CN105461805B

CN105461805B - 抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN105461805B
Application number: CN201510948571.2A
Authority: CN
Inventors: 田克恭; 张云静
Original assignee: Luoyang Pu Laikewantai Bioisystech Co Ltd
Current assignee: Luoyang Pu Tai Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2015-12-17
Filing date: 2015-12-17
Publication date: 2019-02-15
Anticipated expiration: 2035-12-17
Also published as: CN105461805A

Abstract

本发明提供了特异性结合猪流行性腹泻病毒的鼠单克隆抗体的可变区序列、其制备的抗体或抗体片段，以及使用该抗体制备的疫苗和试剂盒。本发明的药物组合物能有效预防和治疗猪流行性腹泻病毒感染。本发明的试剂盒能有效检测猪流行性腹泻病毒，灵敏度高，检测快速。

Description

抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体，以及使用该单克隆抗体制备的药物组合物、试剂盒等应用，属于生物医药领域。

背景技术

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种肠道传染病，主要引起哺乳仔猪呕吐、水样腹泻、脱水等症状，严重时可造成仔猪的死亡，死亡率能达到50％-100％。近年，自2010年冬季，在我国的大部分地区爆发流行，之后相继在韩国、日本、台湾等地区也大范围爆发此病。2013年上半年在北美地区也爆发此病，并迅速传播，给全球的养殖业造成了严重的损失。

目前，检测猪流行性腹泻病毒的方法包括病毒分离鉴定和血清检查，但耗时过长；PCR方法虽然灵敏，但需昂贵的仪器和专业的操作人员。因而，现有技术中亟需研制一种简单、快速、准确检测猪流行性腹泻病毒的产品。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了两个抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体，以及含单克隆抗体的试剂盒、药物组合物及其应用。

本发明涉及一种特异性结合猪流行性腹泻病毒的鼠单克隆抗体PEDV-McAB1的可变区序列，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；2)轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。

本发明还涉及具有上述可变区序列的抗体或其片段，所述抗体或其片段仍保持特异性结合猪流行性腹泻病毒的能力。

本发明还涉及一种特异性结合猪流行性腹泻病毒的鼠单克隆抗体PEDV-McAB2的可变区序列，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.6所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；2)轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.8所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。

本发明还涉及一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含免疫量的含有所述的鼠单克隆抗体PEDV-McAB2的可变区序列的抗体或所述抗体的片段，以及药学上可接受的载体。

本发明还涉及所述药物组合物在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻病毒感染相关疾病的药物中的应用。

本发明还涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的具有鼠单克隆抗体PEDV-McAB1的可变区序列的抗体或所述抗体的片段，和/或有效量的具有鼠单克隆抗体PEDV-McAB2的可变区序列的所述的抗体或所述抗体的片段，以及用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。

本发明还涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的具有鼠单克隆抗体PEDV-McAB1的可变区序列的抗体或所述抗体的片段，和/或有效量的具有鼠单克隆抗体PEDV-McAB2的可变区序列的抗体或所述抗体的片段，以及用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照，其中，所述用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂为与所述抗体或所述抗体的片段结合的酶标二抗以及与所述标记的酶产生颜色反应的底物，所述酶标二抗包括酶标羊抗鼠多抗、酶标羊抗鼠二抗。

本发明还涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PEDV-McAB1、有效量的所述单克隆抗体PEDV-McAB2，以及用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂；其中，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有滤纸、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得抗原与所述单克隆抗体PEDV-McAB2的结合体能在其上向底板第二端迁移；所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体PEDV-McAB2，所述硝酸纤维素膜上近所述底板第二端的位置包括一条检测线和一条质控线，所述检测线上固定化有所述单克隆抗体PEDV-McAB1，所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。

本发明还涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PEDV-McAB1、有效量的所述单克隆抗体PEDV-McAB2，以及用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂；其中，所述试剂盒包括缓冲液供应单元和酶免疫层析检测试纸条；所述缓冲液供应单元用于将缓冲液供给所述酶免疫层析检测试纸条；所述酶免疫层析检测试纸条包括硝酸纤维素膜(1)，所述酶免疫层析检测试纸条在纵向上依次包括底物供应区、样品供应区、检测区；所述底物供应区包括底物垫(3)，其上吸附有干燥的酶底物，所述底物垫(3)与硝酸纤维素膜(1)接触，所述酶底物溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移；所述样品供应区包括酶标垫(2)，其上吸附有酶标记的所述单克隆抗体PEDV-McAB2，所述酶底物能与所述单克隆抗体PEDV-McAB2上标记的酶产生显色反应，所述酶标垫(2)与硝酸纤维素膜(1)接触，所述单克隆抗体PEDV-McAB2溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移；以及所述检测区固定化有所述单克隆抗体PEDV-McAB1；其中，所述缓冲液供应单元包括展开液垫(5)、底物缓冲液槽(8)、底物缓冲液(9)和缓冲液按钮，所述底物缓冲液(9)放置于底物缓冲液槽(8)中，所述缓冲液按钮位于底物缓冲液槽(8)的上方，按下可将所述展开液垫(5)浸入缓冲液(9)中；所述检测区包括检测线(6)、质控线(7)，其中，所述质控线(7)较检测线(6)更远离所述样品供应区，在所述检测线(6)上固定化有所述单克隆抗体PEDV-McAB1，在所述质控线(7)上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗，且吸附在酶标垫(2)上的酶标记的所述单克隆抗体PEDV-McAB2对于固定在检测线(6)上的所述单克隆抗体PEDV-McAB1而言是过量的；所述硝酸纤维素膜(1)全段粘附在所述支撑物(10)上，支撑物(10)连接所述缓冲液供应单元，底物供应区，样品供应区，检测区以及吸水垫(4)，所述吸水垫(4)在距所述缓冲液供应单元的最远端；以及检测样品(11)加入的位置为所述酶标垫(2)的位置。

本发明还涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括包被所述单克隆抗体PEDV-McAB1的ELISA板、含酶标记所述单克隆抗体PEDV-McAB2的反应液、对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。

本发明还涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括包被猪流行性腹泻病毒抗原的ELISA板、含所述单克隆抗体的反应液、洗涤液、稀释液、底物显色液、终止液、阴性对照、阳性对照；其中，含所述单克隆抗体的反应液为含所述单克隆抗体PEDV-McAB1的反应液、或含所述单克隆抗体PEDV-McAB2的反应液、或含所述单克隆抗体PEDV-McAB1与所述单克隆抗体PEDV-McAB2的混合反应液。

本发明还涉及所述试剂盒在用于非诊断目的的猪流行性腹泻病毒检测中的应用。

本发明的有益效果：含本发明抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的试剂盒可用于非诊断目的的猪流行性腹泻病毒检测中的应用或者表位鉴定研究；含本发明抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的药物组合物可解决现有疫苗、母源抗体不足时所引发的仔猪猪流行性腹泻病毒感染的问题。

附图说明

图1为SDS-PAGE凝胶电泳鉴定单克隆抗体PEDV-McAB1和单克隆抗体PEDV-McAB2的纯度，其中泳道1为蛋白Marker；泳道2为单克隆抗体PEDV-McAB1，包括上端的重链和下端的轻链，泳道3为单克隆抗体PEDV-McAB2，包括上端的重链和下端的轻链。

图2为酶免疫层析检测试纸条的侧向示意图，图中：(1)硝酸纤维素膜，(2)酶标垫，(3)底物垫，(4)吸水垫，(5)展开液垫，(6)检测线，(7)质控线，(8)底物缓冲液槽，(9)底物缓冲液，(10)支撑物，(11)检测样品。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

术语“猪流行性腹泻病毒”(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)属于冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)，为单股正链RNA病毒，易引起以呕吐、腹泻、脱水、高死亡为特征的猪流行性腹泻疾病。

术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。抗体为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子，因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP.A.0120694和EP.A.0125023中描述。抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区，参见EP.A.184187，GB2188638A或EP.A.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发明的“单克隆抗体”也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成核苷酸序列或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过二硫桥连接在一起的多肽链几何体，称为轻链和重链的两条多肽主链构成抗体的所有主要结构类别(同型物)。重链和轻链都进一步可分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的可变区和三个不同的恒定区，轻链则包括单个可变区(不同于重链的可变区)和单个恒定区(不同于重链的恒定区)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。

术语“重链可变区”是指一种多肽，其长度为110至125个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链N末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语“轻链可变区”是指一种多肽，其长度为95至115个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链N末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守性变异体，而仍能够保持与猪流行性腹泻病毒特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活性片段或保守性变异体。

术语“保守性变异体”是指基本上保留了其母本的特性，如基本的免疫学生物特性、结构特性、调节特性或生化特性的变异体。一般地，多肽的保守性变异体之氨基酸序列不同于母本多肽，但是差异是有限的，以使与母本多肽之序列与保守性变异体总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。保守性变异体和母本多肽氨基酸序列上的差异可以是例如：一个或多个氨基酸残基及其任意组合的替换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码，也可不由遗传密码编码。多肽的保守性变异体可以自然产生，或者它可以是非自然产生的变异体。多肽之非自然产生的保守性变异体可通过诱变技术或直接合成而产生。

本发明涉及一种由所述的PEDV-McAB1可变区序列中重链可变区序列或其保守性变异体，和/或所述的可变区序列中轻链可变区序列或其保守性变异体组成的抗体；所述抗体可以为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体、猪源单克隆抗体或所述抗体的片段；所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合猪流行性腹泻病毒的能力。

作为本发明的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体PEDV-McAB1，所述单克隆抗体PEDV-McAB1重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.2，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID No.4。

所述单克隆抗体PEDV-McAB1的相对亲和力常数为0.78μg/ml，也就是说，所述单克隆抗体PEDV-McAB1与抗原的抗原决定簇的结合强度非常高，优于现有技术中的抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的结合强度；所述单克隆抗体的中和抗体效价大于1:512，也就是说所述单克隆抗体PEDV-McAB1具有良好的中和活性，可抑制猪流行性腹泻病毒重复感染靶细胞。

术语“基因工程抗体”均能够通过基因工程的方法由适当的宿主细胞表达。本发明可使用多种表达宿主细胞，如原核宿主细胞，包括但不限于大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属等的菌株；真核宿主，包括但不限于曲霉属、酵母菌等的菌株，以及哺乳动物细胞、植物细胞等。本发明并不局限于具体的表达载体和表达宿主，只要其能够表达本发明所述的基因工程抗体，其保守性变异体。

术语“中和活性”是指中和抗体具有中和病毒的作用，其中“中和抗体”在本文以最广义使用，指的是抑制猪流行性腹泻病毒重复感染靶细胞的任何抗体，而不管实现中和的机制。因而，举例来说，可通过抑制病毒附着或粘附到细胞表面来实现中和，例如通过设计抗体，所述抗体直接结合到，或者接近于，负责病毒附着或粘附的位点，还可以通过定向到病毒体(Virion)表面的抗体来实现中和，其导致病毒体的聚集，可通过抑制病毒附着到靶细胞以后病毒和细胞膜融合，通过抑制胞吞作用(endocytosis)抑制感染的子代病毒等，进一步发生中和。本发明的中和抗体不受限于实现中和的机制。

本发明涉及一种特异性结合猪流行性腹泻病毒的鼠单克隆抗体PEDV-McAB2的可变区序列，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.6所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；2)轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.8所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。

本发明涉及一种由所述的PEDV-McAB2可变区序列中重链可变区序列或其保守性变异体，和/或所述的可变区序列中轻链可变区序列或其保守性变异体组成的抗体；所述抗体可以为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体、猪源单克隆抗体或所述抗体的片段；所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合猪流行性腹泻病毒的能力。

作为本发明的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体PEDV-McAB2，所述单克隆抗体PEDV-McAB2重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.6，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID No.8。

所述单克隆抗体PEDV-McAB2的相对亲和力常数为0.44μg/ml，也就是说，所述单克隆抗体PEDV-McAB2与抗原的抗原决定簇的结合强度非常高，优于现有技术中的抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的结合强度。

本发明涉及一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含免疫量的具有所述的PEDV-McAB1可变区序列的所述的抗体或所述抗体的片段，以及药学上可接受的载体。

术语“免疫量”当理解为“预防有效量”时是指能够在接种的个体中足以引发免疫保护反应的量。本领域技术人员知晓，所述“预防有效量”随免疫接种的方式、时机、给药对象以及所述单克隆抗体或其片段的不同而不同，结合本领域已知的文献和教导以及相应的临床规范，本领域技术人员应当能够通过有限的试验得出所用单克隆抗体的“预防有效量”。

术语“免疫量”当理解为“治疗有效量”时是指能够对受试个体产生有效保护以及中和病毒的量。本领域技术人员知晓，所述“治疗有效量”随治疗方案、病程、治疗对象的状况以及所用单克隆抗体或其片段的不同而不同。结合本领域已知的文献和教导以及相应的临床规程，临床技术人员应当能够凭借其经验得出所用单克隆抗体的“治疗有效量”。

术语“药学上可接受的载体”是指不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂。

作为本发明的一种实施方式，所述药物组合物包括：免疫量的所述单克隆抗体PEDV-McAB1，以及药学上可接受的载体。

作为本发明的一种实施方式，所述药物组合物包含免疫量的所述单克隆抗体PEDV-McAB1的重链可变区制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体。

作为本发明的一种优选实施方式，所述药物组合物包含免疫量的所述单克隆抗体PEDV-McAB1的重链可变区和轻链可变区序列制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体。

作为本发明的一种优选实施方式，所述药物组合物包含免疫量的所述单克隆抗体PEDV-McAB1的重链可变区和所述单克隆抗体PEDV-McAB2的轻链可变区序列制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体。

作为本发明的一种实施方式，所述药物组合物经肌肉注射或腹腔注射给药。

作为本发明的一种实施方式，所述药物组合物包括但不限于粉末剂、颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂。

术语“预防和/或治疗”在涉及猪流行性腹泻病毒感染时是指抑制猪流行性腹泻病毒的复制、抑制猪流行性腹泻病毒的传播或防止猪流行性腹泻病毒在其宿主体内定居，以及减轻猪流行性腹泻病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

术语“猪”是指任何属于猪科(Suidae)成员的动物，如猪。

本发明涉及所述药物组合物在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻病毒感染相关疾病的药物中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了含有免疫量的所述单克隆抗体PEDV-McAB1的药物组合物在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻病毒感染相关疾病的药物中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了含有免疫量的所述单克隆抗体PEDV-McAB1的重链可变区制备的单链抗体在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻病毒感染相关疾病的药物中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了含有免疫量的所述单克隆抗体PEDV-McAB1的重链可变区和轻链可变区序列制备的单链抗体在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻病毒感染相关疾病的药物中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了含有免疫量的所述单克隆抗体PEDV-McAB1的重链可变区和和所述单克隆抗体PEDV-McAB2的轻链可变区序列制备的单链抗体在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻病毒感染相关疾病的药物中的应用。

含本发明抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的药物组合物可解决现有疫苗、母源抗体不足时所引发的仔猪猪流行性腹泻病毒感染的问题。

本发明涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的具有所述的PEDV-McAB1可变区序列的所述的抗体或所述抗体的片段，和/或有效量的具有所述的PEDV-McAB2可变区序列的所述的抗体或所述抗体的片段，以及用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照；其中，所述用于和猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂为与所述标记的酶产生颜色反应的底物。

作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PEDV-McAB1，和/或有效量的所述单克隆抗体PEDV-McAB2，以及用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。

术语“有效量”当理解为“诊断有效量”时是指能够利用本发明所述单克隆抗体有效检测样品中是否存在猪流行性腹泻病毒的量。根据已知的免疫化学检测方法，本领域技术人员能够知晓，所用单克隆抗体的量随采用的具体免疫检测方法的不同而不同，根据公知文献的教导，本领域技术人员知晓如何选择适当的本发明所述单克隆抗体用量，以用于诊断样品中是否存在猪流行性腹泻病毒。本领域技术人员知晓，适当地该试剂盒中还应当包括适当的载体，缓冲液/剂，和用于检测所产生信号的试剂及使用说明书。本发明所述试剂盒有效检测样品中是否存在猪流行性腹泻病毒的量时所采用的检测方法可以使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫检测、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法、竞争法及类似检测方法。

术语“酶”是包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和β-D-半乳糖苷酶的任一种。

术语“缓冲液”包括“磷酸盐缓冲液”，是指含有磷酸或其盐并被调至理想pH值的溶液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。一般地，磷酸盐缓冲液是从磷酸或磷酸盐(包括但不限于钠和钾盐)制备的。本领域已经知道一些磷酸盐，例如磷酸二氢钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸氢二钾、磷酸钠和磷酸钾。已经知道磷酸盐是以盐的水合物形式存在的。由于缓冲液的二级解离作用，缓冲的pH值范围很宽，例如约pH4至约pH10的范围，优选约pH5至pH9的范围，更优选约pH6至约pH8的范围，最优选约pH7.4。进一步优选地，所述磷酸盐缓冲液为含氯化钠和氯化钾的磷酸盐缓冲液。

本发明涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的具有所述的PEDV-McAB1可变区序列的所述的抗体或所述抗体的片段，和/或有效量的具有所述的PEDV-McAB2可变区序列的所述的抗体或所述抗体的片段，以及用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照；其中，所述用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂为与所述抗体或所述抗体的片段结合的酶标二抗以及与所述标记的酶产生颜色反应的底物，所述酶标二抗包括酶标羊抗鼠多抗、酶标羊抗鼠二抗。

本发明涉及一种试剂盒，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PEDV-McAB1、有效量的所述单克隆抗体PEDV-McAB2，以及用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂；其中，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有滤纸、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得与抗原与所述单克隆抗体PEDV-McAB2的结合体能在其上向底板第二端迁移；所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体PEDV-McAB2，所述硝酸纤维素膜近所述底板第二端的位置上包括一条检测线和一条质控线，所述检测线上固定化有所述单克隆抗体PEDV-McAB1，所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。

本发明涉及一种试剂盒，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PEDV-McAB1、有效量的所述单克隆抗体PEDV-McAB2，以及用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂；其中，所述试剂盒包括缓冲液供应单元和酶免疫层析检测试纸条；所述缓冲液供应单元用于将缓冲液供给所述酶免疫层析检测试纸条；所述酶免疫层析检测试纸条包括硝酸纤维素膜(1)，所述酶免疫层析检测试纸条在纵向上依次包括底物供应区、样品供应区、检测区；所述底物供应区包括底物垫(3)，其上吸附有干燥的酶底物，所述底物垫(3)与硝酸纤维素膜(1)接触，所述酶底物溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移；所述样品供应区包括酶标垫(2)，其上吸附有酶标记的所述单克隆抗体PEDV-McAB2，所述酶底物能与所述单克隆抗体PEDV-McAB2上标记的酶产生显色反应，所述酶标垫(2)与硝酸纤维素膜(1)接触，所述单克隆抗体PEDV-McAB2溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移；以及所述检测区固定化有所述单克隆抗体PEDV-McAB1；其中，所述缓冲液供应单元包括展开液垫(5)、底物缓冲液槽(8)、底物缓冲液(9)和缓冲液按钮，所述底物缓冲液(9)放置于底物缓冲液槽(8)中，所述缓冲液按钮位于底物缓冲液槽(8)的上方，按下可将所述展开液垫(5)浸入缓冲液(9)中；所述检测区包括检测线(6)、质控线(7)，其中，所述质控线(7)较检测线(6)更远离所述样品供应区，在所述检测线(6)上固定化有所述单克隆抗体PEDV-McAB1，在所述质控线(7)上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗，且吸附在酶标垫(2)上的酶标记的所述单克隆抗体PEDV-McAB2对于固定在检测线(6)上的固定所述单克隆抗体PEDV-McAB1而言是过量的；所述硝酸纤维素膜(1)全段粘附在所述支撑物(10)上，支撑物(10)连接所述缓冲液供应单元，底物供应区，样品供应区，检测区以及吸水垫(4)，所述吸水垫(4)在距所述缓冲液供应单元的最远端；以及检测样品(11)加入的位置为所述酶标垫(2)的位置。

作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒中的所述酶免疫层析检测试纸条包括固相的硝酸纤维素膜1、含有标记试剂的酶标垫2、底物垫3、吸水垫4、展开液垫5、检测线6、质控线7、底物缓冲液槽8、底物缓冲液9、支撑物10，其中2属于样品供应区，3属于底物供应区，5、8属于缓冲液供应单元，6、7属于检测区。检测样品11加入的位置为酶标垫2的位置。所述检测试纸条固定在塑料外壳中，其上从左到右依次固定展开液垫5、底物垫3、酶标垫2、吸水垫4。硝酸纤维素膜1粘附在支撑物10的全段；吸水垫4卡在硝酸纤维素膜1的顶端，且与硝酸纤维素膜1有重叠；酶标垫2位于硝酸纤维素膜1的中段，上面干燥有酶标记的所述单克隆抗体2；底物垫3卡在硝酸纤维素膜1的底端，其上有干燥的酶底物。展开液垫5的上端覆盖了底物垫3，且其下端位于底物缓冲液槽8的底端。底物缓冲液槽8的上面覆盖了一层铝箔纸，以防止底物缓冲液9渗漏，其上有缓冲液按钮，按下缓冲液按钮可刺破铝箔纸，并将展开液垫5的下端浸入到底物缓冲液9中。检测线6位于硝酸纤维素膜1的中上端，其上固定化有所述单克隆抗体PEDV-McAB1。质控线7位于硝酸纤维素膜1的中上端、检测线6的上游，其上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。

本发明涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括包被所述单克隆抗体PEDV-McAB1的ELISA板、含酶标记所述单克隆抗体PEDV-McAB2的反应液、用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。

作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒包括包被所述单克隆抗体PEDV-McAB1的ELISA板、含酶标记所述单克隆抗体PEDV-McAB2的反应液、洗涤液、稀释液、底物显色液、终止液、阴性对照、阳性对照；其中，所述洗涤液为磷酸盐缓冲液，所述稀释液为含牛血清白蛋白的溶液，所述底物显色液为四甲基联苯胺TMB显色液，所述终止液为2mol/l的浓H₂SO₄溶液，所述阴性对照为磷酸盐缓冲液，所述阳性对照为包含灭活纯化后的猪流行性腹泻病毒的溶液。

本发明涉及一种试剂盒，所述试剂盒包括包被猪流行性腹泻病毒抗原的ELISA板、含所述单克隆抗体的反应液、洗涤液、稀释液、底物显色液、酶标记的羊抗鼠二抗、终止液、阴性对照、阳性对照；其中，含所述单克隆抗体的反应液为含所述单克隆抗体PEDV-McAB1的反应液、或含所述单克隆抗体PEDV-McAB2的反应液、或含所述单克隆抗体PEDV-McAB1与所述单克隆抗体PEDV-McAB2的混合反应液；其中，所述洗涤液为磷酸盐缓冲液，所述稀释液为含牛血清白蛋白的溶液，所述底物显色液为四甲基联苯胺TMB显色液，所述终止液为2mol/l的浓H₂SO₄溶液，所述阴性对照为磷酸盐缓冲液，所述阳性对照为包含灭活纯化后的猪流行性腹泻病毒的溶液。

本发明还涉及所述试剂盒检测样品中猪流行性腹泻病毒的方法，所述方法包括：(1)将检测样品与所述单克隆抗体PEDV-McAB1和/或所述单克隆抗体PEDV-McAB2进行接触，(2)检测所述单克隆抗体PEDV-McAB1和/或单克隆抗体PEDV-McAB2与样品中猪流行性腹泻病毒的反应；其中，所述方法步骤(1)中的所述单克隆抗体PEDV-McAB1或所述单克隆抗体PEDV-McAB2附着在固相上，所述固相优选为微滴定板、磁颗粒、乳胶颗粒、硝化纤维素膜中的任一种；其中，所述方法步骤(2)中所述反应可通过酶显色、荧光、胶体金、化学发光中的任一种方法进行测定。

作为本发明的一种实施方式，具有所述的PEDV-McAB1可变区序列的所述的抗体或所述抗体的片段以及具有所述的PEDV-McAB2可变区序列的所述的抗体或所述抗体的片段使用酶标记，所述用于和猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂为与所述标记的酶产生颜色反应的底物。

作为本发明的一种实施方式，所述用于和猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂为与所述抗体或所述抗体的片段结合的酶标二抗以及与所述标记的酶产生颜色反应的底物。

术语“检测样品”包括但不限于动物或患者的排泄物、口鼻腔分泌物、动物细胞培养的完整病毒或裂解病毒液等。

作为本发明的一种实施方式，所述方法包括：将采集的微生物拭子插入到样品处理管中，使样品尽可能溶解在溶液中，将处理后的样品滴加至胶体金检测试纸条加样孔中心，10分钟后判定结果，结果判定标准为：(1)若质控线处无条带，无论检测线处是否有条带，检测过程均无效，(2)在质控线处有条带的情况下，若检测线处有条带，则为阳性，否则为阴性，即：质控线的有无决定了检测过程是否有效，若质控线处并无条带，无论检测线处是否有条带，检测过程均无效，在质控线处有条带的情况下，若检测线处有条带则为阳性，否则为阴性。

作为本发明的一种实施方式，所述方法包括：使用样品处理管预处理样品，将所述预处理样品加入所述酶免疫层析检测试纸条中所述酶标垫的位置，按下缓冲液按钮，30分钟后观察结果，结果判定标准为：(1)若质控线处并无条带，无论检测线处是否有条带，检测过程均无效，(2)在质控线处有条带的情况下，若检测线处有条带，则为阳性，否则为阴性，即：质控线的有无决定了检测过程是否有效，若质控线处并无条带，无论检测线处是否有条带，检测过程均无效，在质控线处有条带的情况下，若检测线处有条带则为阳性，否则为阴性。

作为本发明的一种实施方式，所述方法包括：将包被所述单克隆抗体PEDV-McAB1的ELISA板用封闭液进行封闭，用洗涤液进行洗涤；使用样品处理管预处理样品，将所述预处理样品于稀释液中稀释后加入ELISA反应孔中进行检测反应，同时做阳性对照、阴性对照，于反应后洗涤；加入稀释的酶标记所述单克隆抗体PEDV-McAB2，于37℃作用40-80min反应后洗涤；加入底物显色液，于37℃反应10min后加入终止液；用酶标仪读取数据，对结果进行判定。

作为本发明的一种实施方式，所述方法包括：将包被猪流行性腹泻病毒抗原的ELISA板用封闭液进行封闭，同时做阴性对照、阳性对照，并用洗涤液进行洗涤；使用样品处理管预处理样品，将所述预处理样品于稀释液中进行稀释后加入ELISA反应孔中进行检测反应，并用已知浓度的猪流行性腹泻病毒抗原进行梯度稀释后加入ELISA反应孔中进行检测反应，于反应后洗涤；将含所述单克隆抗体PEDV-McAB1的反应液，或含所述单克隆抗体PEDV-McAB2的反应液，或含所述单克隆抗体PEDV-McAB1和所述单克隆抗体PEDV-McAB2混合的反应液，稀释后加入ELISA反应孔，于37℃反应20-40min，洗涤，同时设空白对照；将酶标记的羊抗鼠二抗稀释后加入ELISA反应孔中，于37℃反应20-40min，洗涤；加入底物显色液，于37℃反应10min后加入终止液；用酶标仪读取数据，对结果进行判定。

本发明涉及所述试剂盒在用于非诊断目的的猪流行性腹泻病毒检测中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了包括有效量的所述单克隆抗体PEDV-McAB1的试剂盒在用于非诊断目的的猪流行性腹泻病毒检测中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了包括有效量的所述单克隆抗体PEDV-McAB2的试剂盒在用于非诊断目的的猪流行性腹泻病毒检测中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了包括有效量的所述单克隆抗体PEDV-McAB1和有效量的单克隆抗体PEDV-McAB2的试剂盒在用于非诊断目的的猪流行性腹泻病毒检测中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了使用本发明的所述单克隆抗体PEDV-McAB1和所述单克隆抗体PEDV-McAB2进行夹心法检测的试剂盒在用于非诊断目的的猪流行性腹泻病毒检测中的应用。

含本发明抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的试剂盒可用于非诊断目的的猪流行性腹泻病毒检测中的应用；所述非诊断目的的猪流行性腹泻病毒检测包括流行病学分析、对离体组织进行检测、表位鉴定研究以及定性和定量鉴别检验含猪流行性腹泻病毒抗原和其他抗原的疫苗组合物中的猪流行性腹泻病毒抗原的检测。

作为本发明的一种实施方式，所述其他抗原包括猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪轮状病毒抗原、猪圆环病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪霍乱病抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种；进一步优选地，所述其他抗原为猪传染性胃肠炎病毒抗原。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的制备、纯化、鉴定及检验

1.1抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的制备和纯化

将猪流性腹泻病毒HN1301株(参见中国专利CN104513827A)按照张丽燕等(张丽燕.猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的研制.四川农业大学.硕士论文)中的方法纯化病毒，免疫小鼠，克隆获得杂交瘤细胞，在小鼠体内制备2株单克隆抗体。

将制备的2株单克隆抗体按照陈丹等(陈丹,孙广瑞,柳增善.辛酸-硫酸铵联合沉淀法在单克隆抗体纯化中的应用.安徽农业科学,2007,35(26):8105,8108)的辛酸-硫酸铵联合沉淀法纯化单克隆抗体的操作方法分别纯化抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB1、抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB2。

1.2抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的鉴定

1.2.1单克隆抗体类型和亚类的鉴定

运用Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit并参照说明书对抗体的亚型进行鉴定。鉴定结果见表1：

表1各单克隆抗体类型的鉴定

注：+表示阳性反应，-表示阴性反应。

由表1可知，单克隆抗体PEDV-McAB1、单克隆抗体PEDV-McAB2重链亚型都为IgG2a，轻链类型都为kappa。

1.2.2单克隆抗体特异性的鉴定

将PEDV、TGEV、PoRV、PRRSV、PRV及Vero细胞分别包被反应板，测定单克隆抗体PEDV-McAB1、单克隆抗体PEDV-McAB2与PEDV、TGEV、PoRV、PRRSV、PRV及Vero细胞是否具有交叉反应性。

测定结果显示：单克隆抗体PEDV-McAB1、单克隆抗体PEDV-McAB2与TGEV、PoRV、PRRSV、PRV及Vero细胞均无交叉反应，仅与PEDV反应呈阳性，表明单克隆抗体PEDV-McAB1、单克隆抗体PEDV-McAB2均是抗猪流行性腹泻病毒的特异性单克隆抗体。

1.3纯化后单克隆抗体的检验

1.3.1外观检验

室温下，肉眼观察可见纯化的单克隆抗体PEDV-McAB1、单克隆抗体PEDV-McAB2均呈无色澄清状态，未见絮状物沉淀。

1.3.2无菌检验

采用无菌检验法，分别取纯化后的单克隆抗体原料接种10ml/管的营养琼脂斜面培养基、改良马丁培养基和硫乙醇酸盐培养基各2管(接种量为0.5ml/管)。接种后的硫乙醇酸盐培养基及营养琼脂斜面培养基各一管置于30-35℃培养，另一管于20-25℃培养。改良马丁培养基置于20-25℃培养。同时以无菌生理盐水同法操作做阴性对照。培养14天后均未观察到培养基中有微生物生长，观察结果表明：单克隆抗体PEDV-McAB1、单克隆抗体PEDV-McAB2原料均符合无菌要求。

1.3.3单克隆抗体的纯度

采用陈丹等(孙广瑞,柳增善.辛酸-硫酸铵联合沉淀法在单克隆抗体纯化中的应用.安徽农业科学,2007,35(26):8105,8108)SDS-PAGE凝胶电泳进行鉴定，上样量为10μg，检测结果如图1所示。结果表明：单克隆抗体PEDV-McAB1、单克隆抗体PEDV-McAB2的纯度均不低于95％。

1.3.4单克隆抗体相对亲和力的测定

将制备的单克隆抗体PEDV-McAB1、单克隆抗体PEDV-McAB2按照宋帅等(宋帅，林彤，邵军军，常惠芸.抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体相对亲和力的测定.兽医免疫学，2009,25(4):333-335)中的操作方法测定其相对亲和力。其中抗原的包被浓度为5μg/ml，酶标二抗的稀释度为1:10000，测定纯化后的单克隆抗体的相对亲和力。计算结果表明：单克隆抗体PEDV-McAB1的相对亲和力为0.78μg/ml，单克隆抗体PEDV-McAB2的相对亲和力为0.44μg/ml。

1.3.5单克隆抗体中和活性的测定

2株单克隆抗体与500TCID₅₀的不同来源的PEDV毒株中和后接种Vero细胞，通过中和试验测定该单克隆抗体具有中和疫苗株PEDV CV777株、疫苗株SM98株及流行毒株的代表毒株HN1301株的能力。测得单克隆抗体PEDV-McAB1中和抗体效价均不小于1:512，表明单克隆抗体PEDV-McAB1具有良好的中和活性，而单克隆抗体PEDV-McAB2的中和抗体效价均小于1:2，表明单克隆抗体PEDV-McAB2无中和活性。

表2用不同毒株与单克隆抗体中和后测得的中和抗体效价

1.4单克隆抗体含量的测定

用BCA蛋白定量试剂盒分别对单克隆抗体PEDV-McAB1、单克隆抗体PEDV-McAB2按照说明书进行定量分析，测定结果表明：单克隆抗体PEDV-McAB1、单克隆抗体PEDV-McAB2的浓度分别为4、4.5mg/ml。

1.5单克隆抗体的配对

选择HN1301株猪流行性腹泻病毒，稀释到10^5.0TCID₅₀/ml，对不同搭配模式进行检测，结果见表3：

表3单克隆抗体搭配

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

结果表明：标记单克隆抗体PEDV-McAB1和固定单克隆抗体PEDV-McAB2检测猪流行性腹泻病毒液为阴性，其余搭配检测结果均为阳性。因而选择固定单克隆抗体PEDV-McAB1、标记单克隆抗体PEDV-McAB2为搭配方式。

实施例2单克隆抗体可变区序列的测定

2.1单克隆抗体重链和轻链可变区引物设计

根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计重链可变区引物序列：

P1：5’-ACTAGTTGACGTGGTCTCTAGGGTCACTTTAGTTTTCCT-3’

P2：5’-CGGAAGCTTCCAGCGRCCARKCCATATACIGRTGG-3’

设计轻链可变区引物序列：

P3：5’-GCCATCTCATGRAGWCATTKWCYCAAGTCTTT-3’

P4：5’-CGGACGCTTACTGCCTGGTAAGAAGATGGA-3’

2.2单克隆抗体可变区序列测定

按照张爱华等(张爱华，闭兰，王志友等.系列鼠抗CD分子单克隆抗体轻、重链可变区基因的克隆和序列分析.中国生物制品学杂志，2001,15(2)：65-68)建立的可变区序列测定方法，通过分子克隆技术分别获得单克隆抗体PEDV-McAB1、单克隆抗体PEDV-McAB2的可变区序列，选取对应的克隆质粒送至苏州金维智生物科技有限公司进行测序。

测定单克隆抗体PEDV-McAB1的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别如SEQ IDNo.1、SEQ ID No.3所示，由其推导的氨基酸序列分别为SEQ ID No.2、SEQ ID No.4；单克隆抗体PEDV-McAB2的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别如SEQ ID No.5、SEQ ID No.7所示，由其推导的氨基酸序列分别为SEQ ID No.6、SEQ ID No.8。

实施例3试剂盒的制备及应用

3.1试剂盒之胶体金检测试纸条

胶体金检测试纸条的制备：按照李红梅等(李红梅，聂政，陈佳等.免疫检测用的胶体金制备工艺的优化研究.食品工业科技，2009,30(12)：289-291)建立的胶体金制备方法，制备胶体金溶液并标记单克隆抗体PEDV-McAB2，单克隆抗体PEDV-McAB1和羊抗鼠IgG(购自Sigma公司)喷涂在硝酸纤维素膜上分别作为检测线和质控线，将该硝酸纤维素膜和浸润有金标单克隆抗体PEDV-McAB2的金标垫用塑料外壳包装起来，做成胶体金检测试纸条。并配置相应的磷酸盐缓冲液作为样品处理液。检测时，将待检样品置于样品处理管中，使样品尽可能溶解在溶液中，将含有待检样品的样品处理管盖子头部折断，滴加2-3滴混匀后的样品(约80μl)至试纸条加样孔中心；10分钟后在检测试纸条的检测区观察记录结果，并依据判定标准进行判定。结果判定标准：质控线显色则试验成立，检测线显色即为阳性、不显色即为阴性；质控线未显色则试验不成立，无论检测线是否显色均判定为无效结果，需重测。

质量研究：

(1)灵敏度检验：将PEDV HN1301株病毒液(病毒滴度为10^6.5TCID₅₀/ml)进行10倍倍比稀释，稀释至毒价为10^5.5TCID₅₀/ml、10^4.5TCID₅₀/ml、10^3.5TCID₅₀/ml，用胶体金检测试纸条进行检测。结果显示试纸条的检测下限为10^4.5TCID₅₀/ml。

(2)敏感性检验：将PEDV(HN1301株和CV777株)病毒液(病毒滴度均为10^6.5TCID₅₀/ml)进行10倍倍比稀释，稀释至毒价为10^5.5TCID₅₀/ml、10^4.5TCID₅₀/ml、10^3.5TCID₅₀/ml，用胶体金检测试纸条进行检测。结果显示试纸条对PEDV HN1301株和CV777株的检测下限均为10^4.5TCID₅₀/ml。

(3)特异性测定：取猪传染性胃肠炎病毒(华毒株)病毒液、猪轮状病毒(OSU株)病毒液、猪细小病毒(WH-1株)病毒液、猪瘟病毒(C株)病毒液、猪伪狂犬病病毒(Bartha K-61株)病毒液，以及阴性粪便样品，按照胶体金检测试纸条检测方法进行检测。结果显示试纸条检测以上6份特异性样品均为阴性。

(4)重复性试验

批间重复性：取3批猪流行性腹泻病毒胶体金检测试纸条按实施例3.1中所述的检测方法分别检测PEDV阳性和阴性样品。试纸条批间的符合率大于90％，且试纸条间检测同一份样品的显色强度一致。

批内重复性：取1批猪流行性腹泻病毒胶体金检测试纸条，由1人对PEDV阳性和阴性样品进行重复检测三次。试纸条批内的符合率大于90％，且试纸条间检测同一份样品的显色强度一致。

临床应用：将采集的20份临床样品按照实施例3.1中所述的检测方法进行检测，结果见表4。

同时，20份临床样品分别用邹勇等建立的RT-PCR(邹勇,钱永清,唐永兰等.猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪轮状病毒RT-PCR鉴别诊断技术研究.上海农业学报，2003,2:82-84)和胶体金试纸条(韩国安捷公司，参照试剂盒参考说明书进行操作)检测，结果见表4。

由表4可知：试纸条的检测结果和RT-PCR检测结果的符合率达到了90％，并且没有出现非特异性。安捷纸条与RT-PCR检测结果的符合率为80％，且有假阳性结果的出现。故自制胶体金试纸条的敏感性和特异性均优于安捷的胶体金试纸条。

3.2试剂盒之酶免疫层析检测试纸条

按照CN104062430A制备酶免疫层析检测试纸条，如图2所示，将实施例1制备的单克隆抗体PEDV-McAB2进行酶标记，将实施例1制备的单克隆抗体PEDV-McAB1和羊抗鼠IgG分别喷涂在硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线，将该硝酸纤维素膜、酶标垫和底物垫用塑料外壳包装起来，做成酶免疫检测试纸条。并配制磷酸盐缓冲液作为样品处理液。

检测时，将待检样品置于样品处理管中，使样品尽可能溶解在溶液中，将含有待检样品的样品处理管盖子头部折断，滴加2-3滴混匀后的样品(约80μl)至试纸条加样孔中心；30分钟后在检测试纸条的检测区观察记录结果，并依据判定标准进行判定。结果判定标准：质控线显色则试验成立，检测线显色即为阳性、不显色即为阴性；质控线线未显色则试验不成立，无论检测线是否显色均判定为无效结果，需重测。

按照实施例3.1中毒株和倍比稀释，进行酶免疫层析检测试纸条的质量研究，进行灵敏度、敏感性、特异性和重复性试验，结果表明：(1)灵敏度检验：显示试纸条的检测下限为10^3.5TCID₅₀/ml；(2)敏感性检验：试纸条对PEDV HN1301株和CV777株的检测下限均为10^3.5TCID₅₀/ml；(3)特异性测定：显示试纸条检测猪传染性胃肠炎病毒(华毒株)病毒液、猪轮状病毒(OSU株)病毒液、猪细小病毒(WH-1株)病毒液、猪瘟病毒(C株)病毒液、猪伪狂犬病病毒(Bartha K-61株)病毒液，以及阴性粪便样品6份特异性样品均为阴性；(4)重复性试验：显示试纸条批间和批内的符合率均大于90％，且试纸条间检测同一份样品的显色强度一致。

临床应用：将2～3滴(约80μl)实施例3.1制备的20份临床样品滴加于酶联免疫试纸条的加样孔处，同时迅速按下缓冲液按钮，静置30分钟后在检测试纸条的检测区观察记录结果，结果见表4。

由表4可知：酶免疫层析检测试纸条的检测结果和RT-PCR检测结果的符合率达到了100％，并且没有出现非特异性。

表4胶体金检测试纸条、酶免疫层析检测试纸条、RT-PCR、安捷试纸条检测临床样品结果比对

注：“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性

3.3试剂盒之双抗夹心Sandwich-ELISA-McAB1/2

以双抗夹心原理检测临床样品中的PEDV，制备Sandwich-ELISA-McAB1/2试剂盒：取实施例1纯化的单克隆抗体PEDV-McAB1用包被液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)稀释至4μg/ml，100μL/孔，置于4℃包被过夜，取出用PBST洗板3次，拍干；用5％的脱脂奶粉以100μL/孔加入，37℃封闭1小时，洗板3次，拍干；取灭活纯化后的PEDV HN1301株(灭活前含量为10^4.0TCID₅₀/ml)作为阳性对照，用PBS缓冲液作为阴性对照，同时取待检样品进行检测，100μL/孔，置于37℃作用1h，取出用PBST洗板3次，拍干；取HRP标记的单克隆抗体PEDV-McAB2作为二抗，做1000倍稀释，100μL/孔，置于37℃作用1h，取出用PBST洗板3次，拍干；加入TMB(四甲基联苯胺)底物溶液50μL/孔，37℃反应10min；最后加入50μL/孔的2M硫酸终止反应，用酶标仪检测OD_450nm。结果判定标准：以阳性对照的OD_450nm值和阴性对照的OD_450nm值作为标准，根据样品的OD_450nm值来判断样品的阴阳性，即阳性对照OD_450nm值-阴性对照OD_450nm值＞0.5则试验成立，阳性对照OD_450nm值/阴性对照OD_450nm值≥2.1，待检样品OD_450nm值≥0.3时即为阳性，否则为阴性。

按照实施例3.1中毒株和倍比稀释，进行双抗夹心Sandwich-ELISA-McAB1/2的质量研究，进行灵敏度、敏感性、特异性和重复性试验，结果表明：(1)灵敏度检验：显示试剂盒的检测下限为10^3.0TCID₅₀/ml；(2)敏感性检验：试剂盒对PEDV HN1301株和CV777株的检测下限均为10^3.0TCID₅₀/ml；(3)特异性测定：显示试剂盒检测猪传染性胃肠炎病毒(华毒株)病毒液、猪轮状病毒(OSU株)病毒液、猪细小病毒(WH-1株)病毒液、猪瘟病毒(C株)病毒液、猪伪狂犬病病毒(Bartha K-61株)病毒液，以及阴性粪便样品6份特异性样品均为阴性；(4)重复性试验：显示试剂盒批间批内的变异系数均小于10％。

临床应用：按照检测方法对实施例3.1制备其中的10份临床样品进行临床检测，其结果见表5。

表5RT-PCR和双抗夹心Sandwich-ELISA-McAB1/2检测结果比较

由表5可知：双抗夹心Sandwich-ELISA-McAB1/2的检测结果和RT-PCR检测结果完全符合，灵敏度达到PCR量级，表明该2株单克隆抗体可以作为双抗夹心ELISA试剂盒的原材料，用于检测猪流行性腹泻病毒抗原。

3.4试剂盒之竞争Competitive-ELISA-McAB1/2/1+2

ELISA2的制备：取纯化好的PEDV HN1301株(10^7.5TCID₅₀/ml)病毒抗原用包被液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)稀释1:10000后进行包被，100μL/孔，同时做阴性对照(用PBS缓冲液代替)、阳性对照(灭活纯化后的PEDV HN1301株，灭活前含量为10^4.0TCID₅₀/ml)，4℃过夜，取出用PBST洗板3次，拍干；用5％的脱脂奶粉以100μL/孔加入，37℃封闭1小时，洗板3次，拍干；按照实施例1.1进行繁殖和纯化PEDV CV777株(10^7.0TCID₅₀/ml)，用稀释液按照1:10V/V的比例进行梯度稀释，并按100μL/孔添加，同时将每个待检样品按照1:10V/V的比例稀释3个；将实施例1纯化后的单克隆抗体用稀释液稀释至100μg/mL，按100μL/孔添加，于37℃反应30分钟，洗涤3次，拍干，同时设空白对照；HRP标记的羊抗鼠二抗用稀释液按1:1×10⁴V/V进行稀释，然后100μL/孔加入，37℃反应30分钟，洗涤3次，拍干；加入TMB(四甲基联苯胺)底物溶液50μL/孔加入，37℃反应10分钟；最后加入50μL/孔的2M硫酸终止反应，用酶标仪检测OD_450nm。

其中，当单克隆抗体为单克隆抗体PEDV-McAB1时作为Competitive-ELISA-McAB1，当单克隆抗体为单克隆抗体PEDV-McAB2时作为Competitive-ELISA-McAB2，当单克隆抗体为单克隆抗体PEDV-McAB1与单克隆抗体以1:1V/V混合时作为Competitive-ELISA-McAB1+2。然后，根据PEDV CV777株梯度稀释经Competitive-ELISA-McAB1、Competitive-ELISA-McAB2、Competitive-ELISA-McAB1+2检测后的OD_450nm值与梯度稀释的浓度绘制竞争标准曲线，并根据待检样品检测的OD_450nm结果计算其所含的PEDV含量。

按照实施例3.1中毒株和倍比稀释，进行竞争Competitive-ELISA-McAB1、Competitive-ELISA-McAB2、Competitive-ELISA-McAB1+2试剂盒的质量研究，进行灵敏度、敏感性、特异性和重复性试验，结果表明：(1)灵敏度检验：显示试剂盒的检测下限均为10^3.0TCID₅₀/ml；(2)敏感性检验：3个试剂盒对PEDV HN1301株和CV777株的检测下限均为10^3.0TCID₅₀/ml；(3)特异性测定：显示3个试剂盒检测猪传染性胃肠炎病毒(华毒株)病毒液、猪轮状病毒(OSU株)病毒液、猪细小病毒(WH-1株)病毒液、猪瘟病毒(C株)病毒液、猪伪狂犬病病毒(Bartha K-61株)病毒液，以及阴性粪便样品6份特异性样品均为阴性；(4)重复性试验：显示3个试剂盒批间批内的变异系数均小于10％。

临床研究：按照检测方法将实施例3.1制备其中的10份临床样品进行临床检测，计算结果如表6所示：

表6竞争ELISA与RT-PCR检测临床样本结果比对

结果显示：Competitive-ELISA-McAB1/2/1+2检测结果与RT-PCR检测结果相吻合。

实施例4单克隆抗体鉴别联苗

将哈尔滨维科生物技术开发公司生产的猪流性腹泻、猪传染性胃肠炎二联活疫苗用DMEM培养液按照疫苗使用说明书稀释疫苗至10^5.0TCID₅₀/ml。

取等体积稀释后的疫苗分别与单克隆抗体PEDV-McAB1(中和效价大于1:512)、抗PEDV高免血清(按照中国专利CN103705918A制备，中和效价大于1:512)置于37℃中和作用1h。取中和后的病毒液先5倍稀释，然后10倍倍比稀释后，接种96孔板测定毒价。统计中和后的细胞病变孔，计算毒价。结果见表7。

表7二联活疫苗经PEDV抗体中和后TGEV毒价

结果显示：上述数据显示，二联活疫苗使用高免血清中和PEDV后，TGEV毒价损失较多，而使用单克隆抗体PEDV-McAB1中和PEDV后，测定TGEV毒价，更接近于配苗的理论值。因此单克隆抗体PEDV-McAB1可以用于二联或多联活疫苗中病毒含量的测定。

实施例5单克隆抗体PEDV-McAB1预防和/或治疗病毒感染的效果评价

5.1单克隆抗体PEDV-McAB1预防病毒感染效果评价

筛选PEDV、PoRV、TGEV抗原、抗体双阴性的2-3日龄仔猪15头，随机分为3组，第一组和第二组分别口服实施例1中制备的单克隆抗体PEDV-McAB12mL,第三组口服PBS缓冲液2mL，口服后24小时第一组和第三组口服PEDV流行毒株HN1301小肠毒2mL(含1000个最小发病剂量)，第二组口服CV777小肠毒(含1000个最小发病剂量)，每日观察仔猪的临床症状，连续观察14天，通过临床发病率、发病程度、死亡率及采用PCR方法检测肛拭子中的病毒监测排毒天数来评价单克隆抗体PEDV-McAB1的预防腹泻病毒感染的效果，结果见表8。

表8服用单克隆抗体PEDV-McAB1后预防PEDV感染的试验结果

5.2单克隆抗体PEDV-McAB1治疗病毒感染效果评价

筛选PEDV、PoRV、TGEV抗原、抗体双阴性的2-3日龄仔猪20头，随机分为4组，第一组和第二组分别口服PEDV流行毒株HN1301小肠毒2mL(含1000个最小发病剂量)，第三组和第四组口服CV777小肠毒(含1000个最小发病剂量)，口服后12小时第一组和第三组分别口服实施例1制备的单克隆抗体PEDV-McAB1-2mL，第二组和第四组口服PBS，每日观察仔猪的临床症状，连续观察14天，通过临床发病率、发病程度、死亡率及采用PCR方法检测肛拭子中的病毒来监测排毒天数，从而评价单克隆抗体PEDV-McAB1治疗猪流行性腹泻病毒感染的效果，结果见表9。

表9PEDV感染后后12小时服用单克隆抗体PEDV-McAB1治疗的试验结果

结果表明，单克隆抗体PEDV-McAB1能够减轻由猪流行性腹泻病毒引起的临床症状，减少死亡率以及减少排毒天数，有很好的预防和/或治疗作用。

实施例6基因工程抗体的制备

按照李越等(李越.A型流感病毒单链抗体基因的克隆及抗病毒活性研究.新疆农业大学硕士学位论文,2014)建立的单链抗体制备的操作方法，分别用单克隆抗体PEDV-McAB1和单克隆抗体PEDV-McAB2的可变区序列制备相对应的单链抗体1和单链抗体2，用单克隆抗体PEDV-McAB1的重链可变区和单克隆抗体PEDV-McAB2的轻链可变区制备单链抗体3，用单克隆抗体PEDV-McAB2的重链可变区和单克隆抗体PEDV-McAB1的轻链可变区制备单链抗体4。

取实施例1.1制备HN1301株PEDV接种细胞，至细胞出现30％的病变，用80％丙酮4℃固定30min，用PH7.4PBS洗涤3次，5min/次，分别加入单链抗体1、单链抗体2、单链抗体3和单链抗体4置于37℃作用1h，用pH7.4PBS洗涤3次，5min/次，加入FITC标记的兔抗鼠IgG置于37℃作用1h，用pH7.4PBS洗涤3次，5min/次，置于荧光显微镜下观察。

按照实施例1.3.5操作方法，测定单链抗体1、单链抗体2、单链抗体3和单链抗体4的中和效价。

结果显示：单链抗体1、单链抗体2、单链抗体3和单链抗体4均可以和猪流行性腹泻病毒发生特异性反应。单链抗体1和单链抗体3的中和效价为1:64，而单链抗体2和单链抗体4无中和效价。

以上结果显示SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5和SEQ ID No.7可用于猪流行性腹泻病毒基因工程抗体的制备。

以上全面描述了本发明的优选实施例，但是可对它们进行各种替代和修改。因此，不应参照以上描述来决定本发明的范围，而是应参照所附权利要求书及其全部等同物来决定本发明的范围。任何特征，(不论是否为优选)均可与任何其他特征(不论是否为优选)相结合。本发明的权利要求书不应被理解为具有方法+功能的限制，除非在某一权利要求中通过术语“…的方法”明确地列举出此类限制。

Claims

1.一种特异性结合猪流行性腹泻病毒的鼠单克隆抗体PEDV-McAB1，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2所示；2)轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示。

2.一种由权利要求1所述的重链可变区，和轻链可变区组成的抗体；所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体、猪源单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的抗体，所述抗体为单克隆抗体PEDV-McAB1，所述单克隆抗体PEDV-McAB1重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID No.4所示。

4.一种特异性结合猪流行性腹泻病毒的鼠单克隆抗体PEDV-McAB2，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.6所示；2)轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.8所示。

5.一种由权利要求4所述的可变区中重链可变区，和所述的可变区中轻链可变区组成的抗体；所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体、猪源单克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的抗体，其中，所述抗体为单克隆抗体PEDV-McAB2，所述单克隆抗体PEDV-McAB2重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.6所示，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.8所示。

7.一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含免疫量的权利要求2所述的抗体，以及药学上可接受的载体。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中，所述药物组合物包含免疫量的所述单克隆抗体PEDV-McAB1，以及药学上可接受的载体。

9.根据权利要求7所述的药物组合物，其中，所述药物组合物包含免疫量的权利要求1所述单克隆抗体PEDV-McAB1的重链可变区制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体。

10.根据权利要求7所述的药物组合物，其中，所述药物组合物包含免疫量的权利要求1所述单克隆抗体PEDV-McAB1的重链可变区和轻链可变区制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体。

11.根据权利要求7所述的药物组合物，其中，所述药物组合物包含免疫量的所述单克隆抗体PEDV-McAB1的重链可变区和所述单克隆抗体PEDV-McAB2的轻链可变区序列制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体；所述单克隆抗体PEDV-McAB1的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，所述单克隆抗体PEDV-McAB2轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNo.8所示。

12.一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的权利要求2所述的抗体，和/或有效量的权利要求5所述的抗体，以及用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。

13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中，所述权利要求2所述的抗体以及权利要求5所述的抗体使用酶标记，所述用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂为与所述标记的酶产生颜色反应的底物。

14.根据权利要求12所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的所述的单克隆抗体PEDV-McAB1，和/或有效量的所述的单克隆抗体PEDV-McAB2，用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。

15.根据权利要求12所述的试剂盒，其中，所述用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂为与所述抗体结合的酶标二抗以及与所述标记的酶产生颜色反应的底物，所述酶标二抗包括酶标羊抗鼠多抗、酶标羊抗鼠二抗。

16.一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的权利要求3所述单克隆抗体PEDV-McAB1、有效量的权利要求6所述单克隆抗体PEDV-McAB2，以及用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂；

其中，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有滤纸、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得抗原与所述单克隆抗体PEDV-McAB2的结合体能在其上向底板第二端迁移；所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体PEDV-McAB2，所述硝酸纤维素膜近所述底板第二端的位置上包括一条检测线和一条质控线，所述检测线上固定化有所述单克隆抗体PEDV-McAB1，所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。

17.一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的权利要求3所述单克隆抗体PEDV-McAB1、有效量的权利要求6所述单克隆抗体PEDV-McAB2，以及用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂；

其中，所述试剂盒包括缓冲液供应单元和酶免疫层析检测试纸条；所述缓冲液供应单元用于将缓冲液供给所述酶免疫层析检测试纸条；所述酶免疫层析检测试纸条包括硝酸纤维素膜(1)，所述酶免疫层析检测试纸条在纵向上依次包括底物供应区、样品供应区、检测区；所述底物供应区包括底物垫(3)，其上吸附有干燥的酶底物，所述底物垫(3)与硝酸纤维素膜(1)接触，所述酶底物溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移；所述样品供应区包括酶标垫(2)，其上吸附有酶标记的所述单克隆抗体PEDV-McAB2，所述酶底物能与所述单克隆抗体PEDV-McAB2上标记的酶产生显色反应，所述酶标垫(2)与硝酸纤维素膜(1)接触，所述单克隆抗体PEDV-McAB2溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移；以及所述检测区固定化有所述单克隆抗体PEDV-McAB1；

其中，所述缓冲液供应单元包括展开液垫(5)、底物缓冲液槽(8)、底物缓冲液(9)和缓冲液按钮，所述底物缓冲液(9)放置于底物缓冲液槽(8)中，所述缓冲液按钮位于底物缓冲液槽(8)的上方，按下可将所述展开液垫(5)浸入缓冲液(9)中；所述检测区包括检测线(6)、质控线(7)，其中，所述质控线(7)较检测线(6)更远离所述样品供应区，在所述检测线(6)上固定化有所述单克隆抗体PEDV-McAB1，在所述质控线(7)上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗，且吸附在酶标垫(2)上的酶标记的所述单克隆抗体PEDV-McAB2对于固定在检测线(6)上的所述单克隆抗体PEDV-McAB1而言是过量的；所述硝酸纤维素膜(1)全段粘附在所述支撑物(10)上，支撑物(10)连接所述缓冲液供应单元，底物供应区，样品供应区，检测区以及吸水垫(4)，所述吸水垫(4)在距所述缓冲液供应单元的最远端；以及检测样品(11)加入的位置为所述酶标垫(2)的位置。

18.一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括包被权利要求3所述单克隆抗体PEDV-McAB1的ELISA板、含酶标记权利要求6所述单克隆抗体PEDV-McAB2的反应液、用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。

19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括包被所述单克隆抗体PEDV-McAB1的ELISA板、含酶标记所述单克隆抗体PEDV-McAB2的反应液、洗涤液、稀释液、底物显色液、终止液、阴性对照、阳性对照；其中，所述洗涤液为磷酸盐缓冲液，所述稀释液为含牛血清白蛋白的溶液，所述底物显色液为四甲基联苯胺TMB显色液，所述终止液为2mol/l的浓H₂SO₄溶液，所述阴性对照为磷酸盐缓冲液，所述阳性对照为包含灭活纯化后的猪流行性腹泻病毒的溶液。

20.一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括包被猪流行性腹泻病毒抗原的ELISA板、含所述单克隆抗体的反应液、洗涤液、稀释液、底物显色液、终止液、阴性对照、阳性对照；其中，含所述单克隆抗体的反应液为含权利要求3所述单克隆抗体PEDV-McAB1的反应液、或含权利要求6所述单克隆抗体PEDV-McAB2的反应液、或含所述单克隆抗体PEDV-McAB1与所述单克隆抗体PEDV-McAB2的混合反应液；其中，所述洗涤液为磷酸盐缓冲液，所述稀释液为含牛血清白蛋白的溶液，所述底物显色液为四甲基联苯胺TMB显色液，所述终止液为2mol/l的浓H₂SO₄溶液，所述阴性对照为磷酸盐缓冲液，所述阳性对照为包含灭活纯化后的猪流行性腹泻病毒的溶液。