CN105441368B

CN105441368B - 一株牛支原体及其应用

Info

Publication number: CN105441368B
Application number: CN201610031897.3A
Authority: CN
Inventors: 张德明; 林燕花; 王锦祥; 李金凤; 车勇良; 张梦青
Original assignee: Fuqing Moke Veterinary Hospital
Current assignee: Fuqing Moke Veterinary Hospital
Priority date: 2016-01-19
Filing date: 2016-01-19
Publication date: 2019-01-01
Anticipated expiration: 2036-01-19
Also published as: CN105441368A

Abstract

本发明涉及一株牛支原体及应用。其步骤为通过病原分离培养、动物回归试验和16S rRNA基因序列测定，确定病原为牛支原体，命名为牛支原体MbovFJ1201株，保藏编号为CCTCC NO：M2015772。将此菌接种到培养基扩大培养，收获培养物，将培养物灭活，灭活后按1:1（V/V）比例加入ISA‑206佐剂混合得到灭活疫苗。本发明的疫苗针对性强，免疫保护效果好，能显著地减轻因感染牛支原体而引起的肺脏病变，提高平均日增重，能达到预防和控制牛支原体相关疾病的良好效果。

Description

一株牛支原体及其应用

技术领域

本发明涉及牛用疫苗领域，具体说是一株牛支原体及其应用。

背景技术

牛支原体相关疾病是危害养牛业的重要疫病。牛支原体感染能引起牛的肺炎、关节炎、乳房炎和结膜炎等疾病。自1961年美国首次报道分离到牛支原体以来，在不同国家都有暴发流行，给养牛业造成了严重的经济损失。美国和欧洲因牛支原体感染所引起的犊牛肺炎所致的损失就达数亿美元之巨。石磊等于2008年首次报道我国牛支原体的流行，此后的调查研究表明牛支原体在我国的牛群中普遍存在。牛支原体不仅导致很高的发病率和死亡率，而且经治疗后症状缓解的患牛一般发育迟缓，甚至成为废牛。

由于支原体的细胞结构介于病毒和细菌之间，且支原体的分离培养难度很大。因此，对其致病机理以及预防控制手段的研究还较不完善。目前，一般使用常规抗菌药物对牛支原体相关疾病进行处理，但作用甚微。因此，亟需一种免疫效果确实的疫苗对该病进行预防和控制。

发明内容

本发明提供一株牛支原体及其应用。

利用从病牛肺脏中分离得到的牛支原体(Mycoplasma bovis)MbovFJ1201株为种子，此菌株于2015年12月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2015772。

本发明的目的在于提供一种以ISA-206为佐剂的牛支原体灭活疫苗，用于牛支原体相关疾病的预防和控制。

本发明的目的通过如下方法实现。

牛支原体灭活疫苗中含牛支原体菌量为10⁸ccu/mL、50wt.% ISA-206佐剂。

由以下步骤制备而成：

1）抗原液的制备；

2）疫苗的配制，取灭活菌液与ISA-206佐剂混合，分装后密封保存。

所述抗原液的制备由以下步骤完成：将牛支原体MbovFJ1201株按3% V/V接种到培养基扩大培养，培养3-5天，收获培养物，测定菌株浓度并调整为2×10⁸ccu/mL；加入甲醛，使其终浓度为0.2%，置4℃灭活72小时制成灭活菌液。

疫苗的配制是将灭活菌液和ISA-206佐剂按体积比1:1混合制备而成。

步骤1）所述培养条件为为37℃、5% CO²培养3~5天，控制培养时间，保证灭活疫苗具有适量的抗原量。

步骤2）所述培养基为含酚红的PPLO培养基。

本发明所述牛支原体灭活疫苗，30日龄犊牛颈部三角区肌肉注射2mL疫苗，60日龄以2mL剂量加强免疫一次，免疫后保护力可达到80%以上，免疫保护期至少可持续5个月，其免疫保护效果确实，制备工艺简单，具有良好的应用前景。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

牛支原体的分离和鉴定

将临床病料进行细菌分离培养、动物回归试验和16S rRNA基因测序，分离到三株致牛肺炎的牛支原体（Mycoplasma bovis），分别命名为Mycoplasma bovis FJ1201（MbovFJ1201）、Mycoplasma bovis FJ1301（MbovFJ1301）和Mycoplasma bovis FJ1501（MbovFJ1501）。16S rRNA基因序列比对结果表明，MbovFJ1201、MbovFJ1301和MbovFJ1501的序列相似性为100%，说明这三株分离株为同一菌株。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料：来自于2012-2015年在福建省福州市、长乐市、厦门市、南平市和三明市多个养牛场，临床病料均为肺炎重症病牛或病死牛的肺脏组织，主要采集坏死灶及其周围的健康组织。采集的病料及时进行支原体的分离培养。

1.1.2 支原体培养基：PPLO液体培养基，含PPLO肉汤粉、酵母粉、丙酮酸钠MEM、马血清、青霉素和1%（w/v）酚红；PPLO固体培养基，含1.5%（w/v）琼脂粉的PPLO液体培养基。培养基于115℃灭菌15min后，于4℃保存备用。

1.1.3 16S rRNA引物：采用16S rRNA通用引物，委托上海生物工程技术有限公司合成。引物序列如下：

16S rRNA上游引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

16S rRNA下游引物：5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'

1.1.4 试验动物： 2月龄健康的荷斯坦犊牛和闽南黄牛，试验前经牛支原体间接血凝实验检测为牛支原体抗体阴性。

1.2 方法

1.2.1 支原体的分离培养

无菌条件下将采集的病肺组织切成小块。将小块组织的切面涂于PPLO固体培养基表面，同时将小块组织接种到PPLO液体培养基中，置于37℃ 5% CO₂培养箱中培养。3~5 d后观察固体培养基上菌落的形态，支原体的典型形态为“煎荷包蛋样”。此外，液体培养基由红色变为黄色，但保持清亮，对照组的培养基为红色。

挑取PPLO固体培养基上具有“煎荷包蛋样”典型特征的菌落，接种到不含青霉素的PPLO液体培养基中，连续传3代。将第3代培养物适当稀释后涂布于PPLO固体培养基，培养3~5 d，培养基上的菌落依然表现为典型的“煎荷包蛋样”形态。

1.2.2 动物回归试验

试验牛为2月龄健康的荷斯坦犊牛和闽南黄牛，其中荷斯坦公犊牛4头、母犊牛4头，闽南黄牛公犊牛4头、母犊牛4头。试验动物分为两组，对照组8头，试验组8头。两组试验动物各包括随机分组的荷斯坦公犊牛2头、母犊牛2头，闽南黄牛公犊牛2头、母犊牛2头。试验组动物通过喉气管接种3mL 72h的支原体液体培养物（MbovFJ1201），对照组动物通过喉气管接种3mL灭菌的PPLO液体培养基。试验期为15d，每天观察试验动物的临床表现，测量体温，如试验动物死亡则立即进行剖杀，观察呼吸道病变病采集病料。于15d试验结束时，剖杀所有试验组动物并剖杀2头对照组动物。

1.2.3 支原体的鉴定

1.2.3.1 取200μL支原体液体培养物，用碱裂解法提取支原体基因组，以此为模板扩增16S rRNA基因。PCR反应体系为25μL，其中2×Taq Mix（Takara）12.5μL，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，支原体基因组模板1.5μL，去离子水补齐至25μL。PCR反应程序为：95℃预变性5min后，95℃变性1min，42℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环后，72℃延伸10min。PCR产物在1%琼脂糖上电泳，目的条带大小约1500bp。PCR产物回收后，委托上海生物过程技术服务有限公司进行基因序列测定。

2 结果

2.1支原体的分离培养

将分离自小块病变肺脏组织中呈“煎荷包蛋样”形态的菌落接种于不含青霉素的液体PPLO培养基，连续传代3次后，再接种于固体PPLO培养基，菌落形态仍然表现为“煎荷包蛋样”。于2012至2015年共分离到三株，分别命名为MbovFJ1201、MbovFJ1301和MbovFJ1501。

2.2支原体的鉴定

对形态表现为“煎荷包蛋样”的菌体进行16S rRNA扩增，扩增出约1500bp的产物。将PCR产物的测序结果与GenBank中的序列进行BLAST分析。分析结果显示，MbovFJ1201、MbovFJ1301和MbovFJ1501的16S rRNA基因序列相似性为100%，且与牛支原体（Mycoplasmabovis）的16S rRNA基因序列同源性高达99%。

2.3动物回归试验

试验组动物在接种支原体2~5天后表现出呼吸道症状，随后出现呼吸道分泌物增多、咳嗽等症状，且在出现呼吸道症状的1~3天体温升高。试验组动物在接种后7天死亡1头，接种后10天死亡2头。对照组动物在试验期间体温正常且无明显的呼吸道症状。试验结束后剖杀试验组动物，同时剖杀2头对照组动物。采集病料，进行支原体分离。对照组的2份病料未分离到支原体，试验组的8份病料中有7份分离到牛支原体，菌落形态表现为“煎荷包蛋样”，分离菌的16S rRNA序列与牛支原体MbovFJ1201株的一致。

3 小结

从临床病料中分离到形态为“煎荷包蛋样”的菌落。易感动物回归试验证实分离到的3株致牛肺炎的菌株为牛支原体（Mycoplasma bovis），分别命名为MbovFJ1201、MbovFJ1301和MbovFJ1501，且三株分离株的16S rRNA序列一致，为同一菌株。以下试验均以MbovFJ1201（CCTCC NO：M2015772）株进行试验。

实施例2

疫苗的制备和安全性检测

1.疫苗的制备：

将牛支原体MbovFJ1201株接种到PPLO液体培养基，置于37℃ 5% CO₂培养箱中培养，5天后收取培养物，作为种子液。将种子液按3.0%（V/V）再次接种到PPLO液体培养基，37℃ 5% CO₂培养5天，即为培养好的疫苗菌液。调整疫苗菌液中的菌数为2×10⁸ccu/mL，加入终浓度为0.2%的甲醛，于4℃灭活72小时。疫苗菌液灭活后按体积比1:1（V/V）加入ISA-206佐剂，混合制得牛支原体灭活疫苗。

2.疫苗的安全性检测：

a.无菌检测：取0.2mL牛支原体灭活疫苗，涂布脱纤绵羊血琼脂平板3块，37℃倒置培养48h，观察有无细菌生长。结果为阴性，说明无细菌污染。

b.动物毒性试验：

（1）将牛支原体灭活疫苗经腹腔注射5周龄BALB/c小鼠10只，每只小鼠注射0.5mL；再取10只5周龄BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌生理盐水0.5mL，作为对照组。观察7天。观察期间，灭活疫苗注射组和对照组小鼠均活泼健康，说明灭活疫苗安全。

（2）随机选取30日龄健康荷斯坦公犊牛15头，分为三组，每组5头。疫苗一组：颈部三角区肌肉注射2mL本发明的疫苗；疫苗二组：两侧颈部三角区肌肉各注射2mL（共4mL）本发明的疫苗；对照组：颈部三角区肌肉注射2mL灭菌生理盐水。观察30天。观察期间，疫苗一组、疫苗二组和对照组的犊牛均健康活泼，早晚体温、采食量和日增重差异均不显著，说明本发明的组织灭活疫苗安全。

实施例3

疫苗免疫效果评价

随机选取体重相近、健康荷斯坦公犊牛90头，分为三组。疫苗组：30头犊牛于30日龄颈部三角区肌肉注射2mL本发明的疫苗，60日龄再次注射本发明的疫苗2mL；对照组：30头犊牛于30日龄颈部三角区肌肉注射2mL灭菌生理盐水，60日龄再次注射灭菌生理盐水2mL；正常对照组：30头犊牛作为正常对照组，不注射。实验动物观察5个月，观察期所有实验动物都采用相同的饲养管理方法。

计算整个观察期间实验动物由支原体引起的发病率和死亡率；计算2~4月龄，4~6月龄，平均日增重。动物屠宰时由不知情人员对肺脏病变评分。

结果：犊牛免疫牛支原体组织灭活疫苗后，犊牛由支原体引起的发病率和死亡率显著降低，2~4月龄，4~6月龄平均日增重显著增加，动物屠宰时实验动物的肺脏病变评分也显著降低。详细结果见表1、表2和表3。

表1 牛支原体灭活疫苗免疫后牛支原体的发病率及引起的死亡率

表2 牛支原体灭活疫苗免疫后牛平均日增重

注：平均日增重用平均值±标准差表示；同列数据中，相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著。

表3 牛支原体灭活疫苗免疫后屠宰牛的肺脏病变评分

注：肺脏病变评分参考Goodwin评价法，无病变为0，轻度病变为1-10，中度病变为10-15，重度病变为15-20，极重度病变为＞20。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福清市默克兽医院

<120> 一株牛支原体及其应用

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acggttacct tgttacgact t 21

Claims

1.一株牛支原体制备牛支原体灭活疫苗，其特征在于：所述牛支原体为牛支原体MbovFJ1201，已于2015年12月23日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO：M2015772。

2.根据权利要求1所述的牛支原体灭活疫苗，其特征在于：疫苗中含牛支原体菌量为10⁸ccu/mL、50wt.% ISA-206佐剂。

3.根据权利要求1所述的牛支原体灭活疫苗，其特征在于：由以下步骤制备而成：

1）抗原液的制备；

4.根据权利要求3所述的牛支原体灭活疫苗，其特征在于：所述抗原液的制备由以下步骤完成：将牛支原体MbovFJ1201株按3% V/V接种到培养基扩大培养，培养3-5天，收获培养物，测定菌体浓度并调整为2×10⁸ccu/mL；加入终浓度为0.2%的甲醛，置4℃灭活72小时制成灭活菌液。

5.根据权利要求3所述的牛支原体灭活疫苗，其特征在于：疫苗的配制是将灭活菌液和ISA-206佐剂按体积比1:1混合制备而成。