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CN105543116B - 一株酵母菌及其在鲜果采后病害防治中的应用 - Google Patents

一株酵母菌及其在鲜果采后病害防治中的应用 Download PDF

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CN105543116B CN201610076567.6A CN201610076567A CN105543116B CN 105543116 B CN105543116 B CN 105543116B CN 201610076567 A CN201610076567 A CN 201610076567A CN 105543116 B CN105543116 B CN 105543116B
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Abstract

本发明公开了一株酵母菌及其在鲜果采后病害防治中的应用。本发明提供的酵母菌(Pseudozyma aphidis)HT‑4，保藏登记号为CGMCC NO.11629。本发明还保护一种病原菌抑制剂或植物病害防控剂，其活性成分为酵母菌HT‑4和/或酵母菌HT‑4的代谢物。所述病原菌为下述(a1)至(a4)中的至少一种：(a1)桃褐腐病致病菌；(a2)西红柿灰霉病致病菌；(a3)链核盘菌；(a4)灰葡萄孢。所述植物病害为下述(b1)至(b4)中的至少一种：(b1)桃褐腐病；(b2)西红柿灰霉病；(b3)链核盘菌引起的植物病害；(b4)灰葡萄孢引起的植物病害。所述桃褐腐病具体可为链核盘菌引起的桃褐腐病。本发明具有良好的应用前景。

Description

一株酵母菌及其在鲜果采后病害防治中的应用
技术领域
本发明属于微生物应用领域，具体涉及一株酵母菌及其在鲜果采后病害防治中的应用。
背景技术
果实采后发生的真菌病害是一类重要的病害，造成了果实的大量减产，严重影响了果实的食用价值和市场价值，导致了果农的经济收入降低。在发达国家，果实采后病害引起的损失量占果实总量的15％以上，在发展中国家由于缺少必要的防控技术和设备，果实采后病害引起的损失量占总量的30％以上。果实采后病害的发生已给现代农业生产尤其是高端果蔬产品生产与加工造成了严重影响。
由Monilinia spp.病原真菌引起的桃褐腐病目前在世界范围内都是桃子的第一大病害，也是影响桃产业发展的第一大问题。据统计，在发达国家如美国、以色列、意大利、法国等，采后褐腐病导致的损失量就占桃总产量的10％-30％；在发展中国家由于缺少必要的防治技术和相关设备其损失量达30％-50％，甚至更高；有些地区，桃褐腐病的大面积严重发生，几乎导致桃果绝收。因此，对桃褐腐病的防治和控制显得更加迫切和重要。我国桃园面积超过900万亩，是世界上桃有效种植面积第一大国；年产桃超过40万吨，是世界上桃产量第一大国。北京桃产量位居国内前8名，仅北京平谷一地,桃种植面积就达22万亩(1.47万公顷)之多；桃产业已成为平谷县的经济支柱产业，一些桃子及相关加工产品已经出口到欧盟、日本等国家。2000年以来北京桃褐腐病大面积增加，且逐年加重；其中2005年发病较重的桃园，桃果受害，大量脱落，采摘时未见显症的果实，在采摘2-3天后，50％以上的果实因褐腐病侵染而腐烂，这给果农造成严重的经济损失。2012年北京市植保站桃褐腐病调查结果显示，北京各郊区县桃产区均有桃褐腐病发生，而且桃子在采后的运输和贮藏期间发病率都在30％以上。这大大降低了果实的食用价值和市场价值，严重影响了北京桃产业的发展。因此对桃采后褐腐病的有效防控与首都经济发展尤其是与果农的经济收入有着紧密联系。
西红柿灰霉病是影响西红柿储藏和运输重要病害之一，每年由灰霉病菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病都会导致西红柿果实的市场价值和食用价值大大降低。因此对西红柿灰霉病的有效防控与经济发展也显得较为重要和迫切。
应用杀菌剂防治采后病害是降低果品损失的重要手段；目前国内应用于果实采后病害防治的化学药剂主要为SO2和噻苯咪唑(Thiabendazole)；而SO2的广泛使用常常会带来环境污染，而且在常距离运输和长期的果实贮藏中，其杀菌效果会随时间而迅速丧失；噻苯咪唑虽然对果实采后真菌病害有较好的防治效果，但对病原细菌没有效果，而且其使用后残效期较长，不易降解，会影响一些高端果品的对外出口，更重要的是，噻苯咪唑的大范围应用容易使得一些病原菌产生抗药性。因此，亟需开发和应用新型鲜果采后病害杀菌剂。
生物杀菌剂相对于化学农药而言有着天然优势,避免了农药残留、环境污染、抗药性等问题，而且低毒、环保、持效且自然界生态兼容性较好。目前，国内生物农药开发主要集中在Bt杀虫剂、农用抗生素、细菌源生防制剂等几个方面，防治对象多集中于大田作物病害。但是针对果实病害，尤其是果实采后病害防治方面，生防应用研究进行的相对较少，且目前国内还没有能够用于果实采后病害防治的生防菌剂产品。与大田作物病害生防菌剂以及土传病害生防菌剂的研发不同，对于果实采后病害生防菌菌剂的开发和应用有着更高的安全要求，因为不同于大田作物，果实采摘之后不需要加工或者仅经过简单加工，就被食用。较之产抗生素类细菌和有丝真菌类生防菌，以类酵母菌或酵母菌为主体开发的杀菌剂在防治果实病害上，显得更为安全、环保。
酵母菌及类酵母真菌源生物杀菌剂有着独特的优势：(1)与生防细菌相比较，不产生抗生素，对环境的负面影响较小；(2)与有丝真菌类生防菌相比，不产生致敏孢子；(3)生长要求简单，易于大规模发酵生产。因此，开发采后病害酵母源杀菌剂成为近年来国际果实病害防治和果品食品安全研究领域中一个新的方向和趋势。
目前国际市场上，已经登记的用于果实采后病害防治的酵母源杀菌剂一共有3种产品。它们分别是基于黑酵母菌Aureobasidium pullulans开发的杀菌剂
Figure BDA0000921522950000021
(德国)，基于梅奇酵母菌Metschnikowia fructicola开发的杀菌剂
Figure BDA0000921522950000022
(以色列)，基于假丝酵母菌Candida sake开发的杀菌剂
Figure BDA0000921522950000023
(西班牙)。国内还没有酵母源生物杀菌剂产品出现。因此，对我们而言，开发新型鲜果采后病害酵母源杀菌剂是必要的也是重要的。
发明内容
本发明的目的是提供一株酵母菌及其在鲜果采后病害防治中的应用。
本发明提供的酵母菌(Pseudozyma aphidis)HT-4，已于2015年11月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.11629。酵母菌(Pseudozyma aphidis)HT-4CGMCC NO.11629，简称酵母菌HT-4。
本发明还保护一种病原菌抑制剂，其活性成分为酵母菌HT-4和/或酵母菌HT-4的代谢物。所述病原菌为下述(a1)至(a4)中的至少一种：(a1)桃褐腐病致病菌；(a2)西红柿灰霉病致病菌；(a3)链核盘菌；(a4)灰葡萄孢。所述桃褐腐病致病菌具体可为链核盘菌。所述西红柿灰霉病致病菌具体可为灰葡萄孢。
本发明还保护一种植物病害防控剂，其活性成分为酵母菌HT-4和/或酵母菌HT-4的代谢物。所述植物病害为下述(b1)至(b4)中的至少一种：(b1)桃褐腐病；(b2)西红柿灰霉病；(b3)链核盘菌引起的植物病害；(b4)灰葡萄孢引起的植物病害。所述桃褐腐病具体可为链核盘菌引起的桃褐腐病。所述西红柿灰霉病具体可为灰葡萄孢引起的西红柿灰霉病。所述链核盘菌引起的植物病害具体可为链核盘菌引起的桃褐腐病。所述灰葡萄孢引起的植物病害具体可为灰葡萄孢引起的西红柿灰霉病。所述桃褐腐病具体可为采摘后发生的桃褐腐病。所述西红柿灰霉病具体可为采摘后发生的西红柿灰霉病。
本发明还保护酵母菌HT-4和/或酵母菌HT-4的代谢物的应用，为下述(c1)至(c4)中的至少一种：(c1)抑制病原菌；(c2)制备病原菌抑制剂；(c3)防控植物病害；(c4)制备植物病害防控剂。所述病原菌为下述(d1)至(d4)中的至少一种：(d1)桃褐腐病致病菌；(d2)西红柿灰霉病致病菌；(d3)链核盘菌；(d4)灰葡萄孢。所述桃褐腐病致病菌具体可为链核盘菌。所述西红柿灰霉病致病菌具体可为灰葡萄孢。所述植物病害为下述(e1)至(e4)中的至少一种：(e1)桃褐腐病；(e2)西红柿灰霉病；(e3)链核盘菌引起的植物病害；(e4)灰葡萄孢引起的植物病害。所述桃褐腐病具体可为链核盘菌引起的桃褐腐病。所述西红柿灰霉病具体可为灰葡萄孢引起的西红柿灰霉病。所述链核盘菌引起的植物病害具体可为链核盘菌引起的桃褐腐病。所述灰葡萄孢引起的植物病害具体可为灰葡萄孢引起的西红柿灰霉病。所述桃褐腐病具体可为采摘后发生的桃褐腐病。所述西红柿灰霉病具体可为采摘后发生的西红柿灰霉病。
以上任一所述植物具体可为水果或蔬菜，例如桃子或西红柿(圣女果)。
酵母菌在自然环境中普遍存在，主要存在于含糖量较为丰富的果实表面和花上，是植物微生态系统中的优势微生物种群之一。该菌生长速度快，营养简单，生长力强。将酵母菌作为生防菌应用，具有如下优势：(1)对环境的污染较少，不产生毒素；(2)＝不产生抗生素，对人类相对比较安全；(3)相对于其他真菌而言，该菌不产生致敏孢子；(4)该菌所需营养比较简单；(5)该菌适合商业化大规模生产。
本发明提供的酵母菌HT-4对桃褐腐病致病菌、西红柿灰霉病致病菌具有抑制作用，对桃褐腐病、西红柿灰霉病具有防控作用，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为酵母菌HT-4在显微镜下的细胞形态。
图2为实施例3的步骤一的结果。
图3为实施例3的步骤二的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
桃褐腐病致病菌为链核盘菌(Monilinia fructicola)，参考文献：王菲等.桃褐腐病的发生与防治.果树花卉.2012年第5期p58。
西红柿灰霉病致病菌为灰葡萄孢(Botrytis cinerea)，参考文献：樊平声等.番茄灰霉病的防治研究进展.江苏农业科学.2012年第4期p133。
实施例1、菌株的分离、鉴定和保藏
一、菌株的分离
从中国新疆采集野果子，从野果表面分离菌株，采用常规梯度稀释涂布分离，用PDA(含有氯霉素)和YPD琼脂(含有氯霉素)共2种培养基分别在25℃条件下培养，挑取菌落形态差异较大并可纯培养的细菌，在YPD琼脂培养基上纯化保存，并以桃褐腐病致病菌为靶标病原菌进行拮抗菌的初筛和多次复筛，得到一株抑菌活性强的菌株，将其命名其为HT-4。
二、菌株的鉴定
对HT-4进行形态学、生理生化特性和部分保守序列的分析。参考《The Yeasts,aTaxonomic Study》(Kurtzman,C.P.(1998a).Williopsis Zender.In The Yeasts,aTaxonomic Study,4th edn,pp.529-920.Edited by C.P.Kurtzman&J.W.Fell.Amsterdam:Elsevier.)中描述方法进行生理生化测定和分子生物学鉴定。
HT-4的形态学特征：菌体营养细胞呈卵形，或近球形，多为单边出芽生殖或少为多边出芽生殖；在YPD琼脂培养基上和PDA培养基上25℃下生长48小时，菌落为奶油状、乳白色不透明，扁平或圆形，边缘整齐，菌落无褶皱。酵母菌HT-4在显微镜下的细胞形态见图1。
HT-4的生理生化特征：可进行葡萄糖发酵，不可进行棉子糖和乳糖发酵；碳源同化方面：山梨糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、D-甘露醇为阳性，半乳糖、乳糖、鼠李糖、核糖醇、赤藓糖醇为阴性；产生有机酸；于含有5％(质量含量)氯化钠的培养基中均可正常生长，于含有10％(质量含量)氯化钠的培养基中不可生长，于pH 7.0-8.5的培养基中均可正常生长，在环境温度为4℃下生长势弱，在40℃以上不可生长；最佳适宜生长温度为25-30℃。
HT-4的26S rDNA如序列表的序列1所示。
上述鉴定结果表明，HT-4为酵母菌(Pseudozyma aphidis)。
三、菌株的保藏
酵母菌(Pseudozyma aphidis)HT-4，已于2015年11月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.11629。酵母菌(Pseudozyma aphidis)HT-4CGMCC NO.11629，简称酵母菌HT-4，用HT-4表示。
实施例2、酵母菌HT-4的抑菌谱测定
植物病原真菌为链核盘菌或灰葡萄孢。
1、酵母菌HT-4在PDA培养基上25℃恒温培养48h。
2、植物病原真菌在PDA平板上25℃恒温培养3-4天，然后自菌落边缘用直径0.7cm的无菌不锈钢打孔器打制带菌琼脂片。
3、用无菌接种针挑取步骤2得到的带菌琼脂片，菌丝面朝下接种于新的PDA培养基平板中心处。
4、取步骤3得到的PDA培养基平板，分成试验组和对照组(每组三个平板)，试验组在距带菌琼脂片两侧均约3.00cm处用无菌接种环划线酵母菌HT-4，对照组不作任何处理，然后在25℃、80％湿度条件下培养5-7天，测量植物病原真菌边缘与酵母菌HT-4的菌落带宽中心之间的抑菌带宽度。
第5天的测量结果如下：酵母菌HT-4对链核盘菌的抑菌带宽度为10±1.0mm，相应对照处理无抑菌带；酵母菌HT-4对灰葡萄孢的抑菌带宽度为12±1.0mm，相应对照处理无抑菌带。结果表明，酵母菌HT-4具有稳定、高效、广谱的抗菌性能。
实施例3、酵母菌HT-4对植物病原真菌引起的腐烂病斑的抑制
一、酵母菌HT-4对链核盘菌引起的腐烂病斑的抑制
桃子采摘后，先用0.5g/100mL次氯酸钠水溶液消毒,然后用灭过菌的移液器枪头沿着桃腰部插孔(每个桃子扎孔3个，每个孔为30mm×30mm)，然后每孔接种30μl HT-4菌液(用无菌水悬浮酵母菌HT-4得到HT-4菌液，酵母菌HT-4浓度分别为107cfu/ml、108cfu/ml或109cfu/ml；设置用无菌水代替HT-4菌液的对照处理)，室温晾干，然后每孔接种30μl链核盘菌孢子悬浮液(用无菌水悬浮链核盘菌孢子，得到孢子浓度为5×104cfu/ml的孢子悬浮液)，然后将桃子贮藏21天(贮藏条件：温度为1℃，相对湿度为95％，黑暗)。
贮藏21天后的照片见图2(图2中的试验组为酵母菌HT-4浓度为108cfu/ml时的处理组)。
每种酵母菌HT-4浓度作为一组，每组对10个桃子进行试验，结果取平均值。
统计贮藏21天后的防治效果。腐烂斑小于10mm被视为未发生腐烂斑。
防治效果＝未发生腐烂斑的孔数/接种致病真菌的总孔数×100％。
当酵母菌HT-4浓度为107cfu/ml时，防治效果为45％。当酵母菌HT-4浓度为108cfu/ml时，防治效果为60％。当酵母菌HT-4浓度为109cfu/ml时，防治效果为65％。对照处理的防治效果为0。
二、酵母菌HT-4对灰葡萄孢引起的腐烂病斑的抑制
西红柿(圣女果)采摘后，先用0.5g/100mL次氯酸钠水溶液消毒,然后用灭过菌的移液器枪头插孔(每个西红柿扎孔3个，每个孔为30mm×30mm)，然后每孔接种30μl HT-4菌液(用无菌水悬浮酵母菌HT-4得到HT-4菌液，酵母菌HT-4浓度分别为107cfu/ml、108cfu/ml或109cfu/ml；设置用无菌水代替HT-4菌液的对照处理)，室温晾干，然后每孔接种30μl灰葡萄孢孢子悬浮液(用无菌水悬浮灰葡萄孢孢子，得到孢子浓度为5×104cfu/ml的孢子悬浮液)，然后将西红柿贮藏21天(贮藏条件：温度为4℃，相对湿度为95％，黑暗)。
贮藏21天后的照片见图3(图3中的试验组为酵母菌HT-4浓度为108cfu/ml时的处理组)。
每种酵母菌HT-4浓度作为一组，每组对10个西红柿进行试验，结果取平均值。
统计贮藏21天后的防治效果。腐烂斑小于10mm被视为未发生腐烂斑。
防治效果＝未发生腐烂斑的孔数/接种致病真菌的总孔数×100％。
当酵母菌HT-4浓度为107cfu/ml时，防治效果为50％。当酵母菌HT-4浓度为108cfu/ml时，防治效果为65％。当酵母菌HT-4浓度为109cfu/ml时，防治效果为70％。对照处理的防治效果为0。
结果表明，贮藏条件下，酵母菌HT-4对供试的2种植物病原真菌引起的腐烂病斑的皆有较好的抑制效果。
Figure IDA0000921523050000011

Claims (1)

1.菌株Pseudozyma aphidis HT-4在防控链核盘菌导致的桃褐腐病中的应用；
菌株Pseudozyma aphidis HT-4，其保藏编号为CGMCC NO.11629。
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