CN105483204A - 一种用于快速检测霉菌和酵母菌的检测皿及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种可同时用于霉菌和酵母菌快速培养和检测的检测皿，利用微生物生化反应的特性，将微生物胞内酶的种类及反应条件作为微生物分类鉴定的主要依据，通过在分离培养基或选择性培养基中，加入微生物特异性酶显色底物，当目的菌在培养基上生长时，其特异性酶就能降解显色底物，并产生带有特殊颜色的代谢物，使菌落形成特定的颜色或形态，从而实现样品中微生物的培养和检测，该检测皿具有操作简便、成本低廉、节省人力、判定结果简单、检测结果可靠、检测时间短等优势，检测结果准确率达到国家标准检测方法90%以上，可在微生物检测中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明专利所属的技术领域是微生物学检测，具体涉及一种用于快速检测霉菌和酵母菌的检测皿及制备方法。
背景技术
霉菌和酵母菌广泛存在于空气、水和土壤中，绝大部分对人体无害，但有些霉菌对人体有害，霉菌可引起食物霉变，会刺激人体消化道、胃部等，严重的还可对肝脏造成损伤，造成食物中毒，危及生命安全。现行检测技术主要有GB4789.15-2010食品安全国家标准，食品微生物学检测—霉菌和酵母菌计数，该方法为平板法，具有检测结果准确、可靠的特点，是经典的微生物检测和鉴定方法，然该方法耗时长、需要现配置培养基，操作步骤繁琐，难以满足快检的实际要求。
纸片法的出现，弥补了平板法的缺点，逐步成为微生物检测和鉴定的主要方法和标准,2007年，Petrifilm?测试片被正式列为中国出入境检验检疫行业标准，该方法正逐渐被越来越多的食品生产加工企业及各类检测机构所认可。目前，国内外对微生物纸片法的研究较多，广州天河绿洲生物化学研究中心公开了一项实用新型专利《霉菌和酵母菌的快速检测检验纸片》CN03274715.2，该专利采用底面涂布含有酶显色剂吸水凝胶粉的上盖膜和吸附了培养基液的培养片组成，该产品的使用，需要进行待测菌液的涂布和盖膜操作，存在人为操作不当盖膜产生气泡及涂布不均影响目标菌生长和实验结果判读困难的缺陷。济南市产品质量监督检验所和山东大学公开了一项发明专利《食品包装材料表面霉菌的检测方法及专用滤纸》CN200110014458.2，该发明仅适用于食品包装材料，且只针对霉菌检测。湖北工业大学公开了一项发明专利《食品和餐具中大肠菌群快速检测纸片的制备与应用》将滤纸片放入无菌的塑模袋内，组装测试片，存在目标菌在组装袋中扩散生长，菌落边缘模糊，影响检测结果判读的缺点。3M创新有限公司申请了一项发明专利《用于检测酵母和霉菌的方法和培养装置》201480007414.5，该培养装置包括含有自支承基材的主体，基材具有第一主表面和第二主表面，该培养装置需要将待测样品进行涂布，在不超过72小时的培养时间，可判断检测结果，其缺点在于存在人工操作不当，引起涂布和盖膜产生气泡的可能。3M创新有限公司还申请了一项发明专利《快速检测微生物的装置》201180032280.9，该装置的使用依赖于待测样品的涂布和盖膜操作，引入了因人为操作不当，导致判读结果有误的可能。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种霉菌和酵母菌快速培养和检测的检测皿及其制备方法，以简化和加快霉菌和酵母菌的检测鉴定，简化实验操作步骤，提高对微生物的检测效率，获得可靠的检测结果。
本发明就是为了弥补现有技术的不足及满足实际检测的需要，在现有纸片检测法的基础上，利用微生物生化反应的特性，将微生物胞内酶的种类及反应条件作为微生物分类鉴定的主要依据，通过在分离培养基或选择性培养基中，加入微生物特异性酶显色底物，当目的菌在培养基上生长时，其特异性酶就能降解显色底物，并产生带有特殊颜色的代谢物，使菌落形成特定的颜色或形态，从而进行样品中微生物的培养和检测。本发明采用培养皿和滤纸为载体，开发霉菌和酵母菌培养、检测，该检测皿将培养时间缩短到48h,菌落或菌斑呈现立体生长，易于判读和分析，可同时实现霉菌和酵母菌的检测，且准确度达国标90%以上，能够满足实际检测需求。
本发明的目的及解决其主要技术问题是采用以下技术方案来实现的：一种用于快速检测霉菌和酵母菌的检测皿，包括无菌培养皿和测试片，测试片平铺于无菌培养皿底部，测试片上附着有霉菌和酵母菌特征显色液体培养基；
其中所述的培养基的组成，每100g蒸馏水中含有：胰蛋白胨0.8g-2.0g、酵母粉0.4g-0.8g、葡萄糖1g-4g、磷酸氢二钾0.05g-0.1g、氯化钠0.05g-0.2g、磷酸二氢钾0.2g-0.4g、硫酸镁0.2g-0.4g、孟加拉红0.04g-0.1g、氯霉素0.1g-0.3g、N,N-二甲基甲酰胺2g-4g、酶解底物混合剂0.015g-0.04g。
所述的酶解底物混合剂由5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐与NBT按2:1-1:1比例溶解于N,N-二甲基甲酰胺得到。
所述的测试片是直径为70mm的白色中速滤纸，每片滤纸使用0.05Mol/LTriton-Tris缓冲生理盐水处理液进行处理，处理液用量为1.0-1.5mL。所述的无菌培养皿是单次使用的培养皿。
这种快速检测霉菌和酵母菌的检测皿的制备方法，按下列步骤制备：
A.配制霉菌和酵母菌特征显色液体培养基：取100g蒸馏水，按照配方加入：胰蛋白胨0.8g-2.0g、酵母粉0.4g-0.8g、葡萄糖1g-4g、磷酸氢二钾0.05g-0.1g、氯化钠0.05g-0.2g、磷酸二氢钾0.2g-0.4g、硫酸镁0.2g-0.4g、孟加拉红0.04g-0.1g、加热溶解后，采用高压灭菌锅在121℃灭菌15min，冷却至室温后依次加入经过滤灭菌的氯霉素及酶解底物混合剂，得到液体培养基，在0-4℃下冷藏备用。
B.制备测试片：
滤纸片前处理：将吸附滤纸切成直径为70mm的测试片，加入1.0-1.5mL0.05Mol/LTriton-Tris缓冲生理盐水处理后，放入37℃恒温箱或干燥箱中干燥4h，放入含有干燥剂的自封袋中，室温保存备用。
培养液吸附：取上述处理滤纸，121℃灭菌15min，将灭菌后的测试片浸入到步骤A所配好的霉菌酵母菌特征显色液体培养基中，浸泡5-10min后，将测试片用镊子夹出，平放在干净的超净工作台上，无菌条件下烘干后，在0-4℃的无菌冷藏箱内，保存备用；
C.组装测试片：将步骤B中所制备的测试片，装入到无菌培养皿内，盖好培养皿盖后，将培养皿置于铝箔包装袋中，抽真空包装，即可得到产品。
本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果。由以上技术方案可知，具体的与现有技术相比突出的实质性进步有以下三点：
第一、通过培养基优化，获得一种同时适用于霉菌和酵母菌生长的培养基；以透气性好、吸附性强、大小合适的滤纸材料作为培养基的载体，通过滤纸的前处理，培养基的吸附及烘干，将培养基附着在滤纸片上；通过将待测样品直接接种于滤纸片上，实现对待测样品中霉菌和酵母菌的快速培养和检测。
第二、本发明所述的快速检测霉菌和酵母菌的检测皿，与现有3MPetrifilm测试片相比，避免了由于涂布不均及盖膜不当产生气泡的现象，气泡的产生和存在，对于检测样品的计数结果将产生较大影响，避免了人为操作不当引起的误差。同时，采取培养皿为载体，利用特有的培养基配方，可实现霉菌和酵母菌立体生长，使其便于观察和区分。
第三、本发明所述的快速检测霉菌和酵母菌的检测皿，使用简便，可以长期存放，应用灵活的特点，可大大节省培养基配置、培养皿灭菌、清洗等处理的时间，降低了劳动强度，缩短了检测时间。同时，本发明检测皿制备方法简单、易行，能够实现自动化生产，成本低廉，使用方便。
附图说明
图1不同的检测方法检测结果比对表1。
图2国标法与本检测皿测试结果比对表2。
图3滤纸处理对试验结果影响比对表3。
图4检测皿制备流程图。
图5检测皿使用流程图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不是来限制本发明的范围。
实施例1
一种用于快速检测霉菌和酵母菌的检测皿，包括无菌培养皿和测试片，测试片平铺于无菌培养皿底部，测试片上附着有霉菌和酵母菌特征显色液体培养基；
其中培养基的组成，每100g蒸馏水中含有：胰蛋白胨0.8g、酵母粉0.4g、葡萄糖1g、磷酸氢二钾0.05g、氯化钠0.05g、磷酸二氢钾0.2g、硫酸镁0.2g、孟加拉红0.04g、氯霉素0.1g、N,N-二甲基甲酰胺2g、酶解底物混合剂0.015g。酶解底物混合剂由5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐与NBT按2：1比例溶解于N,N-二甲基甲酰胺得到。测试片是直径为70mm的白色中速滤纸，每片滤纸使用0.05Mol/LTriton-Tris缓冲生理盐水处理液进行处理，处理液用量为1.0mL。所述的无菌培养皿是单次使用的培养皿。
这种快速检测霉菌和酵母菌的检测皿的制备方法，按下列步骤制备：
A.配制霉菌和酵母菌特征显色液体培养基：按照配方配置培养基加热溶解后，采用高压灭菌锅在121℃灭菌15min，冷却至室温后依次加入经过滤灭菌的氯霉素及酶解底物混合剂，得到液体培养基，在0-4℃下冷藏备用。
B.制备测试片：
滤纸片前处理：将吸附滤纸切成面积为直径为70mm的测试片，加入1.0mL0.05Mol/LTriton-Tris缓冲生理盐水处理后，放入37℃恒温箱或干燥箱中干燥4h，用自封袋放入干燥剂，室温保存备用。培养液吸附：取上述处理滤纸，121℃灭菌15min，将灭菌后的测试片浸入到步骤A所配好的霉菌酵母菌特征显色液体培养基中，浸泡5min后，将测试片用镊子夹出，平放在干净的超净工作台上，无菌条件下烘干后，在0-4℃的无菌冷藏箱内，保存备用；
C.组装测试片：将步骤B中所制备的测试片，装入到无菌培养皿内，盖好培养皿盖后，将培养皿置于铝箔包装袋中，抽真空包装，即可得到产品。
使用这种快速检测霉菌和酵母菌的检测皿时，首先，取样品25mL(g)放入225mL灭菌稀释液（磷酸盐缓冲液或生理盐水）的取样器或均质杯内，制成1:10的样品匀液，用1mL的灭菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，注入含有9mL稀释液的试管内，摇匀后得到1:100的样品稀释液，依次往下稀释。一般样品选1~2个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品（如饮用纯水和矿泉水等）可直接吸取原液进行检测。其次接菌：将测试片置于平坦实验台面，打开培养皿上盖，用灭菌枪头或滴管吸取1mL样品匀液加到测试片上，调整测试片角度使样品液湿润整张测试片，盖上盖即可培养。每个稀释度接种两片，同时取1mL稀释液接种另一测试片作空白对照。然后培养：将接种好的测试片放置于28±1℃培养箱中培养48-72h。最后分析检测结果：霉菌在测试片上呈现灰白色、黑色、蓝绿色等菌落，且菌落较大呈现其自身的形态；酵母菌在测试片上呈现绿色菌落，且菌落较小较平滑。
实施例2
一种用于快速检测霉菌和酵母菌的检测皿，包括无菌培养皿和测试片，测试片平铺于无菌培养皿底部，测试片上附着有霉菌和酵母菌特征显色液体培养基；
其中培养基的组成，每100g蒸馏水中含有：胰蛋白胨1.2g、酵母粉0.6g、葡萄糖3g、磷酸氢二钾0.08g、氯化钠0.1g、磷酸二氢钾0.3g、硫酸镁0.3g、孟加拉红0.06g、氯霉素0.2g、N,N-二甲基甲酰胺3g、酶解底物混合剂0.02g。酶解底物混合剂由5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐与NBT按1:1比例溶解于N,N-二甲基甲酰胺得到。测试片是直径为70mm的白色中速滤纸，每片滤纸使用0.05Mol/LTriton-Tris缓冲生理盐水处理液进行处理，处理液用量为1.2mL。所述的无菌培养皿是单次使用的培养皿。
这种快速检测霉菌和酵母菌的检测皿的制备方法，按下列步骤制备：
A.配制霉菌和酵母菌特征显色液体培养基：按照配方配置培养基加热溶解后，采用高压灭菌锅在121℃灭菌15min，冷却至室温后依次加入经过滤灭菌的氯霉素及酶解底物混合剂，得到液体培养基，在3℃下冷藏备用。
B.制备测试片：
滤纸片前处理：将吸附滤纸切成面积为直径为70mm的测试片，加入1.2mL0.05Mol/LTriton-Tris缓冲生理盐水处理后，放入37℃恒温箱或干燥箱中干燥4h，用自封袋放入干燥剂，室温保存备用。培养液吸附：取上述处理滤纸，121℃灭菌15min，将灭菌后的测试片浸入到步骤A所配好的霉菌酵母菌特征显色液体培养基中，浸泡5min后，将测试片用镊子夹出，平放在干净的超净工作台上，无菌条件下烘干后，在0-4℃的无菌冷藏箱内，保存备用；
C.组装测试片：将步骤B中所制备的测试片，装入到无菌培养皿内，盖好培养皿盖后，将培养皿置于铝箔包装袋中，抽真空包装，即可得到产品。
使用这种快速检测霉菌和酵母菌的检测皿时，首先，取样品25mL(g)放入225mL灭菌稀释液（磷酸盐缓冲液或生理盐水）的取样器或均质杯内，制成1:10的样品匀液，用1mL的灭菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，注入含有9mL稀释液的试管内，摇匀后得到1:100的样品稀释液，依次往下稀释。一般样品选1~2个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品（如饮用纯水和矿泉水等）可直接吸取原液进行检测。其次接菌：将测试片置于平坦实验台面，打开培养皿上盖，用灭菌枪头或滴管吸取1mL样品匀液加到测试片上，调整测试片角度使样品液湿润整张测试片，盖上盖即可培养。每个稀释度接种两片，同时取1mL稀释液接种另一测试片作空白对照。然后培养：将接种好的测试片放置于28±1℃培养箱中培养48-72h。最后分析检测结果：霉菌在测试片上呈现灰白色、黑色、蓝绿色等菌落，且菌落较大呈现其自身的形态；酵母菌在测试片上呈现绿色菌落，且菌落较小较平滑。
实施例3
一种用于快速检测霉菌和酵母菌的检测皿，包括无菌培养皿和测试片，测试片平铺于无菌培养皿底部，测试片上附着有霉菌和酵母菌特征显色液体培养基；
其中培养基的组成，每100g蒸馏水中含有：胰蛋白胨2.0g、酵母粉0.8g、葡萄糖4g、磷酸氢二钾0.1g、氯化钠0.2g、磷酸二氢钾0.4g、硫酸镁0.4g、孟加拉红0.1g、氯霉素0.3g、N,N-二甲基甲酰胺4g、酶解底物混合剂0.04g。酶解底物混合剂由5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐与NBT按1:2比例溶解于N,N-二甲基甲酰胺得到。测试片是直径为70mm的白色中速滤纸，每片滤纸使用0.05Mol/LTriton-Tris缓冲生理盐水处理液进行处理，处理液用量为1.5mL。所述的无菌培养皿是单次使用的培养皿。
这种快速检测霉菌和酵母菌的检测皿的制备方法，按下列步骤制备：
A.配制霉菌和酵母菌特征显色液体培养基：按照配方配置培养基加热溶解后，采用高压灭菌锅在121℃灭菌15min，冷却至室温后依次加入经过滤灭菌的氯霉素及酶解底物混合剂，得到液体培养基，在0-4℃下冷藏备用。
B.制备测试片：
滤纸片前处理：将吸附滤纸切成面积为直径为70mm的测试片，加入1.5mL0.05Mol/LTriton-Tris缓冲生理盐水处理后，放入37℃恒温箱或干燥箱中干燥4h，用自封袋放入干燥剂，室温保存备用。培养液吸附：取上述处理滤纸，121℃灭菌15min，将灭菌后的测试片浸入到步骤A所配好的霉菌酵母菌特征显色液体培养基中，浸泡5min后，将测试片用镊子夹出，平放在干净的超净工作台上，无菌条件下烘干后，在0-4℃的无菌冷藏箱内，保存备用；
C.组装测试片：将步骤B中所制备的测试片，装入到无菌培养皿内，盖好培养皿盖后，将培养皿置于铝箔包装袋中，抽真空包装，即可得到产品。
使用这种快速检测霉菌和酵母菌的检测皿时，首先，取样品25mL(g)放入225mL灭菌稀释液（磷酸盐缓冲液或生理盐水）的取样器或均质杯内，制成1:10的样品匀液，用1mL的灭菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，注入含有9mL稀释液的试管内，摇匀后得到1:100的样品稀释液，依次往下稀释。一般样品选1~2个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品（如饮用纯水和矿泉水等）可直接吸取原液进行检测。其次接菌：将测试片置于平坦实验台面，打开培养皿上盖，用灭菌枪头或滴管吸取1mL样品匀液加到测试片上，调整测试片角度使样品液湿润整张测试片，盖上盖即可培养。每个稀释度接种两片，同时取1mL稀释液接种另一测试片作空白对照。然后培养：将接种好的测试片放置于28±1℃培养箱中培养48-72h。最后分析检测结果：霉菌在测试片上呈现灰白色、黑色、蓝绿色等菌落，且菌落较大呈现其自身的形态；酵母菌在测试片上呈现绿色菌落，且菌落较小较平滑。
为了更好的体现本发明的有益效果，发明人将本发明与国家标准检测法，3M试纸片法作对比检测分析结果如下：
将培养好的酵母菌液，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液将其稀释至10-6、10-7两个梯度，以此稀释好的两个梯度酵母菌液作为母液，将霉菌稀释至10-1、10-2，稀释混匀后，母液中同时含有霉菌和酵母菌，该混合液即为处理好的待测样本菌液。用灭菌枪头或滴管吸取1mL待测样本菌液均匀涂布在国标法推荐的平板上、3M生产的霉菌和酵母菌测试片和本发明的检测皿上，以1mL灭菌生理盐水作为空白对照，在28±1℃条件下，培养48h后，记录观察结果如下表。
表1不同的检测方法检测结果比对表（培养时间48小时，培养温度28±1℃）
将培养好的酵母菌液，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液将其稀释至10-6、10-7两个梯度，以此稀释好的两个梯度酵母菌液作为母液，将霉菌稀释至10-1、10-2，稀释混匀后，母液中同时含有霉菌和酵母菌，该混合液即为处理好的待测样本菌液。用灭菌枪头或滴管吸取1mL待测样本菌液分别均匀涂布在国标法推荐的平板上和本发明的检测皿上，以1mL灭菌生理盐水作为空白对照，在28±1℃条件下，培养66小时后，记录观察结果如下表2。
表2国标法与本检测皿测试结果比对（培养时间66小时，培养温度28±1℃）
通过本发明与国标法及3M霉菌酵母菌检测结果比对后，实验结果表明本发明检测结果达到国标标准，准确率达90%以上，与3M霉菌酵母菌测试结果显示，本发明检测结果正确率达到3M霉菌酵母菌测试片。同时为了验证0.05Mol/LTriton-Tris缓冲生理盐水处理液对本发明的功效和作用，设计了如下对比实验，同样的滤纸材料随机分成两组，一组滤纸进行前处理，另一组不进行任何处理，其他处理和培养条件一致，对培养好的霉菌酵母菌液进行检测，以生理盐水作为空白对照。实验检测结果如表3。
表3滤纸处理对试验结果影响比对表
对比试验表明处理后的滤纸检测结果更准确。经过处理的滤纸，更能有效用于待测样品中霉菌和酵母菌的检测。
Claims (5)
1.一种用于快速检测霉菌和酵母菌的检测皿，包括无菌培养皿和测试片，测试片平铺于无菌培养皿底部，测试片上附着有霉菌和酵母菌特征显色液体培养基，其特征在于：培养基的组成，每100g蒸馏水中含有：胰蛋白胨0.8g-2.0g、酵母粉0.4g-0.8g、葡萄糖1g-4g、磷酸氢二钾0.05g-0.1g、氯化钠0.05g-0.2g、磷酸二氢钾0.2g-0.4g、硫酸镁0.2g-0.4g、孟加拉红0.04g-0.1g、氯霉素0.1g-0.3g、N,N-二甲基甲酰胺2g-4g、酶解底物混合剂0.015g-0.04g。
2.根据权利要求1所述的一种用于快速检测霉菌和酵母菌的检测皿，其特征在于：所述的酶解底物混合剂由5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐与NBT按2:1-1:1比例溶解于N,N-二甲基甲酰胺得到。
3.根据权利要求1所述的一种用于快速检测霉菌和酵母菌的检测皿，其特征在于：所述的测试片是直径为70mm的白色中速滤纸，每片滤纸使用0.05Mol/LTriton-Tris缓冲生理盐水处理液进行处理，处理液用量为1.0-1.5mL。
4.根据权利要求1所述的一种用于快速检测霉菌和酵母菌的检测皿，其特征在于：所述的无菌培养皿是单次使用的培养皿。
5.一种制备权利要求1-4任何一项所述的快速检测霉菌和酵母菌的检测皿的制备方法，其特征在于，按下列步骤制备：
A.配制霉菌和酵母菌特征显色液体培养基：取100g蒸馏水，按照配方加入：胰蛋白胨0.8g-2.0g、酵母粉0.4g-0.8g、葡萄糖1g-4g、磷酸氢二钾0.05g-0.1g、氯化钠0.05g-0.2g、磷酸二氢钾0.2g-0.4g、硫酸镁0.2g-0.4g、孟加拉红0.04g-0.1g、加热溶解后，采用高压灭菌锅在121℃灭菌15min，冷却至室温后依次加入经过滤灭菌的氯霉素及酶解底物混合剂，得到液体培养基，在0-4℃下冷藏备用；
B.制备测试片：
滤纸片前处理：将吸附滤纸切成面积为直径为70mm的测试片，加入1.0-1.5mL0.05Mol/LTriton-Tris缓冲生理盐水处理后，放入37℃恒温箱或干燥箱中干燥4h后取出，放入含有干燥剂的自封袋中,室温保存备用；
培养液吸附：取上述处理滤纸，121℃灭菌15min，将灭菌后的测试片浸入到步骤A所配好的霉菌酵母菌特征显色液体培养基中，浸泡5-10min后，将测试片用镊子夹出，平放在干净的超净工作台上，无菌条件下烘干后，在0-4℃的无菌冷藏箱内，保存备用；
C.组装测试片：将步骤B中所制备的测试片，装入到无菌培养皿内，盖好培养皿盖后，将培养皿置于铝箔包装袋中，抽真空包装，即可得到产品。
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