CN105543369A - 精神障碍的生物标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了精神障碍的生物标志物及其应用。通过对精神障碍组和健康对照组的粪便样品中的肠道菌群微生物基因组进行微生物基因芯片杂交研究描述粪便微生物群落及功能基因特征。通过差异检验、判别分析和机器学习，最终识别出15个功能基因，能够作为生物标志物对精神障碍组进行高精确的区分。生物标志物选自如下一组15种基因中的至少10种。15种基因在精神障碍人群和健康人群的肠道菌群中具有明显不同。本发明另外还公开了能够改变所述的基因的数量或者表达的治疗精神障碍的药物、生产或筛选治疗精神障碍的药物的方法、检测精神障碍的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术，疾病诊断和生物医药领域，具体涉及精神障碍的生物标志物及其应用。
背景技术
精神障碍(mentaldisorders)是一种重要的认知、情感、行为等心理障碍的综合症，可引起个体的紊乱、痛苦、甚至致残。常见的精神障碍主要表现为痴呆、抑郁、焦虑、躁狂、妄想、幻觉、情感障碍、行为怪异、人格分裂等。据估计，约有四分之一的人一年内会经历至少一种精神障碍，全球约有4.5亿人遭受精神健康方面的影响。据2009年的统计，全球在精神障碍方面每年的花费超过2.5万亿美元，到2030年将超过6万亿美元。已经成为个人，家庭和社会的重要的经济和社会负担。
精神障碍的病因比较复杂，仍缺乏清楚的病因学基础。大多数研究认为精神障碍是由生物，心理和环境因素共同导致的。随着研究的深入，近年来越来越多的证据表明肠道微生物通过脑-肠轴或菌-肠-脑轴(brain–gutaxis或microbiota–gut–brainaxis)能够影响中枢神经系统，在精神障碍的发病过程中发挥着重要作用。
已有研究表明肠道菌群可能能够影响压力反应(stressreactivity)，焦虑(anxiety)，抑郁(depression)，自闭症(autism)，精神分裂(schizophrenia)，帕金森氏病(Parkinson'sdisease)等精神疾病。然而，大多研究结果都是针对啮齿动物模型的，针对人类的较少。目前，对人体肠道微生物与精神障碍的相关研究还很少，肠道微生物的组成和功能与精神障碍之间的具体关系仍不清楚。有研究认为，肠道菌群某些菌的过度增殖可能引起宿主肠道菌群失衡，以及一些病源菌的代谢产物影响了正常的脑部活动。另有研究认为，肠道中一些菌的相对比例的变化引起了肠道菌群的紊乱，导致有益菌减少，有害菌增多，过多的有害菌引起宿主的代谢异常，其产生的多种毒害物质可破坏肠粘膜的完整性，导致通透性改变，引起肠漏，大分子物质及毒素变得容易透过肠壁进入血液系统进而改变血脑屏障的通过性，可直接进入中枢神经系统，进而引起大脑出现免疫或炎症反应，阻碍大脑的正常工作，最终使人出现精神错乱。现代社会人们生活压力大，生存环境一日变差，一些心理异常，如女性的产前焦虑、产后抑郁，儿童自闭症、多动症，成年人的焦虑、抑郁、躁狂症、精神分裂症、老年人的帕金森氏症、阿尔兹海默症等开始困扰人类健康，通过检测肠道微生物有望用于对心理疾患的筛查，监测和干预。然而，到目前为止，具体的影响机制并不是很清楚，肠道菌群的代谢产物和功能基因影响宿主的机制仍需要进一步的研究。
检测心理疾病的肠道微生物相关的生物标记物具有重要意义。一方面，通过将获得的生物标志物中的某些保护性微生物进行分离、纯化、培养和加工制成益生菌，可以用于改善并恢复肠道微生物平衡；另一方面，通过直接补充或通过促进有益菌的生长，抑制有害菌或潜在致病菌的增殖可以减少毒害物质的产生，保护肠粘膜的完整性，进而保护血脑屏障的正常通透性，对于降低有害微生物，减少毒性物质的产生，减轻精神障碍的身体和心理症状具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供特异性的针对精神障碍的生物标志物(或称为功能基因标志物)，为早期精神障碍状态的检测和评估提供一种非侵入式的，无创的方法。通过对肠道中的生物标志物进行检测能够间接评价精神障碍状态。
本发明的第一个方面是提供一种精神障碍的生物标志物，其选自肠道微生物产生的，编码以下的功能蛋白：methionyl-tRNAsynthetase(甲硫氨酰-tRNA合成酶)、dihydrodipicolinatesynthase(二氢吡啶二羧酸合酶)、UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanineD-glutamateligase(UDP-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸D-谷氨酸连接酶)、L-glutaminesynthase(L-谷氨酰胺合成酶)、chorismatemutase(分支酸变位酶)、homoserinekinase(高丝氨酸激酶)、MFS_antibiotic、GlycerolKinase(甘油激酶)、riboflavinsynthaseαsubunit(核黄素合酶α亚基)、PyridoxalKinase(吡哆醛激酶)、agamintase(胍基丁胺酶)、FolylpolyglutamateSynthase(叶酰聚谷氨酸合成酶)、carbonmonoxidedehydrogenase(一氧化碳脱氢酶)、branched-chain-amino-acidtransaminase(支链氨基酸转移酶)、carbamoylphosphatesynthetasesmallsubunitglutamineamidotransferase(氨甲酰磷酸合成酶小亚基谷氨酰胺酰基转移酶)的基因；所述基因同源或互补序列或所述基因的翻译产物的中的一种或多种的组合；
其中，methionyl-tRNAsynthetase基因如序列表中序列1所示；dihydrodipicolinatesynthase基因如序列表中序列2所示，UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanineD-glutamateligase基因如序列3所示，L-glutaminesynthase基因如序列表中序列4所示，chorismatemutase基因如序列表中序列5所示，homoserinekinase基因如序列表中序列6所示，MFS_antibiotic基因如序列表中序列7所示，GlycerolKinase基因如序列表中序列8所示，riboflavinsynthaseαsubunit基因如序列表中序列9所示，PyridoxalKinase基因如序列表中序列10所示，agamintase基因如序列表中序列11所示，FolylpolyglutamateSynthase基因如序列表中序列12所示，carbonmonoxidedehydrogenase基因如序列表中序列13所示，branched-chain-amino-acidtransaminase基因如序列表中序列14所示，carbamoylphosphatesynthetasesmallsubunitglutamineamidotransferase基因如序列表中序列15所示。
本发明的另一个方面是提供上述精神障碍的生物标志物在制备诊断精神障碍的试剂中的用途，所述生物标志物选自肠道微生物产生的，编码以下的功能蛋白：methionyl-tRNAsynthetase、dihydrodipicolinatesynthase、UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanineD-glutamateligase、L-glutaminesynthase、chorismatemutase、homoserinekinase、MFS_antibiotic、GlycerolKinase、riboflavinsynthaseαsubunit、PyridoxalKinase、agamintase、FolylpolyglutamateSynthase、carbonmonoxidedehydrogenase、branched-chain-amino-acidtransaminase、carbamoylphosphatesynthetasesmallsubunitglutamineamidotransferase的基因；所述基因同源或互补序列或所述基因的翻译产物的中的一种或多种的组合。
上述生物标志物来源于以下种/菌株水平的微生物中的一种或多种：Desulfovibriodesulfuricans(脱硫弧菌)、Desulfovibriovulgaris、PrevotellastercoreaDSM18206、PrevotellaoulorumF0390、PropionibacteriumacnesSK182B-JCVI、RuminococcaceaebacteriumD16、RuminococcusgnavusATCC29149、Bacteroidescapillosus、ClostridiumspiroformeDSM1552和EnterococcusfaecalisTX0012。
本发明另外提供了供检测粪便样本中精神障碍的生物标志物的方法，所述所述生物标志物选自肠道微生物产生的，编码以下的功能蛋白：methionyl-tRNAsynthetase、dihydrodipicolinatesynthase、UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanineD-glutamateligase、L-glutaminesynthase、chorismatemutase、homoserinekinase、MFS_antibiotic、GlycerolKinase、riboflavinsynthaseαsubunit、PyridoxalKinase、agamintase、FolylpolyglutamateSynthase、carbonmonoxidedehydrogenase、branched-chain-amino-acidtransaminase、carbamoylphosphatesynthetasesmallsubunit和glutamineamidotransferase的基因；所述基因同源或互补序列或所述基因的翻译产物的中的一种或多种的组合；
所述方法包括：比较待测粪便样本和健康对照组粪便样本中上述基因或其表达产物的量。
本发明另外提供了干预精神障碍的食物、益生菌或药物，所述食物、益生菌或药物能够改变上述功能基因的数量或者表达量，例如减少上述功能基因的数量或表达量。
本发明进一步提供了筛选干预精神障碍的食物、益生菌或药物的方法，所述方法包括：包括比较给予该食物、益生菌或药物治疗或干预之前和之后的粪便样本中的上述基因或其表达产物的量。
具体地，所述筛选过程包括：
a，采集个体粪便样本并妥善保存；
b，从个体粪便中提取DNA；
c，采用功能基因检测芯片对粪便DNA进行检测；
d，对高通量芯片检测结果进行信号处理，获得检测结果；
e，对检测结果进行生物信息学分析，确定所述个体的粪便中所述生物标志物的量。
f，将检测的生物标志物的量输入判别模型进行判别。
根据所述的检测流程，其特征在于，所述的步骤f中还包括：针对肠道菌群中的生物标志物的相对丰度进行检测，通过所得到的相对丰度值与预定的相应阈值进行比较。
本发明还提供了一种检测或筛查精神障碍的试剂盒，所述试剂盒包括提取上述基因的DNA提取试剂和检测所提取的DNA的基因芯片。
本发明的有益效果：提供了诊断或治疗精神障碍类疾病的方法，可通过检测肠道微生物的生物标志物用于对精神障碍类易感或高发人群进行筛查，有利于早期发现，为心理疾患的早期诊断提供了重要的生物学检测指标；可以监测精神障碍类疾病的干预效果，能够通过检测生物标志物对病情进行判断，掌握疾病的恢复情况；将发现的生物标志物用作开发或筛选针对精神障碍类疾病的食物/益生菌/药物的评价指标，并制作成检测试剂盒；提供了利用发现的生物标志物的翻译产物用作药品或功能食品。
附图说明
图1为实验流程示意图。
图2为两组之间在功能基因组成上的PCA分析结果。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述。除另外定义，本文所用的所有科技术语一般具有本发明所属领域普通技术人员所通常理解的含义。一般地，本文所用的命名和实验方法是公知的，并且在本领域中常规使用。使用标准技术进行的所有操作通常是根据仪器耗材生产商的产品说明书和常规技术要求以及本文中提供的参考资料进行的。需要注意的是，本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的目的和由此带来的有利方面对于本领域技术人员来说是显而易见的。
实施例中，我们共招募到31个精神障碍个体以及32个健康对照。我们将62个精神障碍个体以及健康对照作为模型的训练样本集，采集精神障碍组的10人以及健康对照组的10人作为验证样本集。通过对模型学习样本集中的粪便样品中肠道微生物的功能基因组成特征进行对比分析找到两组之间的显著差异的潜在生物标志物。随后，通过验证样本集对上述潜在的生物标志物进行验证，从而筛选出最终的生物标志物。通过高通量芯片检测和生物信息学分析表明两组之间在检测到的基因数量，多样性和不同代谢通路上存在不同种类的代表功能基因。实施例1：样本收集检测和DNA提取
实验共采集了63例粪便样品，其中包括31个精神障碍人群及32个年龄和地域匹配健康志愿者的粪便和血液样本。经卡方检验，两组人群在背景信息方面没有显著差异(表1)。所有个体的纳入标准为：50岁以内；身体健康；过去六个月内没有使用过抗生素、益生菌、益生元、合生元等。每个个体的新鲜粪便样品分成5份，每份约1g，样本放入冷藏保温箱中立即运输到实验室中-80℃冰箱冷冻保存。分别从粪便样品中提取总DNA。采用TIANampStoolDNAkit(天根生化科技(北京)有限公司)试剂盒提取DNA，方法按照试剂盒说明实施。DNA的质量和数量检测分别采用NanoDropND-1000分光光度计(美国热电科技)测定在260nm和280nm的吸光率以及1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。血液样本为5ml加入肝素钠和乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂的静脉血，采集完成后立即送入实验室，3000rpm常温离心15分钟后分离血浆到灭菌的离心管中-20℃保存。采用酶联免疫检测试剂盒分别检测血液样本中两种主要神经递质五羟色胺和多巴胺的含量。
表1，所有参与实验人员的背景信息
实施例2：采用功能基因检测芯片对粪便DNA进行检测
检测合格的DNA样本经过真空冷冻干燥后送至AG公司进行基因芯片检测。采用AG公司的微生物基因芯片进行检测。其中，样品的准备、杂交、读数等参照芯片说明书进行。该微生物基因芯片包含36802条探针，对应139个关键代谢通路功能基因家族的50007个蛋白编码序列，可以检测人体微生物在物种/菌株水平的功能基因(Tu,Q.,Z.He,Y.Li,Y.Chen,Y.Deng,L.Lin,etal.(2014):DevelopmentofHuMiChipforFunctionalProfilingofHumanMicrobiomes.PLOSONE.9(3):e90546.)。杂交结果使用NimbleScan(NimbleGen,Madison,WI,USA)进行扫描分析，原始数据输入在线分析平台(http://ieg.ou.edu/microarray/)，按照数据处理说明进行处理。
实施例3：芯片数据的基本处理
获得63个样品的芯片数据以后，原始数据需要进行归一化处理，将检测到的每个信号值除以芯片平均信号轻度。再对其进行质量控制，质控按以下标准进行：最小信号强度设置为1000，信噪比(SNR，SignaltoNoiseRatio)设置为2。对原始数据处理后获取Cleandata，利用在线分析工具(http://ieg2.ou.edu/NimbleGen)进行去冗余等操作，筛选高质量数据。平均每个样本检测到27968个基因信号，平均每个样本获得高质量的基因信号20532个。
实施例4：生物标志物的筛选
参照图1的实验流程，筛选精神障碍相关生物标志物，本领域技术人员所熟知的实验步骤或者操作细节未标注，主要的实验步骤如以下几个实施例所述。
4.1肠道微生物功能基因的差异检验
经过独立样本t检验分析，精神障碍人群和健康对照组之间在焦虑(STAI，State-TraitAnxietyInventory-State)和抑郁(SDS，Self-ratingdepressionscale)两项指标间存在显著差异(p<0.01)。此外，通过检测血液中的五羟色胺和多巴胺的含量，发现实验组血液中五羟色胺的含量(2.126±0.211ng/mL)要显著高于对照组(1.812±0.397ng/mL)的含量(p<0.01)，并且实验组血液中多巴胺的含量(0.116±0.023ng/mL)要显著高于对照组(0.087±0.025ng/mL)的含量(p<0.01)，表明实验组人群两种神经递质与对照组相比明显异常。此外，实验组血液中的氨含量(44.84±10.96pg/mL)显著高于对照组(34.91±13.19，p<0.05)。
由于各被试样本中肠道微生物的数据存在较多的空白，因此需借助非参数检验的方式进行统计分析。通过Mann-WhitneyU检验两组之间肠道微生物的功能基因的差异。经检验，实验组检测到的平均基因数量(9438.67±1424.32)显著少于对照组(11384.46±2493.42)，并且两组之间在氨基酸代谢、碳水化合物代谢、多糖生物合成和代谢、其它氨基酸代谢、抗生素抗性、辅酶和维生素代谢、核酸代谢、能量代谢、脂代谢、萜类和多酮类化合物代谢以及翻译代谢等代谢通路方面存在显著差异(表2)。
表2，两组之间存在显著差异的主要代谢途径
进一步，我们分析了两组之间在氨基酸代谢和合成相关的代谢通路之间的差异，发现两组之间有20个功能基因存在显著差异(表3)。其中，有15个功能基因属于氨基酸代谢，12个功能基因在实验组中的数量低于对照组，另外8个基因的数量则高于对照组。此外，参与色氨酸生物合成的anthranilatesynthase,prephenatedehydrogenase和3-deoxy-7-phosphoheptulonatesynthase等基因的数量在实验组中明显高于对照组，而3-dehydroquinatedehydratase和chorismatemutase等基因的数量则明显低于对照组。色氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，一般需要从食物中摄入。色氨酸是重要的神经递质五羟色胺的前体。色氨酸生物合成相关的基因的差异可能导致色氨酸的合成，进而影响五羟色胺的含量，可能影响神经正常的功能。
表3，两组之间在氨基酸代谢和合成相关代谢通路中的功能基因差异
除此之外，肠道微生物特有的功能基因在两组之间也存在显著差异，在人类和动物体内缺乏的功能基因如莽草酸激酶(shikimatekinase)、丙氨酸消旋酶(alanineracemase)和苏氨酸氨裂解酶(threonineammonialyase)在实验组中显著升高，而生物合成精氨酸脱羧酶(biosyntheticargininedecarboxylase)、高丝氨酸脱氢酶(homoserinedehydrogenase)和3-脱氢奎尼酸脱水酶(3-dehydroquinatedehydratase)在实验组中则显著降低(表3)。
还有一些参与神经递质五羟色胺和多巴胺代谢的功能基因在两组之间存在显著差异，如邻氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase)、预苯酸脱氢酶(prephenatedehydrogenase)和3-脱氧-7-磷酸苯丙氨酸合成酶(3-deoxy-7-phosphoheptulonatesynthase)基因在实验组中显著升高，而3-脱氢奎尼酸脱水酶(3-dehydroquinatedehydratase和分支酸变位酶(chorismatemutase)则在实验组中显著降低(表3)。
苏氨酸氨裂解酶可以代谢氨基酸产生氨，而天冬氨酸氨连接酶(aspartate-ammonialigase)和精氨琥珀酸裂解酶(argininosuccinatelyase)可以清除氨。实验组中苏氨酸氨裂解酶基因显著多于对照组，天冬氨酸氨连接酶和精氨琥珀酸裂解酶基因显著少于对照组，因此，可能导致具有神经毒性的氨的升高。通过检测两组血液中的氨含量，确实发现实验组的血氨含量明显高于对照组(p<0.05)。
多样性指数是反映生态系统内的物种丰富度和均匀度的综合指标。alpha多样性指数结果表明，在Shannon，Simpson和InverseSimpson指数方面，实验组的多样性指数均显著低于对照组的多样性指数(p<0.01)(表4)。表明实验组肠道菌群的功能基因多样性低于对照组。
表4，两组之间多样性指数差异比较
主成分分析(PCA，Principalcomponentanalysis)结果表明，两组之间在功能基因组成上大部分能够较为明显的区分开(图2)，表明实验组和对照组之间存在显著差异。
由于微生物基因芯片上涉及的功能基因都是基于微生物在种/菌株水平的，我们进一步分析了两组之间与功能基因对应的微生物的种/菌株水平的差异，结果表明，实验组和对照组之间的主要差异在Desulfovibriodesulfuricans、Desulfovibriovulgaris、PrevotellastercoreaDSM18206、PrevotellaoulorumF0390、PropionibacteriumacnesSK182B-JCVI、RuminococcaceaebacteriumD16、RuminococcusgnavusATCC29149、Bacteroidescapillosus、ClostridiumspiroformeDSM1552和EnterococcusfaecalisTX0012等微生物。上述微生物种或菌株具有作为生物标志物的潜力。
4.3建模样本集中生物标志物的筛选
采用White.J.R.，Nagarajan.N.和Pop.M.开发的Metastats程序(White,J.R.,N.Nagarajan,andM.Pop(2009):StatisticalMethodsforDetectingDifferentiallyAbundantFeaturesinClinicalMetagenomicSamples.PLoSComputationalBiology.5(4):e1000352.以及Paulson,J.N.,M.Pop,andH.C.Bravo(2011):Metastats:animprovedstatisticalmethodforanalysisofmetagenomicdata.GenomeBiology.12:P17(1):12-12.)Metastats统计方法用来检测组间宏基因组样本的差异丰度特征。对于非正态分布数据，其检测结果中p值和Q值(错误发生率FDR)分别达到显著的变量则表明该变量是特征变量。进一步的，我们将芯片数据中相对丰度大于1％的功能基因相对含量结果上传至在线分析网站(http://metastats.cbcb.umd.edu/detection.html)，经过分析，我们发现高丝氨酸激酶(homoserinekinase)和核黄素合成酶α亚基(riboflavinsynthaseαsubunit)这两种功能基因在实验组显著富集，而胍基丁胺酶(agamintase)、一氧化碳去氢酶(COdehydrogenase)和分支酸变位酶(chorismatemutase)则显著减少。
此外，我们还用线性判别分析LEfSe(lineardiscriminantanalysis(LDA)effectsize)算法分析了两组的代表功能基因。这种方法同时使用了Kruskal-Wallisranksumtest来计算差异显著性，用LDA方法来估计每个变量的效应量，不仅能够给出统计学显著性结果还能够给出生物学相关性结果(Segata,N.,J.Izard,andL.Waldron(2011):Metagenomicbiomarkerdiscoveryandexplanation.GenomeBiology.12:R60(6):81-89.)。将归一化的功能基因相对含量数据上传至在线分析平台(http://huttenhower.sph.harvard.edu/lefse/)，将alpha显著性定为<0.05，效应量大于2作为筛选标准，结果发现α甘露糖苷酶(alpha-mannosidase)和一氧化碳去氢酶基因为对照组的代表功能基因，而高丝氨酸激酶和核黄素合成酶α亚基是实验组的代表功能基因。
上述结果表明，α甘露糖苷酶、胍基丁胺酶、一氧化碳去氢酶和分支酸变位酶可能为对照组的代表功能基因，而高丝氨酸激酶和核黄素合成酶α亚基可能为实验组的代表功能基因。特别是高丝氨酸激酶和核黄素合成酶α亚基基因可以作为精神障碍组的特征生物标志物。其中，高丝氨酸激酶基因在实验组中更多，可能会升高甘氨酸和丝氨酸这两种氨基酸类神经递质的含量。而一氧化碳去氢酶和分支酸变位酶基因在实验组中较少，可能会减少一氧化碳，酪氨酸和色氨酸这几种神经递质的含量。核黄素合成酶α亚基作为神经递质代谢的辅酶在实验组中更多，可能会引起相关神经递质的代谢异常。上述功能基因大多参与了神经递质的代谢，虽然它们反应的肠道中微生物的功能基因，但根据已有研究，肠道里的神经细胞数量比脊髓里的还多，与大脑的神经细胞数量相当，并且细胞类型、神经递质及感受器都与大脑极其相似。肠道也被称为人的“第二大脑”或“肠脑”，肠脑与大脑之间通过脑肠轴(Brain-gut-axis)双向互通(GrenhamS,ClarkeG,CryanJF,DinanTG.Braingutmicrobecommunicationinhealthanddisease.Frontiersinphysiology.2011；2:1-15.)。肠脑能够影响中枢神经系统，影响人的情感，认知和行为(ForsytheP,SudoN,DinanT,TaylorVH,BienenstockJ.Moodandgutfeelings.Brain,Behavior,andImmunity.2010；24:9-16.)。因此，肠道微生物是可以通过其代谢产物影响宿主的情感，认知和行为的。
为了便于所选取的生物标志物的临床应用，我们进一步采用机器学习的方法，构建生物标志物模型。为了筛选肠道微生物的标志物，我们将全部数据用于构建模型，我们再采集实验组和对照组各10位个体的数据用于验证模型。
随机森林(RandomForest)是一种基于分类树(classificationtree)的算法，需要模拟和迭代，被归类为机器学习的一种算法(BreimanL.2001.Randomforests.MachineLearning,45,5-32)。在机器学习的诸多算法中，随机森林因高效而准确被誉为当前最好的算法之一(IversonLR,PrasadAM,MatthewsSN,PetersM.2008.Estimatingpotentialhabitatfor134easternUStreespeciesundersixclimatescenarios.ForestEcologyandManagement,254,390-406；GenuerR,PoggiJM,Tuleau-MalotC.2010.Variableselectionusingrandomforests.PatternRecognitionLetters,31,2225-2236)。随机森林算法包含多个决策树的分类器，可以产生高准确度的分类器，作为有监督的学习方法不容易出现过拟合，能够平衡数据带来的平衡误差，并能够处理大量的输入变量，能够在决定类别时评估变量的重要性。随机森林算法已经成为重要的数据分析工具，被广泛应用于众多科学研究，如微阵列数据处理，图像处理，人脸识别，运动识别等。我们利用随机森林的特点来发现影响精神障碍的特征肠道微生物。我们采用R语言中的randomForest软件包进行随机森林运算(LiawA.2012.Package"randomForest")。通过特征重要性排序分析(MeanDecreaseAccuracy和MeanDecreaseGini)，我们发现methionyl-tRNAsynthetase,dihydrodipicolinatesynthase,UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanineD-glutamateligase,L-glutaminesynthase,chorismatemutase和homoserinekinase等是最重要的几个特征变量(表5)。MFS_antibiotic、GlycerolKinase、riboflavinsynthaseαsubunit、PyridoxalKinase、agamintase、FolylpolyglutamateSynthase、carbonmonoxidedehydrogenase、branched-chain-amino-acidtransaminase、carbamoylphosphatesynthetasesmallsubunit和glutamineamidotransferase。
表5，十五个功能基因特征重要性排序
基于上述十五个功能基因作为输入特征，构建判别随机森林模型的训练数据集。将训练数据集输入随机森林进行训练，获得判别随机森林模型。模型包括不同的分类器个数和各分离点输入特征的随机抽取变量个数，通过选择不同的分类器个数和各分离点随机抽取变量个数可构建不同参数组合的判别随机森林模型。在采用默认设置的情况下进行模型训练，再依据运算结果进行调整，依据不同判别随机森林模型的ROC曲线，将ROC曲线的AUC面积值作为优选指标，将AUC面积最大的模型作为训练模型，最终优选的分类器个数为ntree＝300，变量个数为3。随机森林算法采用R语言的randomForest软件包实现，ROC曲线采用R语言的qROC软件包实现。上述训练模型可用于测试集的测试，进而将精神障碍者与正常对照加以区分。
实施例5：肠道微生物志物的筛选模型的验证与预测
为了证实实施例4中的发现，进一步比较验证模型中的10个健康人及10个精神障碍人群的特征菌群丰度。将测试数据集输入上述步骤4获得的随机森林分类模型中，即可得到最终识别结果。将微生物基因芯片数据按照上述步骤3和4进行处理，得到待检测特征向量，再将上述特征向量输入上述步骤4获得的随机森林分类模型中，即可得到最终识别结果。经过验证，此随机森林判别模型的AUC对实验组和对照组的预测准确率可分别达到0.913和0.817。
利用上述生物标记物以及随机森林分类模型来筛选、诊断或治疗精神障碍者，监测治疗进程，或者生产筛选药物、功能性食品、益生菌，生产检测上述生物标记物的试剂盒以及装置等为本领域技术人员所知悉，皆在本发明的保护范围之内。
生物标志物可以选自精神障碍者富集的生物标记物或者健康人群中富集的生物标记物中的一种或者多种。
Claims (9)
1.一种精神障碍的生物标志物，其选自肠道微生物产生的，编码以下的功能蛋白：methionyl-tRNAsynthetase、dihydrodipicolinatesynthase、UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanineD-glutamateligase、L-glutaminesynthase、chorismatemutase、homoserinekinase、MFS_antibiotic、GlycerolKinase、riboflavinsynthaseαsubunit、PyridoxalKinase、agamintase、FolylpolyglutamateSynthase、carbonmonoxidedehydrogenase、branched-chain-amino-acidtransaminase、carbamoylphosphatesynthetasesmallsubunit和glutamineamidotransferase的基因；所述基因同源或互补序列或所述基因的翻译产物的中的一种或多种的组合；
其中，methionyl-tRNAsynthetase基因如序列表中序列1所示；dihydrodipicolinatesynthase基因如序列表中序列2所示，UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanineD-glutamateligase基因如序列3所示，L-glutaminesynthase基因如序列表中序列4所示，chorismatemutase基因如序列表中序列5所示，homoserinekinase基因如序列表中序列6所示，MFS_antibiotic基因如序列表中序列7所示，GlycerolKinase基因如序列表中序列8所示，riboflavinsynthaseαsubunit基因如序列表中序列9所示，PyridoxalKinase基因如序列表中序列10所示，agamintase基因如序列表中序列11所示，FolylpolyglutamateSynthase基因如序列表中序列12所示，carbonmonoxidedehydrogenase基因如序列表中序列13所示，branched-chain-amino-acidtransaminase基因如序列表中序列14所示，carbamoylphosphatesynthetasesmallsubunitglutamineamidotransferase基因如序列表中序列15所示。
2.精神障碍的生物标志物在制备诊断精神障碍的试剂中的用途，所述生物标志物选自肠道微生物产生的，编码以下的功能蛋白：methionyl-tRNAsynthetase、dihydrodipicolinatesynthase、UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanineD-glutamateligase、L-glutaminesynthase、chorismatemutase、homoserinekinase、MFS_antibiotic、GlycerolKinase、riboflavinsynthaseαsubunit、PyridoxalKinase、agamintase、FolylpolyglutamateSynthase、carbonmonoxidedehydrogenase、branched-chain-amino-acidtransaminase、carbamoylphosphatesynthetasesmallsubunitglutamineamidotransferase的基因；所述基因同源或互补序列或所述基因的翻译产物的中的一种或多种的组合；
其中，methionyl-tRNAsynthetase基因如序列表中序列1所示；dihydrodipicolinatesynthase基因如序列表中序列2所示，UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanineD-glutamateligase基因如序列3所示，L-glutaminesynthase基因如序列表中序列4所示，chorismatemutase基因如序列表中序列5所示，homoserinekinase基因如序列表中序列6所示，MFS_antibiotic基因如序列表中序列7所示，GlycerolKinase基因如序列表中序列8所示，riboflavinsynthaseαsubunit基因如序列表中序列9所示，PyridoxalKinase基因如序列表中序列10所示，agamintase基因如序列表中序列11所示，FolylpolyglutamateSynthase基因如序列表中序列12所示，carbonmonoxidedehydrogenase基因如序列表中序列13所示，branched-chain-amino-acidtransaminase基因如序列表中序列14所示，carbamoylphosphatesynthetasesmallsubunitglutamineamidotransferase基因如序列表中序列15所示。
3.根据权利要求1所述的生物标志物或权利要求2所述的用途，其中，所述生物标志物来源于以下种/菌株水平的微生物中的一种或多种：Desulfovibriodesulfuricans(脱硫弧菌)、Desulfovibriovulgaris、PrevotellastercoreaDSM18206、PrevotellaoulorumF0390、PropionibacteriumacnesSK182B-JCVI、RuminococcaceaebacteriumD16、RuminococcusgnavusATCC29149、Bacteroidescapillosus、ClostridiumspiroformeDSM1552和EnterococcusfaecalisTX0012。
4.检测粪便样本中精神障碍的生物标志物的方法，所述生物标志物选自肠道微生物产生的，编码以下的功能蛋白：methionyl-tRNAsynthetase、dihydrodipicolinatesynthase、UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanineD-glutamateligase、L-glutaminesynthase、chorismatemutase、homoserinekinase、MFS_antibiotic、GlycerolKinase、riboflavinsynthaseαsubunit、PyridoxalKinase、agamintase、FolylpolyglutamateSynthase、carbonmonoxidedehydrogenase、branched-chain-amino-acidtransaminase、carbamoylphosphatesynthetasesmallsubunit和glutamineamidotransferase的基因；所述基因同源或互补序列或所述基因的翻译产物的中的一种或多种的组合；
所述方法包括：比较待测粪便样本和健康对照组粪便样本中上述基因或其表达产物的量。
5.干预精神障碍的食物、益生菌或药物，所述食物、益生菌或药物能够改变上述功能基因的数量或者表达量，例如减少上述功能基因的数量或表达量。
6.筛选干预精神障碍的食物、益生菌或药物的方法，所述方法包括：包括比较给予该食物、益生菌或药物治疗或干预之前和之后的粪便样本中的上述基因或其表达产物的量。
7.根据权利要求6所述的方法，，所述筛选过程包括：
a，采集个体粪便样本并妥善保存；
b，从个体粪便中提取DNA；
c，采用功能基因检测芯片对粪便DNA进行检测；
d，对高通量芯片检测结果进行信号处理，获得检测结果；
e，对检测结果进行生物信息学分析，确定所述个体的粪便中所述生物标志物的量；
f，将检测的生物标志物的量输入判别模型进行判别。
8.根据权利要求7所述的方法，其中于，所述的步骤f中还包括：针对肠道菌群中的生物标志物的相对丰度进行检测，通过所得到的相对丰度值与预定的相应阈值进行比较。
9.一种检测或筛查精神障碍的试剂盒，所述试剂盒包括提取上述基因的DNA提取试剂和检测所提取的DNA的基因芯片。
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