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CN105530950A - 包含Gc-巨噬细胞活化因子的组合物及其用途 - Google Patents

包含Gc-巨噬细胞活化因子的组合物及其用途 Download PDF

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CN105530950A CN201480032752.4A CN201480032752A CN105530950A CN 105530950 A CN105530950 A CN 105530950A CN 201480032752 A CN201480032752 A CN 201480032752A CN 105530950 A CN105530950 A CN 105530950A
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pharmaceutical compositions
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伊拉娜·马格利特
迈克尔·沙哈尔
斯韦塔·利夫希茨
阿亚·斯皮策
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Chinese Mugwort Forlan Nanotesla Co Ltd
Original Assignee
Chinese Mugwort Forlan Nanotesla Co Ltd
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Abstract

本发明涉及稳定的药物组合物，所述稳定的药物组合物包含Gc巨噬细胞活化因子(GcMAF)。本发明特别涉及储存稳定的药物组合物，所述储存稳定的药物组合物包含GcMAF和至少一种药学上可接受的表面活性剂和/或具有表面活性的合成的水溶性聚合物，以及其用于治疗与巨噬细胞活化相关的疾病的用途。

Description

包含Gc-巨噬细胞活化因子的组合物及其用途
发明领域
本发明涉及稳定的药物组合物，所述稳定的药物组合物包含Gc巨噬细胞活化因子(GcMAF)。本发明特别涉及储存稳定的药物组合物，所述储存稳定的药物组合物包含GcMAF和至少一种药学上可接受的表面活性剂和/或具有表面活性的合成的水溶性聚合物，以及其用于治疗与巨噬细胞活化相关的疾病的用途。
发明背景
巨噬细胞活化在炎症发展和免疫应答调节中起重要作用。与炎症相关的巨噬细胞活化需要B淋巴细胞和T淋巴细胞和血清维生素D结合蛋白(还称为“组特异性组分”或Gc蛋白)的参与。
Gc蛋白是人血浆α-2巨球蛋白级分的多态糖蛋白，具有52kDa的表观分子量，通常构成人血浆中约0.5％的蛋白。Gc蛋白携带包含具有双分支半乳糖和唾液酸末端的N-乙酰半乳糖胺的三糖。该寡糖被炎症引发的B淋巴细胞的可诱导的膜β-半乳糖苷酶水解以产生巨噬细胞前体活化因子。巨噬细胞前体活化因子继而被T淋巴细胞的膜Neu-1唾液酸酶水解以产生巨噬细胞活化因子(GcMAF)。用固定化的β-半乳糖苷酶和唾液酸酶逐步处理纯化的Gc蛋白也被显示产生GcMAF。
已经显示GcMAF具有破坏肿瘤的作用。证明了因为血清Gc蛋白在癌症患者中被由癌细胞分泌的血清α-N-乙酰半乳糖苷酶(Nagalase)去糖基化，GcMAF活性在这些患者中被消除或降低。因此，去糖基化的Gc蛋白不转化为GcMAF，且巨噬细胞活化被降低或消除。施用外源GcMAF到患有黑素瘤、前列腺癌、结肠直肠癌或转移性乳腺癌的癌症患者显示出GcMAF通过克服活性巨噬细胞不足的治疗效应(Yamamoto等，2008，Int.J.Cancer,122:461-467；Yamamoto等，Trans.Oncol.2008,1:65-72)。在用GcMAF治疗的感染HIV的和骨硬化的患者中观察到对巨噬细胞活化的相似效应。
美国专利号5,177,002公开了产生巨噬细胞活化因子的方法，该方法包括使糖基化的人组特异性组分与β-半乳糖苷酶或β-半乳糖苷酶与唾液酸酶、α-甘露糖苷酶或其混合物的组合体外接触，并获得巨噬细胞活化因子。美国专利号5,177,002还公开了用于在有相应需要的个体中诱导巨噬细胞活化的方法，该方法包括对个体施用由此产生的人巨噬细胞活化因子。
WO93/07288公开了用于产生有效的巨噬细胞活化因子的方法，其中使动物维生素D结合蛋白在体外与(i)β-半乳糖苷酶或(ii)β-半乳糖苷酶与唾液酸酶、α-甘露糖苷酶或其混合物的组合接触。WO93/07288还公开了用于活化巨噬细胞的方法，该方法包括对动物施用由此产生的巨噬细胞活化因子。
WO96/40903公开了维生素D结合蛋白(Gc蛋白)及其小结构域(还被称为结构域III)经由杆状病毒载体的克隆。克隆的Gc蛋白和克隆的结构域III用固定化的β-半乳糖苷酶和唾液酸酶处理以分别产生巨噬细胞活化因子，GcMAFc和CdMAF。WO96/40903还公开了巨噬细胞活化因子用于治疗癌症、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染和骨质疏松的用途。
WO2012/137199公开了包含基本上缺乏糖苷酶的巨噬细胞活化因子(MAF)的药物组合物，及使用其治疗癌症或感染HIV的患者的方法。
Pihl等(Basic&ClinPharm&Toxicol.,2010,107:853-860)公开了对纯化的血浆来源的人Gc蛋白进行的临床前毒理学实验，并指出发现了Gc蛋白在5％麦芽糖的存在下以磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中约10mg/ml的浓度稳定四年，完全保留肌动蛋白结合能力且Gc蛋白的量无显著变化。
Pacini等(CancerImmunol.Immunother.,2011,60:479-485)评价了不同GcMAF制剂在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)测定中它们抑制PGE1-刺激的血管生成的效力，并表明在25℃储存15天减少了约50％的GcMAF效力。
对保持GcMAF化学稳定性和生物活性的储存稳定的GcMAF药物组合物存在未满足的需求。
发明概述
本发明提供了药物组合物，所述药物组合物在储存后具有改进的稳定性，所述药物组合物包含Gc蛋白来源的巨噬细胞活化因子(GcMAF)和至少一种药学上可接受的表面活性剂和/或具有表面活性的合成的水溶性聚合物。本发明还提供了治疗与巨噬细胞活化相关的疾病或紊乱的方法，所述方法包括对需要此类治疗的受试者施用所述稳定的药物组合物。
本发明部分基于以下发现：当将低浓度的GcMAF的含水溶液储存在4℃或冷冻并然后解冻时，该溶液的储存导致了GcMAF的化学稳定性和生物活性的显著损失。
现公开了常规药学上可接受的多肽稳定剂，诸如人血清白蛋白(HSA)、精氨酸和糖醇甘露糖醇，无论单独或组合加入对稳定GcMAF的含水溶液(低于30μg/ml)中的GcMAF基本上无效。
本发明的发明人出乎意料地发现了向具有低浓度GcMAF的含水溶液中加入药学上可接受的表面活性剂克服了在储存后化学稳定性和生物活性损失的问题。例如，加入非离子表面活性剂到1μg/mlGcMAF的含水溶液在4℃、25℃和甚至37℃下多达三个月的储存期间保持GcMAF化学稳定性。本发明的发明人还公开了非离子表面活性剂能够在具有低浓度例如1μg/ml的GcMAF的溶液的一轮或更多轮冷冻和解冻之后保持溶液中的GcMAF。
还公开了非离子表面活性剂不仅在长期储存低浓度GcMAF溶液期间保持了GcMAF化学稳定性，而且如通过巨噬细胞活化测量的，在此储存期间还保存了GcMAF生物活性。
本发明的发明人还公开了离子表面活性剂以及具有表面活性的水溶性聚合物在长期储存期间有效稳定GcMAF。然而，多糖诸如透明质酸或海藻酸盐对GcMAF不发挥显著的稳定效应。因此，本发明的组合物是高度有益的，因为当被配制为低浓度(～100ng/ml到～1mg/ml)GcMAF的液体制剂时，其在长期储存之后，即在4℃下至少六个月之后，保持GcMAF的化学稳定性和生物活性。而且，本发明的组合物简化GcMAF的操作和递送并使冷冻组合物并在解冻后对GcMAF化学稳定性基本上极小或没有影响成为可能，由此进一步避免解冻后立即使用组合物的需要。
根据第一个方面，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含稳定的或稳定化的Gc巨噬细胞活化因子(GcMAF)或其生物活性变体或片段和选自由以下组成的组的至少一种药学上可接受的赋形剂：表面活性剂和水溶性聚合物。
根据一些实施方案，稳定的GcMAF选自由以下组成的组：独立地具有连接到氨基酸残基的N-乙酰半乳糖胺基团的人GcMAF和动物GcMAF。根据一个实施方案，稳定的GcMAF是具有连接到氨基酸残基的N-乙酰半乳糖胺基团的人GcMAF。根据另外的实施方案，稳定的GcMAF包含如SEQIDNO:1到3中的任一个所列出的氨基酸序列。根据另外的实施方案，稳定的GcMAF片段包含相应于Gc蛋白的氨基酸400-435的氨基酸序列。根据还另外的实施方案，稳定的GcMAF片段由如SEQIDNO:4或SEQIDNO:5中列出的氨基酸序列组成。
根据另外的实施方案，当组合物呈液体的形式时，稳定的GcMAF以从约100ng/ml到约1mg/ml范围的浓度存在，可选地当组合物呈液体的形式时，GcMAF以从约100ng/ml到约300μg/ml、另外可选地从约200ng/ml到约30μg/ml且仍另外可选地从约200ng/ml到约1μg/ml范围的浓度存在。每种可能性是本发明的单独的实施方案。根据某个实施方案，当组合物呈液体的形式时，GcMAF以从约200ng/ml到约1μg/ml范围的浓度存在。
根据另外的实施方案，表面活性剂选自由以下组成的组：非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、兼性表面活性剂(amphotericsurfactant)和两性离子表面活性剂(zwitterionicsurfactant)。
根据一些实施方案，非离子表面活性剂选自由以下组成的组：山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧山梨聚糖脂肪酯(polyoxysorbitanfattyacidesters)、聚氧化烯高级醇醚(polyoxyalkylenehigheralcoholethers)和聚氧化烯高级醇酯。非离子表面活性剂的实例包括，但不限于，聚氧乙烯山梨糖醇酯、聚氧乙烯异辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯十二烷基醚、辛基葡萄糖苷和烷基麦芽糖苷。根据还另外的实施方案，非离子表面活性剂选自由以下组成的组：聚山梨醇酯80(80)、聚山梨醇酯60(60)、聚山梨醇酯20(20)、N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷、TritonX-100、Brij58、泊洛沙姆188、泰洛沙泊、PEG-40硬脂酸酯、NP-40、PluronicTMF-68和泊洛沙姆4070。每种可能性是本发明的单独的实施方案。根据某个实施方案，非离子表面活性剂是聚山梨醇酯，例如，聚山梨醇酯80(80)。
根据另外的实施方案，水溶性聚合物是具有表面活性的合成的水溶性聚合物。根据另外的实施方案，具有表面活性的合成的水溶性聚合物选自由以下组成的组：聚乙烯醇、聚环氧丙烷/环氧乙烷嵌段共聚物、乙二醇/丙二醇的共聚物、聚-1,3-二氧戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、丙二醇均聚物和聚氧乙基化多元醇。根据示例性实施方案，具有表面活性的水溶性聚合物是聚乙烯醇。
根据另外的实施方案，药物组合物还可包含张度剂。根据某个实施方案，张度剂是氯化钠。
根据另外的实施方案，该药物组合物还可包含缓冲剂。缓冲剂的实例包括，但不限于，磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、Tris缓冲液和柠檬酸盐缓冲液。
根据还另外的实施方案，药物组合物还可包含药学上可接受的载体或稀释剂。根据某个实施方案，载体是水。
根据仍另外的实施方案，药物组合物以选自由以下组成的组的形式被配制：溶液、悬浮液、乳剂、粉末、片剂和胶囊。根据某个实施方案，组合物以水溶液的形式被配制。根据示例性实施方案，药物组合物包含GcMAF、聚山梨醇酯80、氯化钠、磷酸盐缓冲液和水，其中组合物的pH范围在约5到约8之间，且其中GcMAF在组合物中的浓度范围从约100ng/ml到约1mg/ml、可选地从约100ng/ml到约300μg/ml、还可选地从约200ng/ml到约30μg/ml，及仍还可选地从约200ng/ml到约1μg/ml。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
根据另一个方面，本发明提供了用于治疗与巨噬细胞活化相关的疾病或紊乱的方法，所述方法包括对需要这样治疗的受试者施用治疗有效量的根据本发明的原理的药物组合物。
根据一些实施方案，受试者是人类或动物。根据某个实施方案，动物是宠物动物，诸如狗。
根据另外的实施方案，与巨噬细胞活化相关的疾病或紊乱选自由以下组成的组：癌症、病毒性疾病、细菌感染、自身免疫性疾病、孤独症和慢性疲劳综合症。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
根据另外的实施方案，稳定的GcMAF是独立地具有连接到氨基酸残基的N-乙酰半乳糖胺基团的人GcMAF或动物GcMAF。根据某个实施方案，GcMAF是具有连接到氨基酸残基的N-乙酰半乳糖胺基团的人GcMAF。根据另外的实施方案，GcMAF包含如SEQIDNO:1到3中的任一个中列出的氨基酸序列。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
根据另外的实施方案，药物组合物通过非肠道或通过口服施用途径来施用。根据某个实施方案，药物组合物通过静脉内、肌肉内或通过皮下施用途径来施用。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
根据另一个方面，本发明提供了根据本发明的原理的药物组合物，所述药物组合物用于治疗与巨噬细胞活化相关的疾病或紊乱。
根据所以下的描述、实施例和权利要求书，将更好地理解本发明的这些和其他实施方案。
附图简述
图1A-B示出了在PBS中稀释的GcMAF在人血清白蛋白(HSA)、80或两者的存在或不存在下的蛋白印迹。图1A示出了GcMAF样品的蛋白印迹分析，该GcMAF样品被在单独的PBS中或包含80、HSA或两者的PBS中稀释并然后加载到4-12％聚丙烯酰胺凝胶上用于免疫印迹。图1B示出了GcMAF样品的蛋白印迹分析，该GcMAF样品被在单独的PBS中或包含80、HSA或两者的PBS中稀释，在4℃下孵育一周，并然后加载到4-12％聚丙烯酰胺凝胶上用于免疫印迹。在PBS中稀释的并其后立即经历免疫印迹的Gc蛋白被用作对照。
图2A-E示出了在PBS中稀释的GcMAF在精氨酸、HSA、80或甘露糖醇存在或不存在下的GcMAF的蛋白印迹或在柠檬酸盐缓冲液中稀释的GcMAF的蛋白印迹。将样品在稀释后立即加载(图2A)，或在免疫印迹之前在37℃下孵育一周(图2B)、25℃下孵育两周(图2C)、37℃下孵育一个月(图2D)或37℃下孵育三个月(图2E)。作为对照，Gc蛋白的样品在PBS中(图2A-E)或在包含80的PBS(图2E)中稀释，并立即经历免疫印迹。
图3A-B示出了在PBS中稀释的GcMAF在不同浓度的80的不存在或存在下的蛋白印迹。将样品在稀释后立即加载(图3A)或在免疫印迹之前在37℃下孵育一周(图3B)。作为对照，Gc蛋白的样品在PBS(图3A)中或在包含80的PBS(图3A和3B)中稀释并立即经历免疫印迹。
图示4A-C示出了在PBS中稀释的GcMAF在非离子表面活性剂80、20、泊洛沙姆188和N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷的不存在或存在下的蛋白印迹。该样品在免疫印迹之前在4℃下孵育过夜(图4A)、37℃下一周(图4B)或37℃下一个月(图4C)。在包含0.005％80的PBS中稀释并其后立即经历免疫印迹的Gc蛋白的样品被用作对照。
图5A-C示出了在PBS中稀释的GcMAF在80、58、或TritonX-100、PEG4000、或海藻糖的不存在或存在下的蛋白印迹。将样品在稀释后立即加载(图5A)，或在免疫印迹之前在37℃下孵育一周(图5B)或37℃下孵育一个月(图5C)。在包含0.005％80的PBS中稀释并其后立即经历免疫印迹的Gc蛋白的样品被用作对照。
图6A-B示出了在PBS中稀释的GcMAF在非离子表面活性剂80、20、泊洛沙姆188和N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷的不存在或存在下的蛋白印迹。将样品稀释后立即加载(图6A)或在免疫印迹之前在37℃下孵育一个月(图6B)。在包含0.005％80的PBS中稀释并其后立即经历免疫印迹的Gc蛋白的样品被用作对照。
图7示出了GcMAF在冷冻和解冻之后的蛋白印迹。在PBS中稀释的GcMAF在80的不存在或存在下经历一轮冷冻/解冻，并然后在免疫印迹之前在4℃下或在室温(RT)下孵育不同的时期。作为对照，Gc蛋白的样品在PBS中或在包含0.005％80的PBS中稀释并其后立即经历免疫印迹。
图8示出了GcMAF在三轮冷冻和解冻之后的蛋白印迹。在PBS中稀释的GcMAF样品在80的不存在或存在下经历三轮冷冻和解冻，并其后经历免疫印迹。
图9A-C示出了在PBS中稀释的GcMAF在80、透明质酸、聚乙烯醇(PVA)、海藻酸盐、酪蛋白、十二烷基硫酸钠(SDS)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的不存在或存在下的蛋白印迹。该样品在稀释之后立即加载(图9A)或在免疫印迹之前在37℃下孵育一周(图9B)或37℃下孵育两周(图9C)。作为对照，Gc蛋白的样品在包含0.005％80的PBS中稀释并其后立即经历免疫印迹。
图10A-B示出了在PBS中稀释的GcMAF在80、20、泊洛沙姆188、N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷和聚乙烯醇(PVA)的不存在或存在下的蛋白印迹。样品在稀释之后立即加载(图10A)或在37℃下孵育一周(图10B)。在包含0.005％80的PBS中稀释并其后立即经历免疫印迹的Gc蛋白的样品被用作对照。
发明详述
本发明提供了稳定的药物组合物，所述稳定的药物组合物包含Gc来源的巨噬细胞活化因子(GcMAF)和选自由以下组成的组的药学上可接受的赋形剂：药学上可接受的表面活性剂和药学上可接受的具有表面活性的合成的水溶性聚合物。本发明部分地基于以下发现：当将低浓度的GcMAF的含水溶液储存在4℃时，该溶液的储存导致了GcMAF的化学稳定性和生物活性的显著损失。没有被任何作用机制束缚，表面活性剂的稳定效应可归因于防止或减少可起因于蛋白-表面活性剂直接相互作用和疏水结构域结合的GcMAF聚集和/或降解和/或到容器的表面的吸附。
Gc蛋白和GcMAF
Gc蛋白，还称维生素D结合蛋白(DBP)，是具有特定寡糖与其附连的52kDa表观分子量的血浆蛋白。Gc蛋白可从血清或血浆通过本领域技术人员已知的任何方法来纯化。高纯度的Gc蛋白可通过25羟维生素D3琼脂糖亲和层析从血清或血浆中来分离。Gc蛋白还可通过利用Gc蛋白对肌动蛋白的结合特异性的肌动蛋白-琼脂糖亲和层析来纯化。
可选地，Gc蛋白可从分离的编码Gc蛋白或Gc蛋白小结构域(结构域III)的cDNA来获得。Gc蛋白和Gc结构域III的克隆和表达在美国专利号6,410,269中描述，该专利通过引用如同全部列出而并入本文。其中描述的方法采用在噬菌体λgt11中的人肝脏cDNA文库(Clontech,PaloAlto,CA)用于分离编码人Gc蛋白的全长cDNA，并使用在昆虫细胞中的杆状病毒表达系统用于蛋白表达。然而，优选哺乳动物细胞系统用于表达编码Gc蛋白或其活性片段的cDNA。优选地，在真核细胞中进行表达以使Gc蛋白或其活性结构域被正确地糖基化。可使用本领域已知的任何这样的细胞系统，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、BHK细胞、人胚肾HEK293细胞和酿酒酵母。因此，可使用任何真核表达载体，包括，但不限于，pCI-NEO、pWE3、pcDNA3.1和pCM182。可通过以下在有或没有扩增的情况下进行载体进入选定的细胞系统的插入：例如，通过电穿孔、通过脂质转染诸如TransFectin或通过本领域技术人员已知的任何化学方法。转染可导致瞬时或稳定的表达，两种形式都足够获得期望的Gc蛋白或其片段。然后可通过本领域已知的任何方法从细胞中提取或从生长培养基中收集是活性MAF的前体的表达的蛋白。
Gc蛋白是多态蛋白，其以如由凝胶电泳分析可显示的两种主要表型：Gc1和Gc2出现。Gc1和Gc2基因的整个核苷酸编码序列和预测的氨基酸序列已经被报道(Cook等，1985.J.Clin.Invest.76:2420；Yang等，1985.Proc.Natl.Acad.Sci.USA827994)。Gc1被进一步分为Gc1f和Gc1s亚型，它们由于一个氨基酸残基中的变异而电泳上迁移为两条带(“快”和“慢”)。
Gc1蛋白是人Gc蛋白的主要亚型。它携带分支三糖，分支三糖包含附连到核心蛋白的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)及唾液酸末端(在Gc1f中)或半乳糖和甘露糖末端或唾液酸末端(在Gc1s中)。Gc2具有简单的糖基化模式，其中核心GalNAc附连到末端半乳糖部分。Gc1f寡糖被炎症引发的B细胞的膜β-半乳糖苷酶水解以产生巨噬细前体胞活化因子，巨噬细前体胞活化因子继而被T细胞的唾液酸酶(还称为神经氨酸酶)水解以产生巨噬细胞活化因子(GcMAF)。动物，例如，小鼠和狗，DBP携带二糖，包含具有末端半乳糖的N-乙酰半乳糖胺。该二糖被单独的B细胞的β-半乳糖苷酶的水解产生有效的MAF(还指GcMAF)。
如本文所用的术语“Gc蛋白”或“维生素D结合蛋白”指人或动物Gc蛋白，指所有基因型和多态形式，包括糖基化形式，例如，Gc1、Gc2、Gc1f、Gc1s和Gc1s*，及其生物活性变体和片段。如本文所用的术语“生物活性”变体或片段指在去糖基化之后产生GcMAF变体或片段的Gc蛋白的任何变体或片段，由此产生的GcMAF变体或片段能够活化巨噬细胞，并具有连接到氨基酸残基，通常连接到苏氨酸，的N-乙酰半乳糖胺基团。
根据本发明的一些实施方案，Gc蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列或由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：SEQIDNO:1到3(分别是Gc1f、Gc1s和Gc2)。这些氨基酸序列中的N-乙酰半乳糖胺基团与成熟Gc蛋白的位置418或420上的苏氨酸相连接。
如本文所用的术语“片段”指具有比Gc蛋白的全长氨基酸序列更少的氨基酸(例如，少于SEQIDNO:1到3的Gc蛋白的458个氨基酸)的Gc蛋白的全长氨基酸序列的任何部分，该部分仍包含连接到氨基酸残基通常连接到苏氨酸的N-乙酰半乳糖胺基团，并仍保留巨噬细胞活化活性。通常，全长蛋白的部分是肽、多肽或蛋白。就“肽”而言其意指由不多于50个氨基酸组成的氨基酸序列。就“多肽”而言其意指通常由多于50个氨基酸残基组成的氨基酸序列。就“蛋白”而言其意指一条或更多条共价地附连的多肽链。术语肽、多肽和蛋白在整个说明书中可互换使用。
Gc蛋白片段可包含相应于每种成熟Gc蛋白多态形式的氨基酸400-435的氨基酸序列。可选地，Gc片段可以是相应于成熟蛋白的氨基酸375-458的Gc蛋白结构域III。
相应于成熟Gc蛋白的氨基酸375-458的Gc片段结构域III由如SEQIDNO:4或SEQIDNO:5中列出的氨基酸序列组成。这些氨基酸序列中的N-乙酰半乳糖胺与位置44或46上的苏氨酸相连接。
GC蛋白的生物活性变体或片段应保留期望的天然多肽的生物活性以使变体或片段多肽当被施用到受试者时具有与天然多肽一样的治疗效应。即，变体或片段多肽将以类似于对天然多肽观察到的方式用作药物组合物中的治疗活性组分。术语“变体”指天然Gc蛋白或天然Gc蛋白的片段的变体，其中变体包含具有一个或更多个氨基酸置换、插入或缺失的天然多肽序列的片段或全长。
Gc蛋白的生物活性变体将通常具有与用作比较基础的Gc蛋白的全长氨基酸序列至少50％，优选地至少60％，更优选地至少70％、80％、90％、95％、98％，且最优选地约99％的序列同一性。可选地，生物活性变体具有与用作比较基础的Gc蛋白的结构域III至少70％、80％、90％、95％、98％且最优选地约99％的序列同一性。术语“序列同一性”指当将变体氨基酸序列的指定的连续区段与参考分子的氨基酸序列对齐和比较时在变体多肽和用作参考的多肽分子内发现的相同的氨基酸残基。两个氨基酸序列之间的序列同一性百分比如下计算：通过确定两个序列中出现相同的氨基酸残基的位置的数目，以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以经历与参考分子比较的区段中位置的总数目，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。
当考虑氨基酸序列同一性百分比时，一些氨基酸残基可由于不影响蛋白功能特性的保守氨基酸置换而不同。在这些情况下，可将序列同一性百分比上调以说明保守置换的氨基酸中的相似性。由此，序列内的氨基酸置换可选自氨基酸所属类别的其他成员。例如，非极性(疏含水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、颉氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。这样的置换被称为保守置换。
用特异性糖苷酶逐步去除某些寡糖导致了Gc蛋白转化为高度有效的巨噬细胞活化因子(GcMAF)，如本文以上和在通过引用如同全部列出而并入本文的美国专利号5,177,002中所公开的。GcMAF可通过离子交换层析，例如，阴离子交换层析，和/或通过疏水层析，例如，苯基琼脂糖凝胶层析，被进一步纯化，如在通过引用并入本文的WO2012/137199中所公开的。
GcMAF组合物
液体制剂中低浓度多肽的稳定性可被以下影响：例如，因素诸如pH和/或制剂的离子强度、储存温度、冷冻-解冻重复轮数、到容器的吸附和暴露于机械剪切力(诸如在处理期间)。聚集形成和生物活性的损失还可由于物理搅动和在溶液中多肽分子的相互作用而发生和在储存瓶内的液体-空气交界面发生。由于搅动，蛋白可聚集形成颗粒，并最终与其他吸附的蛋白沉淀。
本发明的药物组合物可包含作为赋形剂的药学上可接受的表面活性剂。术语“表面活性剂”(还称为表面活性试剂)包括降低两种液体之间或液体和固体之间或气体和液体之间的表面张力(或界面张力)的任何试剂。表面活性剂可充当去垢剂、湿润剂、乳化剂、发泡剂和/或崩解剂。表面活性剂可以是以乳剂形式连接组合物中的油和水的乳化剂。本发明中使用的乳化剂包括任何非离子、阴离子、阳离子、两性离子和兼性药学上可接受的表面活性剂，其在用于人或用于动物的药品中有用。
非离子表面活性剂包括，但不限于，山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧山梨聚糖脂肪酯、聚氧化烯高级醇醚和聚氧化烯高级醇酯。由此，非离子型表面活性剂包括聚氧乙烯山梨糖醇酯诸如聚山梨醇酯80(80)、聚山梨醇酯60(60)和聚山梨醇酯20(20)、泰洛沙泊；聚氧乙烯异辛基苯基醚诸如TritonX-100、聚氧乙烯壬基苯基醚诸如NP-40、聚氧乙烯十二烷基醚诸如Brij58、辛基葡萄糖苷和烷基麦芽糖苷诸如n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷；泊洛沙姆4070；泊洛沙姆188；及硬脂酸聚烃氧40酯。每种可能性是本发明的单独的实施方案。优选和泊洛沙姆表面活性剂，因为他们是FDA批准用于人类使用的。
非离子表面活性剂还可包括，但不限于，脂肪醇乙氧基化物(烷基聚乙二醇)；烷基酚聚乙二醇；烷基硫醇聚乙二醇；脂肪胺乙氧基化物(烷基氨基聚乙二醇)；脂肪酸乙氧基化物(酰基聚乙二醇)；聚丙二醇乙氧基化物(PluronicsTM；例如，PluronicF-68)；脂肪酸烷基醇酰胺(脂肪酸酰胺聚乙二醇)；N-烷基-、N-烷氧基聚-羟基-脂肪酸酰胺、蔗糖酯；山梨糖醇酯和聚乙二醇醚、聚氧乙烯-氢化蓖麻油，脂肪酸链烷醇酰胺、蔗糖脂肪酸酯、甘油单辛酸酯、甘油二辛酸酯和甘油三辛酸酯。每种可能性是本发明的单独的实施方案。
阴离子表面活性剂包括，但不限于，烷基硫酸盐、烯烃硫酸盐、醚硫酸盐、单甘油酯硫酸盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、烯烃磺酸盐、烷基磺基琥珀酸盐、芳基磺基琥珀酸盐，包括十二烷基硫酸钠(SDS)、磺基琥珀辛酯磺酸钠、二辛基磺酸钠。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
阳离子表面活性剂包括，但不限于，苄烷铵盐、聚氧化烯烷基胺、烷基胺、链烷醇胺脂肪酸酯、季铵脂肪酸酯、二烷基铵盐、烷基吡啶盐包括硬脂酰胺、油酸三乙醇胺、氯化苄乙铵。每种可能性是本发明的单独的实施方案。
兼性表面活性剂包括，例如，基于咪唑啉的兼性表面活性剂(诸如2-椰油酰基-2-咪唑啉羟基-1-羧基乙氧基-2-钠盐)，基于甜菜碱的表面活性剂(诸如烷基甜菜碱、酰胺甜菜碱和磺基甜菜碱)和酰甲基氨基乙磺酸。每种可能性是本发明的单独的实施方案。
表面活性剂以以下的量存在于本发明的药物组合物中：以按重量计组合物总重的约0.001％到约10％的量、可选地以按重量计约0.001％到约0.5％的量、或以按重量计约0.001％到约0.2％的量、或以按重量计组合物总重的约0.001％到约0.05％的量。
整个说明书和权力要求书中使用的术语“约”指所示出值的±10％。
本发明的组合物可包含水溶性聚合物。水溶性聚合物可以是具有表面活性的合成的聚合物。术语“表面活性”指降低或消除两种液体之间或液体和固体之间或气体和液体之间的表面张力(或界面张力)的试剂的活性。具有表面活性的水溶性聚合物包括，但不限于，聚乙烯醇、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、乙二醇/丙二醇的共聚物、聚-1,3-二氧戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物和聚氧乙基化多元醇。每种可能性是本发明的单独的实施方案。根据某些实施方案，具有表面活性的水溶性聚合物是聚乙烯醇或聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物。
水溶性聚合物还可以是半合成的聚合物。半合成的水溶性聚合物的实例包括水溶性纤维素衍生物，例如，羧甲基纤维素或羟乙基纤维素。
水溶性聚合物以以下范围的量存在于组合物中：按重量计组合物总重的约0.001％到约5％、可选地按重量计约0.001％到约0.5％、还可选地按重量计组合物总重的约0.01％到约0.2％。
本发明的药物组合物还可包含药学上可接受的载体。术语“载体”指与治疗化合物一起施用的稀释剂或媒介物。这样的药学载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物和合成来源的那些，诸如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等，聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成的溶剂。当药物组合物被静脉内施用时，水是优选的载体。盐溶液和含水葡聚糖和甘油溶液还可被用作液体载体，特别是用于注射溶液。
药物组合物还可包含用于调整张力的试剂，包括，但不限于，氯化钠或葡聚糖。使用氯化钠以保持本发明药物组合物适于注射制剂的渗透压，特别是以约25mM到约300mM的量使用。
药物组合物还可包含缓冲剂。“缓冲剂”意指被加入到组合物以在重构时调节溶液制剂或冻干制剂中pH值的试剂。应理解，液体组合物的pH主要通过其对多肽聚集体形成的效应影响包含在其中的多肽的稳定性。因此，缓冲剂存在于本发明组合物中的量取决于GcMAF稳定性的最佳pH。该最佳pH的确定可使用本领域通常可获得的方法来完成。
可被包括在本发明的组合物中的代表性缓冲剂是，例如，磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、Tris缓冲液和柠檬酸盐缓冲液。每种可能性是本发明的单独的实施方案。缓冲剂调整溶液的pH值以保持GcMAF的稳定性。本发明组合物的pH值优选地在约5到约8的范围内。缓冲剂在组合物中的最终浓度在约1mM到约100mM的范围内。
药物组合物还可包含稳定剂。如本文所用的术语“稳定剂”指保持本发明的GcMAF或其任何变体或片段的化学结构和/或生物活性的赋形剂。
在本发明的实践中有用的稳定剂包括，例如，氨基酸诸如精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、或甘氨酸；或蛋白诸如酪蛋白或白蛋白。可选地，稳定剂可以是糖或糖醇。可使用任何糖诸如单糖、双糖或多糖、或水溶性葡聚糖，包括例如海藻糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、葡聚糖、普鲁兰多糖、糊精、环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和纤维素衍生物，例如，羟乙基纤维素和羧甲基纤维素。糖醇被定义为具有-OH基团的C4-C8烃，并包括，例如，甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。每种可能性是本发明的单独的实施方案。以上提到的糖或糖醇可被单独或组合使用。优选地，糖或糖醇的浓度在约1w/v％和约15w/v％之间，更优选地在约2w/v％和约10w/v％之间。稳定剂还可以是多元醇诸如甘油或丙二醇。
另外的稳定剂可以是甲硫氨酸、EDTA或它们的盐的其中一种诸如二钠盐；已知每个都防止多肽甲硫氨酸氧化。
本发明的药物组合物可被配制为液体。液体组合物可被原样储存或可以以冷冻状态储存或以干燥形式储存用于以后重构为液体形式或适用于施用到受试者的其他形式。术语“干燥形式”指通过冷冻干燥(即，冻干法)、喷雾干燥或空气干燥被干燥的液体组合物。例如，GcMAF可被溶解于适合的含水溶剂中诸如用于注射的蒸馏水、缓冲溶液、生理盐水溶液等，且可向其中加入表面活性剂和/或水溶性聚合物，以及任选地缓冲剂、盐和稳定剂，由此获得的溶液可由通过滤器过滤来灭菌。然后，溶液可被储存在4℃或-20℃下，或可被冻干以得到冻干的组合物。
本发明的药物组合物是“稳定的”或“稳定化的”组合物。术语“稳定的”或“稳定化的”组合物指相对于在如本文公开的表面活性剂和/或水溶性聚合物不存在下制备的组合物具有增加的储存稳定性的组合物。这种增加的储存稳定性通常在直接以之后施用的形式储存的液体制剂中被观察到，尽管增加的稳定性还可在以冷冻状态储存并在使用前解冻的液体制剂中、或以干燥形式(诸如冻干的、空气干燥的或喷雾干燥的形式)制备用于之后在使用前重构为液体形式或其他形式的液体制剂中获得。优选地，本发明的组合物以其液体形式储存以充分利用以下便利：具有在液体形式中的增加的储存稳定性、易于施用而不重构、和提供预填充随时可用的注射器或容器中的制剂的能力或如果组合物与抑菌剂兼容作为多剂量制剂的能力。优选地，本发明的组合物在2-8℃下稳定至少一个月、可选地在2-8℃下至少2个月、3个月、4个、5个或至少6个月。可选地，本发明的组合物在37℃下稳定至少一周、或在37℃下至少两周、至少三周、至少四周、至少2个月或至少3个月。每种可能性是本发明的单独的实施方案。本发明的组合物的稳定性可通过在储存之前即在GcMAF产生之后立即和在储存之后测量GcMAF在包含表面活性剂和/或水溶性聚合物的液体组合物中的蛋白含量来确认。由此，稳定组合物意指如下液体组合物，所述液体组合物在2-8℃下储存一个月后具有与储存之前(即，GcMAF产生之后立即)GcMAF的量相比，至少50％的GcMAF蛋白的量，可选地在2-8℃下储存一个月后具有与储存之前GcMAF的量相比至少60％、70％、80％、90％、95％或至少97％的GcMAF蛋白的量。每种可能性是本发明的单独的实施方案。在本发明组合物中的GcMAF是“稳定的”或“稳定化的”。术语“稳定的”或“稳定化的”GcMAF指在包含如本文详细说明的表面活性剂和/或水溶性聚合物的组合物中具有相对于缺乏表面活性剂和/或水溶性聚合物的组合物增加的储存稳定性，例如，化学稳定性，的GcMAF。
如需要，药物组合物还可包含少量的抗菌剂诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；及螯合剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)。
对于经由选定的途径诸如通过注射或输注施用至受试者，药物组合物必须安全、无菌且必须保留GcMAF的期望的治疗活性。
本发明药物组合物可被配制为液体，诸如溶液、悬浮液或乳剂，即，水包油乳剂、油包水乳剂、微米乳剂或纳米乳剂。药物组合物可以以干燥的形式诸如冻干粉末来制备，其可在通过包括非肠道或口服途径施用的任何方法施用之前被重构为液体溶液、悬浮液或乳剂。稳定化的药物组合物优选地通过膜过滤灭菌并储存在单位剂量或多剂量容器中，诸如密封的小瓶或安瓿。制剂的每种可能性是本发明的单独的实施方案。
药物组合物还可采取片剂、胶囊、持续释放制剂等的形式。每种可能性是本发明的单独的实施方案。药物组合物可与传统粘合剂和载体一起配制为栓剂，所述传统粘合剂和载体诸如甘油三脂、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶。
用于口服施用的制剂，例如片剂和胶囊，可包括标准载体诸如药物级别的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合的药物载体的实例在E.W.Martin的“Remington'sPharmaceuticalSciences”中描述。这样的组合物将包含治疗有效量的GcMAF(优选地基本上纯化的形式)以及适合量的载体，以提供用于适当施用到受试者的形式。
GcMAF的用途
本发明提供了用于治疗与巨噬细胞活化相关的疾病或紊乱的方法，所述方法包括对需要这样治疗的受试者施用治疗有效量的根据本发明原理的稳定的药物组合物。
根据一个实施方案，受试者是人。根据另外的实施方案，受试者是动物，诸如家养宠物动物。根据某个实施方案，宠物动物是狗。
“治疗有效量”是可用于治疗或预防与巨噬细胞活化相关的疾病或紊乱的量。
本发明的药物组合物可经由非肠道施用途径被施用，诸如通过静脉内、肌肉内、皮下、动脉内和腹膜内注射或输注。可选地，药物组合物可被局部、经鼻施用，或通过口服施用。每种可能性是本发明的单独的实施方案。在示例性的实施方案中，药物组合物可通过注射优选地通过肌肉内或皮下注射被施用。
向需要治疗的部位局部施用本发明的药物组合物可以是期望的；这可通过例如且不限于以下的方式来实现：手术期间局部输注、局部应用((例如与术后伤口敷料结合))、通过注射、通过导管、通过栓剂、通过医疗补片(patch)或通过植入物，所述植入物是多孔的、非多孔的，或凝胶状材料。根据一些实施方案，施用可通过经由例如注射器在肿瘤或赘生性(neoplastic)组织或赘生前(pre-neoplastic)组织的部位上直接注射。
根据一些实施方案，GcMAF可以以约50ng/注射到约1000ng/注射的剂量来施用。
根据一些实施方案，与巨噬细胞活化相关的疾病或紊乱选自由以下组成的组：癌症、病毒性疾病、细菌感染、自身免疫性疾病和慢性疲劳综合症。
根据另外的实施方案，通过本发明的药物组合物待治疗的癌症包括，但不限于，实体瘤诸如肉瘤、恶性上皮肿瘤、纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、恶性滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌(Wilms'tumorcervicalcancer)、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、卡波西氏肉瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、少突神经胶质瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。每种可能性是本发明的独立的实施方案。根据另外的实施方案，待治疗的癌症是非实体瘤诸如白血病。
根据另外的实施方案，待治疗的病毒性疾病包括与病毒相关的疾病，诸如例如，人类免疫缺陷病毒1和2(HIV-1和HIV-2)，包括耐药菌株、人T细胞白血病病毒1和2(HTLV-1和HTLV-2)、呼吸道合胞体病毒(RSV)、人乳头状瘤病毒(HPV)、腺病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、EB病毒(EBV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒1和2(HSV-1和HSV-2)、人类疱疹病毒8(HHV-8，也称为卡波西肉瘤相关病毒)和黄病毒，包括黄热病病毒、登革热病毒、日本脑炎和西尼罗河病毒、流感病毒。每种可能性是本发明的单独的实施方案。
根据还另外的实施方案，细菌感染包括由选自由以下组成的组的细菌引起的感染，葡萄球菌(staphylococci)，包括：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(甲氧西林耐药性和易感性)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、溶血葡萄球菌(Staphylococcushemolyticus)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、路邓葡萄球菌(Staphylococcuslugdunensis)、头葡萄球菌(Staphylococcuscapitis)、山羊葡萄球菌(Staphylococcuscaprae)、解糖葡萄球菌(Staphylococcussaccharolyticus)、模仿葡萄球菌(Staphylococcussimulans)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)、人葡萄球菌(Staphylococcushominis)、中间葡萄球菌(Staphylococcusintermedius)、伪中间葡萄球菌(Staphylococcuspseudointermedius)和Staphylococcuslyricus；链球菌(streptococci)，包括酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、停乳链球菌亚种停乳链球菌(Streptococcusdysgalactiaesubspeciesdysgalactiae)、咽峡炎链球菌(Streptococcusanginosus)、缓症链球菌(Streptococcusmitis)、唾液链球菌(Streptococcussalivarius)、牛链球菌(Streptococcusbovis)和变形链球菌(Streptococcusmutans)；肠球菌(enterococci)，包括粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)和屎肠球菌(Enterococcusfaecium)；奈瑟氏菌属物种(Nesseriaspecies)，包括淋球菌(Neisseriagonorrhoeae)和脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitides)；梭菌属物种(Clostridiumspecies)，包括艰难梭菌(Clostridiumdifficile)；博代氏杆菌属物种(Bordetellaspecies)，包括百日咳博代氏杆菌(Bordetellapertussis)；芽孢杆菌属物种(Bacillusspecies)，包括炭疽杆菌(Bacillusanthracis)；和棒状杆菌属物种(Corynebacteriumspecies)，包括白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)。每种可能性是本发明的单独的实施方案。
根据另外的实施方案，自身免疫性疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、银屑病、系统性红斑狼疮(SLE)、湿疹、痛风、炎性肠病和多发性硬化症。每种可能性是本发明的单独的实施方案。
本发明的药物组合物还可被用于治疗孤独症。
以下实施例是为了更充分地说明本发明的一些实施方案而呈现。然而，其不应以任何方式被解释为限制本发明的宽范围。本领域技术人员可以容易地设计本文公开的原理的许多变化和修改而不背离本发明的范围。
实施例1
聚山梨糖醇(聚山梨醇酯80)和人血清蛋白对GcMAF稳定性的影响
为确定不同时间段溶液中GcMAF的稳定性，将数种稳定剂加入到GcMAF溶液，并评估GcMAF的量。
如先前所述制备GcMAF(Yamamoto等，2008,CancerImmunol.Immunother.57:1007-1016)。简言之，使用25羟维生素D3-亲和层析从人血清或血浆中纯化Gc蛋白。将纯化的Gc依序与固定化的β-半乳糖苷酶和唾液酸酶孵育以形成GcMAF。将GcMAF通过0.22微米过滤器过滤以灭菌，并然后在包含以下添加剂中的一种的PBSpH7.5中稀释至200ng/ml的终浓度：0.2％聚山梨醇酯80(80)、600ng/ml人血清白蛋白(HSA)或两者。将该溶液过滤并以1ml等分试样无菌地填充进2ml具有橡皮塞和铝盖的玻璃小瓶中，并保持在4℃下。Gc或GcMAF在时间0和一周后的检测通过在4-12％聚丙烯酰胺凝胶上每个泳道加载总量2.6ngGc或GcMAF由蛋白印迹分析来进行。将该凝胶电泳并转移到硝酸纤维素(NC)膜，该膜用多克隆兔抗Gc抗体，随后是缀合到碱性磷酸酶的山羊抗兔抗体和化学发光检测来探测。
图1A示出了在时间点0(制备稀释的样品当天)进行的蛋白印迹分析。如该图所示，在所有样品中检测到了GcMAF，然而，在80的存在下稀释的样品显示了比在仅PBS或在PBS和HSA中稀释的样品更强的带强度。在PBS中稀释的商品Gc蛋白(Calbiochem)被用作对照并显示了与在PBS中稀释的GcMAF相似的强度。
图1B示出了在4℃下放置一周的GcMAF或Gc样品的蛋白印迹分析。包含80的GcMAF样品显示了相似于由新鲜稀释的商品Gc蛋白获得的强带强度。在PBS中稀释的GcMAF样品显示了与在包含80的PBS稀释的GcMAF样品获得的相比微弱的强度。在包含HSA的PBS中稀释的GcMAF样品显示了比在仅PBS稀释的GcMAF样品更强，但比包含80的GcMAF样品更弱的强度。由此，在4℃下储存一周后，发现0.2％浓度的80保持溶液中的GcMAF，并且示出这种非离子表面活性剂在保存GcMAF稳定性上比HSA更有效。
当将GcMAF样品储存在聚丙烯瓶中时，获得了相似的带强度。
实施例2
GcMAF在不同温度下持续不同时间段的稳定性
GcMAF如在本文以上实施例1中所述来制备。简言之，使用25羟维生素D3-亲和层析从人血清或血浆中纯化Gc蛋白。将纯化的Gc依序与固定化的β-半乳糖苷酶和唾液酸酶孵育以形成GcMAF。将GcMAF通过0.22微米过滤器过滤以灭菌。然后将其在以下不同缓冲溶液中稀释至200ng/ml的终浓度：PBSpH7.5或柠檬酸盐缓冲液pH5.5。PBS溶液还包含以下添加剂中的一种：0.01％80、600ngHSA或50μM精氨酸。所有溶液在2％甘露糖醇的存在或不存下来制备。然后将该溶液过滤并以1ml等分试样无菌地填充进2ml具有橡皮塞和铝盖的玻璃小瓶，并保持在不同温度(4℃、25℃和37℃)下。样品在不同时期下通过在4-12％聚丙烯酰胺凝胶上每个泳道加载总量2.6ng的Gc蛋白或GcMAF的蛋白印迹分析来分析。将该胶电泳并转移到NC膜，该膜用多克隆兔抗Gc抗体，随后是缀合到碱性磷酸酶的山羊抗兔抗体和化学发光检测来探测。
图2A示出了在时间点0(制备稀释的样品当天)进行的蛋白印迹分析。所有GcMAF样品显示了与标准商品Gc蛋白(Calbiochem)相比的相似强度的可见的带。
图2B示出了在37℃下孵育一周的GcMAF样品的蛋白印迹分析。还评估了在4℃下在仅PBS中孵育的GcMAF样品。如该图所示，当将GcMAF样品在包含80的PBS中稀释时，观察到强的强度。对这些GcMAF样品观察到的强度与通过新鲜稀释的Gc样品获得的相似。人血清白蛋白(HSA)在保持GcMAF稳定上示出比80更低的活性。
图2C示出了在25℃下孵育2周的GcMAF样品的蛋白印迹分析。还评估了在4℃下在仅PBS中孵育的GcMAF样品。如该图所示，当将GcMAF样品在包含80的PBS稀释时，观察到强的强度。对这些GcMAF样品观察到的强度与通过新鲜稀释的商品Gc样品获得的相似。人血清白蛋白(HSA)在保持GcMAF稳定上示出比80更低的活性。
图2D和2E示出了包含TWEEN80的GcMAF样品在37℃下孵育一个月(图2D)或三个月(图2E)与新鲜稀释的Gc样品相比的蛋白印迹分析。如该图所示，在80的存在下孵育的GcMAF样品显示了与对新鲜稀释的Gc蛋白观察到的强度相似的高强度。该高带强度甚至在37℃下孵育三个月后(大致相当于在4℃下24个月)被获得。
ELISA通过如下来进行：将Gc或GcMAF样品吸附到96孔板，用兔多克隆抗Gc抗体随后是HRP缀合的抗兔山羊抗体探测并通过吸光度检测。在37℃下孵育3.5个月的包含0.01％80的样品的吸光度与新鲜稀释的Gc蛋白(210ng/ml)的吸光度相同。
生物活性测试通过测量在用GcMAF(0.2ng/μl)刺激后RAW264.7小鼠巨噬细胞系中过氧化氢(H2O2)的释放确定巨噬细胞活化来进行。相对于没有GcMAF的对照的2倍和更高的值被认为是活性的。在37℃下孵育3.5个月的包含80(0.01％)的GcMAF样品中观察到过氧化氢的释放(>2倍)。
实施例3
不同浓度的80对GcMAF稳定性的影响
GcMAF如在本文以上实施例1中所述来制备。简言之，使用25羟维生素D3-亲和层析从血清或血浆中纯化Gc蛋白。将纯化的Gc蛋白依序与固定化的β-半乳糖苷酶和唾液酸酶孵育以形成GcMAF。将GcMAF通过0.22微米过滤器过滤以灭菌。然后将其在包含范围从0％到0.01％的不同浓度的非离子去垢剂80的PBSpH7.5中稀释至200ng/ml的终浓度。将该溶液过滤并以1ml等分试样无菌地填充进2ml具有橡皮塞和铝盖的玻璃小瓶，并保持在37℃下。样品在不同时间点下通过在4-12％聚丙烯酰胺凝胶上每个泳道加载总计2.6ng的Gc或GcMAF的蛋白印迹分析来分析。将该胶电泳并转移到NC膜，该膜用多克隆兔抗Gc抗体，随后是缀合到碱性磷酸酶的山羊抗兔抗体和化学发光检测来探测。
图3A示出了在时间点0(制备稀释的样品当天)进行的蛋白印迹分析。所有样品显示了与标准商品Gc蛋白(Calbiochem)相比的相似强度。
图3B示出了在37℃下孵育一周的GcMAF或Gc样品的蛋白印迹分析。包含80(甚至在0.001％的浓度)的GcMAF样品显示了具有与由新鲜稀释的Gc蛋白获得的相似强度的清晰可见的带。在仅PBS(不存在去垢剂)制备的GcMAF样品显示了与标准Gc蛋白相比非常弱的强度。因此，0.001％或更高浓度的80对保持溶液中的GcMAF在高度有效，并因此对保存其稳定性高度有效。
实施例4
多种非离子去垢剂对GcMAF稳定性的影响
GcMAF如在本文以上实施例1中所述来制备。简言之，使用25羟维生素D3-亲和层析从血清或血浆中纯化Gc蛋白。将纯化的Gc蛋白依序与固定化的β-半乳糖苷酶和唾液酸酶孵育以形成GcMAF。将GcMAF通过0.22微米过滤器过滤以灭菌。然后将其在不存在或存在以下指定浓度的非离子表面活性剂的PBSpH7.5中稀释至200ng/ml的终浓度：80(0.005％)、20(0.005％、0.01％或0.02％)、泊洛沙姆188(0.02％、0.1％或0.2％)和N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷(0.01％、0.02％或0.05％)。将该溶液过滤并以1ml等分试样无菌地填充进2ml具有橡皮塞和铝盖的玻璃小瓶，并在37℃下以倒置位置或在4℃下来保持。样品(一式两份)在不同时间点下通过在4-12％聚丙烯酰胺凝胶上每个泳道加载总计2.6ng的Gc或GcMAF的蛋白印迹分析来分析。将该凝胶电泳并转移到NC膜，该膜用多克隆兔抗Gc抗体，随后是缀合到碱性磷酸酶的山羊抗兔抗体和化学发光检测来探测。
图4A示出了在4℃下孵育过夜后进行的蛋白印迹分析。除了在4℃下过夜后的表面活性剂的不存在下孵育的样品几乎检测不到外，所有样品显示了与标准商品Gc蛋白(Calbiochem)相比相似的染色强度。
图4B示出了在37℃下孵育一周的GcMAF或Gc样品的蛋白印迹分析。在非离子表面活性剂(在所有测试的浓度)的存在下孵育的GcMAF样品显示了与由新鲜稀释的Gc蛋白获得的相似的染色强度。在仅PBS中制备并在表面活性剂不存在下孵育的GcMAF样品在这些条件下未被检测到。
图4C示出了在37℃下孵育一个月的GcMAF或Gc样品的蛋白印迹分析。在非离子表面活性剂(在所有测试的浓度)的存在下孵育的GcMAF样品示出了具有与由新鲜稀释的Gc蛋白获得的相似的染色强度的清晰可见的带。在仅PBS(在表面活性剂的不存在下)中孵育的GcMAF样品是不可见的。因此，非离子表面活性剂诸如聚山梨醇酯20、N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷或泊洛沙姆188，甚至当在37℃下储存一个月时，对保持溶液中的GcMAF高度有效，并因此这些非离子表面活性剂对保存GcMAF稳定性有用。
实施例5
非离子表面活性剂和其他稳定剂对GcMAF稳定性的影响
GcMAF如在本文以上实施例1中所述来制备。简言之，使用25羟维生素D3-亲和层析从血清或血浆中纯化Gc蛋白。将纯化的Gc依序与固定化的β半乳糖苷酶和唾液酸酶孵育以形成GcMAF。将GcMAF通过0.22微米过滤器过滤以灭菌。然后将其在不存在或存在下以下指定浓度的非离子表面活性剂的或存在稳定剂海藻糖(1％或2％)和PEG4000(1％或3％)的PBSpH7.5中稀释至200ng/ml的终浓度：80(0.005％)、TritonX100(0.06％或0.12％)和58(0.015％或0.05％)。将该溶液过滤并以1ml等分试样无菌地填充进2ml具有橡皮塞和铝盖的玻璃小瓶，并在37℃下以倒置位置来保持。样品(一式两份)在不同时间点下通过在4-12％聚丙烯酰胺凝胶上每个泳道加载总计2.6ng的Gc或GcMAF的蛋白印迹分析来分析。将该凝胶电泳并转移到NC膜，该膜用多克隆兔抗Gc抗体，随后是缀合到碱性磷酸酶的山羊抗兔抗体和化学发光检测来探测。
图5A示出了在时间点0(制备稀释的样品当天)进行的蛋白印迹分析。除了在去垢剂不存下孵育的样品且该样品轻微较弱以外，所有样品显示了与标准商品Gc蛋白(Calbiochem)相比的相似的染色强度。
图5B示出了在37℃下孵育一周的GcMAF或Gc样品的蛋白印迹分析。在非离子表面活性剂(在所有测试的浓度)的存在下孵育的GcMAF样品显示了具有与由新鲜稀释的Gc蛋白获得的相似强度的清晰可见的带。在仅PBS(不存在表面活性剂)中孵育的GcMAF样品是检测不到的，且在海藻糖或PEG4000的存在下孵育的样品是几乎检测不到的。
图5C示出了在37℃下孵育一个月的GcMAF或Gc样品的蛋白印迹分析。在非离子表面活性剂(在所有测试的浓度)的存在下孵育的GcMAF样品显示了具有与由新鲜稀释的Gc蛋白获得的相比仅轻微较弱强度的清晰可见的带。在仅PBS(不存在表面活性剂)中或用所有测试浓度的海藻糖或PEG4000孵育的GcMAF样品在这些实验条件下是检测不到的。因此，发现非离子表面活性剂，例如，TritonX-100和Brij58甚至在37℃下储存一个月后保存GcMAF的稳定性。发现海藻糖或PEG4000不太有效。
实施例6
非离子表面活性剂对高浓度GcMAF的稳定性的影响
GcMAF如在本文以上实施例1中所述来制备。简言之，使用25羟维生素D3-亲和层析从血清或血浆中纯化Gc蛋白。将纯化的Gc蛋白依序与固定化的β-半乳糖苷酶和唾液酸酶孵育以形成GcMAF。将GcMAF通过0.22微米过滤器过滤以灭菌。然后将其在包含以下不同浓度的非离子表面活性剂的PBSpH7.5中稀释至2.5μg/ml的终浓度：80(0.005％)、20(0.005％)、泊洛沙姆188(0.05％)和十二烷基麦芽糖苷(0.01％)。将该溶液过滤并以1ml等分试样无菌地填充进2ml具有橡皮塞和铝盖的玻璃小瓶，并在37℃下以倒置位置来保持。样品(一式两份)在不同时间点下通过ELISA和在4-12％聚丙烯酰胺凝胶上每个泳道加载总计5ng的Gc或GcMAF的蛋白印迹分析来分析。将该凝胶电泳并转移到NC膜，该膜用多克隆兔抗Gc抗体，随后是缀合到碱性磷酸酶的山羊抗兔抗体和化学发光检测来探测。
图6A示出了在时间点0(制备样品之后立即)进行的蛋白印迹分析。所有样品示出了与标准商品Gc蛋白(Calbiochem)相比相似的染色强度。
图6B示出了在37℃下孵育一个月的GcMAF或Gc样品的蛋白印迹分析。在非离子表面活性剂的存在下孵育的GcMAF样品显示了具有与由新鲜稀释的Gc蛋白获得的相似强度的清晰可见的带。在仅PBS(不存在表面活性剂)中孵育的GcMAF样品显示了与新鲜制备的标准GC或包含表面活性剂的GcMAF样品相比显著较弱的染色。
ELISA通过如下来进行：将Gc或GcMAF样品吸附到96孔板，用兔多克隆抗Gc抗体随后是HRP缀合的抗兔山羊抗体探测并通过吸光度检测。在非离子表面活性剂的存在下在37℃孵育1个月的GcMAF样品显示了与样品在时间0时相似的吸光度。在表面活性剂不存在下在PBS中孵育的GcMAF显示了浓度的显著降低(时间0时信号的39％)。
实施例7
在非离子表面活性剂的存在或不存在下时间和储存温度对GcMAF解冻后其稳定性的影响
GcMAF如在本文以上实施例1中所述来制备。简言之，使用25羟维生素D3-亲和层析从血清或血浆中纯化Gc蛋白。将纯化的Gc蛋白依序与固定化的β-半乳糖苷酶和唾液酸酶孵育以形成GcMAF。将GcMAF通过0.22微米过滤器过滤以灭菌。然后将其在PBSpH7.5中或在包含0.005％80的PBS中稀释至200ng/ml的终浓度。将该溶液过滤并以1ml等分试样无菌地填充进2ml具有橡皮塞和铝盖的玻璃小瓶，并冷冻在-20℃下。将样品(一式两份)解冻并保持在RT或4℃下直到过夜并在不同时间点通过在4-12％聚丙烯酰胺凝胶上每个泳道加载总计2.6ng的Gc或GcMAF的蛋白印迹分析来分析。将该凝胶电泳并转移到NC膜，该膜用多克隆兔抗Gc抗体，随后是缀合到碱性磷酸酶的山羊抗兔抗体和化学发光检测来探测。
图7示出了蛋白印迹分析的结果。包含80的GcMAF样品甚至在解冻后在RT下储存过夜之后显示了与包含80的新鲜GC样品相似的染色强度，而在仅PBS中的样品在解冻并在RT下储存过夜后是检测不到的。甚至当在PBS制备的GcMAF在解冻后立即(时间0；图7)被加载在聚丙烯酰胺凝胶上时，注意到了GcMAF带强度的显著降低。GcMAF在表面活性剂的不存在下在RT或在4℃储存5小时导致GcMAF带强度的另外的降低，表明GcMAF(不存在非离子表面活性剂诸如80)甚至在短期孵育后是不稳定的。因此，示出了80加入到GcMAF当经历冷冻时在解冻后保持GcMAF的稳定性。
实施例8
聚山梨醇酯80对GcMAF聚集体/二聚体形成的影响
GcMAF如在本文以上实施例1中所述来制备。简言之，使用25羟维生素D3-亲和层析从血清或血浆中纯化Gc蛋白。将纯化的Gc依序与固定化的β-半乳糖苷酶和唾液酸酶孵育以形成GcMAF。将GcMAF通过0.22微米过滤器过滤以灭菌。然后将其在PBSpH7.5中或在包含0.005％80的PBS中稀释至6μg/ml的终浓度。使样品经历三轮冷冻和解冻以增加聚集体形成。将样品(一式两份)通过在4-12％聚丙烯酰胺凝胶上每个泳道加载总计75ng的GcMAF的蛋白印迹分析来分析。将该凝胶电泳并转移到NC膜，该膜用多克隆兔抗Gc抗体，随后是缀合到碱性磷酸酶的山羊抗兔抗体和化学发光检测来探测。
图8示出了在包含0.005％80的PBS中制备的样品显示了大约52kDaMW的高强度带和大约100kDaMW的非常弱的带(可能地分子二聚体)。在80不存在下制备的样品显示了相同强度的52kDa带，然而大约100kDa的高MW带更强。这些结果指示80能够减少GcMAF的聚集体/二聚体形成。
实施例9
离子表面活性剂、水溶性聚合物和其他稳定剂对GcMAF稳定性的影响
GcMAF如在本文以上实施例1中所述来制备。简言之，使用25羟维生素D3-亲和层析从血清或血浆中纯化Gc蛋白。将纯化的Gc蛋白依序与固定化的β-半乳糖苷酶和唾液酸酶孵育以形成GcMAF。将GcMAF通过0.22微米过滤器过滤以灭菌。然后将其在存在以下指定浓度的表面活性物质的PBSpH7.5中稀释至200ng/ml的终浓度：80(0.005％)、SDS(0.02％)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)k90(0.2％)、聚乙烯醇(30-70kD)、酪蛋白钠(0.2％)、海藻酸钠(0.2％)和透明质酸(0.15％)。将该溶液过滤并以1ml等分试样无菌地填充进2ml具有橡皮塞和铝盖的玻璃小瓶，并在37℃下以倒置位置来保持。样品(一式两份)在不同时间点通过在4-12％聚丙烯酰胺凝胶上每个泳道加载总计2.6ng的Gc或GcMAF的蛋白印迹分析来分析。将该凝胶电泳并转移到NC膜，该膜用多克隆兔抗Gc抗体，随后是缀合到碱性磷酸酶的山羊抗兔抗体和化学发光检测来探测。
图9A示出了在时间点0(制备样品之后立即)进行的蛋白印迹分析。除了包含酪蛋白样品显示了较弱信号以外，所有样品显示了与标准商品Gc蛋白(Calbiochem)相比相似的染色强度。
图9B示出了在37℃下孵育1周后的GcMAF的蛋白印迹分析。包含非离子表面活性剂80、离子表面活性剂SDS或表面活性聚合物PVA的GcMAF样品显示了具有与由新鲜稀释的Gc蛋白获得的相似强度的清晰可见的带。在仅PBS中或在包含海藻酸钠的PBS中制备的GcMAF样品是不可见的。在透明质酸、PVP或酪蛋白存在下制备的样品显著较弱。因此，发现不具有表面活性的水溶性聚合物PVP在稳定GcMAF上不太有效。
图9C示出了GcMAF在37℃下孵育2周后的蛋白印迹分析。包含非离子表面活性剂80、离子表面活性剂SDS或表面活性聚合物PVA的GcMAF样品显示了具有与由新鲜稀释的Gc蛋白获得的相似强度的清晰可见的带。在仅PBS中或在包含海藻酸钠或透明质酸的PBS中制备的GcMAF样品是不可见的。在包含PVP或酪蛋白的PBS中制备的样品比新鲜稀释的Gc蛋白带显著更弱。
这些结果表明离子表面活性剂SDS在保持GcMAF稳定性上高度有效。具有表面活性的水溶性聚合物PVA也显示了在保持GcMAF稳定性上有效。然而，示出了多糖透明质酸和海藻酸盐对保持溶液中的GcMAF不太有效。
实施例10
GcMAF在80存在下的生物活性
GcMAF如在本文以上实施例1中所述来制备。简言之，使用25羟维生素D3-亲和层析从血清或血浆中纯化Gc蛋白。将纯化的Gc蛋白依序与固定化的β-半乳糖苷酶和唾液酸酶孵育以形成GcMAF。将GcMAF通过0.22微米过滤器过滤以灭菌。然后将其在包含0.005％80的PBSpH7.5中稀释至200ng/ml或1μg/ml的终浓度。将该溶液过滤并以1ml等分试样无菌地填充进2ml具有橡皮塞和铝盖的玻璃小瓶，并保持在20℃(直立位置)下0、1、3、6和12个月，或在4℃下以倒置位置持续0、1、3和6个月。样品在储存结束时通过生物活性测试来分析。
生物活性测试通过测量在用GcMAF刺激后RAW264.7小鼠巨噬细胞系中过氧化氢(H2O2)的释放确定巨噬细胞活化来进行。相对于没有GcMAF的对照2倍和更高的值被认为是活性的。在以上提到的时间点测试的所有GcMAF样品中观察到过氧化氢的释放(>2倍)，表明GcMAF在4℃下保持其生物活性至少6个月或当冷冻在-20℃下时12个月。
实施例11
非离子表面活性剂或PVA对GcMAF的化学和生物稳定性的影响
GcMAF如在本文以上实施例1中所述来制备。简言之，使用25羟维生素D3-亲和层析从血清或血浆中纯化Gc蛋白。将纯化的Gc蛋白依序与固定化的β-半乳糖苷酶和唾液酸酶孵育以形成GcMAF。将GcMAF通过0.22微米过滤器过滤以灭菌。然后将其在包含以下指定浓度的赋形剂的PBSpH7.5中稀释至200ng/ml的终浓度：80(0.005％)、20(0.005％)、泊洛沙姆188(0.05％)、N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷(0.01％)和具有表面活性的水溶性聚合物PVA(0.2％)。将该溶液过滤并以1ml等分试样无菌地填充进2ml具有橡皮塞和铝盖的玻璃小瓶，并在37℃下以倒置位置来保持。样品(一式两份)通过在4-12％聚丙烯酰胺凝胶上每个泳道加载总计2.6ng的Gc或GcMAF的蛋白印迹分析来分析。将该凝胶电泳并转移到NC膜，该膜用多克隆兔抗Gc抗体，随后是缀合到碱性磷酸酶的山羊抗兔抗体和化学发光检测来探测。
图10A示出了在时间点0(制备样品之后立即)进行的蛋白印迹分析。所有样品示出了与标准商品Gc蛋白(Calbiochem)相比相似的染色强度。
图10B示出了在37℃下孵育一周后的GcMAF或Gc样品的蛋白印迹分析。在指定的非离子表面活性剂或聚合物PVA的存在下孵育的GcMAF样品显示了具有与由新鲜稀释的Gc蛋白获得的相似强度的清晰可见的带。在仅PBS(不存在表面活性剂)中孵育的GcMAF样品显示了与新鲜制备的标准GC或在表面活性剂存在下孵育的GcMAF样品相比显著较弱的染色。
生物活性测试通过测量在用GcMAF刺激后RAW264.7小鼠巨噬细胞系中氧化氢(H2O2)的释放确定巨噬细胞活化来进行。相对于没有GcMAF的对照2倍和更高的值被认为是活性的。在37℃下1周后在包含非离子表面活性剂和聚合物的GcMAF样品中观察到过氧化氢的释放(>2倍)，表明GcMAF保持其生物活性。
本领域技术人员将理解本发明不限于本文以上已经被具体显示和描述的内容。而本发明的范围由随后的权利要求书来限定。

Claims (32)

1.一种药物组合物，所述药物组合物包含稳定的Gc巨噬细胞活化因子(GcMAF)或其生物活性变体或片段及选自由以下组成的组的至少一种药学上可接受的赋形剂：表面活性剂和具有表面活性的合成的水溶性聚合物。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述稳定的GcMAF具有连接到氨基酸残基的N-乙酰半乳糖胺基团，且选自由以下组成的组：人GcMAF和动物GcMAF。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述稳定的GcMAF是具有连接到氨基酸残基的N-乙酰半乳糖胺基团的人GcMAF。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述稳定的GcMAF包含SEQIDNO:1到3中的任一个所列出的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述稳定的片段包含相应于所述Gc蛋白的氨基酸400-435的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中稳定的片段由SEQIDNO:4或SEQIDNO:5中所列出的氨基酸序列组成。
7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中稳定的GcMAF以范围从约100ng/ml到约1mg/ml的浓度存在。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述稳定的GcMAF以范围从约100ng/ml到约300μg/ml的浓度存在。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述稳定的GcMAF以范围从约200ng/ml到约30μg/ml的浓度存在。
10.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述表面活性剂选自由以下组成的组：非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、兼性表面活性剂和两性离子表面活性剂。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述非离子表面活性剂选自由以下组成的组：山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧山梨聚糖脂肪酯、聚氧化烯高级醇醚和聚氧化烯高级醇酯。
12.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述非离子表面活性剂选自由以下组成的组：聚氧乙烯山梨糖醇酯、聚氧乙烯异辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯十二烷基醚、辛基葡萄糖苷和烷基麦芽糖苷。
13.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述非离子表面活性剂选自由以下组成的组：聚山梨醇酯聚山梨醇酯聚山梨醇酯N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷、TritonX-100、Brij58和泊洛沙姆188。
14.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述非离子表面活性剂是聚山梨醇酯
15.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述具有表面活性的合成的水溶性聚合物选自由以下组成的组：聚乙烯醇、聚环氧丙烷/聚环氧乙烷嵌段共聚物、乙二醇/丙二醇的共聚物、聚-1,3-二氧戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、丙二醇均聚物和聚氧乙基化多元醇。
16.根据权利要求1所述的药物组合物，所述药物组合物还包含张度剂。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述张度剂是氯化钠。
18.根据权利要求1所述的药物组合物，所述药物组合物还包含缓冲剂。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述缓冲剂选自由以下组成的组：磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、Tris缓冲液和柠檬酸盐缓冲液。
20.根据权利要求1所述的药物组合物，所述药物组合物还包含药学载体或稀释剂。
21.根据权利要求1所述的药物组合物，所述药物组合物以选自由以下组成的组的形式被配制：溶液、悬浮液、乳剂、粉末、片剂和胶囊。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，所述药物组合物以水溶液的形式被配制。
23.根据权利要求1所述的药物组合物，所述药物组合物包含GcMAF、聚山梨醇酯80、氯化钠、磷酸盐缓冲液和水，其中所述组合物的pH范围在约5和约8之间，且其中所述GcMAF的浓度范围从约100ng/ml到1mg/ml。
24.根据权利要求1到23中的任一项所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗与巨噬细胞活化相关的疾病或紊乱。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中受试者是人类。
26.根据权利要求24所述的药物组合物，其中受试者是动物。
27.根据权利要求26所述的药物组合物，其中所述动物为狗。
28.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述与巨噬细胞活化相关的疾病或紊乱选自由以下组成的组：癌症、病毒性疾病、细菌感染、自身免疫性疾病、孤独症和慢性疲劳综合症。
29.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述药物组合物适合于通过非肠道途径施用。
30.根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述药物组合物适合于静脉内、肌肉内或皮下注射。
31.根据权利要求28所述的药物组合物，其中所述癌症是选自由以下组成的组的实体瘤：肉瘤、恶性上皮肿瘤、纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、恶性滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌(Wilms'tumorcervicalcancer)、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、卡波西氏肉瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、少突神经胶质瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。
32.一种治疗与巨噬细胞活化相关的疾病或紊乱的方法，所述方法包括对需要这样治疗的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1到23中的任一项所述的稳定的药物组合物。
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