CN105532583A - 一种昆虫病原线虫的活体繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种昆虫病原线虫的活体繁殖方法，其包括以下步骤：取培养容器，在该培养容器中放入海绵块，向海绵块滴加无菌水至海绵块完全润湿；将适量昆虫病原线虫水溶液滴在饥饿12～24h的甜菜夜蛾高龄幼虫体表，1～3min后将该甜菜夜蛾高龄幼虫置于海绵块上；将培养容器放置于22～25℃培养箱中恒温培养，培养过程中保持海绵块持续处于完全湿润状态；培养10～15天后，海绵块中分布病原线虫，用无菌水清洗海绵块而收集所需的昆虫病原线虫。本发明繁殖设备简单，降低了活体繁殖成本低，操作简单，寄主昆虫，来源广，方便采集，采用海绵块作为繁殖载体，重复利用线虫的驱水性，保证了病原线虫对甜菜夜蛾高龄幼虫的有效侵染，进一步保证病原线虫的产量。
Description
技术领域
本发明涉及昆虫病原线虫的繁殖，具体涉及一种昆虫病原线虫的活体繁殖方法。
背景技术
昆虫病原线虫是一种专门寄生害虫的线虫，它具有寄主范围广、能主动寻找寄主、对人畜及环境安全无毒、并能人工大量培养等优点，能够有效防治农林、园艺植物的土栖和钻蛀性害虫，如桃小食心虫、各种蛴螬、天牛、地老虎等，因此被国内外专家称为高潜能生物防治武器。
昆虫病原线虫繁殖主要分为活体繁殖和离体人工培养基繁殖，其中离体人工培养基繁殖又分为固体培养和液体培养，两方法均需要多种原料和大型仪器设备，投资高，操作步骤多，生产周期长，而活体繁殖方法简便、所用仪器设备很少、生产周期短，繁殖的线虫致病力高于离体人工培养基繁殖的线虫。
目前主要的繁殖方法有Whitetrap法、Lowtek法、液体培养法(TSYS)以及固体培养法等，其中Whitetrap法和Lowtek法一般采用大蜡螟为寄主昆虫，病原线虫侵入昆虫体内，以体内有机质为应用，利用线虫趋水性繁殖病原线虫的方法，主要存在以下问题：(1)以大蜡螟为寄主昆虫，田间不易采集大蜡螟，寄主昆虫来源不广；(2)收集方法步骤繁琐，中间需要多次操作，费时费力；(3)无法有效保证寄生昆虫在放入繁殖器皿前已被有效侵染，从而无法保证后期的有效繁殖。液体培养法和固体培养法均是利用人工培养基进行病原线虫的繁殖，主要存在以下问题：(1)需要用到动物肝脏，成本较高；(2)连续培养几代后，病原线虫的侵染活性和适应能力均下降；(3)需要培养病原线虫的共生细菌，繁殖过程中不能被其他杂菌感染，操作要求高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术而提供一种操作方便、产量高的昆虫病原线虫的活体繁殖方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种昆虫病原线虫的活体繁殖方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取培养容器，在该培养容器中放入海绵块，向海绵块滴加无菌水至海绵块完全润湿；
(2)将昆虫病原线虫水溶液滴在饥饿12～24h的甜菜夜蛾高龄幼虫体表，1～3min后将该甜菜夜蛾高龄幼虫置于海绵块上；其中对甜菜夜蛾高龄幼虫进行饥饿处理，可有效避免甜菜夜蛾高龄幼虫的排泄物污染培养容器，方便昆虫病原线虫的收集，同时保证繁殖的昆虫病原线虫的品质。
(3)将经所述步骤(2)处理的培养容器放置于22～25℃培养箱中恒温培养，培养过程中保持海绵块处于完全湿润状态；
(4)培养10～15天后，海绵块中分布有病原线虫，用无菌水清洗海绵块而收集所需的昆虫病原线虫。
作为优选，上述步骤(2)中昆虫病原线虫水溶液为每毫升含4500～5000条昆虫病原线虫的悬浮液，且每1g甜菜夜蛾高龄幼虫配比1/5～1/3毫升的昆虫病原线虫水溶液。高密度的昆虫病原线虫有利于在最短的时间内获得最大数目的感染期线虫，但过高的密度会降低线虫的繁殖倍数，因此本申请中选择上述浓度的昆虫病原线虫水溶液。
进一步，所述昆虫病原线虫为斯氏线虫或异小杆线虫，且当昆虫病原线虫为斯氏线虫时，每1g甜菜夜蛾高龄幼虫配比1/5～1/3毫升的昆虫病原线虫水溶液；当昆虫病原线虫为异小杆线虫时，每1g甜菜夜蛾高龄幼虫配比1/5～1/4毫升的昆虫病原线虫水溶液。
为进一步增加昆虫病原线虫的产量，作为优选，所述海绵块横向填满培养容器底面。
进一步，所述培养容器为透明的玻璃瓶、玻璃盒、塑料瓶或塑料盒中的任一种。
再进一步，所述培养容器为圆形盘，且其直径为12～18cm，高度为2.2～3cm，对应地，所述海绵块的直径为12～18cm，高度为1～2cm。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)繁殖设备简单，降低了活体繁殖成本低，操作简单，无需多次收集线虫，一次操作即可；
(2)采用甜菜夜蛾作为寄主昆虫，来源广，方便采集，且甜菜夜蛾高龄幼虫活性好，可使昆虫病原线虫获得更高的产量；
(3)采用保持湿润状态的海绵块作为繁殖载体，重复利用线虫的驱水性，保证了病原线虫对甜菜夜蛾高龄幼虫的有效侵染，进一步保证病原线虫的产量。
利用本发明中的繁殖方法，病原线虫产量高并能保证繁殖的病原线虫对寄主昆虫的保持较高的致病力。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1：
培养容器：透明的塑料保鲜盒，包括圆盘状的盒体和盒盖，盒体的内径为15cm，高度为2.2cm；
供试昆虫：甜菜夜蛾高龄幼虫，采自宁波横溪大岙蔬菜田，室内饲养至高龄。
供试线虫：斯氏线虫(Steinernemacarpocapsae，购于河南济源白云实业有限公司)
试验过程：取直径为15cm、高度为1.5cm的海绵块(未使用过的新鲜海绵)置于盒体中，并使海绵块横向铺满盒体底面，向海绵块滴加无菌水至海绵块完全润湿，盒体底面上有少许水。
将上述线虫用无菌水配制成昆虫病原线虫水溶液，该昆虫病原线虫水溶液为每毫升含5000条昆虫病原线虫的悬浮液，取适量的昆虫病原线虫水溶液滴在饥饿24h的甜菜夜蛾高龄幼虫体表，平均每1克甜菜夜蛾高龄幼虫配比1/5毫升昆虫病原线虫水溶液，1min后将甜菜夜蛾高龄幼虫放置于海绵块上部。
盖上盒盖并保持一定的通气性，将装有甜菜夜蛾高龄幼虫的保鲜盒放置于25℃培养箱中恒温培养，培养过程中适时添加无菌水保持海绵块处于完全湿润状态。培养10天后，甜菜夜蛾高龄幼虫基本死亡，海绵块中存在病原线虫，用无菌水清洗海绵块而收集所需的昆虫病原线虫，繁殖结果如表1所示。
实施例2：
培养容器：透明的塑料保鲜盒，包括圆盘状的盒体和盒盖，盒体的内径为12cm，高度为3cm；
供试昆虫：甜菜夜蛾高龄幼虫，来自宁波横溪大岙蔬菜田，室内饲养至高龄。
供试线虫：异小杆线虫(Heterorhabditisbacteriophora，购于河南济源白云实业有限公司)。
试验过程：取直径为12cm、高度为2cm的海绵块(未使用过的新鲜海绵)置于盒体中，并使海绵块横向铺满盒体底面，向海绵块滴加无菌水至海绵块完全润湿。
将上述线虫用无菌水配制成昆虫病原线虫水溶液，该昆虫病原线虫水溶液为每毫升含4500条昆虫病原线虫的悬浮液，取适量的昆虫病原线虫水溶液滴在饥饿24h的甜菜夜蛾高龄幼虫体表，平均每1克甜菜夜蛾高龄幼虫配比1/4毫升昆虫病原线虫水溶液，2min后将甜菜夜蛾高龄幼虫均匀地放置于海绵块上方。
盖上盒盖并保持一定的通气性，将装有甜菜夜蛾高龄幼虫的保鲜盒放置于25℃培养箱中恒温培养，培养过程中保持海绵块处于完全湿润状态。培养10天后，甜菜夜蛾高龄幼虫基本死亡，海绵块中存在病原线虫，用无菌水清洗海绵块而收集所需的昆虫病原线虫，繁殖结果如表1所示。
实施例3：
培养容器：透明的塑料保鲜盒，包括圆盘状的盒体和盒盖，盒体的内径为18cm，高度为2.2cm；
供试昆虫：甜菜夜蛾高龄幼虫，来自宁波横溪大岙蔬菜田，室内饲养至不同龄期。
供试线虫：斯氏线虫(Steinernemacarpocapsae，购于河南济源白云实业有限公司)。
试验过程：取直径为18cm、高度为1cm的海绵块(未使用过的新鲜海绵)置于盒体中，并使海绵块横向铺满盒体底面，向海绵块滴加无菌水至海绵块完全润湿。
将上述线虫用无菌水配制成昆虫病原线虫水溶液，该昆虫病原线虫水溶液为每毫升含5000条昆虫病原线虫的悬浮液，取适量的昆虫病原线虫水溶液滴在饥饿12h的甜菜夜蛾高龄幼虫体表，平均每1克甜菜夜蛾高龄幼虫配比1/3毫升昆虫病原线虫水溶液，3min后将甜菜夜蛾高龄幼虫，均匀地放置于海绵块上方。
盖上盒盖并保持一定的通气性，将装有甜菜夜蛾高龄幼虫的保鲜盒放置于25℃培养箱中恒温培养，培养过程中保持海绵块处于完全湿润状态。培养15天后，甜菜夜蛾高龄幼虫基本死亡，海绵块中存在病原线虫，用无菌水清洗海绵块而收集所需的昆虫病原线虫，繁殖结果如表1所示。
比较例1：与实施例1不同的是，比较例1中采用大蜡螟(5龄幼虫，采自宁波横溪大田)作为寄主昆虫，其他试验条件与实施例1同，繁殖结果如表1所示。
比较例2：与实施例1不同的是，比较例2中采用滤纸代替实施例1中的海绵块，滤纸的直径为15cm、高度为1cm，横向铺满盒体底面，其他试验条件与实施例1同，繁殖结果如表1所示。
表1各实施例、比较例的繁殖结果
由表1可见，应用本发明中的繁殖方法，病原线虫对寄主昆虫的有效寄生率(即侵染率)显著提高，出线虫时间缩短，病原线虫的产量显著增加。
将实施例1～3中繁殖的病原线虫侵染甜菜夜蛾高龄幼虫5min，繁殖的病原线虫对甜菜夜蛾高龄幼虫的寄生率达到85％以上，具有很强的致病力。
Claims (6)
1.一种昆虫病原线虫的活体繁殖方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取培养容器，在该培养容器中放入海绵块，向海绵块滴加无菌水至海绵块完全润湿；
(2)将适量昆虫病原线虫水溶液滴在饥饿12～24h的甜菜夜蛾高龄幼虫体表，1～3min后将该甜菜夜蛾高龄幼虫置于海绵块上；
(3)将经所述步骤(2)处理的培养容器放置于22～25℃培养箱中恒温培养，培养过程中保持海绵块持续处于完全湿润状态；
(4)培养10～15天后，海绵块中分布有病原线虫，用无菌水清洗海绵块而收集所需的昆虫病原线虫。
2.如权利要求1所述的活体繁殖方法，其特征在于，所述步骤(2)中昆虫病原线虫水溶液为每毫升含4500～5000条昆虫病原线虫的悬浮液，且每1g甜菜夜蛾高龄幼虫配比1/5～1/3毫升的昆虫病原线虫水溶液。
3.如权利要求2所述的活体繁殖方法，其特征在于，所述昆虫病原线虫为斯氏线虫或异小杆线虫，且当昆虫病原线虫为斯氏线虫时，每1g甜菜夜蛾高龄幼虫配比1/5～1/3毫升的昆虫病原线虫水溶液；当昆虫病原线虫为异小杆线虫时，每1g甜菜夜蛾高龄幼虫配比1/5～1/4毫升的昆虫病原线虫水溶液。
4.如权利要求1或2或3所述的活体繁殖方法，其特征在于，所述海绵块横向填满培养容器底面。
5.如权利要求4所述的活体繁殖方法，其特征在于，所述培养容器为透明的玻璃瓶、玻璃盒、塑料瓶、塑料盒中的任一种。
6.如权利要求5所述的活体繁殖方法，其特征在于，所述培养容器为圆形盒，且其内径为12～18cm，高度为2.2～3cm，对应地，所述海绵块的直径为12～18cm，高度为1～2cm。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |