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CN105531374A - 双特异性cd3和cd19抗原结合构建体 - Google Patents

双特异性cd3和cd19抗原结合构建体 Download PDF

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CN105531374A
CN105531374A CN201480044366.7A CN201480044366A CN105531374A CN 105531374 A CN105531374 A CN 105531374A CN 201480044366 A CN201480044366 A CN 201480044366A CN 105531374 A CN105531374 A CN 105531374A
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CN
China
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binding
antigen
construct
cell
cells
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CN201480044366.7A
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G·Y·K·吴
S·B·迪克西特
T·斯普雷特冯克罗登斯泰恩
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ZYMEWORKS Inc
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Abstract

本发明描述了结合CD3和CD19或CD20抗原的双特异性抗原结合构建体。

Description

双特异性CD3和CD19抗原结合构建体
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年7月12日提交的第61/845,948号美国临时申请和2014年1月15日提交的第61/927,877号美国临时申请和2014年4月11日提交的第61/978,719号美国临时申请的权益。这些申请据此以引用的方式整体并入本文中。
序列表
本申请包含序列表，其已经经由EFS-Web提交并据此以引用的方式整体并入本文中。所述ASCII拷贝创建于2014年XX月，命名为XXXXX_CRF_sequencelisting.txt，且大小为XXX,XXX字节。
技术领域
本发明的领域为多特异性骨架的合理设计，例如包含用于生物治疗剂的定制开发的CD3结合域的抗原结合构建体。
发明背景
在治疗性蛋白质的领域中，具有其多价靶结合特征的抗体是用于设计候选药物的极好骨架。除了这些特征以外，所设计的双特异性抗体和其它融合的多特异性治疗剂展现双重或多重靶特异性以及制作具有新颖作用模式的药物的机会。开发具有有利的可制造性、药代动力学和功能活性的此类多价和多特异性治疗性蛋白质已成为一项挑战。
能够使T细胞靶向于肿瘤细胞的双特异性抗体已经被识别并且对其在癌症治疗中的功效进行了测试。博纳吐单抗(blinatumomab)是双特异性抗CD3-CD19抗体的一个实例，形式被称作BiTETM(双特异性T细胞接合子)，其已经被识别来用于治疗B细胞疾病例如复发性B细胞非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma)和慢性淋巴细胞性白血病(Baeuerle等(2009)12:4941-4944)。BiTETM形式是连接衍生自两种不同抗体的可变域的双特异性单链抗体构建体。然而，博纳吐单抗具有不良的体内半衰期并且就生产和稳定性而言是难以制造的。因此，需要改善的双特异性抗体，其能够使T细胞靶向于肿瘤细胞且具有改善的可制造性。
发明概述
本文公开了分离的双特异性抗原结合构建体，其包含：单价地和特异性地结合CD19或CD20抗原的第一抗原结合多肽构建体；单价地和特异性地结合CD3抗原的第二抗原结合多肽构建体；包含第一和第二Fc多肽的异二聚体Fc，所述Fc多肽各自包含修饰的CH3结构域，其中每个修饰的CH3结构域包含不对称氨基酸修饰以促进形成异二聚体Fc和具有约68℃或更高的熔融温度(Tm)的二聚化CH3结构域，其中该第一Fc多肽通过或不通过第一接头连接至第一抗原结合多肽构建体，且第二单体Fc多肽通过或不通过第二接头连接至第二抗原结合多肽构建体；且其中第一抗原结合多肽构建体为Fab，而第二抗原结合多肽构建体为scFv，或第一抗原结合多肽构建体为scFv，而第二抗原结合多肽构建体为Fab。
附图简述
专利申请文件包含至少一幅彩图。如果公开可用，那么这个带有彩图的专利申请的副本将在请求和支付必要费用后由美国专利和商标局(U.S.PatentandTrademarkOffice)提供。
图1描绘本文所述双特异性抗原结合构建体的示例性示意图。图1A代表双重scFv异二聚体Fc形式；图1B代表其中CD3结合多肽呈scFv形式且CD19结合多肽呈Fab形式的实施方案中的杂合异二聚体Fc形式；图1C代表其中CD19结合多肽呈scFv形式且CD3结合多肽呈Fab形式的实施方案中的杂合异二聚体Fc形式；图1D代表全尺寸抗体形式。
图2提供呈双重scFv-Fc(本文也称为双重scFv形式)、杂合或全尺寸单克隆抗体形式的示例性CD3/CD19双特异性变体的汇总。此图中所示双特异性变体包含基于单特异性抗CD3抗体OKT3和单特异性抗CD19抗体HD37的抗原结合域。这里识别出对抗原结合域进行的可改善双特异性变体的生物物理和功能特性的潜在修饰，包括CDR中半胱氨酸至丝氨酸的突变(CDRC→S)、对scFv接头序列(VHVL接头)的修饰和二硫键稳定化修饰(VHVLSS)。此外，还将对Fc区域进行修饰以敲除FcγR结合活性确定为修饰变体功能特性的方式。
图3提供改善所选双特异性变体的生物物理性质的变体优化汇总。这幅图指出用于改善变体的生物物理和功能特性以及可制造性的优化策略，并汇总最终纯化步骤之后的表达量和各自的异二聚体纯度。
图4提供所选变体的某些物理性质、瞬时表达的蛋白质产量、结合性质和验证阶段(即，在体内或在离体模型中测试)的汇总。
图5证实所选变体能够桥接CD19+RajiB细胞和JurkatT细胞。左图示出变体875和891相比于对照IgG的FACS桥接数据。右图提供变体875、1853和6476的T:B桥接分析的汇总。
图6描述所选变体桥接形成伪足的B和T细胞的能力。左侧的表格提供变体875、1661、1853、6476和6518的B:T细胞桥接分析的汇总；右侧的照片示出变体875、1853和6518形成伪足，这是通过桥接显微镜法测定。
图7描绘所选变体在人类全血测定中介导自体B细胞消耗的能力。在人类全血中IL-2孵育48小时后测定CD20+B细胞的存在(平均2个供体，n＝4)。图7A描绘具有双重scDv异二聚体Fc形式或杂合异二聚体Fc形式的变体的结果。图7B示出呈全尺寸抗体形式的变体的结果。
图8描绘所选变体结合人类G2ALL肿瘤细胞系的能力。
图9描绘变体1661(FcγR敲除变体)相比于对照在体内小鼠B-ALL白血病模型中的功效。图A示出呈俯卧姿势的整个身体中的生物发光量；图B示出呈仰卧姿势的整个身体中的生物发光量；图C是整个身体生物发光的图像；且图D示出脾中检测到的生物发光量。
图10描绘杂合变体1853和双重scFv-Fc变体875相比于对照在体内小鼠B-ALL白血病模型中的功效。图A示出呈俯卧姿势的整个身体中的生物发光量；图B示出呈仰卧姿势的整个身体中的生物发光量；图C是整个身体生物发光的图像；且图D示出脾中检测到的生物发光量。
图11描绘示例性CD3-CD19异二聚体变体的药代动力学分析。该图示出0.8mg/kg单次IV给药的v875与1.2mg/kg对照抗体相比在NSG(NODSCIDGAMMA)小鼠中的PK曲线。对照抗体是结合HER2的单特异性抗体。
图12描绘通过示例性双特异性抗CD3-CD19抗原结合构建体的T细胞活化的目标B细胞依赖性。
图13描绘示例性双特异性抗CD3-CD19抗原结合构建体对人类PBMC中T细胞增殖的影响。
图14描绘示例性双特异性抗CD3-CD19抗原结合构建体对人类PBMC中IFNγ、TNFα、IL-2、IL-6和IL-10细胞因子释放的影响。
图15(A和B)展示，就小鼠内半衰期、分布和清除率而言，示例性双特异性抗CD3-CD19抗原结合构建体1853以3mg/kg的单次IV给药在NSG(NODscidgamma,NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠中具有典型的类似人类IgG的药代动力学。图15C示出双特异性CD3/CD19变体在以3mg/kgIV注射后24小时时的血清浓度分析。该分析是作为体内功效研究的一部分进行(参见实施例10和图9、10)。
图16描绘示例性双特异性抗CD3-CD19抗原结合构建体消耗人源化NSG小鼠中体内人类B-ALL异种移植模型中的自体B细胞的能力。
图17描绘人源化NSG小鼠中体内人类B-ALL异种移植模型中自体T细胞响应示例性双特异性抗CD3-CD19抗原结合构建体治疗的活化和重新分布动力学。
图18描绘人源化NSG小鼠中体内人类B-ALL异种移植模型中示例性双特异性抗CD3-CD19抗原结合构建体对人类细胞因子IFNγ、TNFα、IL2、IL6和IL10释放的影响。
图19描绘跨物种反应性变体5851介导全血测定中自体B细胞消耗的能力。在人类全血中IL-2孵育48小时后测定CD20+B细胞的存在(平均2个供体，n＝4)。
发明详述
除非另有规定，否则本文所使用的所有技术和科技术语具有如要求保护的主题所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。如果本文中的术语有多种定义，以本部分中的定义为准。当对URL或其它此类标识符或地址进行引用时，应该理解此类标识符可以变化且互联网上的具体信息可以变化不定，但通过搜索互联网可以发现等效的信息。对其进行的引用证明了此类信息的可用性和公共传播性。
应该了解，上文一般的描述和下文的详细描述仅为示例性和说明性，且不限制要求保护的任何主题。在本申请中，除非另外明确陈述，否则使用单数包括复数。
除非本文明确不同地定义，否则由抗体技术领域中的技术人员所理解的术语各自被给予在本领域中所获得的含义。
在本文中，氨基酸可以被表示为其通常已知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommission)推荐的单字母符号。同样地，核苷酸可以被表示为其通常公认的单字母代码。
在本说明书中，除非另外指明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应该被理解为包括所列举范围内的任何整数值，(在适当时)及其分数(例如整数的十分之一和百分之一)。如本文所使用，除非另外指明，否则"约"意指所指示的范围、值、序列或结构的±10％。应该理解，除非另外说明或由上下文指定，否则如本文所使用的术语"一个(a/an)"是指所列举的组分中的“一个或多个”。替代物(例如，"或")的使用应被理解为意指所述替代物中的任一者、两者或其任何组合。如本文所使用，术语"包括"和"包含"同义地使用。另外，应该理解，衍生自本文所描述的结构和取代基的不同组合的个别单链多肽或抗原结合构建体由本申请公开，其公开程度就如同单独地阐述了每个单链多肽或异二聚体。因此，选择具体组分以形成个别单链多肽或异二聚体是在本公开的范围内。
本文所用的章节标题仅出于组织性目的，并且不应被解释为限制所描述的主题。
应该理解，本文所描述的方法和组合物不限于本文所描述的特定方法、方案、细胞系、构建体和试剂，并且因此可以变化。还应该理解，本文所使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的而不意图限制本文所描述的方法和组合物的范围，所述范围将仅受所附权利要求书限制。
本申请中引用的所有文献或文献的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、手册和论文，均据此出于任何目的以引用的方式明确地整体并入本文。本文提及的所有出版物和专利出于描述和公开例如在所述出版物中描述的构建体和方法的目的以引用的方式整体并入本文，所述构建体和方法可以结合本文所描述的方法、组合物和化合物一起使用。本文所讨论的出版物仅仅是为了其在本申请的提交日期之前的公开内容而提供。本文的任何内容都不应解释为认可由于先前发明或出于任何其它原因而使本文所描述的发明者无权先于此公开。
在本申请中，氨基酸名称和原子名称(例如N、O、C等)是按照由蛋白质数据库(PDB)(www.pdb.org)所定义来使用，该蛋白质数据库是基于IUPAC命名法(IUPACNomenclatureandSymbolismforAminoAcidsandPeptides(残基名称、原子名称等),Eur.J.Biochem.,138,9-37(1984)连同其在Eur.J.Biochem.,152,1(1985)中的修正。
抗原结合构建体
抗原结合构建体是指能够结合抗原的任何试剂，例如多肽或多肽复合物。抗原结合构建体可以是单体、二聚体、多聚体、蛋白质、肽或蛋白质或肽复合物；抗体或抗体片段；scFv等。
术语“双特异性”意图包括具有两种不同的结合特异性的任何试剂，例如抗原结合构建体。例如，在一些实施方案中，该试剂可以与(a)细胞表面靶分子和(b)效应细胞表面上的Fc受体结合或相互作用。在另一个实施方案中，该试剂可以与(a)第一细胞表面靶分子和(b)不同于第一细胞表面靶分子的第二细胞表面靶分子结合或相互作用。在另一个实施方案中，该试剂可以结合并桥接两种细胞，即与(a)第一细胞上的第一细胞表面靶分子和(b)不同于第一细胞表面靶分子的第二细胞上的第二细胞表面靶分子相互作用。
术语“多特异性”或“异种特异性”意图包括具有多于两种不同的结合特异性的任何试剂，例如抗原结合构建体。例如，该试剂可以与(a)细胞表面靶分子例如但不限于细胞表面抗原、(b)效应细胞表面上的Fc受体、和任选地(c)至少一种其它组分结合或相互作用。在另一个实施方案中，该试剂可以与(a)细胞表面靶分子例如但不限于细胞表面抗原、(b)效应细胞表面上的靶分子、和/或(c)其它生物相关的分子组分中的两个或更多个结合或相互作用。因此，本文所描述的抗原结合构建体的实施方案包括但不限于双特异性、三特异性、四特异性和其它多特异性分子。在某些实施方案中，这些分子定向于例如CD3抗原和/或CD19抗原、CD20抗原以及其它靶标例如效应细胞上的Fc受体。
如本文所使用，“分离的”意指已经被识别并且从其天然细胞培养环境的组分中分离和/或回收的试剂。其天然环境的污染物组分是将干扰抗原结合构建体的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。
抗体
抗原结合构建体可以是抗体。如本文所使用，“抗体”或“免疫球蛋白”是指基本上由特异性地结合和识别分析物(抗原)的一个或多个免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽。已识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。抗体或免疫球蛋白的“类别”是指其重链所具有的恒定域或恒定区的类型。有五种主要的抗体类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的若干种可以被进一步分为亚类(同种型)，例如IgGi、IgG2、IgG3、IgG4、IgAi和IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元是由两对多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N端结构域限定具有约100至110个或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链结构域。IgG1重链包括各自从N端至C端的VH、CH1、CH2和CH3结构域。轻链包括从N端至C端的VL和CL结构域。该IgG1重链包括CH1和CH2结构域之间的铰链。在某些实施方案中，免疫球蛋白构建体包含连接至治疗性多肽的来自IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的至少一个免疫球蛋白结构域。在一些实施方案中，本文所提供的抗原结合构建体中发现的免疫球蛋白结构域是来自或衍生自基于免疫球蛋白的构建体，例如双抗体或纳米抗体。在某些实施方案中，本文所描述的免疫球蛋白构建体包含来自重链抗体例如骆驼科动物抗体的至少一个免疫球蛋白结构域。在某些实施方案中，本文所提供的免疫球蛋白构建体包含来自哺乳动物抗体例如牛抗体、人抗体、骆驼科动物抗体、小鼠抗体或任何嵌合抗体的至少一个免疫球蛋白结构域。
“Fab分子”是指由免疫球蛋白的重链的VH和CH1结构域(“Fab重链”)以及轻链的VL和CL结构域(“Fab轻链”)组成的蛋白质。
术语“Fc结构域”或“Fc区”在本文中被用来定义免疫球蛋白重链的C端区域，其包含恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的Fc区的界限可以略微变动，但人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文中另外指定，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是按照Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991中所描述的EU编号系统(也称为EU指数)来进行。如本文所使用，Fc结构域的“亚基”是指形成二聚体Fc结构域的两个多肽之一，即包含免疫球蛋白重链的C端恒定区且能够稳定地自我缔合的多肽。例如，IgGFc结构域的亚基包含IgGCH2和IgGCH3恒定区。
融合的或连接的意指组分(例如Fab分子和Fc结构域亚基)直接或经由一个或多个肽接头通过肽键连接。
如本文所使用，术语“单链”是指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。在某些实施方案中，抗原结合部分之一是单链Fab分子，即其中Fab轻链和Fab重链通过肽接头连接形成单肽链的Fab分子。在一个特定的此类实施方案中，单链Fab分子中的Fab轻链的C端连接至Fab重链的N端。在某些其它实施方案中，抗原结合部分之一是单链Fv分子(scFv)。如文中更详细地描述，scFv具有轻链(VL)的可变域，其通过多肽链从其C端连接到重链(VH)的可变域的N末端。或者，该scFv由多肽链组成，其中VH的C末端通过多肽链连接至VL的N末端。
通过“交叉”Fab分子(又称为"Crossfab")意指其中Fab重链和轻链的可变区或恒定区交换的Fab分子，即，该交叉Fab分子包括由轻链可变区和重链恒定区组成的肽链，以及由重链可变区和轻链恒定区组成的肽链。为了简明起见，在其中Fab轻链和Fab重链的可变区交换的交叉Fab分子中，包含重链恒定区的肽链在文中被称为交叉Fab分子的“重链”。相反地，在其中Fab轻链和Fab重链的恒定区交换的交叉Fab分子中，包含重链可变区的肽链在文中被称为交叉Fab分子的“重链”。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变域残基。可变域的FR一般由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列一般按以下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
“促进Fc结构域的第一和第二亚基的缔合的修饰”是对肽主链的操作或Fc结构域亚基的翻译后修饰，其减少或防止包含该Fc结构域亚基的多肽与相同多肽缔合形成同二聚体。如本文所使用，促进缔合的修饰尤其包括对希望缔合的两个Fc结构域亚基(即Fc结构域的第一和第二亚基)中的每一个进行的分开的修饰，其中所述修饰促进两个Fc结构域亚基的缔合和异二聚体的形成。例如，在某些实施方案中，促进缔合的修饰可以改变Fc结构域亚基中的一个或两个的结构或电荷，以便使得它们的缔合是有利的。
术语“效应器功能”是指可归因于抗体的Fc区的那些生物学活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应器功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导型细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、由免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取、细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调和B细胞活化。
“活化Fc受体”是在被抗体的Fc结构域接合后引起刺激具有该受体的细胞执行效应器功能的信号传导事件的Fc受体。人类活化Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)和FcγRIIa(CD32)。
抗体依赖性细胞介导型细胞毒性(ADCC)是导致免疫效应细胞裂解抗体包被型靶细胞的免疫机制。靶细胞是包含Fc区的抗体或其衍生物通常经由Fc区N端的蛋白质部分特异性结合的细胞。如本文所使用，术语“减少的ADCC”的定义为在靶细胞周围介质中的给定抗体浓度下，在给定时间内，通过上文所定义的ADCC机制裂解的靶细胞数目的减少，和/或在给定时间内通过ADCC机制达到给定数目的靶细胞的裂解所需的靶细胞周围介质中的抗体浓度的增加。ADCC的减少是相对于由通过相同类型的宿主细胞，使用相同的标准产生、纯化、配制和保存方法(其为本领域技术人员已知)而产生，但尚未进行工程化的相同抗体介导的ADCC而言。例如，由在其Fc结构域中包含减少ADCC的氨基酸替代的抗体介导的ADCC减少是相对于由在Fc结构域中无此氨基酸替代的相同抗体介导的ADCC而言。
Fc
根据本发明的抗原结合构建体包括二聚体Fc。在一些方面，Fc包括至少一个或两个CH3序列。在一些方面，Fc通过或不通过一个或多个接头偶合至第一异二聚体和/或第二异二聚体。在一些方面，Fc是人类Fc。在一些方面，Fc是人类IgG或IgG1Fc。在一些方面，Fc是异二聚体Fc。在一些方面，Fc包括至少一个或两个CH2序列。
在一些方面，Fc在至少一个CH3序列中包括一个或多个修饰。在一些方面，Fc在至少一个CH2序列中包括一个或多个修饰。在一些方面，Fc是单一多肽。在一些方面，Fc是多个多肽，例如两个多肽。
在一些方面，Fc是描述于2011年11月4日提交的专利申请PCT/CA2011/001238或2012年11月2日提交的专利申请PCT/CA2012/050780中的Fc，这些申请的全部公开内容均据此出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
修饰的CH3
在一些方面，本文所描述的构建体包括含有修饰的CH3结构域的异二聚体Fc，该CH3结构域已经被不对称地修饰。该异二聚体Fc可以包含两个重链恒定域多肽：第一重链多肽和第二重链多肽，它们可以互换使用，只要Fc包含一个第一重链多肽和一个第二重链多肽。通常，第一重链多肽包含第一CH3序列且第二重链多肽包含第二CH3序列。
包含以不对称方式引入的一个或多个氨基酸修饰的两个CH3序列通常在这两个CH3序列二聚化时产生异二聚体Fc，而不是同二聚体。如本文所使用，“不对称的氨基酸修饰”是指其中在第一CH3序列上的特定位置处的氨基酸不同于在第二CH3序列上的相同位置处的氨基酸，且第一和第二CH3序列优先配对形成异二聚体而不是同二聚体的任何修饰。这种异二聚化可以通过以下方式产生：仅修饰每个序列上的相同的相应氨基酸位置处的两个氨基酸之一；或在第一和第二CH3序列中的每一个上的相同的相应位置处修饰每个序列上的氨基酸。异二聚体Fc的第一和第二CH3序列可以包括一个或多于一个不对称氨基酸修饰。
表A提供人类IgG1Fc序列的氨基酸序列，其对应于全长人类IgG1重链的氨基酸231至447。CH3序列包括全长人类IgG1重链的氨基酸341-447。
通常，Fc可以包括能够二聚化的两个连续重链序列(A和B)。在一些方面，Fc的一个或两个序列包含在以下位置处的一个或多个突变或修饰：L351、F405、Y407、T366、K392、T394、T350、S400和/或N390(使用EU编号)。在一些方面，Fc包含表X中所示的突变序列。在一些方面，Fc包含变体1A-B的突变。在一些方面，Fc包含变体2A-B的突变。在一些方面，Fc包含变体3A-B的突变。在一些方面，Fc包含变体4A-B的突变。在一些方面，Fc包含变体5A-B的突变。
表A：IgG1Fc序列
第一和第二CH3序列可以包含如本文所描述的氨基酸突变，参照全长人类IgG1重链的氨基酸231至447。在一个实施方案中，异二聚体Fc包含修饰的CH3结构域，其中第一CH3序列具有在位置F405和Y407处的氨基酸修饰，且第二CH3序列具有在位置T394处的氨基酸修饰。在一个实施方案中，异二聚体Fc包含修饰的CH3结构域，其中第一CH3序列具有选自L351Y、F405A和Y407V的一个或多个氨基酸修饰，且第二CH3序列具有选自T366L、T366I、K392L、K392M和T394W的一个或多个氨基酸修饰。
在一个实施方案中，异二聚体Fc包含修饰的CH3结构域，其中第一CH3序列具有在位置L351、F405和Y407处的氨基酸修饰，且第二CH3序列具有在位置T366、K392和T394处的氨基酸修饰，且第一或第二CH3序列之一还包含在位置Q347处的氨基酸修饰，而另一个CH3序列还包含在位置K360处的氨基酸修饰。在另一个实施方案中，异二聚体Fc包含修饰的CH3结构域，其中第一CH3序列具有在位置L351、F405和Y407处的氨基酸修饰，且第二CH3序列具有在位置T366、K392和T394处的氨基酸修饰，第一或第二CH3序列之一还包含在位置Q347处的氨基酸修饰，而另一个CH3序列还包含在位置K360处的氨基酸修饰，且所述CH3序列中的一者或两者还包含氨基酸修饰T350V。
在一个实施方案中，异二聚体Fc包含修饰的CH3结构域，其中第一CH3序列具有在位置L351、F405和Y407处的氨基酸修饰，且第二CH3序列具有在位置T366、K392和T394处的氨基酸修饰，且所述第一和第二CH3序列之一还包含氨基酸修饰D399R或D399K，而另一个CH3序列包含T411E、T411D、K409E、K409D、K392E和K392D中的一个或多个。在另一个实施方案中，异二聚体Fc包含修饰的CH3结构域，其中第一CH3序列具有在位置L351、F405和Y407处的氨基酸修饰，且第二CH3序列具有在位置T366、K392和T394处的氨基酸修饰，所述第一和第二CH3序列之一还包含氨基酸修饰D399R或D399K，且另一个CH3序列包含T411E、T411D、K409E、K409D、K392E和K392D中的一个或多个，且所述CH3序列中的一者或两者还包含氨基酸修饰T350V。
在一个实施方案中，异二聚体Fc包含修饰的CH3结构域，其中第一CH3序列具有在位置L351、F405和Y407处的氨基酸修饰，且第二CH3序列具有在位置T366、K392和T394处的氨基酸修饰，其中所述CH3序列中的一者或两者还包含氨基酸修饰T350V。
在一个实施方案中，异二聚体Fc包含含有以下氨基酸修饰的修饰的CH3结构域，其中“A”表示对第一CH3序列的氨基酸修饰，且“B”表示对第二CH3序列的氨基酸修饰：A:L351Y_F405A_Y407V、B:T366L_K392M_T394W、A:L351Y_F405A_Y407V、B:T366L_K392L_T394W、A:T350V_L351Y_F405A_Y407V、B:T350V_T366L_K392L_T394W、A:T350V_L351Y_F405A_Y407V、B:T350V_T366L_K392M_T394W、A:T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V和/或B:T350V_T366L_N390R_K392M_T394W。
一个或多个不对称氨基酸修饰可以促进异二聚体Fc的形成，其中异二聚体CH3结构域具有与野生型同二聚体CH3结构域相当的稳定性。在一个实施方案中，一个或多个不对称氨基酸修饰促进异二聚体Fc结构域的形成，其中该异二聚体Fc结构域具有与野生型同二聚体Fc结构域相当的稳定性。在一个实施方案中，一个或多个不对称氨基酸修饰促进异二聚体Fc结构域的形成，其中该异二聚体Fc结构域具有经由差示扫描量热法研究中的熔融温度(Tm)观察到的稳定性，且其中该熔融温度与针对相应的对称性野生型同二聚体Fc结构域观察到的熔融温度相差不超过4℃。在一些方面，Fc在至少一个CH3序列中包含一个或多个修饰，其促进形成具有与野生型同二聚体Fc相当的稳定性的异二聚体Fc。
在一个实施方案中，可以通过测量CH3结构域的熔融温度(例如通过差示扫描量热法(DSC))来评估该CH3结构域的稳定性。因此，在另一个实施方案中，CH3结构域具有约68℃或更高的熔融温度。在另一个实施方案中，CH3结构域具有约70℃或更高的熔融温度。在另一个实施方案中，CH3结构域具有约72℃或更高的熔融温度。在另一个实施方案中，CH3结构域具有约73℃或更高的熔融温度。在另一个实施方案中，CH3结构域具有约75℃或更高的熔融温度。在另一个实施方案中，CH3结构域具有约78℃或更高的熔融温度。在一些方面，二聚化CH3序列具有约68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、77.5、78、79、80、81、82、83、84或85℃或更高的熔融温度(Tm)。
在一些实施方案中，可以形成相比于表达产物中的同二聚体Fc具有至少约75％的纯度的含有修饰的CH3序列的异二聚体Fc。在另一个实施方案中，所形成的异二聚体Fc具有大于约80％的纯度。在另一个实施方案中，所形成的异二聚体Fc具有大于约85％的纯度。在另一个实施方案中，所形成的异二聚体Fc具有大于约90％的纯度。在另一个实施方案中，所形成的异二聚体Fc具有大于约95％的纯度。在另一个实施方案中，所形成的异二聚体Fc具有大于约97％的纯度。在一些方面，Fc是在表达时以大于约75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的纯度形成的异二聚体。在一些方面，Fc是在经由单细胞表达时以大于约75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的纯度形成的异二聚体。
修饰单体Fc多肽以促进异二聚体Fc形成的其它方法描述在国际专利公布第WO96/027011号(旋钮入孔(knobsintoholes))；Gunasekaran等(GunasekaranK.等(2010)JBiolChem.285,19637-46,electrostaticdesigntoachieveselectiveheterodimerization)；Davis等(Davis,JH.等(2010)ProtEngDesSel；23(4):195-202,strandexchangeengineereddomain(SEED)technology)；和Labrijn等[EfficientgenerationofstablebispecificIgG1bycontrolledFab-armexchange.LabrijnAF、MeestersJI、deGoeijBE,vandenBremerET、NeijssenJ、vanKampenMD、StrumaneK、VerploegenS、KunduA、GramerMJ、vanBerkelPH、vandeWinkelJG、SchuurmanJ、ParrenPW.ProcNatlAcadSciUSA.2013年3月26日；110(13):5145-50。
在一些实施方案中，本文所描述的分离的构建体包括结合抗原的抗体构建体；和二聚体Fc多肽构建体，其相对于不包含相同Fc多肽的抗体构建体具有优越的生物物理性质，例如稳定性和易制造性。Fc的重链序列中的许多突变在本领域中是已知用于选择性改变抗体Fc对不同的Fcγ受体的亲和力。在一些方面，Fc包含一个或多个修饰以促进Fc-γ受体的选择性结合。
CH2结构域
Fc的CH2结构域是示于表a中的序列的氨基酸231-340。示例性突变如下所列出：
·S298A/E333A/K334A、S298A/E333A/K334A/K326A(LuY、VernesJM、ChiangN等JImmunolMethods.2011年2月28日；365(1-2):132-41)；
·F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L、F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L(StavenhagenJB、GorlatovS、TuaillonN等CancerRes.2007年9月15日；67(18):8882-90；NordstromJL、GorlatovS、ZhangW等BreastCancerRes.2011年11月30日；13(6):R123)；
·F243L(StewartR、ThomG、LevensM等ProteinEngDesSel.2011年9月；24(9):671-8.)、S298A/E333A/K334A(ShieldsRL,NamenukAK,HongK,等JBiolChem.2001年3月2日；276(9):6591-604)；
·S239D/I332E/A330L、S239D/I332E(LazarGA、DangW、KarkiS等ProcNatlAcadSciUSA.2006年3月14日；103(11):4005-10)；
·S239D/S267E、S267E/L328F(ChuSY、VostiarI、KarkiS等MolImmunol.2008年9月；45(15):3926-33)；
·S239D/D265S/S298A/I332E、S239E/S298A/K326A/A327H、G237F/S298A/A330L/I332E、S239D/I332E/S298A、S239D/K326E/A330L/I332E/S298A、G236A/S239D/D270L/I332E、S239E/S267E/H268D、L234F/S267E/N325L、G237F/V266L/S267D以及列于WO2011/120134和WO2011/120135(以引用方式并入本文)中的其它突变。TherapeuticAntibodyEngineering(WilliamR.Strohl和LilaM.Strohl,WoodheadPublishingseriesBiomedicine第11期,ISBN1907568379,2012年10月)在第283页上列举了突变。
在一些实施方案中，CH2结构域包含一个或多个不对称的氨基酸修饰。在一些实施方案中，CH2结构域包含一个或多个不对称的氨基酸修饰以促进FcγR的选择性结合。在一些实施方案中，CH2结构域允许分离和纯化本文所描述的分离的构建体。
改善效应器功能的其它修饰。
在一些实施方案中，可以修饰本文所描述的构建体以改善其效应器功能。此类修饰在本领域中是已知的且包括无岩藻糖基化(afucosylation)，或抗体Fc部分对活化受体(主要为FCGR3a(针对ADCC)和对C1q(针对CDC))的亲和力的工程化。下表B中汇总了文献中报道的用于效应器功能工程化的多种设计。
因此，在一个实施方案中，本文所描述的构建体可以包括二聚体Fc，其包含表B中所述及的赋予改善的效应器功能的一个或多个氨基酸修饰。在另一个实施方案中，可以使该构建体无岩藻糖基化以改善效应器功能。
表B：CH2和效应器功能工程化。
FcRn结合和PK参数
如本领域中已知，结合至FcRn使内吞抗体从核内体再循环回到血流中(Raghavan等，1996,AnnuRevCellDevBiol12:181-220；Ghetie等，2000,AnnuRevImmunol18:739-766)。这个过程与由于全长分子的大尺寸而阻止肾过滤结合起来产生从1周至3周的有利的抗体血清半衰期。Fc结合至FcRn还在抗体运输中起关键作用。因此，在一个实施方案中，本发明的构建体能够结合FcRn。
减少FcγR和/或补体结合和/或效应器功能的Fc修饰是本领域中已知的。最近的出版物描述了已经被用来设计具有降低的或沉默的效应器活性的抗体的策略(参见Strohl,WR(2009),CurrOpinBiotech20:685-691，及Strohl,WR和StrohlLM,“AntibodyFcengineeringforoptimalantibodyperformance”，TherapeuticAntibodyEngineering,Cambridge:WoodheadPublishing(2012)，第225-249页)。这些策略包括通过糖基化修饰、使用IgG2/IgG4骨架或在抗体Fc区的铰链区或CH2区引入突变来减少效应器功能。例如，美国专利公布号2011/0212087(Strohl)、国际专利公布号WO2006/105338(Xencor)、美国专利公布号2012/0225058(Xencor)、美国专利公布号2012/0251531(Genentech)和Strop等((2012)J.Mol.Biol.420:204-219)描述了特异性修饰以减少FcγR或补体与Fc的结合。
已知的氨基酸修饰的特定非限制性实例包括在下表中确定的那些修饰。
表C：减少FcγR或补体结合至Fc的修饰
公司 突变
GSK N297A
Ortho Biotech L234A/L235A
Protein Design labs IGG2 V234A/G237A
Wellcome Labs IGG4 L235A/G237A/E318A
GSK IGG4 S228P/L236E
Alexion IGG2/IGG4联合体
Merck IGG2 H268Q/V309L/A330S/A331S
Bristol-Myers C220S/C226S/C229S/P238S
Seattlc Genetics C226S/C229S/E3233P/L235V/L235A
Amgen 大肠杆菌产生，非糖基化
Medimune L234F/L235E/P331S
Trubion 铰链突变，可能为C226S/P230S
在一个实施方案中，Fc包含在上表中确定的至少一个氨基酸修饰。在另一个实施方案中，Fc包含L234、L235或D265中的至少一个的氨基酸修饰。在另一个实施方案中，Fc包含位于L234、L235和D265处的氨基酸修饰。在另一个实施方案中，Fc包含氨基酸修饰L234A、L235A和D265S。
接头
本文所描述的构建体可以包括本文所描述的一个或多个异二聚体，其可操作性地偶合至本文所描述的Fc。在一些方面，Fc利用或不利用一个或多个接头偶合至一个或多个异二聚体。在一些方面，Fc直接偶合至一个或多个异二聚体。在一些方面，Fc经由一个或多个接头偶合至一个或多个异二聚体。在一些方面，Fc经由接头偶合至每个异二聚体的重链。
在一些方面，一个或多个接头是一个或多个多肽接头。在一些方面，一个或多个接头包含一个或多个IgG1铰链区。
形式scFv
本文所描述的抗原结合构建体为双特异性，例如，它们包含至少两个抗原结合多肽构建体，其中每个能够特异性结合至两个不同的抗原。一个抗原结合多肽构建体呈scFv形式(即抗原结合域由重链可变域和轻链可变域组成)。在一个实施方案中，所述scFv分子为人类分子。在另一个实施方案中，所述scFv分子为人源化。
在scFv分子中，轻链可变区的C端可以连接至重链可变区的N端，或重链可变区的C端可以连接至轻链可变区的N端。
可变区可以直接或通常经由允许形成功能性抗原结合部分的连接肽而连接。典型的肽接头包含约2-20个氨基酸，且描述于本文中或为本领域中已知。适宜的非免疫原性连接肽包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n、G4(SG4)n或G2(SG2)n连接肽，其中n一般为1与10之间，通常2与4之间的数字。
scFv分子可以通过重链和轻链可变域之间的二硫键桥接进一步稳定化，例如如Reiter等(NatBiotechnol14,1239-1245(1996))中所述。因此，在一个实施方案中，本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子包含scFv分子，其中重链可变域中的氨基酸和轻链可变域中的氨基酸已经被半胱氨酸替换，以使得可以在重链和轻链可变域之间形成二硫键桥接。在一个特定实施方案中，轻链可变域的位置44处的氨基酸和重链可变域的位置100处的氨基酸已经被半胱氨酸替换(Kabat编号)。
如本领域中已知，scFv还可以通过CDR序列的突变而稳定化，如[Miller等，ProteinEngDesSel.2010年7月；23(7):549-57；Igawa等，MAbs.2011年5月-6月；3(3):243-5；Perchiacca和Tessier，AnnuRevChemBiomolEng.2012；3:263-86.]中所描述。
HVR和CDR
本文所使用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变域的在序列上高变和/或形成结构上受限定的环(“高变环”)的区域中的每一个。通常，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列变异性和/或涉及抗原识别。除VH中的CDR1之外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)还被称为“互补决定区”(CDR)，且这些术语在本文中可互换使用，指可变区的形成抗原结合区的部分。Kabat等，U.S.Dept.ofHealthandHumanServices,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(1983)和Chothia等，JMolBiol196:901-917(1987)已经描述了这个特定区域，其中定义包括相互比较时氨基酸残基的重叠或亚群。但是，应用任一定义来指抗体或其变体的CDR旨在处于如本文所定义和使用的术语的范围内。涵盖如上文引用的参考文献中的每一篇所定义的CDR的适当氨基酸残基被列于下文的表1中作为比较。涵盖具体CDR的精确残基数量将根据CDR的序列和大小而变化。考虑到抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以按常规方式确定哪些残基包含具体的CDR。
抗原
所述抗原结合构建体特异性地结合至少一个抗原，例如CD3抗原和/或CD19抗原。如本文所使用，术语"抗原决定簇"与"抗原"和"表位"同义，并且是指多肽大分子上与抗原结合部分结合，从而形成抗原结合部分-抗原复合物的位点(例如连续延伸的氨基酸或由不同的非连续氨基酸区域构成的构象性构造)。实例包括CD3抗原、CD19抗原和CD20抗原。
可用的抗原决定簇可以见于例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其它患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、游离在血液血清中和/或在细胞外基质(ECM)中。除非另外说明，否则本文中被称为抗原(例如，CD3、CD19和C20)的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的任何天然形式的蛋白质，脊椎动物来源包括哺乳动物，例如灵长类动物(例如，人类)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在一个特定实施方案中，抗原是人类蛋白质。如果在本文中提及特定蛋白质，则该术语包括“全长”未加工的蛋白质以及通过在细胞中处理所得到的任何形式的蛋白质。该术语还包括蛋白质的天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。其它可用作抗原的人类蛋白质包括但不限于：黑色素瘤相关的硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)，又名硫酸软骨素蛋白多糖4(UniProt编号Q6UVK1(版本70),NCBIRefSeq编号NP001888.2)；成纤维细胞活化蛋白(FAP)，又名Seprase(UniProt编号Q12884、Q86Z29、Q99998，NCBI登录号NP004451)；癌胚抗原(CEA)，又名癌胚抗原相关的细胞粘附分子5(UniProt编号P06731(版本119)，NCBIRefSeq编号NP004354.2)；CD33，又名gp67或Siglec-3(UniProt编号P20138，NCBI登录号NP001076087、NP001171079)；表皮生长因子受体(EGFR)，又名ErbB-1或Her1(UniProt编号P0053，NCBI登录号NP958439、NP958440)；以及CD3，特别是CD3的ε亚基(参见UniProt编号P07766(版本130)、NCBIRefSeq编号NP000724.1，针对人类序列；或UniProt编号Q95LI5(版本49),NCBIGenBank编号BAB71849.1，针对食蟹猴[Macacafascicularis]序列)。
在某些实施方案中，本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子结合至活化T细胞抗原或靶细胞抗原的表位，该表位在来自不同物种的活化T细胞抗原或靶抗原中间是保守的。
“特异性结合”或“选择性结合”意指结合对于抗原有选择性，并且可以与不想要的或非特异性的相互作用区别开来。抗原结合部分结合特定抗原决定簇的能力可以经由酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术，例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等，GlycoJ17,323-329(2000))和传统的结合测定(Heeley，EndocrRes28,217-229(2002))来测量。在一个实施方案中，抗原结合部分对无关蛋白质的结合程度小于该抗原结合部分对抗原的结合的约10％，如通过例如SPR所测量。在某些实施方案中，结合至抗原的抗原结合部分或包含抗原结合部分的抗原结合分子具有<1μM、<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM或<0.001nM(例如10～8M或更少，例如10～8M至10"13M，例如10"9M至10"13M)的解离常数(KD)。
"亲和力"是指分子(例如受体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如配体)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另外指示，否则如本文所使用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如抗原结合部分和抗原，或受体和其配体)之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示，解离常数为解离与结合速率常数(分别为kOff和kon)的比率。因此，相等的亲和力可以包含不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可以通过本领域已知的确立方法来测量，包括本文所描述的那些方法。用于测量亲和力的一种具体方法是表面等离子体共振(SPR)。
“降低的结合”(例如降低的对Fc受体的结合)是指针对相应相互作用的亲和力降低，如例如通过SPR所测量。为了清楚起见，该术语还包括亲和力降低至零(或低于分析方法的检测极限)，即完全消除相互作用。相反地，"增加的结合"是指针对相应相互作用的结合亲和力的升高。
如本文所使用，"活化T细胞抗原"是指在T淋巴细胞特别是细胞毒性T淋巴细胞的表面上表达的抗原决定簇，其能够在与抗原结合分子相互作用后诱导T细胞活化。明确地说，抗原结合分子与活化T细胞抗原的相互作用可以通过触发T细胞受体复合物的信号传导级联来诱导T细胞活化。在一个具体实施方案中，活化T细胞抗原为CD3。
如本文所使用，"T细胞活化"是指T淋巴细胞特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞反应，其选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标记物的表达。本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子能够诱导T细胞活化。适用于测量T细胞活化的测定在本文所描述的领域中是已知的。
如本文所使用，"靶细胞抗原"是指呈现在靶细胞表面上的抗原决定簇，该靶细胞是例如肿瘤中的B细胞诸如癌细胞或肿瘤基质的细胞。如本文所使用，就抗原结合部分等而言的术语"第一"和"第二"是为了在有超过一个每种类型的部分时便于区分而使用。除非明确如此陈述，否则这些术语的使用不意图赋予T细胞活化双特异性抗原结合分子的特定次序或取向。
如本文所使用，术语“跨物种结合”或“种间结合”意指本文所描述的结合域与人类和其它生物体(例如但不限于非黑猩猩灵长类动物)中的相同靶分子结合。因此，“跨物种结合”或“种间结合”应被理解为对表达于不同物种中的相同分子“X”(即同源物)，但不对非“X”的分子的种间反应性。识别例如人类CD3ε的单克隆抗体对非黑猩猩灵长类动物CD3ε例如猕猴CD3ε的跨物种特异性可以例如通过FACS分析来测定。进行FACS分析的方式为测试相应的单克隆抗体与分别表达所述人类和非黑猩猩灵长类动物CD3ε抗原的人类和非黑猩猩灵长类动物细胞(例如猕猴细胞)的结合。其它测定是本领域技术人员所熟知的。上述主题加以必要的修改适用于PSCA、CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白(Endosialin)、EpCAM、IGF-1R和FAPα抗原：识别例如人类PSCA、CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα的单克隆抗体对非黑猩猩灵长类动物PSCA、CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα(例如，猕猴PSCA、CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα)的跨物种特异性可以例如通过FACS分析来测定。进行FACS分析的方式为测试相应的单克隆抗体与分别表达所述人类和非黑猩猩灵长类动物PSCA、CD19、C-MET、内皮唾液酸蛋白、EpCAM、IGF-1R或FAPα抗原的人类和非黑猩猩灵长类动物细胞(例如猕猴细胞)的结合。
CD3、CD19和CD20
本发明的抗原结合构建体包括抗原结合多肽构建体，其单价地和特异性地结合CD3抗原和/或CD19抗原和/或CD20抗原。
如本文所描述的“CD3”或“CD3复合物”是成熟T淋巴细胞中的至少五个膜结合多肽的复合物，所述多肽相互并与T细胞受体非共价缔合。CD3复合物包括γ、δ、ε、ζ和η链(又称为亚基)。已经针对这些链中的一些开发了非人类单克隆抗体，例如鼠科动物抗体OKT3、SP34、UCHT1或64.1所例示(参见例如June等，J.Immunol.136:3945-3952(1986)；Yang等，J.Immunol.137:1097-1100(1986)和Hayward等，Immunol.64:87-92(1988))。CD3聚簇在T细胞上(例如通过固定化的抗CD3抗体)导致T细胞活化，这类似于T细胞受体的接合，但与其典型克隆特异性无关。大多数抗CD3抗体识别CD3ε链。
在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体包含单价地和特异性地结合CD3抗原的CD3抗原结合多肽，其衍生自：OKT3(ORTHOCLONE-OKT3TM(莫罗单抗(muromonab)-CD3)；TeplizumabTM(MGA031,EliLilly)；物种交叉反应性抗CD3(Micromet,US2011/0275787)；blinatumomabTM；UCHT1(Pollard等1987JHistochemCytochem.35(11):1329-38)；NI0401(WO2007/033230)；维西珠单抗(visilizumab)(US25834597)。在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体包含单价地和特异性地结合CD3抗原的CD3抗原结合多肽，所述CD3抗原结合多肽的VH和VL区衍生自选自由以下组成的组的CD3特异性抗体：X35-3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、WT31、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2和F101.01。
根据本发明，所述VH和VL区衍生自能够在其它TCR亚基的背景下特异性识别人类CD3ε的抗体/抗体衍生物等。
提供待用于包含在本发明药物组合物中的双特异性抗原结合构建体中的可变区(VH和VL)的针对人类CD19的抗体/抗体分子/抗体衍生物也是本领域中所熟知的。在一个实施方案中，结合CD19的抗原结合多肽衍生自针对人类CD19的抗体，如例如：4G7(Meecker(1984)Hybridoma3,305-20)；B4(Freedman(1987)Blood70,418-27；B43(Bejcek(1995)CancerRes.55,2346-51)；BU12(Callard等，J.Immunology,148(10):2983-7(1992)，Flavell(1995)Br.J.Cancer72,1373-9)；CLB-CD19(DeRie(1989)Cell.Immunol.118,368-81)；Leu-12(MacKenzie(1987),J.Immunol.139,24-8)；SJ25-C1(GenTrak,PlymouthMeeting,Pa.)、J4.119(BeckmanCoulter,Krefeld,Germany)、B43(PharMingen,SanDiego,Calif.)、SJ25C1(BDPharMingen,SanDiego,Calif.)、FMC63(IgG2a)(Zola等，Immunol.Cell.Biol.69(PT6):411-22(1991)；Nicholson等，Mol.Immunol.,34:1157-1165(1997)；Pietersz等，CancerImmunol.Immunotherapy,41:53-60(1995))和/或HD237(IgG2b)(FourthInternationalWorkshoponHumanLeukocyteDifferentiationAntigens,Vienna,Austria,1989；和Pezzutto等，J.Immunol.,138(9):2793-2799(1987))。CD19抗原结合多肽还可以衍生自诸如Mor-208、MEDI-551、MDX-1342的抗体，或如Hammer(2012)Mabs4:5,571-577中所述的其它抗CD19抗体。在另一个实施方案中，所述VH(CD19)和VL(CD19)区(或其部分如CDR)衍生自由HD37杂交瘤提供的抗体(Pezzutto(1997),J.Immunol.138,2793-9)。
CD20是在成熟B细胞的细胞膜上表达的非糖基化磷蛋白。CD20被认为是B细胞肿瘤相关抗原，因为其由超过95％的B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)和其它B细胞恶性肿瘤表达，但它不存在于前体B细胞、树突细胞和浆细胞上。据信，抗CD20抗体通过补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导型细胞毒性(ADCC)和/或细胞凋亡诱导和对化疗的敏化作用来杀死表达CD20的肿瘤细胞。双特异性抗原结合构建体可以衍生自抗CD20抗体利妥昔单抗(rituximab)、奥法木单抗(ofatumumab)或托西莫单抗(tositumumab)。利妥昔单抗抗体是针对CD20的基因工程嵌合鼠科动物/人类单克隆抗体。利妥昔单抗是在美国专利号5,736,137(Anderson等)中称作“C2B8”的抗体。CD20抗原结合多肽还可以衍生自如Lim等，Haematologica2010；95(1):135–143中所描述的其它抗CD20抗体。
某些CD抗原的表达高度局限于淋巴造血细胞的特定谱系，且在过去的几年中，针对淋巴特异性抗原的抗体已被用来开发在体外或在动物模型中有效的治疗。就此而言，CD19已经证明是极为有用的靶标。CD19在从祖B细胞至成熟B细胞的全部B谱系中表达，它不是散布的，在所有淋巴瘤细胞上一致地表达，并且不存在于干细胞中。
CD3复合物结合多肽构建体：
在本文所提供的抗原结合构建体的某些实施方案中，所述抗原结合构建体包括至少一个CD3结合多肽构建体，其结合至位于至少一个CD3表达细胞上的CD3复合物。在一些实施方案中，至少一个CD3结合多肽构建体包含至少一个来自以下的CD3结合域：CD3特异性抗体、纳米抗体、纤连蛋白、亲和体、抗运载蛋白(anticalin)、半胱氨酸结蛋白、DARPin、高亲和性多聚体(avimer)、Kunitz结构域或其变体或衍生物。在一些实施方案中，至少一个CD3结合域包含至少一个氨基酸修饰，其相比于不包含所述修饰的相应CD3结合域降低免疫原性。在一个实施方案中，至少一个CD3结合域包含至少一个氨基酸修饰，其相比于不包含所述修饰的相应CD3结合域增加如通过Tm所测量的稳定性。在一些实施方案中，与不包含所述至少一个修饰的天然CD3结合域相比，Tm增加约3度。在一些实施方案中，与不包含所述至少一个修饰的天然CD3结合域相比，Tm增加约5度。在一些实施方案中，与不包含所述至少一个修饰的天然CD3结合域相比，Tm增加约8度。在一些实施方案中，与不包含所述至少一个修饰的天然CD3结合域相比，Tm增加约10度。
在一些实施方案中，本文所描述的至少一个CD3结合多肽构建体包含至少一个来自CD3特异性抗体的CD3结合域，其中所述CD3特异性抗体是不含轻链的重链抗体。
在某些其它实施方案中，本文所描述的至少一个CD3结合多肽构建体包含至少一个衍生自非抗体蛋白骨架结构域的CD3结合域。
在某些实施方案中，CD3结合多肽构建体是CD3结合Fab构建体(即，包含重链和轻链的抗原结合构建体，每条链包含可变区和恒定区)。在一些实施方案中，所述Fab构建体是哺乳动物构建体。在一实施方案中，所述Fab构建体是人类构建体。在另一个实施方案中，所述Fab构建体是人源化的。在又一个实施方案中，所述Fab构建体包含人类重链和轻链恒定区中的至少一个。在另一个实施方案中，所述Fab构建体为单链Fab(scFab)。
在某些实施方案中，CD3结合多肽构建体包含CD3结合scFab构建体，其中Fab轻链的C端经由肽接头连接至Fab重链的N端。肽接头允许排列Fab重链和轻链以形成功能性CD3结合部分。在某些实施方案中，适于连接Fab重链和轻链的肽接头包括包含甘氨酸-丝氨酸接头的序列，例如但不限于(GmS)n-GG(SEQIDNO:360)、(SGn)m(SEQIDNO:361)、(SEGn)m(SEQIDNO:362)，其中m和n在0-20之间。在某些实施方案中，scFab构建体是交叉构建体，其中Fab轻链和Fab重链的恒定区互换。在交叉Fab的另一个实施方案中，Fab轻链和Fab重链的可变区互换。
在某些实施方案中，CD3结合多肽构建体包括CD3结合Fv构建体(即，包含重链和轻链的抗原结合构建体，每条链包含可变区)。在一些实施方案中，所述Fv构建体是哺乳动物构建体。在一个实施方案中，所述Fv构建体是人类构建体。在另一个实施方案中，所述Fv构建体是人源化的。在又一个实施方案中，所述Fv构建体包含人类重链和轻链可变区中的至少一个。在另一个实施方案中，所述Fv构建体是单链Fv(scFv)。
在某些实施方案中，本文所描述的抗原结合构建体的CD3结合多肽构建体结合至CD3复合物的至少一种组分。在一个特定实施方案中，CD3结合多肽构建体结合至CD3复合物的CD3ε、CD3γ、CD3δ或CD3ζ中的至少一个。在某些实施方案中，CD3结合多肽构建体结合CD3ε结构域。在某些实施方案中，结合多肽构建体结合人类CD3复合物。在某些实施方案中，CD3结合多肽构建体展现与CD3复合物的至少一个成员的跨物种结合。
本文提供了抗原结合构建体，其包含至少一个CD3结合多肽构建体，该多肽构建体结合位于至少一个CD3表达细胞上的CD3复合物，其中该CD3表达细胞是T细胞。在某些实施方案中，该CD3表达细胞是人类细胞。在一些实施方案中，该CD3表达细胞是非人类哺乳动物细胞。在一些实施方案中，T细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+或CD8+T细胞。
在本文提供的抗原结合构建体的某些实施方案中，所述构建体能够活化T细胞的细胞毒性活性并将其重新定向至靶细胞如B细胞。在一个具体实施方案中，所述重新定向与靶细胞的由MHC介导的肽抗原呈递和和/或T细胞的特异性无关。
本文提供了能够同时结合B细胞抗原(例如肿瘤细胞抗原)和活化T细胞抗原的抗原结合构建体。在一个实施方案中，抗原结合构建体能够通过同时结合B细胞抗原例如CD19或CD20和活化T细胞抗原例如CD3使T细胞和靶B细胞交联。在一个实施方案中，同时结合导致靶B细胞例如肿瘤细胞的裂解。在一个实施方案中，此类同时结合导致T细胞的活化。在其它实施方案中，此类同时结合导致T淋巴细胞例如细胞毒性T淋巴细胞的细胞反应，该细胞反应选自以下的组：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标记物的表达。在一个实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子与活化T细胞抗原结合而不同时结合靶细胞抗原不会导致T细胞活化。
CD19和/或CD20B细胞结合多肽构建体：
本文提供了分离的抗原结合构建体，其包含至少一个抗原结合多肽构建体，该多肽构建体结合至位于至少一个B细胞上的靶抗原。在某些实施方案中，抗原结合多肽构建体结合B细胞CD21-CD19-CD81复合物的至少一个成员。在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含至少一个CD19结合域或其片段。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体包含至少一个CD20结合域。
在一些实施方案中，至少一个抗原结合域是CD19或CD20结合域，其获自CD19或CD20特异性抗体、纳米抗体、纤连蛋白、亲和体、抗运载蛋白、半胱氨酸结蛋白、DARPin、高亲和性多聚体、Kunitz结构域或其变体或衍生物。在一些实施方案中，本文所描述的至少一个抗原结合多肽构建体包含至少一个抗原结合域，该结合域为来自抗体的CD19或CD20结合域，该抗体是不含轻链的重链抗体。
在一些实施方案中，至少一个抗原结合域为包含至少一个氨基酸修饰的CD19或CD20结合域，该修饰相比于不包含所述修饰的相应抗原结合域降低免疫原性。在一个实施方案中，至少一个抗原结合域为包含至少一个氨基酸修饰的CD19或CD20结合域，该修饰相比于不包含所述修饰的相应结构域增加如通过Tm所测量的稳定性。
在某些实施方案中，至少一个抗原结合多肽构建体是Fab构建体，其结合B细胞上的CD19和CD20中的至少一个。在一些实施方案中，所述Fab构建体是哺乳动物构建体。在一实施方案中，所述Fab构建体是人类构建体。在另一个实施方案中，所述Fab构建体是人源化的。在又一个实施方案中，所述Fab构建体包含人类重链和轻链恒定区中的至少一个。在另一个实施方案中，所述Fab构建体为单链Fab(scFab)。
在某些实施方案中，CD19和/或CD20结合多肽构建体包含scFab构建体，其中Fab轻链的C端经由肽接头连接至Fab重链的N端。该肽接头允许排列Fab重链和轻链以形成功能性CD19和/或CD20结合部分。在某些实施方案中，适于连接Fab重链和轻链的肽接头包括包含甘氨酸-丝氨酸接头的序列，例如但不限于(GmS)n-GG(SEQIDNO:363)、(SGn)m (SEQIDNO: 364)、(SEGn)m (SEQIDNO:365)，其中m和n在0-20之间。在某些实施方案中，scFab构建体是交叉构建体，其中Fab轻链和Fab重链的恒定区互换。在交叉Fab的另一个实施方案中，Fab轻链和Fab重链的可变区互换。
在某些实施方案中，至少一个抗原结合多肽构建体是Fv构建体，其结合B细胞上的CD19和CD20中的至少一个。在一些实施方案中，所述Fv构建体是哺乳动物构建体。在一个实施方案中，所述Fv构建体是人类构建体。在另一个实施方案中，所述Fv构建体是人源化的。在又一个实施方案中，所述Fv构建体包含人类重链和轻链可变区中的至少一个。在另一个实施方案中，所述Fv构建体是单链Fv(scFv)。
在某些实施方案中，抗原结合多肽构建体展现与在B细胞表面上表达的至少一种抗原的跨物种结合。在一些实施方案中，本文所描述的抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体结合至哺乳动物CD19和CD20中的至少一个。在某些实施方案中，结合多肽构建体与人类CD19或CD20结合。
本文提供了能够同时结合B细胞抗原(例如肿瘤细胞抗原)和活化T细胞抗原的构建体。在一个实施方案中，抗原结合构建体能够通过同时结合B细胞抗原例如CD19或CD20和活化T细胞抗原例如CD3使T细胞和靶B细胞交联。
在某些实施方案中，本文所描述的抗原结合构建体包含至少一个抗原结合多肽构建体，其结合至与疾病相关的至少一种B细胞上的靶抗原例如CD19或CD20。在一些实施方案中，疾病是选自癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤和神经胶质瘤的癌症。在一个实施方案中，癌症是鳞状细胞癌、腺癌、移行细胞癌、骨肉瘤和软组织肉瘤中的至少一种。在某些实施方案中，至少一种B细胞是自身免疫反应性细胞，即淋巴细胞或骨髓细胞。
其它抗原结合构建体：
在某些实施方案中，本文所描述的抗原结合构建体还包含至少一个结合域，其结合下列中的至少一个：GPA133、EpCAM、EGFR、IGFR、HER-2neu、HER-3、HER-4、PSMA、CEA、MUC-1(粘蛋白)、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUC7、CCR4、CCR5、CD19、CD20、CD33、CD30、神经节苷脂GD3、9-O-乙酰基-GD3、GM2、PolySA、GD2、碳酸酐酶IX(MN/CAIX)、CD44v6、音猬因子(Shh)、Wue-1、浆细胞抗原(膜结合)、黑色素瘤硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)、CCR8、TNF-α前体、STEAP、间皮素、A33抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、Ly-6；桥粒芯蛋白4、E-钙粘蛋白新表位、胎儿乙酰胆碱受体、CD25、CA19-9标记物、CA-125标记物和缪勒氏(Muellerian)抑制物质(MIS)受体类型II、sTn(唾液酸化Tn抗原；TAG-72)、FAP(成纤维细胞活化抗原)、内皮唾液酸蛋白、LG、SAS、EPHA4CD63、CD3BsAb免疫细胞因子TNF(包含连接至细胞因子的CD3抗体)、IFN·、IL-2和TRAIL。
多肽和多核苷酸
抗原结合构建体包含至少一种多肽。术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"在本文中可以互换使用来指氨基酸残基的聚合物。也就是说，针对多肽的描述同样适用于对肽的描述和对蛋白质的描述，并且反之亦然。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物，以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然编码的氨基酸的氨基酸聚合物。如本文所使用，所述术语涵盖包括全长蛋白质在内的任何长度的氨基酸链，其中氨基酸残基通过共价肽键相连接。
术语"氨基酸"是指天然存在的和非天然存在的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基团结合的碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经过修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经过修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。提及氨基酸包括例如天然存在的蛋白源性(proteogenic)L-氨基酸；D-氨基酸；化学修饰的氨基酸，例如氨基酸变体和衍生物；天然存在的非蛋白源性氨基酸，例如β-丙氨酸、鸟氨酸等；以及具有本领域已知的作为氨基酸的特征的特性的化学合成化合物。非天然存在的氨基酸的实例包括但不限于α-甲基氨基酸(例如α-甲基丙氨酸)、D-氨基酸、组氨酸样氨基酸(例如，2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸)、在侧链中具有额外亚甲基的氨基酸("高"氨基酸)和其中侧链中的羧酸官能团被磺酸基团置换的氨基酸(例如，磺基丙氨酸)。将非天然氨基酸(包括合成的非天然氨基酸、取代的氨基酸或一个或多个D-氨基酸)并入本发明的蛋白质中可以是以多种不同的方式有利的。含有D-氨基酸的肽等与含有L-氨基酸的对应物相比展现出增加的体外或体内稳定性。因此，当需要或要求更高的细胞内稳定性时，构建并入D-氨基酸的肽等可以是特别有用的。更具体地说，D-肽等对内源性肽酶和蛋白酶有抗性，从而在需要改善的分子生物利用度和延长的体内半衰期时，提供此类特性。另外，无法有效加工D-肽等以用于对T辅助细胞的II类主要组织相容性复合物限制呈递，并且因此不太可能诱导完整生物体中的体液免疫反应。
如本文所使用，术语"工程化(engineer/engineered/engineering)"被视为包括肽主链的任何操作或天然存在的多肽或重组多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括对氨基酸序列、糖基化模式或个别氨基酸的侧链基团的修饰以及这些方法的组合。工程化蛋白质是通过标准分子生物学技术来表达和产生。
本发明还包括编码抗原结合构建体的多肽的多核苷酸。术语“多核苷酸”或“核苷酸序列”意图指示连续延伸的两个或更多个核苷酸分子。核苷酸序列的来源可以是基因组、cDNA、RNA、半合成或合成或其任何组合。
“分离的核酸分子或多核苷酸”意指已从其天然环境中分离的核酸分子(DNA或RNA)。例如，包含在载体中的编码多肽的重组多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的进一步实例包括维持在异源性宿主细胞中的重组多核苷酸或呈溶液态的纯化(部分或基本上)多核苷酸。分离的多核苷酸包括多核苷酸分子，其包含在通常含有该多核苷酸分子的细胞中，但该多核苷酸分子存在于染色体外或其所处的染色体位置不同于其天然染色体位置。分离的RNA分子包括体内或体外RNA转录物，以及正链和负链形式和双链形式。本文所描述的分离的多核苷酸或核酸还包括通过合成(例如经由PCR或化学合成)产生的此类分子。此外，在一些实施方案中，多核苷酸或核酸包括调节元件例如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
术语"聚合酶链式反应"或"PCR"通常是指用于在体外扩增所需核苷酸序列的方法，如例如美国专利号4,683,195中所描述。一般来说，PCR方法涉及引物延伸合成的重复循环，所述引物延伸合成使用能够与模板核酸优先杂交的寡核苷酸引物。
提及具有与本发明的参照核苷酸序列至少例如95％“相同”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，其意思是对于参照核苷酸序列的每100个核苷酸，除了多核苷酸序列可以包括最多五个点突变以外，多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同。换言之，为了获得具有与参照核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，可以将参照序列中至多5％的核苷酸删除或用另一个核苷酸替代，或可以将参照序列中的总核苷酸的至多5％的大量核苷酸插入参照序列中。参照序列的这些改变可以发生在参照核苷酸序列的5’或3’端位置处，或这些末端位置之间的任何位置处，既可以单独地穿插在参照序列中的残基之间，又可以以一个或多个连续的组穿插在参照序列内。作为一个实际问题，任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同可以使用已知的计算机程序例如上文针对多肽所讨论的程序(例如ALIGN-2)按常规方式确定。
如果多肽的衍生物或变体的氨基酸序列与来自原始肽的100个氨基酸的序列具有至少50％的同一性，则所述衍生物或变体被称为与所述肽共有“同源性”或是“同源的”。在某些实施方案中，所述衍生物或变体与所述肽或所述肽的具有相同数目的氨基酸残基作为衍生物的片段的衍生物或变体至少75％相同。在某些实施方案中，所述衍生物或变体与所述肽或所述肽的具有相同数目的氨基酸残基作为衍生物的片段的衍生物或变体至少85％相同。在某些实施方案中，所述衍生物的氨基酸序列与所述肽或所述肽的具有相同数目的氨基酸残基作为衍生物的片段至少90％相同。在一些实施方案中，所述衍生物的氨基酸序列与所述肽或所述肽的具有相同数目的氨基酸残基作为衍生物的片段至少95％相同。在某些实施方案中，所述衍生物或变体与所述肽或所述肽的具有相同数目的氨基酸残基作为衍生物的片段的衍生物或变体至少99％相同。
"保守修饰的变体"适用于氨基酸和核酸序列两者。就特定核酸序列来说，"保守修饰的变体"是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或如果核酸不编码氨基酸序列时，则是指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每一个位置处，可以在不改变所编码的多肽的情况下将密码子更改为所描述的相应密码子中的任一个。此类核酸变异是"沉默变异"，其为保守修饰变异中的一种。本文中编码多肽的每一个核酸序列还描述了该核酸的每一种可能的沉默变异。本领域的普通技术人员将认识到核酸中的每个密码子(除了通常为甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和通常为色氨酸的唯一密码子的TGG以外)均可被修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变异均隐含在每个所描述的序列中。
关于氨基酸序列，本领域的普通技术人员将认识到改变、添加或删除所编码序列中的单一氨基酸或一小比例氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别替代、删除或添加是"保守修饰的变体"，其中所述改变导致氨基酸的删除、氨基酸的添加或氨基酸被化学上类似的氨基酸替代。提供功能相似的氨基酸的保守性替代表是本领域的普通技术人员已知的。此类保守修饰的变体附加于并且不排除本发明的多态变体、种间同源物和等位基因。
提供功能相似的氨基酸的保守性替代表是本领域的普通技术人员已知的。以下八组各自包含为彼此的保守性替代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)
(参见例如Creighton,Proteins:StructuresandMolecularProperties(WHFreeman&Co.；第2版(1993年12月)
在两种或更多种核酸或多肽序列的背景下的术语"相同"或"同一性"百分比是指相同的两个或更多个序列或子序列。当越过比较窗比较和比对最大对应性时，或如使用以下序列比较算法(或对本领域的普通技术人员来说可利用的其它算法)中的一种或通过手动比对和目视检查来测量指定区域时，如果序列具有一定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即在指定区域上具有约50％同一性、约55％同一性、60％同一性、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％同一性)，那么所述序列是“基本上相同的”。此定义还指测试序列的互补序列。同一性可以存在于长度为至少约50个氨基酸或核苷酸的区域上，或长度为75至100个氨基酸或核苷酸的区域上，或者在未指定的情况下可以存在于多核苷酸或多肽的整个序列上。编码本发明的多肽的多核苷酸(包括来自非人类物种的同源物)可以通过包括以下步骤的方法来获得：在严格杂交条件下使用具有本发明的多核苷酸序列或其片段的标记探针来筛选文库；以及分离全长cDNA和含有所述多核苷酸序列的基因组克隆。此类杂交技术是熟练的技术人员所熟知的。
短语“选择性(或特异性)杂交”是指当特定核苷酸序列存在于复合混合物(包括但不限于总细胞或文库DNA或RNA)中时，在严格杂交条件下某分子仅与所述序列结合、形成双链体或杂交。
短语"严格杂交条件"是指在如本领域中已知的低离子强度和高温条件下的DNA、RNA或其它核酸或其组合的序列的杂交。通常，在严格条件下，探针将与其在核酸的复合混合物(包括但不限于总细胞或文库DNA或RNA)中的靶子序列杂交，但不与复合混合物中的其它序列杂交。严格条件是序列依赖性的并且在不同情况下将是不同的。较长序列在较高温度下特异性地杂交。有关核酸杂交的广泛指导见于Tijssen,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology--HybridizationwithNucleicProbes,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993)。
抗原结合构建体的重组和合成产生方法：
本文还描述了经由在宿主细胞中表达多肽来产生抗原结合构建体的方法。
术语“表达盒”是指由重组或合成产生的多核苷酸，其具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列指定核酸元件。重组表达盒可以掺入到质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子以及其它序列。在某些实施方案中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”同义，并且是指用来引入并指导与之可操作性连接的特定基因在靶细胞中的表达的DNA分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及掺入它所引入到的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许转录大量稳定的mRNA。一旦表达载体处于靶细胞的内部，即通过细胞转录和/或翻译机制产生由基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中，本发明的表达载体包含表达盒，其包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
"细胞"、"宿主细胞"、"细胞系"和"细胞培养物"在本文中可互换使用，并且所有此类术语应被理解为包括由细胞的生长或培养所产生的后代。"转化"和"转染"可互换地用来指将DNA引入细胞中的过程。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已将外源核酸引入其中的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括初级转化细胞及由其衍生的后代，而不考虑传代数。在某些实施方案中，后代在核酸含量上并非与亲本细胞完全相同，而是可以含有突变。本文包括具有如在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物活性的突变体后代。宿主细胞是可以用来产生本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养细胞，例如哺乳动物培养细胞，如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞(仅列举了一些)，以及包含在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织内的细胞。
提供了在稳定的哺乳动物细胞中产生含有本文所描述的抗原结合构建体的表达产物的方法，所述方法包括：用编码所述第一多肽构建体的至少一个第一DNA序列和编码所述第二多肽构建体的至少一个第二DNA序列转染至少一种哺乳动物细胞，以使得所述至少一个第一DNA序列、所述至少一个第二DNA序列以预定比率转染于所述至少一种哺乳动物细胞中，从而产生稳定的哺乳动物细胞；培养所述稳定的哺乳动物细胞以产生包含所述抗原结合构建体的所述表达产物。在某些实施方案中，至少一个第一DNA序列：至少一个第二DNA序列的所述预定比率为约1:1。在某些其它实施方案中，至少一个第一DNA序列：至少一个第二DNA序列的所述预定比率偏向于较大量的一个第一DNA序列，例如约2:1。在其它实施方案中，至少一个第一DNA序列：至少一个第二DNA序列的所述预定比率偏向于较大量的一个第一DNA序列，例如约1:2。在选择的实施方案中，哺乳动物细胞选自由VERO、HeLa、HEK、NS0、中国仓鼠卵巢(CHO)、W138、BHK、COS-7、Caco-2和MDCK细胞以及其亚类和变体组成的组。
在某些实施方案中，抗原结合构建体是通过从酵母、微生物如细菌或人类或动物细胞系分泌而作为重组分子产生。在多个实施方案中，所述多肽是从宿主细胞分泌的。
实施方案包括细胞，例如被转化来表达本文所描述的抗原结合构建体蛋白质的酵母细胞。除了转化的宿主细胞自身以外，提供那些细胞在营养培养基中的培养物，优选为单克隆(同源克隆)培养物，或源自单克隆培养物的培养物。如果分泌多肽，则培养基将包含多肽与所述细胞，或无所述细胞(如果它们已经被过滤或离心掉)。许多表达系统是已知的并且可以使用，包括细菌(例如大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))、酵母(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris))、丝状真菌(例如曲霉属真菌(Aspergillus))、植物细胞、动物细胞和昆虫细胞。
本文所描述的抗原结合构建体是以常规方式产生，例如从插入宿主染色体中或在游离质粒上的编码序列产生。所述酵母以任何常用方式例如电穿孔用所需蛋白质的编码序列进行转化。用于通过电穿孔转化酵母的方法公开于Becker&Guarente(1990)MethodsEnzymol.194,182中。
成功转化的细胞，即包含本发明的DNA构建体的细胞可以通过熟知技术来鉴别。例如，可以使由引入表达构建体而产生的细胞生长以产生所需多肽。可以收获并溶解细胞，并且使用方法例如由Southern(1975)J.Mol.Biol.98,503或Berent等(1985)Biotech.3,208所描述的方法检查其DNA内容物中所述DNA的存在。或者，可以使用抗体来检测上清液中蛋白质的存在。
有用的酵母质粒载体包括pRS403-406和pRS413-416并且通常可从StratageneCloningSystems，LaJolla，Calif.92037,USA获得。质粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合质粒(YIp)并且并入了酵母可选择标记物HIS3、7RP1、LEU2和URA3。质粒pRS413-416是酵母着丝粒质粒(Ycp)。
已开发多种方法用于经由互补粘性末端将DNA可操作地连接至载体。例如，可以将互补光聚合物段(tract)添加至待插入载体DNA中的DNA区段。载体和DNA区段然后通过所述互补同聚物尾部之间的氢键合连接形成重组DNA分子。
含有一个或多个限制性位点的合成接头提供将DNA区段连接至载体的替代性方法。将通过内切核酸酶限制性消化产生的DNA区段用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶1进行处理，所述酶利用其3'5'核酸外切活性去除突出的单链末端，并且利用其聚合活性填充凹陷的3'末端。
这些活性的组合因此产生平端DNA区段。所述平端区段然后在能够催化平端DNA分子的连接的酶(例如噬菌体T4DNA连接酶)存在下与大量摩尔过量的接头分子一起孵育。因此，反应产物是在其末端携带聚合物接头序列的DNA区段。这些DNA区段然后用适当的限制酶裂解并且连接至表达载体，所述表达载体已经用产生与所述DNA区段的末端相容的末端的酶裂解。
含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头可从多个来源购买，包括InternationalBiotechnologiesInc.,NewHaven,Conn.,USA。
预期作为用于表达蛋白质的宿主适用于实践本发明的示例性酵母属为毕赤酵母属(Pichua)(以前被分类为汉逊酵母属(Hansenula))、酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、曲霉属、假丝酵母属(Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、固囊酵母属(Citeromyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、德巴里酵母属(Debaromyces)、木霉属(Trichoderma)、头孢霉属(Cephalosporium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)、亚罗酵母属(Yarrowia)、梅奇酵母属(Metschunikowia)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、白冬孢酵母属(Leucosporidium)、葡状子囊菌属(Botryoascus)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、拟内孢霉属(Endomycopsis)等。优选的属是选自由酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属和有孢圆酵母属所组成的组的那些属。酵母属菌种的实例是酿酒酵母、意大利糖酵母(S.italicus)和鲁氏糖酵母(S.rouxii)。
克鲁维酵母属菌种的实例是胞壁克鲁维酵母(K.fragilis)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)。适合的有孢圆酵母属菌种是德布尔有孢酵母(T.delbrueckii)。毕赤酵母属(汉逊酵母属)菌种的实例是安格斯毕赤酵母(P.angusta)(以前的多形汉逊酵母(H.polymorpha))、异常毕赤酵母(P.anomala)(以前的异常汉逊酵母(H.anomala))和巴斯德毕赤酵母。用于转化酿酒酵母的方法是EP251744、EP258067和WO90/01063中通常所教导的，所有这些专利以引用的方式并入本文。
适用于合成本文所描述的抗原结合构建体的示例性酵母属菌种包括酿酒酵母、意大利糖酵母、糖化酵母(S.diastaticus)和鲁氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)。优选的示例性克鲁维酵母属菌种包括胞壁克鲁维酵母和乳酸克鲁维酵母。优选的示例性汉逊酵母属菌种包括多形汉逊酵母(现在的安格斯毕赤酵母)、异常汉逊酵母(现在的异常毕赤酵母)和荚膜毕赤氏酵母(Pichiacapsulata)。其它优选的示例性毕赤酵母菌种包括巴斯德毕赤酵母。优选的示例性曲霉属菌种包括黑曲霉(A.niger)和构巢曲霉(A.nidulans)。优选的示例性亚罗酵母属菌种包括解脂亚罗酵母(Y.lipolytica)。许多优选的酵母菌种可从ATCC获得。例如，以下优选的酵母菌种可从ATCC获得并且适用于表达蛋白质：酿酒酵母Hansen、有性型菌株BY4743yap3突变体(ATCC登录号4022731)；酿酒酵母Hansen，有性型菌株BY4743hsp150突变体(ATCC登录号4021266)；酿酒酵母Hansen，有性型菌株BY4743pmt1突变体(ATCC登录号4023792)；酿酒酵母Hansen，有性型(ATCC登录号20626、44773、44774和62995)；糖化酵母Andrews和Gilliland不包括vanderWalt，有性型(ATCC登录号62987)；乳酸克鲁维酵母(Dombrowski)vanderWalt，有性型(ATCC登录号76492)；安格斯毕赤酵母(Teunisson等)Kurtzman，保藏为多形汉逊酵母deMorais和Maia的有性型，有性型(ATCC登录号26012)；黑曲霉vanTieghem，无性型(ATCC登录号9029)；黑曲霉vanTieghem，无性型(ATCC登录号16404)；构巢曲霉(Eidam)Winter，无性型(ATCC登录号48756)；以及解脂亚罗酵母(Wickerham等)vanderWalt和vonArx，有性型(ATCC登录号201847)。
酿酒酵母的合适启动子包括与以下相关的那些：PGKI基因、GAL1或GAL10基因、CYCI、PH05、TRP1、ADH1、ADH2；甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡糖异构酶、葡萄糖激酶、α-交配因子信息素[一种交配因子信息素]的基因；PRBI启动子、GUT2启动子、GPDI启动子以及涉及5'调控区的部分与其它启动子的5'调控区的部分或与上游活化位点的杂合体的杂合启动子(例如EP-A-258067的启动子)。
用于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的方便的可调控启动子是如Maundrell(1990)J.Biol.Chem.265,10857-10864所描述的来自nmt基因的硫胺素可抑制启动子以及如Hoffman和Winston(1990)Genetics124,807-816所描述的葡萄糖可抑制jbp1基因启动子。
转化用于表达外源基因的毕赤酵母的方法教导于例如Cregg等(1993)和各种Phillips专利(例如美国专利号4,857,467，以引用的方式并入本文)中，并且毕赤酵母表达试剂盒可从InvitrogenBV,Leek,Netherlands和InvitrogenCorp.,SanDiego,Calif购买。合适的启动子包括AOX1和AOX2。Gleeson等(1986)J.Gen.Microbiol.132,3459-3465包括关于汉逊酵母载体和转化的信息，合适的启动子是MOX1和FMD1；而EP361991、Fleer等(1991)和来自Rhone-PoulencRorer的其它出版物教导了如何在克鲁维酵母属菌种中表达外源蛋白质，合适的启动子是PGKI。
转录终止信号优选为真核基因的3'侧翼序列，该序列包含用于转录终止和多腺苷酸化的适当信号。合适的3'侧翼序列可以是例如与所使用的表达控制序列天然连接的基因的那些序列，即可以与启动子相对应。或者，它们可以是不同的，在这种情况下优选酿酒酵母ADHI基因的终止信号。
在某些实施方案中，所需抗原结合构建体蛋白质最初使用分泌性前导序列表达，该前导序列可以是在所选酵母中有效的任何前导序列。适用于酿酒酵母中的前导序列包括来自交配因子α多肽(MFα-1)的前导序列和EP-A-387319的杂合前导序列。此类前导序列(或信号)在成熟蛋白质释放到周围培养基中之前被酵母裂解。此外，此类前导序列包括JP62-096086(授权号为911036516)中公开的酿酒酵母转化酶(SUC2)、酸性磷酸酶(PH05)、MFα-1的前序列、0葡聚糖酶(BGL2)和杀伤毒素；糖化酵母葡糖淀粉酶I1；卡尔酵母(S.carlsbergensis)α-半乳糖苷酶(MEL1)；乳酸克鲁维酵母杀伤毒素；以及假丝酵母属葡糖淀粉酶的前导序列。
提供了含有编码本文所描述的抗原结合构建体的多核苷酸的载体、宿主细胞以及通过合成和重组技术产生抗原结合构建体蛋白质。载体可以是例如噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可以为复制感受态型或复制缺陷型。在后者的情况下，病毒繁殖通常将仅发生于互补宿主细胞中。
在某些实施方案中，编码本文所描述的抗原结合构建体蛋白质的多核苷酸连接至含有用于在宿主中繁殖的选择性标记物的载体。一般来说，将质粒载体引入沉淀物例如磷酸钙沉淀物中，或引入具有带电脂质的复合物中。如果载体是病毒，则可以使用适当的包装细胞系在体外对其进行包装且然后转导至宿主细胞中。
在某些实施方案中，多核苷酸插入物可操作地连接至适当的启动子，举例来说，例如噬菌体λPL启动子、大肠杆菌lac、trp、phoA和rac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR的启动子。其它适合的启动子对于本领域技术人员来说将是已知的。表达构建体将还包含转录起始位点、终止位点，以及在转录区中用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的转录物的编码部分将优选包括在待翻译的多肽的起始处的翻译起始密码子和恰好位于待翻译多肽的末端处的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。
如所指示，表达载体将优选包括至少一种选择性标记物。此类标记物包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶、G418、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性，以及用于在大肠杆菌和其它细菌中培养的四环素、卡那霉素(kanamycin)或氨苄青霉素(ampicillin)抗性基因。适当宿主的代表性实例包括但不限于：细菌细胞，例如大肠杆菌、链霉菌属和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)细胞；真菌细胞，例如酵母细胞(例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母(ATCC登录号201178))；昆虫细胞例如果蝇属S2和夜蛾属Sf9细胞；动物细胞例如CHO、COS、NSO、293和Bowes黑色素瘤细胞；以及植物细胞。用于上述宿主细胞的适当培养基和条件是本领域中已知的。
优选用于细菌的载体包括可从QIAGEN,Inc.获得的pQE70、pQE60和pQE-9；可从StratageneCloningSystems,Inc.获得的pBluescript载体、Phagescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；以及可从PharmaciaBiotech,Inc.获得的ptrc99a、pKK223-3、PKK233-3、pDR540、pRIT5。优选的真核载体是可从Stratagene获得的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；以及可从Pharmacia获得的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。用于酵母系统的优选表达载体包括但不限于pYES2、pYD1、pTEFl/Zeo、pYES2/GS、pPICZ、pGAPZ、pGAPZalph、pPIC9、pPIC3.5、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pPIC9K和PAO815(全部可从Invitrogen,Carlsbad,CA获得)。其它适合的载体对于技术人员来说将是显而易见的。
在一个实施方案中，编码本文所描述的抗原结合构建体的多核苷酸与信号序列融合，该信号序列将指导本发明的蛋白质定位至原核或真核细胞的特定隔室和/或指导本发明的蛋白质从原核或真核细胞的分泌。例如，在大肠杆菌中，可能希望使所述蛋白质的表达定向至周质间隙。与抗原结合构建体蛋白质融合以使得多肽的表达定向至细菌的周质间隙的信号序列或蛋白质(或其片段)的实例包括但不限于pelB信号序列、麦芽糖结合蛋白(MBP)信号序列、MBP、ompA信号序列、周质大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基的信号序列和碱性磷酸酶的信号序列。几种载体可商购用于构建将引导蛋白质定位的融合蛋白，例如可从NewEnglandBiolabs获得的pMAL系列载体(具体地是pMAL-.rho.系列)。在一个具体实施方案中，编码本发明蛋白质的多核苷酸可以与pelB果胶酸裂解酶信号序列融合，以增加此类多肽在革兰氏阴性细菌中的表达和纯化效率。参见美国专利号5,576,195和5,846,818，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
与抗原结合构建体蛋白质融合以便引导其在哺乳动物细胞中的分泌的信号肽的实例包括但不限于MPIF-1信号序列(例如GenBank登录号AAB51134的氨基酸1-21)、斯钙素(stanniocalcin)信号序列(MLQNSAVLLLLVISASA)(SEQIDNO:276)和共有信号序列(MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG)(SEQIDNO:277)。可以与杆状病毒表达系统结合使用的合适信号序列是gp67信号序列(例如，GenBank登录号AAA72759的氨基酸1-19)。
使用谷氨酰胺合酶(GS)或DHFR作为选择性标记物的载体可以分别在药物甲硫氨酸砜亚胺或甲氨蝶呤的存在下扩增。基于谷氨酰胺合酶的载体的优点是谷氨酰胺合酶阴性细胞系(例如鼠科动物骨髓瘤细胞系NSO)的可用性。谷氨酰胺合酶表达系统还可以通过提供额外抑制剂来防止内源基因的作用而在表达谷氨酰胺合酶的细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中起作用。谷氨酰胺合酶表达系统和其组分详述于以下PCT公布中：WO87/04462、WO86/05807、WO89/10036、WO89/10404和WO91/06657，所述公布特此以引用的方式整体并入本文。另外，谷氨酰胺合酶表达载体可以获自LonzaBiologics,Inc.(Portsmouth,N.H.)。使用GS表达系统在鼠科动物骨髓瘤细胞中表达和产生单克隆抗体描述于Bebbington等，Bio/technology10:169(1992)和Biblia和RobinsonBiotechnol.Prog.11:1(1995)中，所述文献以引用的方式并入本文。
还提供了含有本文所描述的载体构建体的宿主细胞，并且另外提供含有核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列使用本领域中已知的技术与一个或多个异源控制区(例如，启动子和/或增强子)可操作地结合。宿主细胞可以是高等真核细胞例如哺乳动物细胞(例如，人源细胞)或低等真核细胞例如酵母细胞，或宿主细胞可以是原核细胞例如细菌细胞。可以选择调节插入基因序列的表达或以所需特定方式修饰并加工基因产物的宿主菌株。可以在某些诱导物的存在下提高从某些启动子开始的表达，从而可以控制遗传工程化多肽的表达。此外，不同宿主细胞具有用于蛋白质的翻译和翻译后加工和修饰(例如，磷酸化、裂解)的特征和特异性机制。可以选择适当细胞系以确保对所表达的外源蛋白质的所需修饰和加工。
将本发明的核酸和核酸构建体引入宿主细胞中可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法来实现。此类方法描述于许多标准实验室手册中，例如Davis等，BasicMethodsInMolecularBiology(1986)。明确预期了本发明的多肽可以事实上由缺乏重组载体的宿主细胞表达。
除涵盖含有本文所讨论的载体构建体的宿主细胞以外，本发明还涵盖已被工程化为缺失或替换内源性遗传物质(例如对应于货物(Cargo)多肽的编码序列被对应于货物多肽的抗原结合构建体蛋白质替换)和/或包括遗传物质的脊椎动物来源特别是哺乳动物来源的原代、继代和永生化宿主细胞。与内源多核苷酸可操作地结合的遗传物质可以活化、改变和/或扩增内源多核苷酸。
另外，本领域中已知的技术可以用于经由同源重组将异源多核苷酸(例如编码蛋白质或其片段或变体的多核苷酸)和/或异源控制区(例如启动子和/或增强子)与编码治疗性蛋白质的内源多核苷酸序列可操作地结合(参见例如1997年6月24日发布的美国专利号5,641,670；国际公布号WO96/29411；国际公布号WO94/12650；Koller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:8932-8935(1989)；以及Zijlstra等，Nature342:435-438(1989)，每个文献的公开内容以引用的方式整体并入)。
本文所描述的抗原结合构建体蛋白质可以通过熟知的方法从重组细胞培养物中回收并纯化，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸萃取法、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法(例如与A蛋白)、羟基磷灰石色谱法、疏水性电荷相互作用色谱法和凝集素色谱法。最优选地，采用高效液相色谱法("HPLC")进行纯化。
在某些实施方案中，本发明的抗原结合构建体蛋白质使用阴离子交换色谱法进行纯化，所述阴离子交换色谱法包括但不限于在Q-琼脂糖、DEAE琼脂糖、porosHQ、porosDEAF、ToyopearlQ、ToyopearlQAE、ToyopearlDEAE、Resource/SourceQ和DEAE、FractogelQ和DEAE柱上的色谱法。
在特定实施方案中，本文所描述的蛋白质使用阳离子交换色谱法进行纯化，所述阳离子交换色谱法包括但不限于SP-琼脂糖、CM琼脂糖、porosHS、porosCM、ToyopearlSP、ToyopearlCM、Resource/SourceS和CM、FractogelS和CM柱以及其等效物和相当物。
另外，本文所描述的抗原结合构建体蛋白质可以使用本领域中已知的技术化学合成(例如，参见Creighton,1983,Proteins:StructuresandMolecularPrinciples,W.H.Freeman&Co.,N.Y以及Hunkapiller等，Nature,310:105-111(1984))。例如，对应于多肽的片段的多肽可以通过使用肽合成仪来合成。此外，如果需要，非经典氨基酸或化学氨基酸类似物可以作为替代或添加引入多肽序列中。一般来说，非经典氨基酸包括但不限于常见氨基酸的D型异构体、2,4二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、g-Abu、e-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、设计产生的氨基酸例如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸以及氨基酸类似物。此外，氨基酸可以是D型(右旋的)或L型(左旋的)。
翻译后修饰：
在某些实施方案中为本文所描述的抗原结合构建体，其在翻译期间或之后被差异地修饰。在一些实施方案中，所述修饰为下列中的至少一种：糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团进行衍生化、蛋白水解裂解以及与抗体分子或其它细胞配体的键联。在一些实施方案中，通过已知技术对抗原结合构建体进行化学修饰，所述技术包括但不限于通过溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4进行特异性化学裂解；乙酰化、甲酰化、氧化、还原；以及在衣霉素存在下的代谢合成。
本文所描述的抗原结合构建体的其它翻译后修饰包括例如N-连接或O-连接的碳水化合物链、N末端或C末端的加工)、化学部分附接至氨基酸主链、N-连接或O-连接的碳水化合物链的化学修饰以及由于原核宿主细胞表达而产生的N末端甲硫氨酸残基的添加或缺失。本文所描述的抗原结合构建体用可检测标记例如酶、荧光、同位素或亲和标记进行修饰，以允许检测和分离蛋白质。在某些实施方案中，合适的酶标记的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素生物素和亲和素/生物素；合适的荧光物质的实例包括伞酮(umbelliferone)、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光物质的实例包括鲁米诺(luminol)；生物发光物质的实例包括萤光素酶、萤光素和水母蛋白；且合适的放射性物质的实例包括碘、碳、硫、氚、铟、锝、铊、镓、钯、钼、氙、氟。
在具体实施方案中，本文所描述的抗原结合构建体附接至与放射性金属离子缔合的大环螯合剂。
在一些实施方案中，通过自然过程(如翻译后加工)或通过本领域中熟知的化学修饰技术对本文所描述的抗原结合构建体进行修饰。在某些实施方案中，相同类型的修饰可以以相同或不同程度存在于给定多肽中的若干位点处。在某些实施方案中，来自本文所描述的抗原结合构建体的多肽是支链的(例如由于泛素化)，并且在一些实施方案中是环状的，有或无分支。环状、支链和支链环状多肽是源于翻译后自然过程或通过合成方法而制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素(flavin)的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加(如精氨酰化)以及泛素化。(参见例如PROTEINS--STRUCTUREANDMOLECULARPROPERTIES,第2版,T.E.Creighton,W.H.FreemanandCompany,NewYork(1993)；POST-TRANSLATIONALCOVALENTMODIFICATIONOFPROTEINS,B.C.Johnson编辑,AcademicPress,NewYork,第1-12页(1983)；Seifter等，Meth.Enzymol.182:626-646(1990)；Rattan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48-62(1992))。
在某些实施方案中，本文所描述的抗原结合构建体附接至固体支持物，所述固体支持物特别适用于通过本发明的蛋白质来结合、与本发明的蛋白质结合或缔合的多肽的免疫测定或纯化。此类固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
测定：
可以使用或按常规修改本领域中已知的测定以及本文所描述的测定对本文所描述的抗原结合构建体的功能活性(例如生物活性)进行测定。
例如，在一个实施方案中，如果测定本文所描述的抗原结合构建体结合抗原或与另一个多肽竞争地结合抗原或结合Fc受体和/或抗体的能力，可以使用本领域中已知的各种免疫测定，包括但不限于竞争性和非竞争性测定系统，其使用技术例如放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、"夹心"免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫测定(使用例如胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集测定(例如凝胶凝集测定、血凝测定)、补体结合测定、免疫荧光测定、A蛋白测定和免疫电泳测定等。在一个实施方案中，通过检测初级抗体上的标记来检测抗体结合。在另一个实施方案中，通过检测次级抗体或试剂与初级抗体的结合来检测初级抗体。在另一个实施方案中，标记次级抗体。许多用于在免疫测定中检测结合的方法是本领域中已知的并且在本发明的范围内。
在某些实施方案中，如果针对本文所描述的抗原结合构建体所包含的抗原结合域来识别结合配偶体(例如受体或配体)，则测定本文所描述的抗原结合构建体对该结合配偶体的结合，例如通过本领域中熟知的方法如例如还原和非还原凝胶色谱法、蛋白质亲和色谱法和亲和印迹法。一般参见Phizicky等，Microbiol.Rev.59:94-123(1995)。在另一个实施方案中，抗原结合构建体的生理相关物结合本文所描述的抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体的底物的能力可以使用本领域中已知的技术来进行常规测定。
药物组合物
另外且如本文所更详细描述，包括包含抗原结合构建体和载体的组合物。
“药学上可接受的载体”是指药物组合物中除活性成分以外的成分，其对受试者无毒性。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所使用，“治疗(treatment)”(和其语法变型如(treat/treating))是指试图改变所治疗的个体中的疾病的自然过程的临床干预，并且可以为了预防而进行或在临床病理学的过程中进行。希望的治疗效果包括但不限于防止疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理结果、防止转移、减慢疾病进展的速度、改善或缓和疾病状态以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本文所描述的抗原结合构建体被用于延缓疾病的发展或减慢疾病的进展。术语“说明书”是用来指通常包含在治疗性产品的商业包装中的说明，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、联合治疗、禁忌症的信息和/或关于使用此类治疗性产品的警告。
药剂(例如本文所描述的抗原结合构建体)的“有效量”是指在施用该药剂的细胞或组织中产生生理变化所必需的量。
药剂(例如包含本文所描述的抗原结合构建体的药物组合物)的“治疗有效量”是指对在必要的剂量下和时间内有效实现所需的治疗或预防结果的量。药剂的治疗有效量例如消除、减少、延迟、最小化或防止疾病的不良效应。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人类和非人灵长类动物如猴)、兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。具体来说，所述个体或受试者是人类。
术语“药物组合物”是指这样的制剂，其呈现使得包含在其中的抗原结合构建体的生物活性有效的形式，且不包含对将施用该制剂的受试者具有不可接受的毒性的其它成分。
治疗用途：
在一方面，本文所描述的抗原结合构建体涉及基于抗体的疗法，该疗法涉及向患者施用包含货物多肽的所述抗原结合构建体以用于治疗所公开的疾病、病症或病状中的一种或多种，所述货物多肽为抗体、抗体的片段或变体。本文所描述的治疗性化合物包括但不限于本文所描述的抗原结合构建体、编码本文所描述的抗原结合构建体的核酸。
在某些实施方案中，提供一种预防、治疗或减轻下列中的至少一种的方法：增生性疾病、微量残留癌症、肿瘤性疾病、炎性疾病、免疫紊乱、自身免疫疾病、传染病、病毒性疾病、过敏反应、寄生反应、移植物抗宿主疾病或宿主抗移植物疾病或细胞恶性肿瘤，所述方法包括对需要此类预防、治疗或减轻的受试者施用包含本文所描述的抗原结合构建体的药物组合物。
在某些实施方案中为一种治疗有需要的哺乳动物中的癌症的方法，其包括对该哺乳动物施用包含有效量的本文所描述的药物组合物的组合物以及任选地与其它药物活性分子的组合。在某些实施方案中，所述癌症是实体瘤。在一些实施方案中，所述实体瘤是肉瘤、癌和淋巴瘤中的一种或多种。在某些其它实施方案中，所述癌症是血液癌。在一些实施方案中，所述癌症是B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和白血病中的一种或多种。
提供了一种处理癌细胞的方法，其包括向所述细胞提供包含本文所描述的抗原结合构建体的组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括提供所述抗原结合构建体以及另一种治疗剂的结合。
提供了一种治疗有需要的哺乳动物中的对博纳吐单抗无反应的癌症的方法，其包括对该哺乳动物施用组合物，该组合物包含有效量的含有本文所描述的抗原结合构建体的药物组合物。
在一些实施方案中为一种处理在用博纳吐单抗处理后消退的癌细胞的方法，其包括向所述癌细胞提供组合物，该组合物包含有效量的含有本文所描述的抗原结合构建体的药物组合物。
在一些实施方案中为一种治疗患有特征为B细胞表达的疾病的个体的方法，所述方法包括向所述个体提供有效量的组合物，该组合物包含有效量的含有本文所描述的抗原结合构建体的药物组合物。在一些实施方案中，所述疾病对使用抗CD19抗体和抗CD20抗体中的至少一种进行的治疗无反应。在某些实施方案中，所述疾病是对CD19或CD20裂解性抗体具有抗性的癌症或自身免疫病状。
提供了一种治疗有需要的哺乳动物中的自身免疫病状的方法，其包括对所述哺乳动物施用包含有效量的本文所描述的药物组合物的组合物。在某些实施方案中，所述自身免疫病状是下列中的一种或多种：多发性硬化症、类风湿性关节炎、红斑狼疮、银屑病性关节炎、银屑病、血管炎、葡萄膜炎、克罗恩氏病(Crohn’sdisease)和1型糖尿病。
提供了一种治疗有需要的哺乳动物中的炎性病状的方法，其包括对所述哺乳动物施用组合物，该组合物包含有效量的含有本文所描述的抗原结合构建体的药物组合物。
借助本文所提供的教导，本领域的普通技术人员将知道如何出于诊断、监测或治疗目的来使用本文所描述的抗原结合构建体而无需过度实验。
本文所描述的包含抗体的至少一个片段或变体的抗原结合构建体可以单独或与其它类型的治疗(例如，放射疗法、化学疗法、激素疗法、免疫疗法和抗肿瘤剂)组合施用。一般来说，优选的是施用物种与患者相同的物种起源或物种反应性(在抗体的情况下)的产品。因此，在一个实施方案中，为了治疗或预防，将人类抗体、片段衍生物、类似物或核酸施用给人类患者。
基因疗法：
在一个具体实施方案中，通过基因疗法，施用包含编码本文所描述的抗原结合构建体蛋白质的序列的核酸来治疗、抑制或预防与蛋白质的异常表达和/或活性相关的疾病或病症。基因疗法是指通过向受试者施用表达的或可表达的核酸所进行的疗法。在本发明的这个实施方案中，所述核酸产生其编码的介导治疗作用的蛋白质。可以使用本领域中可用的任何基因疗法方法。
治疗或预防活性的证明：
在用于人类中之前，在体外测试本文所描述的抗原结合构建体或药物组合物，且然后在体内测试所需的治疗或预防活性。例如，用于证明化合物或药物组合物的治疗或预防效用的体外测定包括化合物对细胞系或患者组织样品的作用。化合物或组合物对细胞系和/或组织样品的作用可以使用本领域技术人员已知的技术进行测定，所述技术包括但不限于玫瑰花结(rosette)形成测定和细胞裂解测定。根据本发明，可以用于确定是否指示施用特定化合物的体外测定包括体外细胞培养测定，其中使患者组织样品在培养物中生长并且暴露于抗原结合构建体或以其它方式施用抗原结合构建体，并且观察此类抗原结合构建体对所述组织样品的作用。
治疗性/预防性施用和组合物：
提供了通过向受试者施用有效量的本文所描述的抗原结合构建体或药物组合物来治疗、抑制和预防的方法。在一个实施方案中，所述抗原结合构建体是基本上纯化的(即，基本上不含限制其作用或产生非所需副作用的物质)。在某些实施方案中，所述受试者是动物，包括但不限于动物例如牛、猪、马、鸡、猫、狗等，并且在某些实施方案中是哺乳动物，且最优选为人类。
不同递送系统是已知的并且可以用于施用本文所描述的抗原结合构建体制剂，例如封装在脂质体、微颗粒、微胶囊中；能够表达所述化合物的重组细胞；受体介导的内吞作用(参见例如Wu和Wu，J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987))；构建作为逆转录病毒载体或其它载体的一部分的核酸等。引入方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。所述化合物或组合物可以通过任何方便的途径来施用，例如通过输注或推注、通过经由上皮或粘膜皮肤衬层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。另外，在某些实施方案中，希望通过任何适合的途径(包括心室内和鞘内注射)将本文所描述的抗原结合构建体组合物引入中枢神经系统中；可以通过例如附接至储器(例如Ommaya储器)的心室内导管来促进心室内注射。还可以采用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器并与雾化剂一起配制。
在一个具体实施方案中，希望将本文所描述的抗原结合构建体或组合物局部施用至需要治疗的区域；这可以通过例如但不限于以下的方式来实现：在外科手术过程中局部输注、局部应用(例如在外科手术后结合伤口敷料)、通过注射、借助于导管、借助于栓剂或借助于植入物，所述植入物是多孔、无孔或凝胶状材料，包括膜例如硅橡胶膜或纤维。优选地，当施用本发明的蛋白质(包括抗体)时，必须注意使用所述蛋白质不会被吸收的材料。
在另一个实施方案中，所述抗原结合构建体或组合物可以在囊泡具体地说脂质体中来递送(参见Langer,Science249:1527-1533(1990)；Treat等，LiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer,Lopez-Berestein和Fidler(编辑),Liss,NewYork，第353-365页(1989)；Lopez-Berestein，同上，第317-327页；一般参见如上)。
在又一个实施方案中，可以采用控释系统形式来递送所述抗原结合构建体或组合物。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Langer，同上；Sefton,CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987)；Buchwald等，Surgery88:507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321:574(1989))。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料(参见MedicalApplicationsofControlledRelease,Langer和Wise(编辑),CRCPres.,BocaRaton,Fla.(1974)；ControlledDrugBioavailability,DrugProductDesignandPerformance,Smolen和Ball(编辑),Wiley,NewYork(1984)；Ranger和Peppas,J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61(1983)；还参见Levy等，Science228:190(1985)；During等，Ann.Neurol.25:351(1989)；Howard等，J.Neurosurg.71:105(1989))。在又一个实施方案中，控释系统可以邻近治疗靶标(例如脑部)放置，由此仅需要全身剂量的一部分(参见例如Goodson，MedicalApplicationsofControlledRelease，同上，第2卷，第115-138页(1984))。
其它控释系统论述于Langer(Science249:1527-1533(1990))的综述中。
在包含编码本文所描述的抗原结合构建体的核酸的一个具体实施方案中，所述核酸可以通过将其构建为适当核酸表达载体的一部分并且施用它以使得它变成细胞内核酸来体内施用，以促进它所编码的蛋白质的表达，此举的实现是例如通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利号4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic,Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包覆，或通过将所述核酸与已知会进入核内的同源盒样肽连接来施用(参见例如Joliot等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:1864-1868(1991))等。或者，可以细胞内引入核酸并且通过同源重组并入宿主细胞DNA内以进行表达。
本文还提供了药物组合物。此类组合物包含治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体。在一个具体实施方案中，术语"药学上可接受的"意指由联邦或州政府的监管机构批准，或在美国药典(U.S.Pharmacopeia)或用于动物且更具体地说人类的其它公认药典中列出。术语"载体"是指使用其来施用治疗剂的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可以用作液体载体，尤其是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。必要时，组合物还可以含有少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、持续释放制剂等形式。组合物可以用传统粘合剂和载体(例如甘油三酯)配制成栓剂。口服制剂可以包含标准载体，例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例描述于E.W.Martin的"Remington'sPharmaceuticalSciences"中。此类组合物将包含治疗有效量的化合物(优选呈纯化形式)连同合适量的载体，以便提供适于施用至患者的形式。制剂应该适合施用模式。
在某些实施方案中，将包含抗原结合构建体的组合物根据常规程序配制成适于静脉内施用至人类的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂(例如利诺卡因)以减轻注射部位处的疼痛。一般来说，所述成分是单独或混合在一起以单位剂型(例如作为干燥冻干粉末或无水浓缩物)提供于指示活性剂的量的密闭容器(例如安瓿或药囊)中。在组合物有待通过输注施用的情况下，其可以用含有无菌药用级水或盐水的输注瓶进行分配。在组合物通过注射施用的情况下，可以提供注射用无菌水或盐水的安瓿以便可以在施用前混合各成分。
在某些实施方案中，本文所描述的组合物被配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的那些盐，例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐；以及与阳离子形成的那些盐，例如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等的盐。
可以通过标准临床技术来确定本文所描述的组合物的将有效治疗、抑制和预防与治疗性蛋白质的异常表达和/或活性相关的疾病或病症的量。另外，可以任选地采用体外测定来帮助确定最佳剂量范围。待用于所述制剂中的精确剂量还将取决于施用途径和疾病或病症的严重度，并且应该根据从业人员的判断和每位患者的状况来决定。由源自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推有效剂量。
在某些实施方案中，在一次或一系列治疗中适宜地对患者施用本文所描述的抗原结合构建体。取决于疾病的类型和严重度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的T细胞活化双特异性抗原结合分子可以是无论例如通过一次或多次分开施用或通过连续输注来对患者施用的初始候选剂量。取决于上述因素，一个典型的日剂量可以是从约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围。对于持续数天或更长的重复施用，根据状况，治疗一般会持续至出现对疾病症状的所需抑制。本文所描述的抗原结合构建体的一个示例性剂量将在从约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其它非限制性实例中，剂量还可以包括每次施用从约1μg/kg体重、约5μg/kg体重、约10μg/kg体重、约50μg/kg体重、约100μg/kg体重、约200μg/kg体重、约350μg/kg体重、约500μg/kg体重、约1mg/kg体重、约5mg/kg体重、约10mg/kg体重、约50mg/kg体重、约100mg/kg体重、约200mg/kg体重、约350mg/kg体重、约500mg/kg体重至约1000mg/kg体重或更多，以及其中可衍生的任何范围。在可从本文所列的数字衍生的范围的非限制性实例中，基于上述数字，可以施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重、约5μg/kg体重至约500mg/kg体重等的范围。因此，可以对患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg中的一个或多个剂量(或其任何组合)。此类剂量可以间歇施用，例如每周或每三周一次(例如，以使得患者接受约2至约20个或例如约6个剂量的T细胞活化双特异性抗原结合分子)。可以首先施用较高的负荷剂量，然后施用一个或多个较低剂量。然而，可以使用其它给药方案。这种疗法的进展容易通过常规技术和测定来监测。
本文所描述的抗原结合构建体通常以可有效达到预期目的的量来使用。为了用来治疗或预防疾病状况，以治疗有效量来施用或应用本文所描述的抗原结合构建体或其药物组合物。尤其是鉴于本文所提供的详细公开内容，治疗有效量的测定充分地处于本领域技术人员的能力范围之内。
对于全身施用，最初可以从体外测定例如细胞培养测定来估算治疗有效剂量。然后可以配制在动物模型中达到包括如在细胞培养物中测定的IC50的循环浓度范围的剂量。此类信息可以用于更准确地测定在人类中有用的剂量。
还可以使用本领域熟知的技术从体内数据例如动物模型估算初始剂量。本领域的普通技术人员可以基于动物数据容易地优化对人类的施用。
可以单独地调整剂量和间隔来提供足以维持治疗效果的本文所描述的抗原结合构建体的血浆水平。通过注射施用的常见患者剂量介于约0.1至50mg/kg/天，通常约0.5至1mg/kg/天的范围内。可以通过每天施用多个剂量来达到治疗有效的血浆水平。血浆中的水平可以例如通过HPLC来测量。
在局部施用或选择性摄取的情况下，本文所描述的抗原结合构建体的有效局部浓度可以与血浆浓度无关。本领域技术人员将能够在无需过度实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。
本文所描述的抗原结合构建体的治疗有效剂量通常将提供治疗益处而不引起实质性毒性。可以通过标准药学程序在细胞培养物或实验动物中测定本文所描述的抗原结合构建体的毒性和治疗功效。可以利用细胞培养测定和动物研究来测定LD50(将群体的50％致死的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比为治疗指数，其可以表示为比值LD50/ED50。优选显示大治疗指数的T细胞活化双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中，根据本发明的本文所描述的抗原结合构建体显示高治疗指数。从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制适用于人类的一系列剂量。该剂量优选落在包括ED50且具有很小毒性或无毒性的循环浓度范围内。取决于多种因素例如所用的剂型、所利用的施用途径、受试者的病状等，剂量可以在此范围内变动。精确的制剂、施用途径和剂量可以由个别医师鉴于患者的病状来选择(参见例如Fingl等，1975，ThePharmacologicalBasisofTherapeutics，第1章，第1页，该文献以引用的方式整体并入本文中)。
用本文所描述的抗原结合构建体治疗的患者的主治医师将知道如何和何时由于毒性、器官功能障碍等而终止、中断或调整施用。相反地，如果临床反应不充分(排除毒性)，则主治医师还将知道如何将治疗调整至更高水平。在受关注病症的治疗中施用的剂量的量级将随待治疗的病状的严重度、施用途径等而变化。病状的严重度可以例如通过标准预后评价方法来部分评价。此外，剂量且可能剂量频率还将根据个体患者的年龄、体重和反应而变化。
还提供了一种产生包含本文所描述的抗原结合构建体的药物组合物的方法，所述方法包括在允许表达抗原结合构建体的条件下培养宿主细胞；从培养物中回收产生的抗原结合构建体；和产生所述药物组合物。
其它药剂和治疗：
在某些实施方案中，本文所描述的抗原结合构建体在疗法中与一种或多种其它药剂组合施用。例如，在一个实施方案中，本文所描述的抗原结合构建体与至少一种其它治疗剂共同施用。术语“治疗剂”涵盖被施用来在需要此类治疗的个体中治疗症状或疾病的任何药剂。此类其它治疗剂可以包含适用于所治疗的特定适应症的任何活性成分，优选那些具有不互相产生不利影响的互补活性的活性成分。在某些实施方案中，其它治疗剂是免疫调节剂、细胞生长抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞毒剂、细胞凋亡活化剂或提高细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂。在一个特定实施方案中，其它治疗剂是抗癌剂，例如微管破坏剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷化剂、激素疗法、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡活化剂或抗血管发生剂。
此类其它药剂适合以对于预期目的有效的量组合存在。此类其它药剂的有效量取决于所使用的T细胞活化双特异性抗原结合分子的量、病症或治疗的类型和上文讨论的其它因素。本文所描述的抗原结合构建体通常以相同的剂量和本文所描述的施用途径，或本文所描述的剂量的约1至99％，或者以任何剂量和通过在经验/临床上被确定为适当的任何途径来使用。
上述此类联合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在相同或分开的组合物中)和分开施用，在分开施用的情况下，本文所描述的抗原结合构建体的施用可以在施用其它治疗剂和/或佐剂之前、与之同时和/或之后进行。本文所描述的抗原结合构建体还可以与放射疗法组合使用。
制品:
在本发明的另一个方面，提供了包含可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料的制品。所述制品包括容器和位于容器上或与容器相连的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉输液袋等。容器可以由多种材料例如玻璃或塑料形成。容器内含有单独的组合物或与另一种有效治疗、预防和/或诊断病状的组合物组合的组合物，并且可以具有无菌接入口(例如容器可以为具有塞子的静脉输液袋或小瓶，塞子可被皮下注射针刺穿)。所述组合物中的至少一种活性剂是本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子。标签或包装说明书指示组合物用于治疗所选的病状。另外，所述制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中该组合物包含本文所描述的抗原结合构建体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中该组合物包含另一种细胞毒性剂或另外的治疗剂。在本发明的这个实施方案中的制品可以还包括指示组合物可以用于治疗特定病状的包装说明书。可选地或另外地，所述制品可以还包含第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲液，例如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer'ssolution)和葡萄糖溶液。可以还包括就商业和用户立场而言可期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。
实施例
以下具体和非限制性实施例应该被解释为仅仅是说明性的，并且无论如何不以任何方式限制本公开。无需进一步详述，据信本领域技术人员可以基于本文的描述在最大程度上利用本公开。本文所引用的所有出版物据此均以引用的方式整体并入本文中。当对URL或其它此类标识符或地址进行引用时，应该理解此类标识符可以变化且互联网上的具体信息可以变化不定，但通过搜索互联网可以发现等效的信息。对其进行的引用证明了此类信息的可用性和公共传播性。
实施例1.双特异性抗CD19-CD3抗原结合构建体的描述。
如下文所述设计多个示例性双特异性抗CD3-CD19抗原结合构建体。图1A-C中示出这类构建体的示例性示意图。图2中示出这些变体的汇总。所有形式都是基于由CH3结构域中的已知突变构建的异二聚体Fc(VonKreudenstein等人，MAbs.20135(5):646-54)：
·双重scFv异二聚体Fc分子包含具有抗CD19scFv和抗CD3scFv的异二聚体Fc
·杂合异二聚体Fc分子包含具有抗CD19scFv和抗CD3Fab的异二聚体Fc或具有抗CD19Fab和抗CD3scFv的异二聚体Fc。
·全尺寸异二聚体Fc分子包含具有抗CD19Fab和抗CD3Fab的异二聚体Fc；所述全尺寸分子可以由共同轻链或和抗CD19轻链和抗CD3轻链构建。
双重scFv异二聚体Fc构建体：
v873和v875举例说明双重scFv异二聚体Fc双特异性抗CD3-CD19抗原结合构建体。
变体v873和v875的抗CD19scFv(HD37scFv)序列是由已知抗CD19scFv(VL-VH)HD37产生(Kipriyanov等人，1998,Int.JCancer:77,763-772)。变体v875的抗CD3scFv(OKT3scFv)是通过将公布的OKT3(OrthocloneOKT3，莫罗单抗)可变轻链序列融合至可变重链序列而产生，所述轻链与重链之间具有(GGGGS)3接头。变体v873的抗CD3scFv(博纳吐单抗scFv)是由已知博纳吐单抗(Amgen)抗CD3scFv(VH-VL)序列所产生。
v873在异二聚体Fc的A链上具有抗CD19-(HD37)scFv，且在其B链上具有抗CD3(博纳吐单抗)scFv，以下突变L351Y_F405A_Y407V在A链上，且T366L_K392M_T394W在B链上。
v875在异二聚体Fc的A链上具有抗CD19(HD37)scFv，且在其B链上具有抗CD3(OKT3)scFv，以下突变L351Y_F405A_Y407V在A链上，且T366L_K392M_T394W在B链上。
以下变体是Fc敲除变体，其在两条重链上均包括突变D265S_L234A_L235A。这组突变破坏Fc结合至FcγR。v1661在异二聚体Fc的A链上具有抗CD19BiTETM(HD37)scFv，且在其B链上具有抗CD3(OKT3)scFv，以下突变D265S_L234A_L235A_T350V_L351Y_F405A_Y407V在A链上，且D265S_L234A_L235A_T350V_T366L_K392L_T394W在B链上。
用于改善生物物理性质的杂合异二聚体Fc和工程化构建体：
制备其它双特异性抗CD3-CD19抗原结合构建体1853、6754、10151、6750、6751、6475、6749、10152、10153和6518。这些构建体是基于与变体875相同的抗原结合域，但是用于改善收率和生物物理性质进行工程化。改性包括将一个或两个scFv变成等效Fab形式和/或通过VL-VH二硫键工程化和稳定CDR突变使scFv稳定。
如上所述产生抗CD19scFv和抗CD3scFv序列。抗CD19Fab(HD37Fab)是嵌合Fab，其使用分别融合至人类IgG1CH和CL序列的HD37VH和VL序列。scFv或VH-CH结构域融合至异二聚体Fc的一条链上。抗CD3Fab(hOKT3Fab)是由人源化OKT3抗体替利珠单抗(teplizumab)(EliLilly)的已知序列产生。VH-CH结构域融合至异二聚体Fc的一条链上。
抗CD3和抗CD19scFv二者的scFv二硫键工程化策略(VHVLSS)都利用公布位置VH44和VL100(根据Kabat编号系统)来在scFv的VH与VL之间引入二硫键[Reiter等人，Nat.Biotechnol.14:1239-1245(1996)]。
以下变体包含抗CD3scFv的突变，以改善稳定性和收率，如先前所报道[Kipriyanov等人，Prot.Eng.10(4):445-453(1997)]。v1653、v6475和v10153具有抗CD3(OKT3)，其在VHCDR3的位置100A处具有半胱氨酸到丝氨酸的突变。
如实例7中所述设计其它双特异性抗CD3-CD19抗原结合构建体。对应各双特异性抗CD3-CD19抗原结合构建体的克隆示于表XX中，且各克隆的相应序列组成示于表YY中。
基准对照
v891具有与博纳吐单抗(BiTETM)相同的多肽序列，且包含抗CD3scFv和抗CD19scFv(50kDa)。
实施例2：示例性抗原结合构建体的克隆、表达和纯化
如下克隆和表达实施例1中所述变体(抗原结合构建体)和对照。利用针对人类/哺乳动物表达优化的密码子，经由基因合成构建编码抗体重链和轻链的基因。scFv和Fab序列是由已知抗CD19抗体HD37(HD37，Kipriyanov等人，1998,Int.JCancer:77,763-772)和已知抗CD3单克隆抗体OKT3(ORTHOCLONEOKT3，DrugBank索引：DB00075)、替利珠单抗(MGA031,EliLilly)、博纳吐单抗(Amgen,US2011/0275787)序列产生，并如实施例1中所述构建。
将最终基因产物亚克隆于哺乳动物表达载体pTT5(NRC-BRI,Canada)中，并在CHO细胞中表达(Durocher,Y.,Perret,S.&Kamen,A.High-levelandhigh-throughputrecombinantproteinproductionbytransienttransfectionofsuspension-growingCHOcells.Nucleicacidsresearch30,E9(2002))。
在对数生长期(1.5至2百万个细胞/mL)用1mg/mL25kDa聚乙烯亚胺水溶液(PEI,Polysciences)，以2.5:1的PEI:DNA比转染CHO细胞。(RaymondC.等人Asimplifiedpolyethylenimine-mediatedtransfectionprocessforlarge-scaleandhigh-throughputapplications.Methods.55(1):44-51(2011))。为测定形成异二聚体的最佳浓度范围，DNA是以容许形成异二聚体的重链A(HC-A)、轻链(LC)和重链B的最佳DNA比转染(例如HC-A/HC-B/比＝50:50％(OAAs；HC/Fc)，50:50％。在5至6天后收获转染细胞，在以4000rpm离心后收集培养基，并利用0.45μm过滤器使其澄清。
将澄清培养基加载至MabSelectSuRe(GEHealthcare)蛋白质-A柱上，并用10倍柱体积的pH7.2PBS缓冲液清洗。用10倍柱体积的pH3.6柠檬酸盐缓冲液对抗体进行洗脱，用pH11TRIS中和含所述抗体的混合级分。最后用Econo-Pac10DG柱(Bio-Rad)使蛋白质脱盐。
在一些情况下，通过蛋白质L色谱法，借助如下方法进一步纯化蛋白质。用PBS平衡CaptoL树脂PBS，并将经蛋白质A纯化的v875(用1MTris中和)添加至树脂，并在RT下孵育30min。用PBS清洗树脂，并收集流经物，用0.5ml0.1M甘氨酸(pH3)洗脱结合蛋白。
在一些情况下，通过凝胶过滤进一步纯化蛋白质，将3.5mg抗体混合物浓缩至1.5mL，并经由AKTAExpressFPLC以1mL/min的流速加载至Superdex200HiLoad16/600200pg柱(GEHealthcare)上。pH7.4的PBS缓冲液是以1mL/min的流速使用。收集对应于纯化抗体的级分，浓缩至约1mg/mL，并储存在-80℃下。
所有示例性抗原结合构建体都在CHO3E7细胞中瞬时表达，细胞存活率>80％。
实施例3：呈杂合异二聚体Fc形式或呈全尺寸抗体形式的示例性双特异性抗原结 合构建体(抗CD3-CD19或抗CD3-CD20)的描述、表达和纯化
V5850、v5851、v5852、v6325、v1813、v1821和v1823举例说明双特异性CD3/CD19或CD3/CD20杂合抗原结合构建体。这些双特异性杂合变体是由A链或B链上与替代多肽链上的scFv-Fc配对的Fab组成。异二聚体Fc的A链包括以下突变：T350V_L351Y_F405A_Y407V，且异二聚体Fc的B链包括以下突变：T350V_T366L_K392L_T394W。V1813、v1821和v1823举例说明CD3/CD20共同轻链抗原结合构建体。共同轻链变体是由两条不同Fab)组成，各Fab)在互补异二聚体Fc上，共享一条轻链。表1中指示特异性变体的组成。
至于共同轻链变体，还制备并测试除那些表1中所示以外的组合。
表1.CD3/CD19或CD20杂合变体的组成
v5852中所用抗CD19MOR208_scFv-Fc(VHVL)是通过将公布的重链可变序列融合至表1中所示轻链可变序列而产生，所述重链和轻链之间具有(GGGGS)3(SEQIDNO:380)接头。可变域融合至异二聚体Fc的B链上。
v6325中所用抗CD20奥法木单抗_scFv-Fc(VHVL)是通过将公布的重链可变序列融合至表1中所示轻链可变序列而产生，所述重链和轻链之间具有(GGGGS)3(SEQIDNO:380)接头。可变域融合至异二聚体Fc的B链上。
如实施例2中所指示进行克隆、表达和纯化。
下表2中指示变体的收率和纯度。如下所述通过LCMS分析测定异二聚体纯度。通过LC-MS测试示例性抗原结合构建体的纯度。首先如实施例2中所述通过蛋白质A、蛋白质L和SEC纯化来纯化抗原结合构建体。如下所述进行LC-MS分析得到异二聚体纯度。
在370C下用肽N-糖苷酶F对纯化样品进行去糖基化6小时。MS分析前，将样品注射至PorosR2柱上，并在3分钟内以20-90％ACN、0.1％FA的梯度洗脱，得到单个峰。
借助LTQ-OrbitrapXL质谱仪，利用以下设置分析LC柱的峰：锥孔电压：50V’镜筒透镜：215V；FT分辨率：7,500。用软件Promass或MaxEnt.对质谱进行积分，以产生分子量曲线。
杂合异二聚体Fc构建体和全尺寸mAb变体示出相当的表达量和纯化收率。所有变体展示超过73.8％的异二聚体纯度，所有测试的变体的平均纯度为89.6％。样品具有少量未正确配对的同二聚体，介于总产物的0至5.3％之间。所报告的值代表所有观察到的同二聚体种类的总和。半抗体的存在比同二聚体更常见，且介于总产物的0至20.7％之间。所报告的值代表所有观察到的半抗体种类的总和。
表2.变体表达和纯度
实施例4：双特异性抗原结合构建体结合至T细胞和B细胞。
如下所述经由FACS分析评估示例性CD3/CD20双特异性抗原结合构建体v5850、v6325、v1813、v1821、v1823结合至CD3-和CD20-表达细胞的能力。另外，以类似方式评估示例性双特异性抗CD3-CD19抗原结合构建体v5851和v5852结合至CD3-和CD19-表达细胞的能力。还作为基准测试变体v875，一种呈双重scFv形式的抗CD3-CD19BiTEFc抗体构建体。在属于两个双特异性家族的变体中，对目标B细胞的结合亲和力高于如所设计的效应T细胞。
通过FACS方案进行全细胞结合：
将2×106个细胞/ml细胞(>80％存活率)重新悬浮于L10+GS1培养基中，与抗体稀释液混合，并在冰上孵育1小时。
通过添加10ml冷R-2缓冲液清洗细胞，并在4℃下以233g离心10min。用100μl(1/100稀释液，在L10+GS1培养基中)荧光标记的抗小鼠或抗人类IgG使细胞沉淀物重新悬浮，并在RT下培养1小时。
如先前所述通过添加10ml冷R-2来清洗细胞处理物，并用400μl冷L-2使细胞沉淀物重新悬浮，然后使样品滤过Nitex，并添加至含4μl碘化丙啶的试管中。
通过流式细胞术分析样品。
下文在表4和5中列出各变体的以动力学常数Bmax和Kd表示的结合结果。表4描述结合至表达CD19和CD20的RajiB细胞，而表5描述结合至表达CD3的JurkatT细胞。在Raji结合研究(表4)中，CD19-CD3双特异性双重scFv异二聚体Fc和杂合异二聚体Fc变体以低nM表观亲和力和相当的Bmax结合目标B细胞。抗CD20-CD3双特异性杂合异二聚体Fc和全尺寸共同轻链变体以相当的Bmax结合目标B细胞，且3种共同轻链变体中有2种对目标B细胞显示低nM结合亲和力。
在Jurkat结合研究(表5)中，CD19-CD3双特异性双重scFv异二聚体Fc和杂合异二聚体Fc变体以nM亲和力和相当的Bmax结合T细胞。抗CD20-CD3双特异性杂合异二聚体Fc和全尺寸共同轻链变体以相当的Bmax结合T细胞，且3种共同轻链变体中有1种对T细胞显示nM结合亲和力。
正如预期，所有双特异性抗CD19-CD3构建体以高亲和力结合至CD19B细胞，并以较低亲和力结合至CD3T细胞。双重scFv异二聚体Fc构建体和杂合异二聚体Fc构建体示出相当的结合亲和力。
虽然测试了几种其它的共同轻链抗CD20-CD3全尺寸构建体(数据未示出)，但只有变体1813、1821和1823对目标CD20B细胞和CD3T细胞示出良好结合。
表4(Raji)
表5(Jurkat)
实施例5：双特异性抗CD3-CD19抗原结合构建体和双特异性抗CD3-CD20抗原结合 构建体桥接T细胞和B细胞。
经由FACS分析，按照下文所述程序测试五种示例性抗CD3-CD20抗原结合构建体-即v5850、v6325、v1813、v1821和v1823-和两种示例性抗CD3-CD19抗原结合构建体-即v5851和v5852-桥接T细胞和B细胞的能力。还作为对照测试其它构建体，即v792和v875。V792是在异二聚体Fc的A链和B链上具有基于曲妥珠单抗(trastuzumab)的相同抗Her2F(ab’)的二价抗HER2抗体，以下突变T350V_L351Y_F405A_Y407V在A链上，而T350V_T366L_K392L_T394W在B链上(drugbank登录号-DB00072)
通过FACS的全细胞桥接
用0.3μM适宜CellTrace标记来标记悬浮在RPMI中的1×106个细胞/ml，混合，并在37℃水浴中孵育25分钟。
将沉淀物重新悬浮于2ml的L10+GS1+NaN3中，直到最终浓度为5××106个细胞/ml。
通过流式细胞术分析细胞悬浮液(1/5稀释液)，以验证适当细胞标记和激光器设置。使用Flow-check和flow-set荧光球(Fluorosphere)验证仪器标准化、光学对准和射流(fluidics)。
在流式细胞术验证之后，且在桥接之前，以期望比率将各细胞系混合在一起，最终浓度为1×106个细胞/ml。
用Jurkat-violet+Jurkat-FarRed评估T:T桥接，用RAJI-violet+RAJI-FarRed评估B:B，并用Jurkat-violet+RAJI-FarRed评估T:B桥接。
在室温下，在L10+GS1+NaN3中将抗体稀释至2×，然后添加至细胞中，接着轻轻混合，并孵育30min。
孵育30min后，添加2μl碘化丙啶，缓慢混合，并立即通过流式细胞术分析。
桥接％的计算方法是同时标记violet和Far-red的事件的百分比。
表6和7提供Jurkat-Jurkat、Raji-Raji和Jurkat-Raji之间针对各变体的桥接百分比，各表代表单个实验。所有具有T和B细胞结合互补位的变体(属于双重scFv、杂合和全尺寸(共同轻链)异二聚体Fc形式)都有效桥接Jurkat和Raji细胞。此外，没有变体桥接两个Jurkat细胞，且观察到一些不同程度的Raji-Raji细胞桥接。阴性对照v792未显示特异性(背景)T-B、B:B、T:T桥接。
分析显示，尽管结合域的几何结构和空间距离存在差异，但所有形式，双重scFv异二聚体Fc、杂合异二聚体Fc和全尺寸抗体形式都能够有效桥接T和B细胞。另外，CD19和CD20都可以定向诱导T:B细胞桥接。
表6.全细胞FACSB:T细胞桥接分析
表7.全细胞FACSB:T细胞桥接分析
实施例6:旨在改善生物物理性质的双特异性抗CD3-CD19抗原结合构建体的表达、 纯化和生物物理表征。
如实施例2中所述克隆、表达和纯化实施例1中所述抗原结合构建体，并通过如实施例3中所述的LC/MS和UPLC-SEC估算最终产物的纯度和收率。如实施例4中所述测量可饱和结合至CD19+目标RajiB细胞和CD3+JurkatT细胞的全细胞。
图3A和3B中示出v875和v6754的纯化结果。双重scFv异二聚体Fc变体v875在蛋白质A纯化后示出大量高分子量聚集体，而杂合异二聚体Fc变体v6754示出类似于针对标准治疗单克隆抗体观察到的一个主峰。将双重scFv异二聚体Fc变体和杂合异二聚体Fc变体纯化至>98％同质性，如通过LC/MS和HPLC-SEC确定。
图3C示出优化变体的改善收率和相应的优化策略。具体地，杂合变体的收率和异二聚体纯度相比于v875全面改善。
预期，可如实施例1中所述通过VHVL二硫键稳定化和给scFv添加稳定化CDR突变来进一步改善变体的可制造性。已知，可变域二硫键工程化高度依赖特异性可变轻链和VH-VL界面。这并不适用于所有scFv，且可导致收率显著下降和/或丧失抗原结合性[Miller等人，ProteinEngDesSel.2010年7月；23(7):549-57；Igawa等人，MAbs.2011年5月-6月；3(3):243-5；Perchiacca&Tessier,AnnuRevChemBiomolEng.2012；3:263-86.]。变体v6747是v875的等效变体，两个scFv都如实施例1中所述被VL-VH二硫键稳定化。图3C示出，二硫键稳定化变体v6747相比于v875具有更高收率，且表观结合亲和力无损失。这些实验展示，抗CD19和抗CD3scFv均可通过二硫键工程化来稳定，收率增加且结合亲和力无损失。
实施例7:双特异性抗原结合构建体结合至Raji和Jurkat细胞。
通过如实施例4中所述FACS评估图2中所述双特异性抗原结合构建体1853、6754、6750和6751结合至CD19-和CD3-表达细胞的能力。使用实施例1中所述变体v875和v1661的结合性质作为比较对象。
图4提供结果汇总。所有变体(包括双重scFv异二聚体Fc和杂合异二聚体Fc变体)都以低nM亲和力结合CD19RajiB细胞，并以5-30nM的较低表观亲和力结合CD3T细胞。实施例9：通过FACS分析双特异性抗原结合构建体的T:B-细胞桥接。
通过如下的FACS分析测试改善的双特异性抗CD3-CD19抗原结合构建体桥接T细胞和B细胞并使它们聚集的能力。
简而言之，用0.3μM适宜CellTrace标记来标记悬浮在RPMI中的1×106个细胞/ml，混合，并在37℃水浴中孵育25分钟。
如下制备Jurkat或RAJI细胞。细胞培养物生长至对数期，然后离心。将细胞沉淀物重新悬浮于2ml的L10+GS1+NaN3中，直到最终浓度为5××106个细胞/mL。通过流式细胞术分析细胞悬浮液(1/5稀释液)，以验证适当细胞标记和激光器设置。使用Flow-check和flow-set荧光球验证仪器标准化、光学对准和射流。在流式细胞术验证之后，且在桥接之前，以期望比率将各细胞系混合在一起，最终浓度为1×106个细胞/ml。
用Jurkat-violet+Jurkat-FarRed评估T:T桥接，用RAJI-violet+RAJI-FarRed评估B:B，并用Jurkat-violet+RAJI-FarRed评估T:B桥接。在室温下，在L10+GS1+NaN3中将测试抗体稀释至2×，然后添加至细胞中，接着轻轻混合，并孵育30min。孵育30min后，添加2μl碘化丙啶，缓慢混合，并立即通过流式细胞术分析。桥接％的计算方法是同时标记violet和Far-red的事件的百分比。
图5概述测试的杂合变体的T:B桥接％。这些结果表明，杂合异二聚体Fc变体1853和v6476均能够桥接CD19+RAJI细胞和CD3+Jurkat细胞(右表)，能力可与双重scFv异二聚体Fc变体v875相当。图5中左图示出变体875(双重scFv)和891(scFv)(供参考)在CD19+RAJI细胞和CD3+Jurkat细胞中的桥接结果。
实施例8:通过显微法分析T:B细胞突触(T细胞伪足)
如下评估示例性变体介导形成T细胞突触和伪足的能力。在这个测定中，测试的变体包括875、1661、1853和6476。还测试变体6518，它是全尺寸CD3/CD19双特异性抗体(CD3和CD19抗原结合域都呈Fab形式)。
标记的RajiB细胞(红色)和标记的JurkatT细胞(蓝色)在室温下与3nM人类IgG或v875一起孵育30min。通过离心浓缩细胞悬浮液，随后移除180μl上清液。将细胞重新悬浮于剩余体积中，并以200×和400X成像。
获得显微图像(200X)，进行伪染色，叠加并利用Openlab软件转化为TIFF。然后利用细胞计数器在ImageJ软件中计算细胞数，并分成5个不同群体：
1.只有T(还包括T:T)
2.T与B结合(无伪足)
3.T与B结合(有伪足，即呈现新月状结构的T细胞)
4.只有B(还包括B:B)
5.B与T结合
对于一些细胞，为了正确分类，有必要在Openlab软件中查看原始图像和相位图像。然后，可测定与B细胞结合的总T细胞的％、与具有丝状伪足的B细胞结合的总T细胞的％、与具有丝状伪足的B细胞结合的T细胞的％、与T细胞结合的B细胞的％和总体B:T(％)。
结果示于图6中，且展示杂合异二聚体Fc变体(1853和6476)、全尺寸双特异性(6518)和双重scFv异二聚体Fc(875和1661)形式也可以桥接CD19+RajiB细胞和JurkatT细胞，形成T:B细胞突触(T细胞伪足)，通过对突触进行全细胞FACS分析量化得出比背景高5-8倍，且这是通过相差显微术证明，并在T:B细胞间而不是B:B细胞间形成特异性突触。
分析显示，尽管结合域的几何结构和空间距离存在差异，但是双重scFv异二聚体Fc和杂合异二聚体Fc还有全尺寸抗体形式能够有效桥接T细胞和B细胞，并介导形成T细胞突触和伪足，表明T细胞介导的目标细胞裂解。
实施例9:人类全血中的自体B细胞消耗
分析双特异性CD19-CD3变体在IL2活化条件下消耗人类全血原代细胞培养物中自体B细胞的能力。在这个测定中，测试的变体是双重scFv异二聚体Fc变体875和1661以及杂合异二聚体Fc变体1853、6754、6750和6749(图7A)。在这个测定中，也在独立实验中测试全尺寸双特异性抗体v6518(图7B)。使用没有Fab结合臂的同二聚体Fc作为非特异性对照，在图7A中称为Fc阻断物。
简而言之，变体在IL2存在下于肝素化人类全血中孵育2天。针对各对照和实验条件一式四份地涂铺孔，并在5％CO2、37℃下孵育培养物，并在48小时时终止。收获培养物后，使红血细胞裂解，并对收集的原代细胞进行染色，以进行CD45、CD20和7-AADFACS检测。通过InCyte/FlowJo，如下对CD45+、CD45+/CD20+和CD45+/CD20+/7AAD+/-群体进行FACS分析：通过细胞计数法分析5,000个事件(针对FSC/SSC和补偿孔)至30,000个事件(针对实验孔)。设置阈值以跳过碎片和RBC。对淋巴细胞、CD45+、CD20+和7AAD+细胞进行门控。
图7A和7B示出双特异性抗CD19-CD3抗原结合构建体在IL2孵育后对人类全血中自体B细胞浓度的细胞毒性作用。在这个测定中，所有变体在0.1nM下都能够最大限度消耗CD20+B细胞。
分析显示，尽管结合域的几何结构和空间距离存在差异，但双重scFv、异二聚体Fc和杂合异二聚体Fc以及全尺寸抗体形式可以有效消耗人类原代血培养物中的B细胞。
实施例10:CD19-CD3异二聚体变体在植入IL2活化的人类PBMC和G2白血病细胞的 NSG小鼠中的体内功效
测定所选变体在体内小鼠白血病模型中的功效。在这个模型中，给NSG(NODscidγ)小鼠植入IL2活化的人类PBMC和G2白血病细胞。
作为预备实验，测试所选变体结合至G2白血病细胞系的能力。
体外FACS结合至人类G2ALL肿瘤细胞系：
在CO2缺乏下使预冷却的G2细胞(1×106个活细胞/管)与冰冷的双特异性试剂huCD3xhuCD19一起一式三份地在冰上孵育2小时，所述试剂的浓度为0、0.1、0.3、1、3、10、30和100nM，所述试剂在含10％热灭活的胎牛血清和1％山羊血清(L-10+GS1)的莱博维茨(Leibovitz)L15缓冲液中，最终体积为200ul/管。孵育后，在4ml冰冷的莱博维茨L15中清洗细胞，并将沉淀物重新悬浮在100ul以1/100稀释于L-10+GS1中的冰冷的Alexafluor488-标记的抗人类抗体(JacksonImmunoresearch)中。在黑暗中≥15min后，添加4ml莱博维茨L15，使细胞沉淀，然后重新悬浮在200ul含2ug/ml7AAD的冰冷的流式细胞术运行缓冲液中，随后通过流式细胞术分析。使用平均荧光强度建立结合曲线，由此确定各双特异性试剂针对各细胞系的Kd。
图8显示，示例性变体873、875和1661能够结合G2ALL细胞。
植入IL2活化的人类PBMC和G2白血病细胞的NSG小鼠中的体内功效：
给NOD/SCID/c null(NSG)小鼠(n＝5/组)静脉内植入与3×106个活化的(抗CD3/抗CD28[1珠粒/CD3+细胞]+50UIL2/ml，持续5天)人类PBMC混合的1×105个G2-CBRluc/eGFP细胞，所有小组的小鼠使用单个供体作为细胞来源。利用流式细胞术评估T细胞的活化状态(CD3、CD4、CD8、CD25、CD69、CD45RO、CD62L和CCR7)和存活率(7AAD)。
在PBMC和G2植入1小时后，小鼠接受第一剂量(n-5/组)的双特异性变体，在第0、2和4天时以3mg/kg给药，在第5天时结束。给小鼠注射D-萤光素(150微克/g体重)后出现肿瘤进展，随后在10min后在基线处和在植入后第9、14和18天进行全身生物发光成像(BLI)。在第18天时，处死动物，收获脾进行离体BLI(生物发光成像)。
此外，在第一次3mg/kgIV给药后24小时时，每个组群收集2只动物的血清样品。如实施例17中所述分析血清样品，并在图15中示出24小时血清浓度。结果示于图15C中，从而证实测试的CD3-CD19双特异性变体具有类似IgG1的PK。
图9示出双重scFv异二聚体FcFcgR敲除变体1661对全身和分离脾中的G2白血病细胞植入的作用。V1661示出完全消耗G2ALL细胞，且在ALL的主要受影响器官和组织中没有明显G2植入。
图10示出双重scFv异二聚体Fc变体v875和杂合异二聚体Fc变体v1853的作用，两种变体都具有野生型IgG1Fc(无FcgRKO突变)。在这些条件下，与具有Fc敲除的等效双重scFv异二聚体Fc变体1661相比，变体875和杂合1853(都含野生型Fc)示出在全身成像下的G2消耗水平下降。双重scFv异二聚体和杂合异二聚体Fc构建体尽管形式不同，但都在全身生物发光成像中示出相当的G2消耗水平。
实施例11:双特异性抗CD3-CD19抗原结合构建体在NSG小鼠中的药代动力学
测定在雌性NSG小鼠(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)中以一个剂量水平单次IV施用0.8mg/kg的v875后的药代动力学(PK)。还测定对照单特异性抗体结合至Her2的PK。
简而言之，在第1天通过以1mg/kg的剂量以IV方式注入尾静脉中来施用纯化的v875。在所选时间点(每个时间点3只动物)至多到注射后72小时从下颌下腺静脉或隐静脉收集约0.050mL血样。从初次接受试验的动物获得预处理血清样品。容许血样在室温下凝结15到30分钟。在室温下，在2700rpm下对血样离心10min以获得血清。将血清样品分成3管，并保持在-80℃下，等待分析。
通过标准抗人类-FcalphaLISA测定血清浓度。利用单独测量的纯化的v875的标准曲线测定v875的血清浓度。利用WinnonLin软件5.3版分析血清浓度。
图11示出双重scFv异二聚体Fc变体v875在NSG小鼠中在注射后最初12小时和最初72小时的PK曲线，PK曲线可与IgG对照抗体v506(v506是治疗性抗体曲妥珠单抗(赫塞汀(Genentech))，用作对照)相当。
实施例12:在人类PBMC中通过双特异性异二聚体变体活化T细胞的目标B细胞依赖 性
在人类PBMC中测定通过示例性双特异性异二聚体变体6754活化T细胞对目标B细胞的依赖性。如下文所述进行实验。
从供体收集人类血液(120-140mL)，并从供体新鲜分离PBMC。PBMC经过进一步处理得到亚群i)PBMC和ii)不含B细胞的PBMC(PBMC-B)。在第0天时，通过FACS测定自体B细胞和T细胞。针对各对照和实验条件一式四份地涂铺孔，并在5％CO2、37℃下孵育PBMC培养物，并在72小时时终止。评估培养物中自体T细胞和B细胞各自的比例，和它们的7AAD+细胞含量。将细胞沉淀物重新悬浮于各种抗体混合物中用于进行流式细胞分析。利用Guava8HT流式细胞仪分析细胞亚群。
结果示于表8和图12中。表13提供供体PBMC特征。从健康供体收集的人类PBMC中的平均E:T比是约10:1的CD3+T细胞比CD19+B细胞。
表8：
图12表明，v6754不会活化高达10nM的缺乏B细胞的PBMC培养物中的T细胞，但会在b细胞存在下活化浓度低至0.01nM的全PBMC中的T细胞。v6754在介导最大离体B细胞消耗的浓度下示出严格的目标依赖性T细胞活化(图7))。
实施例13:双特异性异二聚体变体在人类原代血培养物中比对照刺激更少的人类 T细胞增殖
如下文所述评估示例性杂合异二聚体Fc变体6754诱导人类PBMC中自体T细胞增殖的能力。
细胞增殖测定：在第1天，从4个供体中的每一个收集血液，并新鲜分离PBMC。针对0.3和100nM的最终浓度准备测试项目，并与PBMC组合，以250,000个细胞/孔涂铺。孵育混合物3天，此后将氚化胸腺嘧啶添加至含细胞的孔中，最终得到0.5μCi胸腺嘧啶/孔；另外孵育板18小时，此后将板冷冻。总孵育时间为4天。过滤板，并利用β-计数器计数(CPM)。如下从平均值计算刺激指数(SI)，并将数据制成表：测试项目的平均CPM/只有培养基的平均CPM。
结果示于表9和图13中。从健康供体收集的人类PBMC中的平均E:T比是约10:1的CD3+T细胞比CD19+B细胞。
表9：
如图13中所示，商业治疗性抗体莫罗单抗-OKT3在0.3nM下以降序排列介导最大T细胞增殖：891(BiTE)>6754：在此血清浓度下，OKT3和BiTE与不良效应有关(参见例如，Chatenoud等人，JImmunol137(3):830–8(1986)；Abramowicz等人，Transplantation47(4):606–8(1989)；Goebeler等人AnnalsOncology22,增刊4:摘要068(2011)；Bargou等人Science321(5891):974-7(2008)；Topp等人，J.Clin.Oncol.29(18):2493-8(2011)；Klinger等人Blood119(28):6226-33(2010)；和国际专利公布号WO2011051307A1)。通过6754诱导的T细胞增殖显著低于OKT3和BiTE在0.3nM和高达100nM下诱导的T细胞增殖水平。v6754诱导足量T细胞增殖(但水平比基准低得多)，以消耗最多B细胞(图7)。
实施例14:双特异性异二聚体变体在人类原代血培养物中相比对照呈现低细胞因 子释放水平
测定静息人类PBMC中由示例性变体6754诱导的细胞因子释放程度。
细胞因子释放测定：在第1天，从4个供体中的每一个收集血液，并新鲜分离PBMC。针对0.3和100nM的最终浓度准备测试项目，并与PBMC组合，以250,000个细胞/孔涂铺。将混合物孵育4天。孵育后，汇集平行测定的上清液，并利用BDBiosciences的CBAHumanTh1/Th2细胞因子试剂盒II一式两份地用于细胞因子测量。这个试剂盒测量IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF和IFNγ。
结果示于表10和图14中。从健康供体收集的人类PBMC中的平均E:T比是约10:1的CD3+T细胞比CD19+B细胞。
表10：
图14显示，在100nM的浓度下，v6754将IFNγ、TNFa、IL-2、IL-6和IL-10细胞因子水平诱导至比商业治疗性抗体莫罗单抗-OKT3在7nM浓度下时明显更低的水平。在7nM血清浓度下，OKT3与不良效应有关(参见例如Chatenoud等人，JImmunol137(3):830–8(1986)，和
Abramowicz等人，Transplantation47(4):606–8(1989))。BiTE在v6754的相当浓度下诱导类似和更高水平的IFNγ、TNFα、IL-2、IL-6和IL-10细胞因子。v6754在介导最大离体B细胞消耗的浓度下诱导低水平细胞因子(图7)。
实施例15:示例性双特异性杂合异二聚体变体的体内小鼠药代动力学
测定示例性双特异性异二聚体变体1853在小鼠中的药代动力学(PK)。变体1853与变体6754相同，不同的是变体1853不包括CH2突变，其敲除Fc与FcγR的结合。如下文所述进行实验。
NSG小鼠中的药代动力学：测定1853以一个剂量水平在雌性NSG小鼠(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)中单次IV施用3mg/kg后的药代动力学。在第1天通过以3mg/kg的剂量以IV方式注入尾静脉中来施用1853。在所选时间点(每个时间点3只动物)下从下颌下腺静脉或隐静脉收集约0.050mL血样。从初次接受试验的动物获得预处理血清样品。容许血样在室温下凝结15到30分钟。在室温下，在2700rpm下对血样离心10min以获得血清。将血清样品分成3管，并保持在-80℃下，等待分析。通过标准抗人类-FcLuminex测定血清浓度。利用单独测量的纯化的1853的标准曲线测定1853的血清浓度。借助WinNonLin，利用非房室模型分析计算PK参数。
结果示于表11和图15A和B中。
表11：v1853在NSG小鼠中的PK参数
表11示出针对1853所测量的PK参数。图15展示，6754以3mg/kg的单一IV给药在NSG(NODscidgamma,NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠中示出类似IgG1的清除率，且在小鼠中示出>24小时的半衰期(图15B示出利用对数刻度绘制的图15A的数据)。v6754示出典型的类似人类IgG的药代动力学：在小鼠中的半衰期、分布和清除率。
此外，作为如在实施例12中详细描述的体内功效研究的一部分，在最初3mg/kgIV给药后24小时时收集两只动物的血清样品(实施例12)。如上所述分析血清样品，并在图15C中示出24小时血清浓度。IV注射后在24小时时的暴露(图15C)等效于PK研究中观察到的暴露(图15A、B)，证实测试的CD3-CD19双特异性变体的类似IgG1的PK。
实施例16:双特异性异二聚体变体在人源化NSG小鼠中的体内人类B-ALL异种移植 模型中的作用
评估示例性变体v6754在人源化(CD34+)NSG小鼠(E:T约1:5)中体内人类B-ALL异种移植模型中的作用。如下文所述测定v6754在这个模型中消耗自体B细胞(图16)、活化T细胞和使其重新分配(图17)、和调节细胞因子释放(图18)的能力。
人源化(CD34+)NSG小鼠是从Jackson实验室购买。给2周龄NSG(NODscidgamma,NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠注射来自人类胎肝的人类(CD34+)造血干细胞HSC。人源化(CD34+)NSG小鼠在12周内形成人类T细胞和B细胞谱系。人源化(CD34+)NSG小鼠中的平均T细胞比B细胞比率为约1:5。v6754以单一3mg/kgIV注射给药。
在人源化NSG小鼠中的体内功效：如下测试双特异性抗原结合构建体的体内细胞毒性。简而言之，在第1天以3mg/kg给人源化(hCD34+)NSG小鼠注射1个v6754的IV大丸剂，并在注射后第4-6小时时和在第2和5天时测量外周血液、骨髓和脾中的自体循环B细胞和T细胞数量以及人类细胞因子水平。在给人类CD45、CD20、CD4、CD8和CD69作标记后，通过FACS分析T细胞和B细胞群体。测量人类细胞因子IFNγ、TNFα、IL2、IL6、IL10。通过FACS监测外周血液、骨髓和脾中的自体B细胞消耗。将外周血液中的B细胞和T细胞群体归一化为第1天注射前2周时分析的水平。
自体B细胞消耗：图16中示出描绘v6754对消耗自体B细胞的作用的结果。表12示出人源化NSG小鼠在处理前的平均淋巴细胞群体。图16描述人源化NSG小鼠中6754的体内功效。
表12：
如图16中所示，v6754的单次IV给药(3mg/kg)后，在给药后5天，未在人源化NSG小鼠中的外周血液、骨髓和脾中观察到B细胞，E:T比率低，为1:5。
自体T细胞的体内活化和重新分配动力学：如上所述评估人源化(CD34+)NSG小鼠(E:T约1:5)中自体T细胞的v6754介导的体内活化和重新分布动力学。
结果示于图17中。在v6754完全消耗体内自体B细胞的剂量下(图16)，自体T细胞瞬时活化，如通过4小时后的CD69+染色测定。外周T细胞数在注射v6754后几个小时下降，达到最低点，并在<5天后恢复至基线。T细胞活化和血清计数分布下降与博纳吐单抗的公开研究结果类似(参见Klinger等人Blood119(28):6226-33(2010))，但作用更为温和，暗示双特异性抗原结合构建体可介导最大B细胞消耗，相对于博纳吐单抗，T细胞活化水平“适当”。CD3-CD19杂合和双重scFv异二聚体Fc形式允许借助它们的特殊几何结构、所得T细胞接合性质、突触形成和动力学更好控制T细胞活化。
人源化NSG小鼠中的体内细胞因子释放：如上所指出，测量人类细胞因子IFNγ、TNFα、IL2、IL6、IL10。结果示于图18中，且表明单次3mg/kgIV注射后，v6754诱导人源化NSG小鼠中细胞因子释放。细胞因子释放是瞬时的，且在最初的几个小时内达到峰值。3mg/kg剂量下的峰值水平低于公布的临床细胞因子水平。v6754在单次3mg/kgIV注射后诱导温和且瞬时的细胞因子释放。细胞因子释放形式类似于博纳吐单抗的公开研究结果(参见前面的Klinger(2010))，但作用更为温和，再次暗示双特异性抗原结合构建体可在“适当”水平下活化T细胞，实现最大B细胞消耗。
实施例17:具有针对人类和食蟹猴的跨物种结合活性的双特异性CD3-CD19结合构 建体的体外和离体表征
CD19-CD3杂合异二聚体Fc变体5851(实施例2和3中所述克隆和构建)是由已知的可变域构建得到，所述可变域已知可结合人类和食蟹猴CD19和CD3。表达V5851，通过如实施例3-5中所述的LC/MS和全细胞FACS结合来纯化和表征。如实施例11中所述进一步分析纯化的v5851在人类原代血培养物中的离体活性。
图19示出与双重scFv异二聚体Fc变体v875相比，跨物种反应性v5851构建体在IL2孵育后对人类全血中自体B细胞浓度的细胞毒性作用。在这个测定中，两种变体都可以在0.1nM下最大程度消耗CD20+B细胞。
分析显示，尽管两种抗CD3和抗CD19可变域间存在差异，且双重scFv异二聚体Fc与杂合异二聚体Fc变体间的结合域的几何结构存在差异，但双重scFv异二聚体Fc变体v875和跨物种反应性杂合异二聚体Fc变体v5851在0.1nM的最小测量浓度下于人类原代血培养物中示出相当的离体功效。
附加表格
表XX：示例性抗CD3-CD19或抗CD3-CD20抗原结合构建体的变体编号以及重链(H1 和H2)和(如果适用)轻链(L1和L2)的克隆名称。
参见表YY可知克隆的核酸和多肽序列。
变体编号 H1(克隆) H2(克隆) L1(克隆) L2(克隆)
873 1064 1065 n/a n/a
875 1064 1067 n/a n/a
1661 2183 2176 n/a n/a
1653 1842 2167 n/a n/a
5850 3320 2317 2325 n/a
5851 3320 2307 2312 n/a
5852 2304 3322 2309 n/a
6325 2304 3916 2309 n/a
1813 2313 2317 2325 2325
1821 2303 1342 1335 1335
1823 2303 2316 2323 2323
1853 2304 2175 2309 n/a
6754 5239 2185 2309 n/a
10151 5239 6691 2309 n/a
6750 5241 5238 2310 n/a
6751 5242 2176 2310 n/a
6475 2305 2171 2310 n/a
6749 5242 2177 2310 n/a
10152 5242 6689 2310 n/a
10153 5242 6690 2310 n/a
6518 2304 2305 2309 2310
6476 2305 2170 2310 n/a
表YY1：表XX中所述克隆的核酸序列。
表YY2：表YY中所述克隆的多肽序列。
表ZZ：抗原结合多肽构建体的示例性CDR序列

Claims (36)

1.一种分离的双特异性抗原结合构建体，其包含：
第一抗原结合多肽构建体，其单价地和特异性地结合CD19抗原或CD20抗原；
第二抗原结合多肽构建体，其单价地和特异性地结合CD3抗原；
包含第一和第二Fc多肽的异二聚体Fc，所述Fc多肽各自包含修饰的CH3结构域，其中每个修饰的CH3结构域包含不对称氨基酸修饰以促进形成异二聚体Fc和具有约68℃或更高的熔融温度(Tm)的二聚化CH3结构域，其中所述第一Fc多肽通过或不通过第一接头连接至所述第一抗原结合多肽构建体，且所述第二单体Fc多肽通过或不通过第二接头连接至所述第二抗原结合多肽构建体；且
其中所述第一抗原结合多肽构建体为Fab，而所述第二抗原结合多肽构建体为scFv，或所述第一抗原结合多肽构建体为scFv，而所述第二抗原结合多肽构建体为Fab。
2.根据权利要求1所述的分离的双特异性抗原结合构建体，其由变体6754、6751、1853、10151、6475、6749、10152、10153、6476、5850、5851、5852或6325组成。
3.根据权利要求1所述的分离的双特异性抗原结合构建体，其包含变体6754、6751、1853、10151、6475、6749、10152、10153、64765850、5851、5852或6325的至少3个、至少6个或至少12个CDR。
4.根据权利要求1所述的分离的双特异性抗原结合构建体，其中至少一个多肽包含与变体6754、6751、1853、10151、6475、6749、10152、10153、6476、5850、5851、5852或6325中的至少一个多肽至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的分离的双特异性抗原结合构建体，其中
a.所述第一抗原结合多肽构建体包括对CD19具有特异性的抗原结合多肽构建体，其衍生自选自由以下组成的组的抗体：4G7、B4、B43、BU12、CLB-CD19、Leu-12、SJ25-C1、J4.119、B43、SJ25C1、FMC63(IgG2a)、HD237(IgG2b)、Mor-208、MEDI-551和MDX-1342；
b.且所述第二抗原结合多肽构建体包括对CD3具有特异性的结合多肽构建体，其衍生自选自以下的抗体：OKT3、TeplizumabTM(MGA031,EliLilly)、Micromet,blinatumomabTM、UCHT1、NI0401、维西珠单抗、X35-3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、WT31、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2和F101.01；
c.和/或所述抗原结合构建体与a或b中所述的抗体竞争；
d.和/或其人源化形式。
6.根据权利要求5所述的分离的双特异性抗原结合构建体，其中所述第一抗原结合多肽构建体包含与所述对CD19具有特异性的抗原结合多肽构建体至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，且所述第二抗原结合多肽构建体包含与所述对CD3具有特异性的抗原结合多肽构建体至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的分离的双特异性抗原结合构建体，其包含表A的异二聚体Fc或变体6754、6751、1853、10151、6475、6749、10152、10153、6476、5850、5851、5852或6325。
8.根据权利要求1所述的分离的双特异性抗原结合构建体，其中至少一个Fc多肽包含与表A的异二聚体Fc或变体6754、6751、1853、10151、6475、6749、10152、10153、6476、5850、5851、5852或6325中的至少一个Fc多肽至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
9.根据前述权利要求中任一项所述的分离的双特异性抗原结合构建体，其中所述异二聚体Fc
为人类Fc；和/或
为人类IgG1Fc或IgG4Fc；和/或
在至少一个所述CH3结构域中包含一个或多个修饰；和/或
在至少一个所述CH3结构域中包含一个或多个修饰，所述修饰促进形成具有与野生型同二聚体Fc相当的稳定性的异二聚体；和/或
在至少一个所述CH3结构域中包含如表A中所述的一个或多个修饰；
还包含至少一个CH2结构域；和/或
还包含至少一个CH2结构域，其包含一个或多个修饰；和/或
还包含至少一个CH2结构域，其在至少一个所述CH2结构域中包含如表B中所述的一个或多个修饰；和/或
包含一个或多个修饰以促进Fc-γ受体和/或补体的选择性结合。
10.根据前述权利要求中任一项所述的分离的双特异性抗原结合构建体，其中所述二聚化CH3结构域具有68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、77.5、78、79、80、81、82、83、84或85℃或更高的熔融温度(Tm)。
11.根据前述权利要求中任一项所述的分离的双特异性抗原结合构建体，其中每个异二聚体Fc多肽经由接头与每个抗原结合多肽构建体融合。
12.根据权利要求11所述的分离的双特异性抗原结合构建体，其中所述接头为多肽接头。
13.根据权利要求11所述的分离的双特异性抗原结合构建体，其中所述接头包含IgG1铰链区。
14.根据前述权利要求中任一项所述的分离的双特异性抗原结合构建体，其显示减少的Fcγ受体结合且不显示相关免疫细胞介导的效应器活性。
15.根据前述权利要求中任一项所述的分离的双特异性抗原结合构建体，其中所述双特异性抗原结合构建体
能够形成突触并桥接在CD19+RajiB细胞和JurkatT细胞之间，如通过FACS和/或显微术所测定；和/或
介导人类全血中的CD20+B细胞的T细胞定向杀死；和/或
展现相比于v875而言改善的生物物理特性；和/或
展现相比于v875而言改善的收率，例如在SEC(尺寸排阻色谱法)后以>10mg/L表达；和/或
在相当的表达条件下展现高10倍收率的所需同源性物种，和/或
展现例如>95％的异二聚体纯度。
16.根据前述权利要求中任一项所述的分离的双特异性抗原结合构建体，其中所述抗原结合构建体与药物缀合。
17.一种药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的分离的双特异性抗原结合构建体和药物载体。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，所述载体包括缓冲剂、抗氧化剂、低分子量分子、药物、蛋白质、氨基酸、碳水化合物、脂质、螯合剂、稳定剂或赋形剂。
19.一种用于医药中的药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗原结合构建体。
20.一种用于治疗癌症的药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗原结合构建体。
21.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗原结合构建体。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述受试者是人类。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述癌症是造血性癌症、白血病、淋巴瘤、血液癌、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤；对CD19裂解性抗体、CD20裂解性抗体和博纳吐单抗中的至少一个无反应的癌症；在用博纳吐单抗处理后消退的癌细胞、ALL、CLL、NHL、套细胞淋巴瘤、弥散性B细胞疾病以及脑、肺、肝和/或骨转移。
24.一种治疗受试者的病状的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗原结合构建体，其中所述病状为炎性病状、增生性疾病、微量残留癌症、肿瘤性疾病、炎性疾病、免疫紊乱、自身免疫疾病、传染病、病毒性疾病、过敏反应、寄生反应、移植物抗宿主疾病或宿主抗移植物疾病或细胞恶性肿瘤、与B细胞相关的疾病、对用抗CD19抗体和抗CD20抗体中的至少一个进行治疗无反应的疾病。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述自身免疫病状是下列中的一种或多种：多发性硬化症、类风湿性关节炎、红斑狼疮、银屑病性关节炎、银屑病、血管炎、葡萄膜炎、克罗恩氏病和1型糖尿病。
26.一种产生根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗原结合构建体的方法，其包括在适用于表达所述双特异性抗原结合构建体的条件下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码根据前述权利要求中任一项所述的分离的双特异性抗原结合构建体的多核苷酸；以及纯化所述双特异性抗原结合构建体。
27.一种检测或测量样品中的CD3和/或CD19的方法，其包括使所述样品与根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗原结合构建体接触，以及检测或测量结合复合物。
28.一种抑制、减少或阻断细胞中的CD3和/或CD19信号传导的方法，其包括向所述细胞施用有效量的根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗原结合构建体；以及任选地施用小分子或第二抗体。
29.一种分离的多核苷酸或分离的多核苷酸组，其包含编码根据前述权利要求中任一项所述的分离的双特异性抗原结合构建体的至少一个多肽的至少一个核酸序列。
30.根据权利要求29所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸或多核苷酸组为cDNA。
31.一种分离的多核苷酸或分离的多核苷酸组，其编码变体6754、6751、1853、10151、6475、6749、10152、10153、6476、5850、5851、5852或6325中的至少一种多肽。
32.一种载体或载体组，其包含根据权利要求29所述的多核苷酸或多核苷酸组中的一个或多个。
33.一种载体或载体组，其包含根据权利要求29所述的多核苷酸或多核苷酸组中的一个或多个，所述载体选自由质粒、病毒载体、非附加型哺乳动物载体、表达载体和重组表达载体组成的组。
34.一种分离的细胞，其包含根据权利要求29所述的多核苷酸或多核苷酸组，或根据权利要求32所述的载体或载体组。
35.根据权利要求34所述的分离的细胞，所述分离的细胞为杂交瘤、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或HEK293细胞。
36.一种分离的双特异性抗原结合构建体，其由V1813或v1812或v1823组成。
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