CN105506013A - 一种制备鸭油甘油二酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种固定化脂肪酶催化制备鸭油甘油二酯的方法，首先利用碱性水解的方法制得混合脂肪酸，然后将混合脂肪酸与甘油混合，利用固定化的脂肪酶进行催化反应。通过加酶量、底物比、酶解温度、酶解时间四个单因素试验和响应面分析的方法得出固定化的脂肪酶制备鸭油甘油二酯的最佳条件。采用固定化脂肪酶催化鸭油制备甘油二酯，酶与产物甘油二酯可以得到彻底分离，使产品无酶的残留，产品纯度高，保障了食品安全。另外，选用的固定化酶可回收重复利用，降低了生产成本，减少了环境污染。本发明的方法为鸭油副产品综合利用开辟了一新的途径，能够大大提高鸭油的附加值，是一项具有重要开发价值的绿色创新项目。
Description
技术领域
本发明属于甘油二酯制备的技术领域，具体涉及一种固定化脂肪酶催化制备鸭油甘油二酯的方法。
背景技术：
鸭油的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量较高，且单不饱和脂肪酸(MUFA)含量高于猪油、花生油、豆油、玉米油、接近橄榄油。目前对于鸭油的研究较少，大部分鸭油作为饲料使用，经济价值较低。本发明拟采用以鸭油作为脂肪酸供体催化制备甘油二酯，以拓宽鸭油的利用途径，提高鸭加工过程中产生的脂肪附加值。
甘油二酯是由丙三醇(甘油)与两个脂肪酸酯化后得到的产物。它分为1,3-甘油二酯和1,2-甘油二酯两种异构体。研究表明，甘油二酯(DG)在降血脂、减少内脏脂肪、抑制体重增加等方面有重要功能。此功能主要是通过抑制甘油三酯(TG)在体内蓄积实现的。TG在肠道中，两端脂肪酸由于脂肪酶作用，被酶解为2-单甘酯(MG)与游离脂肪酸(FA)，并在小肠上皮细胞被吸收。在小肠上皮细胞中，FA与2-MG再次被迅速合成为TG(中性脂肪)，作为血中中性脂肪在全身运动，那些未被作为能量利用的中性脂肪便作为体内脂肪而蓄积。而DG大多都被分解为不能再合成脂肪的1-MG与脂肪酸，因为1-MG与2-MG中脂肪酸与甘油结合的位置不同，因此作为中性脂肪合成原料有很大差别，在小肠内向中性脂肪再次合成极其迟缓。细胞内游离脂肪酸浓度变高，并通过β-氧化途径最终被分解为水和二氧化碳释放，因此DG在小肠脂质分解和能量利用率提高。同时使食用DG后血液中的中性脂肪难以上升，这样，若持续食用DG，便可减少体内脂肪积累。由此推断，甘油二酯一方面保留了甘油三酯所具有的营养功能；另一方面，由于甘油二酯和甘油三酯在人体内代谢的差异，以及人体内的胰脂肪酶是1,3位专一性酶，因此，甘油二酯具有一些甘油三酯所不具有的理化特性和保健功效。此外，由于甘油二酯具有独特的一些物理和生化特性，使其在食品、化妆品、医药等方面都有广阔的开发利用前景。
迄今为止，国内外领域专家探索的制备甘油二酯的方法有以下几种：1)化学法：其生产甘油二酯具有成本低、运行经济，容易实现规模生产的优点。早期人们多用此法生产甘油二酯。然而由于反应缺乏专一性，所得产品是1,2-甘油二酯、1,3-甘油二酯的混合物，比例通常为7:3～6:4。因此，该法通常不能预测脂肪酸在终产品中的结合位置。虽然通过特异的化学反应也可生产结构特殊的1,3-DG，但需保护剂，反应步骤繁杂冗长，并且需大量的化学试剂或有机溶剂，污染严重，这是食品、医药行业不期望的，从清洁生产、绿色环保的要求来看也是不适合的。2)水解法：目前公开的水解脂肪来生产甘油二酯的方法中，大都在高温、高压的条件下进行(专利CN101768076A)，容易使不饱和脂肪酸发生氧化，并且能耗多，生产成本较高，并容易蒸发造成污染，不利于大规模生产。3)酶解法：脂肪酶催化的酯交换反应，包括转酯化、甘油解、酸解反应。利用天然的脂肪酶作为催化剂催化油脂水解或甘油醇解合成甘二酯，因采用了高效的生物催化剂而成为最具工业前景的制备方法；然而，此酶不能够与产物(甘油二酯)彻底分离，产品纯度低，无法保障食品安全；另外，此工艺不能使酶回收重复利用。
因此，发明一种安全、环保、高效、经济的鸭油甘油二酯制备方法，最终达到催化酶能够与产物(甘油二酯)得到彻底分离，产品无酶残留，可回收重复利用的目标，对鸭脂肪生态利用和提高产品的附加值具有重要意义。
发明内容：
本发明的目的是提供一种鸭油甘油二酯的制备方法，即采用固定化脂肪酶催化鸭油制备甘油二酯。
申请人在长期的研究中确定了酶解制备鸭油甘油二酯的最佳制备条件，通过对加酶量、底物比(甘油：鸭油混合脂肪酸)、温度、时间的筛选确定出最佳的制备条件，并且对固定化酶的制备进行了优化，从而促成了本发明。
本发明的制备鸭油甘油二酯的方法，包括如下步骤：
1)混合脂肪酸的制备：
将鸭油水溶液在87℃恒温水浴锅中1.5h，然后转移至分液漏斗除去下层溶液，在下层溶液中加入1mol/L的NaOH溶液，87℃恒温水解，用NaCI洗涤除去甘油，再用10％的HCl酸化至pH2～3，释放游离的脂肪酸；
2)甘油二酯的制备：
将上述步骤1)中的混合脂肪酸与甘油混合，加入固定化脂肪酶，放置在恒温摇床进行酶解反应，反应结束后通过离心将酶与底物分离，得到鸭油甘油二酯。
上述步骤2)中甘油与混合脂肪酸的质量比为1:2.02，酶解温度为44℃，酶解时间为9.1h，此条件下，酶解反应最充分，产品纯度高，减少了原材料及能源的浪费，有利于实现绿色生产。
其中固定化脂肪酶，其制备方法如下：
1)按1.5：1的比例称取FeC13、FeCl2，加入浓度为40％的淀粉乳中，置65℃水浴中升温，调至pH值为10，于65℃水浴中超声混匀；再将混匀后的液体置于60℃水浴中搅拌2h，再静置冷却至室温，调pH至中性，将反应后的液体用95％乙醇洗涤3次，用磁铁进行固液分离，倾去上清液，真空冷冻干燥，过100目筛，即得磁性淀粉微球；
2)称取1份磁性淀粉载体，加入20倍体积的1％的京尼平溶液，交联6h，产物进行固液分离，真空冷冻干燥，得到活化的磁性淀粉微球；
3)将活化的磁性淀粉微球1份、1％的脂肪酶溶液3份，用pH为4的缓冲液定容至25倍体积，于30℃、转速200r/min下在摇床中振荡反应8h，真空冷冻干燥，即得到固定化脂肪酶。
本发明采用固定化脂肪酶催化鸭油制备甘油二酯，能够与产物(甘油二酯)彻底分离，产品纯度高，且酶能够实现多次回收重复利用；保障了食品安全、减少了环境污染、降低了生产成本。
附图说明:
图1本发明中底物比与加酶量交互响应面图
图2本发明中酶解温度与加酶量交互响应面图
图3本发明中酶解时间与加酶量交互响应面图
图4本发明中酶解温度与底物比交互响应面图
图5本发明中酶解时间与底物比交互响应面图
图6本发明中酶解时间与酶解温度交互响应面图
具体实施方式：
本发明采用碱法水解鸭油制备鸭油混合脂肪酸，再将甘油与混合脂肪酸按照一定比例混合，然后加入一定量的固定化脂肪酶进行反应。以甘油二酯的生成率为指标，底物比、加酶量、反应时间及反应温度为因素，设计响应面试验，筛选出酶解鸭油制备甘油二酯的最佳工艺条件。
本发明中酶解鸭油制备甘油二酯方法，包括有如下的步骤：
1)混合脂肪酸的制备：将200g鸭油放入1000mL的烧杯，加蒸馏水至440mL，放置在87℃恒温水浴锅中1.5h。然后转移至分液漏斗除去下层，重复以上操作。然后加入一定量的1mol/L的NaOH溶液，87℃恒温水解，用NaCI洗涤除去甘油，用10％的HCl酸化至pH2～3，释放游离的脂肪酸。
2)鸭油甘油二酯的制备：将甘油和鸭油混合脂肪酸按照1:0.5～3的比例放入到锥形瓶中，加入0.5％～3％的固定化南极假丝酵母脂肪酶B，然后放置到摇床上，设定温度为30℃～70℃，设置反应时间为2～12h，反应结束后，将上述反应液于4000r/min的高速离心机中离心20min，便可将酶分离，得到的上清液为高纯度的甘油二酯混合物。得到的甘油二酯混合物用高效液相色谱法测定其含量。
下面结合具体实施例对本发明的方法进行详细描述。
实施例1：鸭油甘油二酯的制备
将甘油和鸭油混合脂肪酸按照1:0.5～3的比例放入到锥形瓶中，加入0.5％～3％的固定化南极假丝酵母脂肪酶B，然后放置到摇床上，设定温度为30℃～70℃，设置反应时间为2～12h，反应结束后，将上述反应液于4000r/min的高速离心机中离心20min，便可将酶分离，得到的上清液为高纯度的甘油二酯混合物。得到的甘油二酯混合物用高效液相色谱法测定其含量。
上述反应条件的优化步骤如下：
(1)加酶量的筛选：将底物比(甘油：混合脂肪酸)设为1:2，反应温度为50℃，反应时间为10h，加酶量分别为0.5％，1％，1.5％，2％，2.5％，3％，然后分别进行试验，通过测定甘油二酯的生成率来进行加酶量的初步筛选。
(2)底物比的筛选：设置加酶量为2％，反应温度为50℃，反应时间为10h，甘油：混合脂肪酸分别为1:0.5，1:1，1:1.5，1:2，1:2.5，1:3，分别进行试验，通过测定甘油二酯的生成率来进行底物比的初步筛选。
(3)酶解温度的筛选：设置加酶量为2％，反应时间为10h，底物比为1:2，反应温度分别为30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，分别进行试验，通过测定甘油二酯的生成率来进行酶解温度的初步筛选。
(4)酶解时间的筛选：设置加酶量为2％，底物比为1:2，反应温度为50℃，酶解时间分别为2h，4h，6h，8h，10h，12h，分别进行试验，通过测定甘油二酯的生成率来进行酶解时间的初步筛选。
(5)响应面试验因素水平设计
表1响应面试验因素水平
(6)响应面试验及其结果：
表2响应面方案及结果
(7)响应面回归方程的建立与分析：通过响应面分析软件designexpert8.0.5对试验结果进行分析后得出其线性回归方程如下：
Y＝93.27+2.33A-0.15B+2.11C+0.74D-1.07AB+0.97AC-1.48AD+1.88BC-0.52BD+0.12CD-4.38A2-3.63B2-3.00C2-2.56D2
式中Y表示甘油二酯的生成率，A表示加酶量，B表示底物比，C表示酶解温度，D表示酶解时间。对上述响应面进行方差分析，结果如表3
表3响应面方差分析
由表3可以看出，回归模型呈现极显著(P<0.01)，模型失拟项为0.0643>0.05，无显著性影响，说明方程的拟合程度较好，残差由随机误差引起，模型规定适当，可用回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析，其校正决定系数为0.9110，有91.10％的试验数据的变异性可用此回归模型来解释。因此，回归方程能较好地描述各因素与响应值之间的关系，各具体试验因子对响应面值的影响不是简单的线性关系。各因素中A、C、A2、B2、C2、D2对试验结果有极显著的影响(P<0.01)，BC对试验结果有显著影响(P<0.05)，4个因素影响的大小关系是:A>C>D>B。
使用designexpert8.0.5软件处理数据和分析，鸭油甘油二酯最佳条件为：加酶量1.65％，底物比(甘油：混合脂肪酸)为1:2.02，酶解温度为54℃，酶解时间为9.1h，在此条件下甘油二酯的生成率为94.08％。
实施例2：酶解鸭油制备甘油二酯最佳工艺条件筛选回归试验
按底物比(甘油：混合脂肪酸)1:2.02的比例将混合脂肪酸和甘油加入锥形瓶中，置于恒温摇床中，并设定反应温度为44℃，并加入1.65％固定化南极假丝酵母脂肪酶B，反应时间为9.1h，反应结束后，将酶解液于高速离心机中离心10min，将酶分离，上清液即为高甘油二酯混合物，中间层为固定化脂肪酶，液相色谱法测定甘油二酯的生成率。
通过5次验证试验发现，在该条件下所得甘油二酯生成率依次为93.25％、94.09％、93.88％、94.22％、94.17％，平均提取率为93.92％，与实施案例1的结果基本一致；上述结果表明本发明的工艺具有很好的重复性和稳定性。
实施例3：固定化脂肪酶的制备
(1)固定化载体的预处理：将HPD-800大孔树脂用无水乙醇浸泡12h，抽滤，用蒸馏水洗至中性，真空干燥至恒重。5％HCl酸洗12h，5％NaOH碱洗12h，洗至中性，干燥备用。用pH7.5磷酸缓冲溶液浸泡24h，干燥待用。
(2)脂肪酶的固定化：按照15.3:1的比例称取载体与脂肪酶，置于锥形瓶中，加入30mL的蒸馏水，于34℃的恒温摇床中(转速150r/min)吸附3h。吸附完成后加入1％的京尼平交联3.2h，之后冷冻干燥，即得固定化的脂肪酶。
采用此方法固定的南极假丝酵母脂肪酶B酶活力为固定前的92.3％，且该固定化的脂肪酶重复使用4次相对酶活仍为80.3％。且使用京尼平作为交联剂，与戊二醛相比更适合于食品领域。
(3)固定化脂肪酶稳定性测定
1)固定化酶的热稳定性：将固定化的脂肪酶和未固定化的脂肪酶放置于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃的恒温水浴锅中1h，之后立即放入4℃的冰箱中冷却，测定酶活。结果表明：未固定化的脂肪酶和固定化的脂肪酶在40℃耐热性相差不大，未固定化的脂肪酶40℃以后酶活开始下降，固定化的脂肪酶在50℃酶活才开始下降，表明固定化的脂肪酶与未固定化的相比具有较好的热稳定性。
2)固定化酶的储存稳定性：将固定化的和未固定化的脂肪酶放在4℃冰箱中储存，测定储存2d、4d、6d、8d、10d、12d、14d后的酶活，随着时间的延长，游离酶活力明显下降，但固定化的脂肪酶在储存14d后酶活仍保持87.5％，说明固定化的脂肪酶具有良好的储存稳定性。
3)操作稳定性测定：为了检测固定化脂肪酶的操作稳定性，每次反应后，将酶全部过滤，有机溶剂清洗干燥后再用来测定酶活。第一次的酶活为100％，此后每次酶活与第一次酶活相比较，得到相对酶活；检测结果表明，固定化酶重复使用6次时，相对酶活为55％，说明固定化酶具有很好的操作稳定性。
实施例4：未固定化的脂肪酶催化制备鸭油甘油二酯
采用未固定化的南极假丝酵母脂肪酶B催化甘油和鸭油混合脂肪酸进行直接酯化反应。以加酶量1.65％，底物比(甘油：混合脂肪酸)为1:2.02，酶解温度为54℃，酶解时间为9.1h，5次试验结果为甘油二酯的得率为93.28％，94.05％，95.02％，92.81％，93.33％，其反应结果与固定化的脂肪相比较甘油二酯的得率差别不显著；检测结果表明，未固定化的脂肪酶在产物中含有2％～3％的残留，而固定化的脂肪酶在产物中可以达到100％分离，无残留。产物中含有一定量的脂肪酶会影响甘油二酯的稳定性，减短其货架期，并且影响产品质量安全性。
本发明的方法在传统酶解的基础上，首先对鸭油进行碱法水解制备混合脂肪酸，然后加入甘油和固定化的脂肪酶进行反应，不仅使反应更加充分，减少了原材料浪费，还在一定程度上缩短了反应时间，提高了生产效率和甘油二酯的生成率。同时，此项技术避免了采用高温、高压工艺造成的能源浪费，避免了化学法大量使用试剂带来的环境和食品的污染，实现酶与产物分离、重复利用，属于节能、减排和安全工艺的创新。可以直接应用于鸭油新产品的进一步开发，为鸭脂肪的科学利用提供了一条新的途径，该项技术的推广应用将具有重大社会推广价值。
Claims (7)
1.一种制备鸭油甘油二酯的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
1)混合脂肪酸的制备：
将鸭油水溶液在87℃恒温水浴锅中处理1.5h，然后转移至分液漏斗除去下层溶液，在剩余的溶液中加入1mol/L的NaOH溶液，87℃恒温水解，用NaCI洗涤除去甘油，再用10％的HCl酸化至pH2～3，释放游离的脂肪酸；
2)甘油二酯的制备：
将上述步骤1)中的混合脂肪酸与甘油混合，加入固定化脂肪酶，放置在恒温摇床进行酶解反应，反应结束后通过离心将酶与底物分离，得到鸭油甘油二酯。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中甘油与混合脂肪酸的质量比为1:2.02。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中酶解温度为44℃。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中酶解时间为9.1h。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中的固定化脂肪酶，其制备方法如下：
1)固定化载体的预处理：将HPD-800大孔树脂用无水乙醇浸泡12h，抽滤，用蒸馏水洗至中性，真空干燥；再用5％HCl酸洗12h，5％NaOH碱洗12h，洗至中性，干燥；用pH7.5磷酸缓冲溶液浸泡24h，干燥待用；
2)脂肪酶的固定化：按照15.3:1的比例称取大孔树脂与南极假丝酵母脂肪酶B，置于锥形瓶中，加入30mL的蒸馏水，于34℃的恒温摇床中吸附3h；吸附完成后加入1％的京尼平进行交联，之后冷冻干燥，即得固定化的脂肪酶。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中大孔树脂和南极假丝酵母脂肪酶B的质量比为15.3：1。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中1％的京尼平交联时间为3.2h。
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