，尤其对原核生物，其mRNA稳定性通常远远低于真核基因的mRNA，半衰期仅0.5~50 min，因此，提高mRNA的稳定性，有利于提高原核生物基因的表达。在对芽孢杆菌基因序列研究的基础上，发明人认为部分芽孢杆菌基因的5′端和3′端的部分序列对于提高mRNA的稳定性具有较为重要的影响，而现有技术中，尚未见到将这些序列用于改造普鲁兰酶的报道。

发明内容

在对芽孢杆菌mRNA序列研究的基础上，本发明认为，通过基因工程操作在普鲁兰酶基因的5′端和3′端分别附加SD序列和3t茎环结构序列后，可以较好提高普鲁兰酶表达量和活性。

下面就本发明的技术方案简要介绍如下。

一种提高普鲁兰酶活性的方法，在利用生物发酵工程制备普鲁兰酶时，通过基因工程操作手段在普鲁兰酶基因的5’端增加SD序列，和/或在普鲁兰酶基因的3’端增加3t茎环结构序列，重组构建新的普鲁兰酶基因序列，将该基因序列转化表达后，可以提高普鲁兰酶活性，并获得较高表达量；

所述SD序列，包括5个碱基，如SEQ ID.1序列中的第9至13位序列所示，即：GGAGG；

所述3t茎环结构序列，包括479个碱基，如SEQ ID.1序列中的第3339至3817位序列所示，即：

ATTAACTAGAAAGTAAAGAAGTAGTGACCATCTATGATAGTAAGCAAAGGATAAAAAAATGAGTTCATAAAATGAATAACATAGTGTTCTTCAACTTTCGCTTTTTGAAGGTAGATGAAGAACACTATTTTTATTTTCAAAATGAAGGAAGTTTTAAATATGTAATCATTTAAAGGGAACAATGAAAGTAGGAAATAAGTCATTATCTATAACAAAATAACATTTTTATATAGCCAGAAATGAATTATAATATTAATCTTTTCTAAATTGACGTTTTTCTAAACGTTCTATAGCTTCAAGACGCTTAGAATCATCAATATTTGTATACAGAGCTGTTGTTTCCATCGAGTTATGTCCCATTTGATTCGCTAATAGAACAAGATCTTTATTTTCGTTATAATGATTGGTTGCATAAGTATGGCGTAATTTATGAGGGCTTTTCTTTTCATCAAAAGCCCTCGTGTATTTCTCTGTAAGCT。

所述提高普鲁兰酶活性的方法，操作时具体包括以下步骤：

（1）提取菌株的DNA基因组，设计引物，并以所提取的DNA基因组为模板，进行目的基因序列的PCR扩增，对扩增产物分别回收备用；

仅在5’端增加SD序列时，引物序列可设计如下：

SD-pul-F：GCTCTAGAGGAGGACAGCTATGCTCAGATATACCTGTCATGCCC，（其中5’端TCTAGA表示XbaⅠ酶切位点）

SD-pul-R：GCCGACGTCAATTATTTACTGCTCACCGGCAGG；（其中5’端GACGTC表示AatⅡ酶切位点）

仅在3’端增加3t茎环结构序列时，引物序列可设计如下：

pul-3-F：GCTCTAGAGCATGCTCAGATATACCTGTCATGCCC，（其中5’端TCTAGA表示XbaⅠ酶切位点）

pul-3-R：GCCGACGTCATTATTTACTGCTCACCGGCAGG；（其中5’端GACGTC表示AatⅡ酶切位点，其中GGACTAGTCC序列表示SpeⅠ酶切位点）

在5’端增加SD序列的同时在3’端增加3t茎环结构序列时，可设计引物序列如下：

SD-pul-3-F：GCTCTAGAGGAGGACAGCTATGCTCAGATATACCTGTCATGCCC，（其中5’端TCTAGA表示XbaⅠ酶切位点）

SD-pul-3-R：GCCGACGTCAGGACTAGTCCTTATTTACTGCTCACCGGCAGG；（其中5’端GACGTC表示AatⅡ酶切位点，其中ACTAGT序列表示SpeⅠ酶切位点）

需要注意的是，为在3’端增加3t茎环结构序列，或在5’端和3’端同时增加相应基因序列时，可以如下引物设计为例，以3t茎环结构序列（可人工合成）为模板，进行PCR扩增，

3T-F：GGACTAGTCCATTAACTAGAAAGTAAAGAAGTAGTGACC，（其中5’端ACTAGT序列表示SpeⅠ酶切位点）

3T-R：GCCGACGTCAAGCTTACAGAGAAATACACGAGGGC；（其中5’端GACGTC表示AatⅡ酶切位点）

（2）与pMD19-T质粒载体连接，

依据欲在5’端、3’端所增加序列的不同，可分别将将第（1）步中所回收的PCR扩增产物（即目的基因片段）与pMD19-T质粒载体进行连接；

（3）转化、筛选，

依据欲在5’端、3’端所增加序列的不同，将第（2）步中对应构建的质粒转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞，筛选阳性菌株，扩增并提取质粒；

（4）酶切、重连，

仅在5’端增加SD序列时，将第（3）步骤中所提取的对应质粒与pHT43质粒分别采用XbaⅠ、AatⅡ酶进行双酶切，回收酶切产物，并用DNA连接酶进行连接，然后将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选、获得重组质粒pHT43-SD-pul；

仅在3’端增加3t茎环结构序列，或在5’端和3’端同时增加基因序列时，将第（3）步骤中所提取的对应质粒与pHT43质粒分别采用XbaⅠ、AatⅡ酶进行双酶切，回收酶切产物，并用DNA连接酶进行连接，然后将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选、获得重组质粒pHT43-pul-3、pHT43-SD-pul-3；然后对重组质粒pHT43-pul-3、pHT43-SD-pul-3分别采用SpeⅠ和AatⅡ进行双酶切，并回收酶切产物；同时对第（2）步骤中连接有3t茎环结构序列的pMD19-T质粒载体采用SpeⅠ和AatⅡ酶进行双酶切，并回收酶切产物；将采用SpeⅠ和AatⅡ酶进行酶切的双酶切产物采用DNA连接酶进行连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选、获得重组质粒pHT43-pul-3t或pHT43-SD-pul-3t；

（5）转化、诱导表达，

将第（4）步骤中所构建的重组质粒（pHT43-SD-pul、pHT43-pul-3t或pHT43-SD-pul-3t）转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，筛选阳性菌株，并采用液体LB培养基进行培养，在培养至菌液至OD₆₀₀=0.6时，加入IPTG诱导普鲁兰酶蛋白表达，表达完成后取菌液、裂解菌体、离心分离取上清，即为含有普鲁兰酶的粗酶液。

以中国普通微生物菌种保藏管理中心（北京）保藏编号为CGMCC NO.10357的克雷伯氏菌为例，采用上述提高普鲁兰酶活性的方法所重构的普鲁兰酶表达基因SD-pul-3t，其碱基序列如SEQ ID.1所示。

利用所重构的普鲁兰酶表达基因SD-pul-3t，所制备的普鲁兰酶。

发明人认为，芽孢杆菌的SD（Shine-Dalgarno）序列和苏云金芽孢杆菌的3t茎环结构序列是两个相对保守的序列，对于延长mRNA的半衰期具有较为重要的作用。本发明创新性的将这两个保守序列单独或共同连接于普鲁兰酶基因时，都能较好地提高普鲁兰酶的活性，表现出了较好地应用效果。总体而言，本发明不仅对于提高普鲁兰酶产量、改进普鲁兰酶的应用具有较好地应用前景，同时也为其他基因改造工程提供了较好地借鉴意义。

附图说明

图1为所提取的克雷伯氏菌基因组DNA电泳图，其中M为λHind Ⅲ DNA marker，1~6为所提取的克雷伯氏菌基因组DNA；

图2为PCR扩增所获得的XbaⅠ-pul-AatⅡ片段的电泳检测图，其中M为500 bp DNAMarker，1为回收的目的片段XbaⅠ-pul-AatⅡ；

图3为PCR扩增所获得的XbaⅠ-SD-pul-AatⅡ片段的电泳检测图，其中M为DNAMarker Ⅳ,1为回收的目的片段XbaⅠ-SD-pul-AatⅡ；

图4为PCR扩增所获得的XbaⅠ-pul-3-AatⅡ片段的电泳检测图，其中M为500 bpDNA ladder，1为回收的目的片段XbaⅠ-pul-3-AatⅡ片段；

图5为PCR扩增所获得的XbaⅠ-SD-pul-3-AatⅡ-SpeⅠ片段的电泳检测图，其中M为1kb plus DNA ladder，1为回收的目的片段XbaⅠ-SD-pul-3-AatⅡ-SpeⅠ；

图6为PCR扩增所获得的SpeⅠ-3t-AatⅡ片段的电泳检测图，其中M为1 kb plusDNA ladder，1为回收的目的片段SpeⅠ-3t-AatⅡ；

图7为所筛选的pMD19-T- XbaⅠ-pul-AatⅡ质粒电泳检测图，其中M为1 kb plusDNA ladder，1~16为所提取的拟转化子的重组质粒；

图8为所筛选的pMD19- XbaⅠ-SD-pul-AatⅡ质粒电泳检测图，其中M为1 kb plusDNA ladder，1~11为提取的拟转化子的重组质粒；

图9为所筛选的pMD19- XbaⅠ-pul-3-AatⅡ质粒电泳检测图，其中M为1 kb plusDNA ladder，1~10为提取的拟转化子的重组质粒；

图10为所筛选的pMD19- XbaⅠ-SD-pul-3-AatⅡ-SpeⅠ质粒电泳检测图，其中M为1kb plus DNA ladder，1~10为提取的拟转化子的重组质粒；

图11为质粒pHT43双酶切产物电泳图，其中M为1kb plus DNA ladder，1为质粒pHT43 XbaⅠ和AatⅡ双酶切产物；

图12为重组质粒pHT43-pul电泳图，其中M为1 kb plus DNA ladder，1~11为提取的拟转化子质粒pHT43-pul；

图13为重组质粒pHT43-SD-pul电泳图，其中M为1 kb plus DNA ladder，1~4为提取的pHT43-SD-pul质粒；

图14为重组质粒pHT43-pul-3t电泳图，其中M为1kb plus DNA ladder，1~10为提取的pHT43-pul-3t质粒；

图15为pHT43-SD-pul-3t质粒电泳图，其中M为1 kb plus DNA ladder，1~14为提取的pHT43-SD-pul-3t质粒；

图16为细胞上清液SDS-PAGE图谱，其中M为蛋白分子Marker，1为重组质粒pHT43-pul破碎细胞上清，2为重组质粒pHT43-SD-pul破碎细胞上清，3为重组质粒pHT43-pul-3t破碎细胞上清，4为重组质粒pHT43-SD-pul-3t破碎细胞上清。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，对下述实施例中所涉及的部分生物制品及实验设备简要介绍说明如下。

菌株、DNA与载体：

大肠杆菌DH5α、pMD19-T（simple）载体和pHT43载体购自TakaRa公司；

大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购自天根公司；

克雷伯氏菌，目前保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（北京），保藏编号为：CGMCC NO.10357，该菌株的原始菌株由发明人筛选获得，因此发明人保藏有该菌株的备份；

3t茎环结构DNA片段，其序列如SEQ ID.1序列中的第3339至3817位序列所示，包括479个碱基，由上海生工公司合成提供。

试剂与药品：

Tryptone（胰蛋白胨）、Yeast Extract（酵母提取物）等购自OXID公司；

DNA分子量Marker、2×Tag Mix、细菌基因组DNA提取试剂盒等购自LifeFeng生物技术有限公司；

限制性内切酶XbaⅠ、AatⅡ和SpeⅠ、T4 DNA连接酶等购自NEB公司；

DNA凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒等购自Axygen公司；

普鲁兰多糖购自东京化成工业株式会社。

培养基及试剂配制：

LB培养基：Tryptone 10g，Yeast Extract 5g，NaCl 10g，蒸馏水定容至1000mL（制备固体LB培养基时，定容前再加入20g琼脂糖），分装后于121℃，灭菌30min备用；

100 g/L 氨苄青霉素溶液：称取1g氨苄青霉素溶解于10mL蒸馏水中，用0.22µm的细菌过滤器过滤除菌，分装成小管保存于-20℃；

50×TAE电泳缓冲液：Tris 242.2g溶解于去离子水，加入57ml冰乙酸，100mL 0.5M的EDTA(pH8.0)，去离子水定溶至1000mL。

普鲁兰酶活力测定用试剂：

0.5%普鲁兰多糖溶液：称取0.5g普鲁兰多糖溶解于蒸馏水中，定溶至100mL；

DNS试剂：将3.15 g DNS（3,5-二硝基水杨酸，化学纯）溶于131 mL 2M NaOH热溶液中（10.48g NaOH溶于131mL蒸馏水中），加入250 mL酒石酸钾钠热溶液（91 g 酒石酸钾钠溶于250 mL蒸馏水中），再加2.5 mL苯酚（固体加热）和2.5 g Na₂SO₃，溶解后定容到500 mL，贮于棕色瓶中7d后使用。

SDS-PAGE及相关试剂

A液：29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉丙烯酰胺，溶解后加灭菌去离子水定溶至100mL，密封保存于棕色试剂瓶中；

B液：1.5mM Tris-HCl，0.4％SDS，pH8.8；

C液：0.5mM Tris-HCl，0.4％SDS，pH6.8；

SDS-PAGE电泳缓冲液：称取Tris 3.0g，甘氨酸14.4g，SDS 1g，加去离子水定溶至1000mL；

脱色液：40%甲醇，10%冰乙酸，50%去离子水。

实施例1

由于本发明以普鲁兰酶基因克隆为基础，因而本实施例主要介绍一下普鲁兰酶（pul）基因的克隆及与T载体（pMD19-T（simple）质粒载体）的连接过程。

（一）对克雷伯氏菌基因组DNA的提取

利用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取克雷伯氏菌的基因组DNA，具体过程如下：

（1）培养并裂解克雷伯氏菌，

将克雷伯氏菌采用液体培养方式培养至其OD₆₀₀ 处于1~1.5时（即1 mL 菌液中约含1.0×10⁹ 个细胞）；

取菌液于离心管中，5000×g 离心10 min，收集≤2×10⁹个细菌（注意去除干净培养基，不然会影响裂解效果）；

加入150μL Lysozyme 裂解缓冲液和30μL 15mg/mL的Lysozyme，充分悬浮菌体沉淀，37℃水浴30 min；

（2）加入5μL Proteinase K 和300 μL Buffer CL，Vortex（涡旋）10秒或者剧烈摇晃20 次混合均匀，置于70℃水浴锅中温浴10 min；

（3）加入230μL 无水乙醇，温和翻转离心管10 次；混合均匀，避免产生大量泡沫，简短离心(离心速度达到3000×g 后立即停止)去除离心管盖上的液体；

（4）将溶液和絮状凝集物全部倒入或者用移液器转入DNA 吸附柱-C中，室温下静置2min；然后12000×g 离心2 min，弃废液，将DNA 吸附柱-C 放回2 mL离心管中；

（5）在DNA 吸附柱-C 中加入500 μL Buffer WA，室温、12000×g 离心1 min，弃废液，将DNA 吸附柱-C 放回2 mL离心管中；重复此步骤3次后，室温、12000×g 离心2 min；

（6）将DNA 吸附柱-C 转入试剂盒携带的1.5 mL 离心管中，向DNA 吸附膜的中央加50μL、65℃温浴过的elution buffer 或者去离子水，室温放置5min，最后室温12000×g离心1 min；离心后取上清液于-20℃保存备用。

对所提取的DNA溶液取5μL进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果如图1所示，从图中可以看出，不同批次菌液提取时，所提取的基因组DNA条带均一致，且条带单一明亮，可以用于后续作为模板使用。

（二）设计引物，并进行目的基因的克隆

根据克雷伯氏菌中普鲁兰酶基因序列、芽孢杆菌的SD序列和苏云金芽孢杆菌的颈环结构（3t）序列，共设计5对引物，序列如下：

pul-F：GCTCTAGAATGCTCAGATATACCTGTCATGCCC，（其中5’端TCTAGA表示XbaⅠ酶切位点）

pul-R：GCCGACGTCAATTATTTACTGCTCACCGGCAGG；（其中5’端GACGTC表示AatⅡ酶切位点）

3T-R：GCCGACGTCAAGCTTACAGAGAAATACACGAGGGC（其中5’端GACGTC表示AatⅡ酶切位点）。

PCR扩增获得XbaⅠ-pul-AatⅡ基因时，50 µL反应体系设计如下：

步骤（一）中所提取的克雷伯氏菌基因组DNA，1 µL；

引物pul-F，2 µL；

引物pul-R，2 µL；

2×Tag Mix，25 µL；

dd H₂O，20µL；

PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸3 min 40s，30个循环；72℃延伸10min；

XbaⅠ-SD-pul-AatⅡ、XbaⅠ-SD-pul-3- AatⅡ-SpeⅠ和XbaⅠ-pul-3-AatⅡ的PCR扩增体系参考上述XbaⅠ-pul-AatⅡ基因的扩增。

PCR扩增SpeⅠ-3t-AatⅡ时，以人工所合成的3t 颈环结构序列为模板，参考上述PCR扩增体系进行PCR扩增。

对上述PCR扩增产物分别进行电泳跑胶，在紫外灯下切下目的条带，并用凝胶回收试剂盒回收目的产物。

XbaⅠ-pul-AatⅡ、XbaⅠ-SD-pul-AatⅡ、XbaⅠ-SD-pul-3-AatⅡ-SpeⅠ、XbaⅠ-pul-3-AatⅡ和SpeⅠ-3t-AatⅡ片段的电泳结果如图2~6所示，从图中可以看出，回收的目的基因条带明亮，可以用于后续的连接实验。

（三）目的片段与T载体的连接

将步骤（二）中所回收的目的片段分别与pMD19-T（simple）质粒载体进行连接，10µL连接体系设计如下：

步骤（二）中分别回收的目的片段，4 µL；

pMD19-T vector（simple），1 µL；

Solution Ⅰ，5 µL；

16℃，酶连过夜，连接产物4℃保存备用。

（四）重组质粒的转化

将步骤（三）中连接产物转化至大肠杆菌DH5α 感受态细胞，筛选阳性菌株，扩增并进行提取，具体过程如下。

重组质粒的转化：

将步骤（三）中10 μL的连接产物加入至100 μL的大肠杆菌DH5α 感受态细胞（感受态细胞预先制备并保存于-80℃备用）中，冰浴30 min，然后在42℃水浴锅中热激90 s，立即放置于冰上2 min；

取出转化管于超净工作台中加入890 μL 液体LB 培养基，37 ℃、220 rpm 、摇床振荡培养1 h；

取 100 mL LB 固体培养基，微波炉中充分溶解后，待冷却到55℃时迅速加入100μL 100 g/L的氨苄青霉素，摇匀后倒入平板中，待冷却后使用（即制备含氨苄青霉素抗性的100 mg/L的固体LB培养基）；

将悬浮的大肠杆菌感受态细胞（即上述振荡培养后的悬液）均匀的涂布在平板中，静置30 min 后于37 ℃ 恒温箱中倒置培养过夜。

重组质粒的提取：

取上述培养过夜的平板，挑取阳性单菌落于3 mL 含3 μL 氨苄抗性的LB 液体培养基中，37℃、220 rpm、振荡培养过夜；

对振荡培养过夜后的菌体，按照质粒小提试剂盒说明书进行质粒的提取。

对所提取的质粒进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测鉴定，结果如图7~10所示，将正确的重组质粒4℃保存备用。

对电泳正确的重组质粒进一步进行测序（上海生工），并与目的片段的序列进行比对，结果表明其相似性达99.91％，可以用于后续的实验。

本实施例通过对具体菌株的普鲁兰酶的基因序列，分别设计引物克隆目的基因，将所扩增的基因与pMD19-T(simple)质粒载体连接，最终对所提取的拟转化子测序验证，成功构建了一些列质粒：pMD19-T- XbaⅠ-pul-AatⅡ、pMD19- XbaⅠ-SD-pul-AatⅡ、pMD19-XbaⅠ-SD-pul-3-AatⅡ-SpeⅠ、pMD19- XbaⅠ-pul-3-AatⅡ、pMD19- SpeⅠ-3t-AatⅡ。

实施例2

以实施例1所提取的质粒和pHT43质粒为基础，发明人采用酶切、酶连的方法构建了新的可在大肠杆菌中表达抗氨苄青霉素基因的穿梭质粒表达载体，详细构建过程介绍如下。

第一，对实施例1中所提取的质粒采用XbaⅠ、AatⅡ酶进行双酶切，所述质粒包括4中：pMD19-T- XbaⅠ-pul-AatⅡ、pMD19- XbaⅠ-SD-pul-AatⅡ、pMD19- XbaⅠ-SD-pul-3-AatⅡ-SpeⅠ、pMD19- XbaⅠ-pul-3-AatⅡ；

50 µL双酶切体系设计如下：

实施例1中所提取的连接有目的基因的pMD19-T质粒载体，9 µL；

XbaⅠ（酶活，20000U/mL），1 µL；

AatⅡ（酶活，20000U/mL），1 µL；

10 × Cut Smart Buffer，5 µL；

dd H₂O，34 µL；

37℃酶切2h。

酶切产物电泳跑胶，在紫外灯下切下回收目的条带，凝胶回收试剂盒回收目的片段，回收产物4℃保存备用。

第二，对质粒载体pHT43采用XbaⅠ、AatⅡ酶进行双酶切，

50 µL双酶切体系设计如下：

pHT43质粒，7 µL；

XbaⅠ（酶活，20000U/mL），1 µL；

AatⅡ（酶活，20000U/mL），1 µL；

10 × Cut Smart Buffer，5 µL；

dd H₂O，36 µL；

37℃酶切2h。

酶切产物电泳跑胶（结果如图11所示），在紫外灯下切下回收目的条带，凝胶回收试剂盒回收目的片段，回收产物4℃保存备用。

第三，将上述所回收的酶切产物（即第一步骤中4种质粒的双酶切产物和pHT43质粒的双酶切产物）采用T4 DNA连接酶进行连接；

20 µL连接体系设计如下：

第一步中所回收的目的基因的双酶切产物，11 µL；

第二步中质粒载体pHT43的双酶切产物，6 µL；

T4 DNA Ligase，1 µL；

T4 DNA ligase Buffer，1 µL；

dd H₂O，1 µL；

16℃酶连过夜，连接产物4℃保存备用。

第四，将第三步骤中的连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并进行阳性重组质粒的筛选和提取，具体操作可参考实施例1中“（四）重组质粒的转化”的操作步骤，不再重述；

最终构建、筛选获得4种重组质粒pHT43-pul（电泳图如图12所示）、pHT43-SD-pul（电泳图如图13所示）、pHT43-pul-3、pHT43-SD-pul-3。

第五，将第四步骤中所筛选提取的重组质粒pHT43-pul-3和pHT43-SD-pul-3分别用SpeⅠ和AatⅡ进行双酶切，回收目的片段；

同时将实施例1中所构建的质粒pMD19- SpeⅠ-3t-AatⅡ用SpeⅠ和AatⅡ进行双酶切，并回收目的片段；

将上述双酶切产物分别用T4 DNA ligase进行连接，16℃酶连过夜；

将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性菌株，并最终筛选、提取、获得重组质粒pHT43-pul-3t（电泳图如图14所示）和pHT43-SD-pul-3t（电泳图如图15所示）；

相关体系设计和步骤操作可参考实施例1及上述相关操作，不再重复。

最终，本实施例共构建了4种重组表达穿梭质粒载体：pHT43-pul、pHT43-SD-pul、pHT43-pul-3t、pHT43-SD-pul-3t。重组质粒中所引入的芽孢杆菌的SD序列，能够与芽孢杆菌的16S核糖体RNA进行结合，有利于后期蛋白质的翻译；同时，将颈环结构序列（3t）连接到目的基因的3'末端，可通过增强目的基因转录后mRNA的稳定性来提高目的基因的表达；而穿梭质粒载体上的氨苄青霉素和氯霉素抗性为筛选提供了便利。

实施例3

本实施例主要介绍将实施例2中所构建的重组表达穿梭质粒载体转化、表达，并进行普鲁兰酶表达量和酶活测定的相关实验过程，详述如下。

第一，将实施例2中所构建的4种重组表达穿梭质粒载体分别转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，转化过程参考实施例1中“（四）重组质粒的转化”相关操作，不再重述。

第二，对第一步中的阳性克隆菌株培养，并进行蛋白的诱导表达，具体过程如下：

吸取2mL的转化子菌液接种到200mL的液体LB中，37℃、220rpm振荡培养2~3h（OD₆₀₀大约0.6），然后加入IPTG使终浓度为0.6 mmol/L，28℃、180rpm振荡培养诱导表达8h；

取诱导表达后的菌液，4℃、6000rpm离心10min；

加入适量的1×E/W（pH7.0）使菌体充分溶解，放置冰上进行超声波破碎（3s×4s×30min）；

将破碎的细胞悬液4℃、6000rpm离心30min；

取上清液分装到2mL离心管中，4℃、12000rpm离心30min，得到的上清即为粗酶液。

对上述所制备的粗酶液分别进行酶活检测和SDS-PAGE蛋白表达检测，相关检测过程介绍入如下。

酶活检测：采用DNS法测定普鲁兰酶的酶活，具体测定过程介绍如下。

首先，制作葡萄糖标准曲线，具体过程如下：

取8支干净的试管，标记为1、2、3、4、5、6、7、8；

依次加入0.0 mL、0.2mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2mL、1.4 mL的葡萄糖标准液，用蒸馏水将每支试管定容到2mL；

再加入1.5 mL DNS试剂，充分混合后在沸水中煮沸10 min；

冷却后用蒸馏水定容至20mL；

在540nm下测吸光值，以1号管为对照；以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

其次，测定普鲁兰酶酶活，具体过程如下：

取两支试管，每支试管中均加入粗酶液1mL和1mL去离子水，取其中一只试管沸水加热10min灭活做对照；

然后在两只试管中分别加入1mL 0.5%的普鲁兰多糖溶液，45℃保温30 min；

再加入1.5mL DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，于沸水浴10min显色，迅速冷却，在540nm波长下进行比色（灭活酶液作为对照）；根据测定的吸光度值查上述所制备的标准曲线得到反应体系中的葡萄糖含量，代入下式计算酶活力，

普鲁兰酶酶活=。

本发明中，酶活定义为：在45℃条件下，每分钟产生相当于1μmol萄萄糖还原力的酶活定义为1个酶活单位。

对采用不同转基因序列表达的普鲁兰酶酶活测定结果如下表所示：

从上表中可以看出，重组质粒pHT43-SD-pul、pHT43-pul-3t、pHT43-SD-pul-3t的酶活分别比阳性对照pHT43-pul提高358.8、0.12、708.15倍。

SDS-PAGE蛋白表达检测：

取适量粗酶液，加入上样缓冲液，沸水浴煮沸5min，进行SDS-PAGE检测。

检测结果如图16所示。从图中可以看出，普鲁兰酶表达后，分子量大小约为130kDa；而重组质粒pHT43-SD-pul、pHT43-pul-3t、pHT43-SD-pul-3t的表达量均比阳性对照pHT43-pul高。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南仰韶生化工程有限公司

<120> 一种提高普鲁兰酶表达量的方法

<130> none

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3827

<212> DNA

<213> 克雷伯氏菌

<400> 1

gctctagagg aggacagcta tgctcagata tacctgtcat gccctatttc ttggatcgtt 60

agtattattg agtggctgtg ataacagctc ttcctcttca ccctctggct caccgggttc 120

accaggcaat cctggcaacc caggcacgcc cggtacgccc gacccgcagg atgtggtcgt 180

ccgcttaccg gacgttgccg tccctggcga agcggcgcag gcttccgcca accaggctgt 240

cattcacctt gtcgatatcg ccggcatcac cagcagcacg ccggccgact atgcgactaa 300

aaacctctat ctatggaata acgaaacctg tgatgcgctg agcgcgccgg tggcggactg 360

gaatgatgtc agcactacgc cgaccggcag cgacaaatat ggcccttact gggtgatccc 420

gctgactaaa gagagcggat gtatcaacgt tatcgtccgc gatggcacca ataagcttat 480

cgacagcgac ctgcgcgtct cttttggcga tttcaccgat cgcacggtat cggtcatcgc 540

tggcaacagc gcggtctatg actcccgcgc cgacgccttc cgcgccgcct ttggcgtggc 600

gctggccgat gcgcactggg tcgataaaac caccctgctg tggccgggcg gcgaaaataa 660

acccattgtg cgcctctatt acagccacag cagtaaggtg gccgccgaca gtaacggcga 720

atttaccgat aagtatgtca agctgactcc caccaccgtc agtcagcagg tgagcatgcg 780

cttcccgcat ctcgccagct atcctgcctt taagctgccg gatgatgtca acgtcgatga 840

attgctgcag ggcgagacgg tggcgatatc cgccgaaagc gacgggatcc tgagctccgc 900

cacccaggta cagaccgccg gcgtgctgga cgatacctat gccgccgccg ccgaggcgct 960

gagctacggc gcccagctaa ccgatagcgg cgtgaccttc cgcgtctggg cacccacggc 1020

gcagcaggtt gagctggtgg tctacagcgc cgacaagaag gtggtggcca gccatccgat 1080

gacccgcgac agcgcctccg gcgcctggtc ctggcagggc gggagcgacc tgaagggcgc 1140

gttctaccgc tacgcgatga ccgtctacca cccgcagtcg cgtaaagtcg agcagtacga 1200

agtgaccgat ccctacgccc atagtttgtc gaccaactcg gagtacagcc aggtggtcga 1260

tctcaacgac agcgcgctga agccggaagg ctgggacggg ctgacgatgc cgcacgcgca 1320

gaaaaccaaa gccgacctgg cgaaaatgac gatccacgag tcgcatattc gcgatctctc 1380

tgcctgggat caaaccgttc ccgccgaact gcgcggtaag tatctggcgc tcaccgccca 1440

ggagagcaat atggtccagc atctgaaaca gctgtcggcc tcgggagtga cccatattga 1500

gctgctgccg gtcttcgatc tggcgacggt caatgagttc agcgacaaag tcgccgatat 1560

tcagcagccg ttcagtcgcc tgtgcgagat caacagcgcg gtgaagagca gcgagttcgc 1620

gggctattgc gacagcggtt cgacggtcga agaggtgctg acccagctga agcagaacga 1680

cagcaaggat aacccgcagg tgcaggcgtt gaatacgctg gtggcgcaga ccgactccta 1740

taactggggc tacgatccgt tccactacac ggtgccggaa ggatcctacg ccaccgatcc 1800

ggaaggcacg gcgcgcatta aagagttccg caccatgatt caggcgatca agcaggatct 1860

gggaatgaac gtcattatgg acgtggtgta caaccacacc aacgccgccg gcccgaccga 1920

ccgcacctcg gtgctggata agatcgtccc ctggtactat cagcgcctga atgaaaccac 1980

cggcagcgtg gaatcggcca cctgttgctc cgactcggcg ccagagcacc ggatgttcgc 2040

caagcttatc gccgattcac tggcggtatg gaccaccgat tataagatcg atggcttccg 2100

cttcgacctg atgggctatc atccgaaagc gcagatcctc tcggcctggg agcgcattaa 2160

agcgctgaat ccggacattt atttctttgg tgaaggctgg gattccaacc agagcgatcg 2220

ctttgaaatt gcctcgcaaa tcaatctgaa aggcaccggg atcggcacgt tctccgatcg 2280

tctgcgcgac gccgtgcgcg gtggcgggcc gttcgattcc ggcgatgcat tgcgccagaa 2340

tcaggggggg ggcagcggcg ccggcgttca gccaaatgag ctgaccagca tgaccgacga 2400

tcaggcgcgc cacctcgccg atctgacccg tctgggcatg gccggtaacc tcgcggactt 2460

cgtgctgatc gacaaagacg gcgcggtgaa gaaaggcagc gagattgact ataacggcgc 2520

gcctggcggc tatgcggctg acccgacgga agtcgtgaat tatgtgtcaa aacacgacaa 2580

ccaaacgctg tgggacatga tcagctataa agctgctcag gaggcggatc tcgatacccg 2640

cgtccggatg caggcggtgt cgctggcgac ggtgatgctc ggccagggga tcgcctttga 2700

ccagcagggc tcggagctgc tgcgctctaa atcttttacc cgcgattcgt atgattccgg 2760

tgactggttt aaccgcgtgg attactccct gcaggacaac aactacaacg tgggtatgcc 2820

gcgcagcagc gatgatggca gcaactatga cattatcgcc cgggtgaaag acgcggtggc 2880

tactccgggt gaaacggagc tcaagcagat gaccgcgttt tatcaggagc tgaccgcgct 2940

gcgtaaatcg tctccgctgt ttaccctcgg tgacggcgcg acggtgatga agcgcgtgga 3000

cttccgcaac accggcgccg atcagcagac gggtctgctg gtgatgacca tcgatgatgg 3060

gatgcaggct ggcgccagtc tggacagccg tgtcgacggc atcgtggtgg cgatcaacgc 3120

cgcaccggaa agccggacgc tgcaggactt cgccggcaca tcgctgcagc tgagcgccat 3180

ccagcaggcg gcaggcgacc gttcgctggc gagcggcgtg caggttgccg ctgacggctc 3240

ggtcacgctg ccggcctggt cggtagcggt tctcgagctg cgacaggggg aatcgcaggg 3300

cgctggcctg ccggtgagca gtaaataagg actagtccat taactagaaa gtaaagaagt 3360

agtgaccatc tatgatagta agcaaaggat aaaaaaatga gttcataaaa tgaataacat 3420

agtgttcttc aactttcgct ttttgaaggt agatgaagaa cactattttt attttcaaaa 3480

tgaaggaagt tttaaatatg taatcattta aagggaacaa tgaaagtagg aaataagtca 3540

ttatctataa caaaataaca tttttatata gccagaaatg aattataata ttaatctttt 3600

ctaaattgac gtttttctaa acgttctata gcttcaagac gcttagaatc atcaatattt 3660

gtatacagag ctgttgtttc catcgagtta tgtcccattt gattcgctaa tagaacaaga 3720

tctttatttt cgttataatg attggttgca taagtatggc gtaatttatg agggcttttc 3780

ttttcatcaa aagccctcgt gtatttctct gtaagcttga cgtvggc 3827

Claims

1.一种提高普鲁兰酶活性的方法，其特征在于，在利用生物发酵工程制备普鲁兰酶时，通过基因工程操作手段在普鲁兰酶基因的5’端增加SD序列，和/或在普鲁兰酶基因的3’端增加3t茎环结构序列，重组构建新的普鲁兰酶基因序列，将该基因序列转化表达；

2.如权利要求1所述提高普鲁兰酶活性的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

仅在5’端增加SD序列时，引物序列设计如下：

SD-pul-F：GCTCTAGAGGAGGACAGCTATGCTCAGATATACCTGTCATGCCC， SD-pul-R：GCCGACGTCAATTATTTACTGCTCACCGGCAGG；

仅在3’端增加3t茎环结构序列时，引物序列设计如下：

pul-3-F：GCTCTAGAGCATGCTCAGATATACCTGTCATGCCC，

pul-3-R：GCCGACGTCATTATTTACTGCTCACCGGCAGG；

在5’端增加SD序列的同时在3’端增加3t茎环结构序列时，设计引物序列如下：

SD-pul-3-F：GCTCTAGAGGAGGACAGCTATGCTCAGATATACCTGTCATGCCC，

SD-pul-3-R：GCCGACGTCAGGACTAGTCCTTATTTACTGCTCACCGGCAGG；

在3’端增加3t茎环结构序列，或在5’端和3’端同时增加相应基因序列时，以3t茎环结构序列为模板，进行PCR扩增，引物序列设计如下：

3T-F：GGACTAGTCCATTAACTAGAAAGTAAAGAAGTAGTGACC，

3T-R：GCCGACGTCAAGCTTACAGAGAAATACACGAGGGC；

（2）与pMD19-T质粒载体连接，

依据欲在5’端、3’端所增加序列的不同，分别将第（1）步中所回收的PCR扩增产物与pMD19-T质粒载体进行连接；

（3）转化、筛选，

（4）酶切、重连，

（5）转化、诱导表达，

将第（4）步骤中所构建的重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，筛选阳性菌株，培养、IPTG诱导表达，表达完成后取菌液、裂解菌体、离心分离取上清，即为含有普鲁兰酶的粗酶液。

3.如权利要求2所述提高普鲁兰酶活性的方法，其特征在于，步骤（1）中所述菌株为中国普通微生物菌种保藏管理中心（北京）保藏编号为CGMCC NO.10357的克雷伯氏菌。

4.如权利要求3所述提高普鲁兰酶活性的方法，其特征在于，所重构的普鲁兰酶表达基因SD-pul-3t，其碱基序列如SEQ ID.1所示。