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CN105440139A - 抗微生物剂 - Google Patents

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CN105440139A
CN105440139A CN201510751765.3A CN201510751765A CN105440139A CN 105440139 A CN105440139 A CN 105440139A CN 201510751765 A CN201510751765 A CN 201510751765A CN 105440139 A CN105440139 A CN 105440139A
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Y.布里尔斯
G.沃尔凯尔特
M.瓦尔马格
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Katholieke Universiteit Leuven
Lysando Holding AG
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Abstract

本发明涉及针对革兰氏阴性细菌的抗微生物剂，特别涉及包含具有降解革兰氏阴性细菌细胞壁活性的酶和在N端或C端融合于该酶的肽段的融合蛋白。而且，本发明涉及编码所述融合蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的载体以及包含所述核酸分子或所述载体的宿主细胞。此外，本发明涉及所述融合蛋白作为药物，特别是用于治疗或预防革兰氏阴性细菌感染，作为诊断手段或作为美容用物质的用途。本发明还涉及处理或阻止食品、食物加工装置、食品加工厂、与食品相接触的表面、医疗装置、医院和手术中的表面的革兰氏阴性细菌污染的用途。此外，本发明涉及包含所述融合蛋白的药物组合物。

Description

抗微生物剂
本申请是申请日为2010年06月28日，申请号为201080028371.0，PCT申请号为PCT/EP2010/059146，发明名称为“抗微生物剂”的中国专利申请的分案申请。
本发明涉及针对革兰氏阴性菌的抗微生物剂，特别涉及融合蛋白，所述融合蛋白由具有降解革兰氏阴性细菌细胞壁的活性的酶和在N或C端融合于所述酶的其他肽段组成。而且，本发明涉及编码所述融合蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的载体以及包含所述核酸分子或所述载体的宿主细胞。此外，本发明涉及所述融合蛋白作为药物，特别是用于治疗或预防革兰氏阴性细菌感染，作为诊断手段或作为美容用物质的用途。本发明还涉及处理或阻止食品、食物加工装置、食品加工厂、与食品相接触的表面、医疗装置、医院和手术中的表面的革兰氏阴性细菌污染的用途。此外，本发明涉及包含所述融合蛋白的药物或美容用组合物。
革兰氏阴性细菌具有外膜，其特点为特征性的不对称双分子层。外膜的双分子层由含有磷脂(主要为磷脂酰乙醇胺)的内侧单分子层和主要包含单一糖脂——脂多糖(LPS)的外侧单分子层组成。在细菌界，LPS结构具有广阔的多样性，且LPS结构可响应主导的环境条件而受修饰。LPS层的稳定性以及不同LPS分子之间的相互作用主要通过二价离子(Mg2+、Ca2+)与LPS分子的阴离子组分(脂质A中的磷酸基团和KDO的内核和羧基基团)的静电相互作用达成。此外，脂质A疏水部分的密集而有序的折叠，受益于不饱和脂肪酸的缺乏，构成具有高粘性的刚性结构。这使其较不易被亲脂性分子渗透，并赋予外膜(OM)额外的稳定性。
已知多种类型具有杀菌或抑菌活性的试剂，例如抗生素、细胞内溶素、抗微生物肽和防卫素。然而，微生物对抗生素的增加的抗性对于治疗越来越多由细菌导致的感染造成困难。对于由革兰氏阴性细菌如铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)导致的感染产生了特别的困难。
细胞内溶素为细菌噬菌体(或细菌的病毒)编码的肽聚糖水解酶。其在噬菌体复制的裂解周期中的晚期基因表达过程中合成，并通过降解细菌肽聚糖来介导后代病毒体从受感染的细胞的释放。其为β(1,4)-糖基化酶(溶菌酶)、糖基转移酶、酰胺酶或内肽酶。细胞内溶素的抗微生物应用已经在1991年由Gasson(GB2243611)提出。尽管细胞内溶素的杀灭能力久为人知，由于抗生素的成功和主宰地位，这些酶作为抗细菌剂的用途一直受忽略。仅在多重抗生素耐药性细菌出现后，用细胞内溶素对抗人类病原体这一简单概念方才受到注意。出现了开发完全新颖类型的抗细菌剂的令人瞩目的需求，且用作酶抗生素(enzybiotics)(“酶”和“抗生素”的组合术语)的细胞内溶素完美地符合该需求。在2001年，Fischetti及其同事首次阐明了细菌噬菌体Cl细胞内溶素对A组链球菌的治疗潜力(Nelson等，2001)。从此，多份文献确立了细胞内溶素作为控制细菌感染，特别是革兰氏阳性细菌的细菌感染的有吸引力和补充的替代手段。接着，针对其他革兰氏阳性病原体如肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)(Loeffler等,2001)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)(Schuch等,2002)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(Cheng等,2005)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(Rashel等,2007)的其他不同的细胞内溶素证明了其作为酶抗生素的效力。现在，对于细胞内溶素疗法最重要的挑战在于革兰氏阴性细菌由于其外膜屏蔽细胞内溶素接近肽聚糖而对细胞内溶素外源作用的不敏感性。这一点现在阻止了细胞内溶素的作用范围扩张至重要的革兰氏阴性病原体。
抗微生物肽(AMP)代表广泛范围的短的、阳离子性、由基因编码的肽抗生素，其可见于几乎所有生物。不同的AMP显示不同的特性，且该类型中的许多肽不仅作为抗生素，还作为细胞穿透肽的模板正经受彻底的研究。尽管分享一些共同特征(例如，阳离子性，两亲性和小尺寸)，AMP序列变化极大，且已提出至少四种结构组(α-螺旋，β-片层，延伸型(extended)和环状(looped))引起观察到的AMP构象的多样性。同样，已提出了几种其作为抗生素的作用模式，且显示例如许多这些肽的主要靶是细胞膜，而对于其他肽，主要靶是细胞质侵袭和核心代谢功能的扰乱。尽管缺乏特异性靶结合，AMP可变得足够集中(concentrated)以显示协作活性(cooperativeactivity)，例如，通过在膜上形成孔，如对于大部分AMP的情况下。然而，该现象仅在模式磷脂双分子层中观察到，且在一些情况下，需要在膜中AMP的浓度高至每六个磷脂分子一个肽分子来使这些事件发生。所述浓度接近甚至可达到全膜饱和。因为对于AMP最低抑制浓度(MIC)通常在低微摩尔范围，可理解地，对于这些阈值的相关性及在体内的重要性产生了怀疑(Melo等,Naturereviews,Microbiology,2009,245).
防卫素是一大家族的小的、阳离子性、富含半胱氨酸和精氨酸的抗微生物肽，见于脊椎动物和无脊椎动物两者。防卫素根据半胱氨酸的间隔样式(spacingpattern)分为五个组：植物、无脊椎动物、α-、β-和θ-防卫素。后三种主要见于哺乳动物。α-防卫素为见于嗜中性粒细胞和肠上皮的蛋白质。β-防卫素为最广泛分布的，并由白细胞和许多类型的上皮细胞所分泌。θ-防卫素目前很少见，例如见于猕猴(rhesusmacaques)的白血病。防卫素对细菌、真菌和许多有包膜和无包膜病毒有活性。然而，有效杀灭细菌所需的浓度多数情况下较高，即在微摩尔范围。许多肽的活性在生理盐条件、二价阳离子和血清的存在下受限。取决于疏水氨基酸残基的含量，防卫素亦显示溶血活性。
因此，有对新颖的抗微生物剂的需要。
该目标通过权利要求中限定的主题解决。
如本文中使用的术语“蛋白质”与术语“多肽”所指相同。本文中使用的术语“蛋白质”指氨基酸残基通过肽键以特定序列连接的直链聚合物。蛋白的氨基酸残基可通过例如共价附着多种基团如糖和磷酸来修饰。其他的物质如血红素或脂质可更松散的与多肽链相联系，得到偶合的蛋白质，其也包含于本文中使用的术语“蛋白质”中。有多种方式阐明多肽链的折叠，特别是针对α螺旋和β折叠片层的存在。如本文中使用的术语“蛋白质”指所有四种类型的蛋白质，即全α、全β、α/β和α加上β。而且，术语“蛋白质”指复合物，其中所述复合物指均聚物(homomer)。
如本文中使用的术语“融合蛋白”指由两个核酸序列融合所得的表达产物。上述蛋白可例如在重组DNA表达系统中产生。而且，如本文中使用的术语“融合蛋白”指第一氨基酸序列如例如酶，与第二或更进一步的氨基酸序列的融合物。所述第二或更进一步的氨基酸序列可限定域或任何类型的肽段。优选地，所述第二和/或更进一步的氨基酸序列对于第一氨基酸序列为外源的，并不与第一氨基酸序列的任何域实质上同源。
如本文中使用的术语“肽段”指连接于蛋白质的任何类型的肽，如酶。
如本文中使用的术语“肽”指由约2至约100个氨基酸残基，更优选约4至约50个氨基酸残基，更优选约5至30个氨基酸残基组成的短多肽，其中一个氨基酸残基的氨基基团通过肽键连接于另一个氨基酸残基的羧基基团。肽可具有特定功能。肽可为天然出现的肽或合成设计和产生的肽。所述肽可例如通过酶法或化学剪切来源于天然蛋白或从天然蛋白移出，或者可使用常规的肽合成技术(例如固相合成)或分子生物学技术(参见Sambrook,J.等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989))来制备。天然出现的肽的实例为抗微生物肽、防卫素、寿司肽(sushipeptide)。合成产生的肽的实例为聚阳离子性、两亲性(amphiphatic)或疏水性肽。本发明意指的肽并不指用于纯化或定位蛋白质的His-标记、Strep-标记、硫氧还蛋白或麦芽糖结合蛋白(MBP)等。
如本文中使用的术语“细胞内溶素”指适于水解细菌细胞壁的酶。“细胞内溶素”包含至少一个“酶活性域”(EAD)，其具有至少一种下述活性：内肽酶、壳多糖酶、T4样胞壁质酶(T4likemuraminidase)、lambda样胞壁质酶、N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(酰胺酶)、胞壁酰-L-丙氨酸-酰胺酶、溶菌酶(muramidase)、裂解性糖基转移酶(lytictransglycosylase)(C)、裂解性糖基转移酶(M)、N-乙酰基溶菌酶、N-乙酰-氨基葡糖苷酶(溶菌酶)或糖基转移酶如例如KZ144和EL188。此外，所述细胞内溶素还可包含无酶活性并结合于宿主细菌细胞壁的区，所谓CBD(细胞壁结合域)。
如本文中使用的术语“EAD”指细胞内溶素的酶活性域。EAD负责水解细菌肽聚糖。其显示细胞内溶素的至少一种酶活性。EAD还可包含多于一种酶活性模块。
术语“自溶素”指与细胞内溶素相关的酶，但其由细菌编码并涉及例如细胞分裂。关于自溶素的综述可见于“Bacterialpeptidoglycan(murein)hydrolases.VollmerW,JorisB,CharlierP,FosterS.FEMSMicrobiolRev.2008Mar；32(2):259-86”。
如本文中使用的术语“细菌素”指能够抑制其他细菌生长的蛋白质样、多肽样或肽样物质。优选地，所述抑制是特别通过将所述其他细菌吸收于所述细菌素的特定受体所致的。一般而言，细菌素由微生物产生。然而，如本文中使用的术语“细菌素”指由微生物产生的分离形式或指人工合成的形式两者，且还指基本上保留其亲本细菌素的活性，但其序列经插入或缺失一个或多个氨基酸残基而改变的变体。
如本文中使用的术语“抗微生物肽(AMP)”指任何具有杀微生物和/或抑微生物活性的肽。因此，如本文中使用的术语“抗微生物肽”特别指任何具有抗细菌、抗真菌、抗霉菌、抗寄生物、抗原生生物、抗病毒、抗传染/感染(anti-infectious,anti-infective)和/或杀菌、杀藻、杀阿米巴、杀微生物、杀细菌、杀真菌、杀寄生物、杀原生生物(protozoacidal,protozoicidal)性的肽。
如本文中使用的术语“防卫素”指存在于动物，优选哺乳类，更优选人之内的肽，其中所述防卫素在固有宿主防御系统中起摧毁外源物质如感染性细菌和/或感染性病毒和/或真菌的作用。防卫素是非抗体杀微生物和/或杀肿瘤蛋白质、肽或多肽。“防卫素”的实例为“哺乳动物防卫素”、“α-防卫素”、“β-防卫素”、indolicidin和马加宁(magainin)。如本文中使用的术语“防卫素”指来自动物细胞的分离形式或人工合成的形式两者，且还指基本上保留其亲本蛋白质细胞毒活性，但其序列经一个或多个氨基酸残基的插入或缺失而改变的变体。
如本文中使用的术语“寿司肽”指具有短的共同重复的补体调控蛋白(CCP)。寿司肽的寿司模块在许多不同蛋白质中作为蛋白质-蛋白质相互作用域起作用。已显示包含寿司域的肽具有抗微生物活性。
如本文中使用的术语“阳离子性肽”指具有荷正电的氨基酸残基的肽。优选地，阳离子性肽具有9.0或更高的pKa值。通常，所述阳离子性肽的至少四个氨基酸残基可荷正电，例如为赖氨酸或精氨酸。“荷正电”指所述氨基酸残基的侧链在接近生理环境具有净的正电荷。可重组产生的天然出现的阳离子性肽的实例为防卫素、马加宁、蜂毒肽和天蚕素(cecropin)。
如本文中使用的术语“聚阳离子性肽”指主要包含赖氨酸和/或精氨酸残基的合成产生的肽。
如本文中使用的术语“两亲肽”指具有亲水性和疏水性功能基团两者的肽。优选地，如本文中使用的术语“两亲肽”指具有确定排列的亲水性和疏水性基团的肽，例如两亲肽可为例如α-螺旋，沿螺旋一侧主要为非极性侧链，而沿其其余的表面为极性残基。
如本文中使用的术语“疏水基团”指基本上不溶于水，但溶于油相，且在油相中的溶解性高于在水中或在水相中的溶解性的化学基团如氨基酸侧链。在水中，具有疏水侧链的氨基酸彼此相互作用生成非水环境。具有疏水侧链的氨基酸的实例为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸。
如本文中使用的术语“缺失”指从对应的起始序列去除1、2、3、4、5或更多个氨基酸残基。
如本文中使用的术语“插入”或“添加”指向对应的起始序列插入或添加1、2、3、4、5或更多个氨基酸残基。
如本文中使用的术语“取代”指用不同的氨基酸替换位于某个位置的氨基酸残基。
本发明涉及针对革兰氏阴性细菌的新颖的抗细菌剂，特别涉及包含(composedof)具有降解革兰氏阴性细菌细胞壁活性的酶和在N端或C端或两端融合于该酶的肽段的融合蛋白。
在本发明的一个方面，具有降解革兰氏阴性细菌细胞壁活性的酶为细胞内溶素、自溶素或细菌素。
在本发明的另一个方面，根据本发明的酶可进一步包含不具酶活性并结合于宿主细菌细胞壁的区，所谓CBD(细胞壁结合域)。
根据本发明的优选的融合蛋白描述于SEQIDNO:36至63。根据SEQIDNO:36至63的融合蛋白可在N端包含一个或多个其他氨基酸残基。优选地所述其他氨基酸残基为甲硫氨酸。
优选地，所述细胞内溶素由对革兰氏阴性细菌具有特异性的细菌噬菌体编码，所述革兰氏阴性细菌如细菌组(group)、科、属或种的革兰氏阴性细菌，其包含人或动物病原性菌株，如肠杆菌科((埃希氏菌属(Escherichia)，特别是大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)特别是肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、摩根氏菌属(Morganella)、变形杆菌属(Proteus)、普罗维登斯菌属(Providencia)、沙雷氏菌属(Serratia)、耶尔森氏菌属(Yersinia))、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)(假单胞菌属(Pseudomonas)、特别是铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas))、奈瑟氏菌属(Neisseria)、莫拉氏菌属(Moraxella)、弧菌属(Vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)、布鲁氏菌属(Brucella)、弗朗西丝氏菌属(Francisella)、博德特氏菌属(Bordetella)、军团菌属(Legionella)、巴尔通氏体属(Bartonella)、考克斯氏体属(Coxiella)、嗜血菌属(Haemophilus)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、曼氏菌属(Mannheimia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、加德纳氏菌属(Gardnerella)、螺旋体科(Spirochaetaceae)(密螺旋体属(Treponema)和疏螺旋体属(Borrelia))、钩端螺旋体科(Leptospiraceae)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、螺菌属(Spirillum)、链杆菌属(Streptobacillus)、类杆菌科(Bacteroidaceae)(拟杆菌属(Bacteroides)、梭杆菌属(Fusobacterium)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、卟啉单胞菌(Porphyromonas))、不动杆菌属(Acinetobacter)、特别是鲍氏不动杆菌(A.baumanii)。
优选地，所述自溶素由革兰氏阴性细菌编码，所述革兰氏阴性细菌如细菌组(group)、科、属或种的革兰氏阴性细菌，其包含人或动物病原性菌株，如肠杆菌科((埃希氏菌属(Escherichia)，特别是大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)特别是肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、摩根氏菌属(Morganella)、变形杆菌属(Proteus)、普罗维登斯菌属(Providencia)、沙雷氏菌属(Serratia)、耶尔森氏菌属(Yersinia))、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)(假单胞菌属(Pseudomonas)、特别是铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas))、奈瑟氏菌属(Neisseria)、莫拉氏菌属(Moraxella)、弧菌属(Vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)、布鲁氏菌属(Brucella)、弗朗西丝氏菌属(Francisella)、博德特氏菌属(Bordetella)、军团菌属(Legionella)、巴尔通氏体属(Bartonella)、考克斯氏体属(Coxiella)、嗜血菌属(Haemophilus)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、曼氏菌属(Mannheimia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、加德纳氏菌属(Gardnerella)、螺旋体科(Spirochaetaceae)(密螺旋体属(Treponema)和疏螺旋体属(Borrelia))、钩端螺旋体科、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、螺菌属(Spirillum)、链杆菌属(Streptobacillus)、类杆菌科(Bacteroidaceae)(拟杆菌属(Bacteroides)、梭杆菌属(Fusobacterium)、普雷沃氏菌属、卟啉单胞菌(Porphyromonas))、不动杆菌属(Acinetobacter)、特别是鲍氏不动杆菌(A.baumanii)。
所述细菌素优选对上文所列的革兰氏阴性细菌具有特异性，但亦可为具较低特异性的。
根据本发明的酶针对下述革兰氏阴性细菌具有细胞壁降解活性，所述革兰氏阴性细菌为细菌组(group)、科、属或种的革兰氏阴性细菌，其包含人或动物病原性菌株，如肠杆菌科((埃希氏菌属(Escherichia)，特别是大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)特别是肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、摩根氏菌属(Morganella)、变形杆菌属(Proteus)、普罗维登斯菌属(Providencia)、沙雷氏菌属(Serratia)、耶尔森氏菌属(Yersinia))、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)(假单胞菌属(Pseudomonas)、特别是铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas))、奈瑟氏菌属(Neisseria)、莫拉氏菌属(Moraxella)、弧菌属(Vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)、布鲁氏菌属(Brucella)、弗朗西丝氏菌属(Francisella)、博德特氏菌属(Bordetella)、军团菌属(Legionella)、巴尔通氏体属(Bartonella)、考克斯氏体属(Coxiella)、嗜血菌属(Haemophilus)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、曼氏菌属(Mannheimia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、加德纳氏菌属(Gardnerella)、螺旋体科(Spirochaetaceae)(密螺旋体属(Treponema)和疏螺旋体属(Borrelia))、钩端螺旋体科、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、螺菌属(Spirillum)、链杆菌属(Streptobacillus)、类杆菌科(Bacteroidaceae)(拟杆菌属(Bacteroides)、梭杆菌属(Fusobacterium)、普雷沃氏菌属、卟啉单胞菌(Porphyromonas))、不动杆菌属(Acinetobacter)、特别是鲍氏不动杆菌(A.baumanii)。
来源于噬菌体或为野生型细胞内溶素的细胞内溶素部分的具体实例描述于下表：
表1：
还优选来自铜绿假单胞菌噬菌体ΦKZ和EL、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)噬菌体、大肠杆菌噬菌体N4、噬菌体LUZ24的细胞内溶素、gp61胞壁质酶、STM0016细胞内溶素和PSP3细胞内溶素的细胞内溶素部分。
细胞内溶素部分的其他实例选自下组：SEQIDNO:1的phiKZgp144、SEQIDNO:2的ELgp188、SEQIDNO:3的沙门氏菌属细胞内溶素、SEQIDNO:4的肠杆菌噬菌体T4细胞内溶素、SEQIDNO:5的鲍氏不动杆菌细胞内溶素、SEQIDNO:18的大肠杆菌噬菌体K1F细胞内溶素、SEQIDNO:34的OBPgpLYS、SEQIDNO:20的PSP3沙门氏菌细胞内溶素(PSP3gp10)、SEQIDNO:21的大肠杆菌噬菌体P2细胞内溶素(P2gp09)、SEQIDNO:22的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)噬菌体溶菌酶(muramidase)STM0016、SEQIDNO:23的大肠杆菌噬菌体N4溶菌酶(muramidase)N4-gp61和SEQIDNO:24的N4-gp61截短型(trunc.)、SEQIDNO:25的KZ144。
在本发明另一个优选实施方案中，本发明的融合蛋白的细胞内溶素、自溶素和细菌素包含氨基酸序列的修饰和/或改变。上述改变和/或修饰可包含突变如缺失、插入和添加、取代或其组合和/或氨基酸残基的化学改变，例如生物素化、乙酰化、PEG化、氨基、SH或羧基基团的化学变化。所述本发明的融合蛋白的细胞内溶素、自溶素和细菌素呈现相应的野生型细胞内溶素、自溶素和细菌素的裂解活性。然而，所述活性可与相应的野生型细胞内溶素的活性相同、更高或更低。所述活性可为相应的野生型细胞内溶素活性的约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或约200％甚至更高。所述活性可由本领域技术人员通过本领域周知的测定法来测量，例如平板裂解(platelysis)测定法或液体裂解(liquidlysis)测定法，其描述于(Briers等,J.Biochem.BiophysMethods70:531-533,(2007))或DonovanDM,LardeoM,Foster-FreyJ.FEMSMicrobiolLett.2006Dec；265(1)或类似公开。
优选地，本发明的融合蛋白的肽段融合于细胞内溶素、自溶素或细菌素的N端和/或C端。在一个特别优选的实施方案中，所述肽段仅融合于酶的N端。在另一个优选实施方案中，所述肽段仅融合于酶的C端。然而，还优选的是在N端和C端均具有肽段的修饰的融合蛋白。所述在N端和在C端的肽段可为相同或不同的肽段。所述肽段可通过附加的氨基酸残基(例如由于克隆原因)连接于酶。优选地，所述肽段可通过至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个附加氨基酸残基连接于融合蛋白。在一个优选实施方案中，所述肽段通过附加的氨基酸残基甘氨酸和丝氨酸(Gly-Ser)或亮氨酸和谷氨酸(Leu-Glu)连接于酶。而且，本发明的融合蛋白的肽段还在其N端包含其他氨基酸。优选地，所述肽段包含氨基酸甲硫氨酸(Met)、丙氨酸和甲硫氨酸和甘氨酸(Ala-Met-Gly-Ser)或丙氨酸和甘氨酸和丝氨酸(Ala-Met-Gly-Ser)。
本发明的融合蛋白的肽段优选共价结合于酶。优选地，所述肽段由至少5个，更优选至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或至少100个氨基酸残基组成。特别优选的是包含约5至约100个氨基酸残基、约5至约50或约5至约30个氨基酸残基的肽段。更优选的是包含约6至约42个氨基酸残基、约6至约39个氨基酸残基、约6至约38个氨基酸残基、约6至约31个氨基酸残基、约6至约25个氨基酸残基、约6至约24个氨基酸残基、约6至约22个氨基酸残基、约6至约21个氨基酸残基、约6至约20个氨基酸残基、约6至约19个氨基酸残基、约6至约16个氨基酸残基、约6至约14个氨基酸残基、约6至约12个氨基酸残基、约6至约10个氨基酸残基或约6至约9个氨基酸残基的肽段。
优选地，所述肽段并非标记如His标记、Strep标记、Avi标记、Myc标记、Gst标记、JS标记、半胱氨酸标记、FLAG标记或本领域已知的其他标记，且并非硫氧还蛋白或者麦芽糖结合蛋白(MBP)。然而，本发明的肽段和/或细胞内溶素、自溶素或细菌素可另行包含此种或此类标记。
更优选地，所述肽段具有引导融合蛋白通过外膜的功能，但当不与酶融合而施用时，可具有或不具有活性或仅具有较低活性。引导融合蛋白通过革兰氏阴性细菌外膜的功能是由外膜的电势(potential)或所述肽段的LPS破坏或透化(permeabilising)或脱稳(destabilizing)活性所致。
在本发明的一个方面，融合肽段是两亲肽，其包含一个或多个荷正电的赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸氨基酸残基，组合于一个或多个疏水的缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和/或甘氨酸氨基酸残基。氨基酸残基的侧链优选为下述顺序的取向：阳离子性和疏水表面簇集于肽的相反侧。优选地，所述肽中多于约30、40、50、60或70％的氨基酸残基为荷正电的氨基酸。优选地，所述肽中多于约30、40、50、60或70％的氨基酸残基为疏水氨基酸残基。有利地，所述两亲肽融合于具有细胞壁降解活性的酶的N端和/或C端，从而增强了后者蛋白质的两亲性。
在本发明另一个实施方案中，所述融合于酶的两亲肽由至少5个，更优选至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或至少50个氨基酸残基组成。在一个优选实施方案中，所述两亲肽的氨基酸残基的至少约30、40、50、60或70％为精氨酸或赖氨酸残基，和/或所述两亲肽的氨基酸残基的至少约30、40、50、60或70％为疏水氨基酸缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和/或甘氨酸。
优选的两亲肽为SEQIDNO:6的Pleurocidin，SEQIDNO:7的杀菌肽P1，SEQIDNO:8的BuforinII，SEQIDNO:19的BuforinI和SEQIDNO:9的马加宁。其他优选的两亲肽是Cathelidicine，例如SEQIDNO:10的LL-37，SEQIDNO:26的Nigrocine2和SEQIDNO:27的Ascaphine5。
在本发明的另一个方面，所述融合肽段是抗微生物肽，其包含净正电荷，和50％左右的疏水氨基酸。所述抗微生物肽具两亲性，具有约12至约50个氨基酸残基的长度。
本发明的抗微生物肽的具体实例列于下表：
表2
在本发明的另一个方面，所述融合肽段为由DingJL,LiP,HoBCellMolLifeSci.2008Apr；65(7-8):1202-19TheSushipeptides:structuralcharacterizationandmodeofactionagainstGram-negativebacteria描述的寿司肽。特别优选的是SEQIDNO:32的寿司1肽。
优选的寿司肽为寿司肽S1和S3及其多重物(multiple)：FASEBJ.2000Sep；14(12):1801-13。
在本发明的另一个方面，所述融合肽段是防卫素，优选Cathelicidine、杀菌肽P1、杀菌肽A或马加宁II。
在本发明的另一个方面，所述融合肽段是疏水肽，例如具有SEQIDNO:28的氨基酸序列的Apidaecine，具有SEQIDNO:33的氨基酸序列的WLBU2-变体和具有SEQIDNO:35的氨基酸序列的Walmagh1。具有氨基酸序列Phe-Phe-Val-Ala-Pro(SEQIDNO:17)的疏水肽并非本发明的一部分。
在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的融合蛋白的肽段包含对氨基酸序列的修饰和/或改变。此类修饰和/或改变可包括突变如缺失、插入和添加、取代或其组合，和/或氨基酸残基的化学改变，例如生物素化、乙酰化、PEG化、氨基、SH-或羧基基团的化学变化。
本发明融合蛋白的具体实例列于下表：
表3：
本发明的融合蛋白，并且因此特别是SEQIDNO:36至63的特别优选的融合蛋白，还可在N端包含甲硫氨酸。
本发明的融合蛋白，并且因此特别是SEQIDNO:36至63的特别优选的融合蛋白，还可包含例如用于纯化的标记。优选的是His6标记，优选位于融合蛋白的C端和/或N端。该标记可通过附加的氨基酸残基连接于融合蛋白，例如由于克隆原因。优选地，所述标记可通过至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个附加的氨基酸残基连接于所述融合蛋白。在一个优选实施方案中，所述融合蛋白在其C端包含His6标记，其通过附加的氨基酸残基赖氨酸和甘氨酸(Lys-Gly)或亮氨酸和谷氨酸(Leu-Glu)连接于所述融合蛋白。在另一个优选实施方案中，融合蛋白在其N端包含His6标记，其通过附加的氨基酸残基赖氨酸和和甘氨酸(Lys-Gly)或亮氨酸和谷氨酸(Leu-Glu)连接于所述融合蛋白。在另一个优选实施方案中，融合蛋白在其N端和C端包含His6标记，其通过附加的氨基酸残基赖氨酸和和甘氨酸(Lys-Gly)或亮氨酸和谷氨酸(Leu-Glu)连接于所述融合蛋白。
在一个更优选的实施方案中，融合蛋白在其C端包含His6标记，其通过附加的氨基酸残基亮氨酸和谷氨酸(Leu-Glu)连接于融合蛋白，且本发明的融合蛋白的肽段通过附加的氨基酸残基甘氨酸和丝氨酸连接于酶的N端。在另一个优选实施方案中，融合蛋白在其C端包含His6标记，其通过附加的氨基酸残基亮氨酸和谷氨酸(Leu-Glu)连接于融合蛋白，且本发明的融合蛋白的肽段通过附加的氨基酸残基甘氨酸和丝氨酸(Gly-Ser)连接于酶的N端，且该融合蛋白在N端包含附加的氨基酸残基甲硫氨酸(Met)或丙氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸(Ala-Met-Gly)或丙氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸和丝氨酸(Ala-Met-Gly-Ser)。优选地，所述融合蛋白依照SEQIDNO:77至90。
融合蛋白是通过将至少两个核酸序列使用如Sambrook等2001,MolecularCloning:ALaboratoryManual所述的标准克隆技术来构建的。上述蛋白质可于例如重组DNA表达系统中产生。本发明的上述融合蛋白可通过将细胞内溶素及相应的肽段的核酸融合来获得。
本发明的融合蛋白可融合或连接于其他别的蛋白质。该其他别的蛋白质的实例是硫氧还蛋白。
本发明进一步涉及编码本发明的融合蛋白的分离的核酸分子。本发明进一步涉及包含本发明的核酸分子的载体。所述载体可提供所述本发明的融合蛋白的组成型或诱导型表达。
本发明还涉及用于从微生物，例如表达所述融合蛋白的经遗传修饰的合适宿主细胞，获得所述融合蛋白的方法。所述宿主细胞可为微生物如细菌或酵母，或为动物细胞如例如哺乳动物细胞，特别是人细胞。在本发明的一个实施方案中，所述宿主细胞是巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)细胞。宿主可仅由于生物技术原因选取，例如产率、溶解性、成本等，但亦可从医学角度选取，例如非病原体细菌或酵母、人细胞。
本发明的另一个方面涉及用于遗传转化合适的宿主细胞以获得本发明的融合蛋白的表达的方法，其中宿主细胞是通过将编码所述融合蛋白的遗传材料引入所述宿主细胞，并通过本领域技术人员众所周知的遗传工程方法获得其翻译和表达来遗传修饰的。
在另一个方面本发明涉及组合物，优选药物组合物，其包含本发明的融合蛋白和/或经下述核酸分子或载体转化的宿主，所述核酸分子或载体包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述组合物还包含渗透革兰氏阴性细菌的外膜的试剂，如金属螯合剂例如EDTA、TRIS、乳酸、乳铁蛋白、多粘菌素、柠檬酸和/或其他如例如Vaara(Agentsthatincreasethepermeabilityoftheoutermembrane.VaaraM.MicrobiolRev.1992Sep；56(3):395-441)所述的物质。还优选的是包含上述提及的渗透剂的组合的组合物。特别优选的是包含约10μM至约100mMEDTA、更优选约50μM至约10mMEDTA、更优选约0.5mM至约10mMEDTA、更优选约0.5mM至约2mMEDTA、更优选约0.5mM至1mMEDTA的组合物。然而，也优选包含约10μM至约0.5mMEDTA的组合物。还优选包含约0.5mM至约2mMEDTA，更优选约1mMEDTA以及另外约10至约100mMTRIS的组合物。
本发明还涉及本发明的融合蛋白和/或经包含本发明的融合蛋白的编码核苷酸序列的核酸转化的宿主作为药物的用途。在另一个方面，本发明涉及本发明的融合蛋白和/或经包含下述核酸分子的载体转化的宿主在制备治疗和/或预防与革兰氏阴性细菌相关的病症、疾病或病状中的用途，所述核酸分子包含编码本发明的修饰的融合蛋白的核苷酸序列。具体而言，待治疗和/或预防的病症、疾病或病状可由下述革兰氏阴性细菌所造成的，所述革兰氏阴性细菌为细菌组(group)、科、属或种，其包含人或动物病原性菌株，如肠杆菌科((埃希氏菌属(Escherichia)，特别是大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)特别是肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、摩根氏菌属(Morganella)、变形杆菌属(Proteus)、普罗维登斯菌属(Providencia)、沙雷氏菌属(Serratia)、耶尔森氏菌属(Yersinia))、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)(假单胞菌属(Pseudomonas)、特别是铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas))、奈瑟氏菌属(Neisseria)、莫拉氏菌属(Moraxella)、弧菌属(Vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)、布鲁氏菌属(Brucella)、弗朗西丝氏菌属(Francisella)、博德特氏菌属(Bordetella)、军团菌属(Legionella)、巴尔通氏体属(Bartonella)、考克斯氏体属(Coxiella)、嗜血菌属(Haemophilus)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、曼氏菌属(Mannheimia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、加德纳氏菌属(Gardnerella)、螺旋体科(Spirochaetaceae)(密螺旋体属(Treponema)和疏螺旋体属(Borrelia))、钩端螺旋体科、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、螺菌属(Spirillum)、链杆菌属(Streptobacillus)、类杆菌科(Bacteroidaceae)(拟杆菌属(Bacteroides)、梭杆菌属(Fusobacterium)、普雷沃氏菌属、卟啉单胞菌(Porphyromonas))、不动杆菌属(Acinetobacter)、特别是鲍氏不动杆菌(A.baumanii)。
本发明还涉及包含本发明的融合蛋白和/或经下述核酸转化的宿主的药物，所述核酸包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列。
在另一个方面，本发明涉及在需要治疗和/或预防的受试者中治疗病症、疾病或病状的方法，所述方法包括施与所述受试者有效量的本发明的融合蛋白和/或有效量的经下述核酸转化的宿主或本发明的组合物，所述核酸包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列。所述受试者可为人或动物。
具体而言，所述治疗(或预防)方法可用于治疗和/或预防由革兰氏阴性细菌特别是上述列举的革兰氏阴性细菌造成的皮肤，软组织，呼吸系统，肺，消化道，眼，耳，牙齿，鼻咽，口，骨，阴道，菌血症(bacteraemia)伤口和/或心内膜炎的感染。
用于本发明的治疗方法中的给药剂量和途径取决于待治疗的具体疾病/感染位置。给药途径可例如为经口、局部、鼻咽、肠胃外、静脉内、直肠或任何其他的给药途径。
对于将本发明的融合蛋白和/或有效量的经核酸(所述核酸包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列)转化的宿主或本发明的组合物施用于感染位置(或有受感染危险的位置)，可使用下述制剂，所述制剂保护活性化合物免受环境影响如蛋白酶、氧化、免疫应答等，直至其抵达感染位置。因此，所述制剂可为胶囊、锭剂、丸剂、粉末、栓剂、乳剂、悬液、凝胶、洗剂(lotion)、乳霜(cream)、软膏(salve)、可注射溶液、糖浆、喷雾剂、吸入剂或任何其他医药上合理的盖仑(galenic)制剂。优选地，所述盖仑制剂可包含合适的载体、稳定剂、调味剂、缓冲液或其他合适的试剂。例如，对于局部施用，所述制剂可为洗液、乳霜、凝胶、软膏或硬膏(plaster)，对于鼻咽施用所述试剂可为通过喷雾施与鼻部的盐水溶液。对于经口施用以治疗和/或预防特定感染位置(例如肠中)的情况下，可能必需保护本发明的融合蛋白免受胃肠道的严峻消化环境的作用，直至其抵达感染位置。因此，可使用细菌作为载体，其在胃中的初始消化步骤中存活，并之后将本发明的融合蛋白分泌入肠环境。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的融合蛋白和/或经包含核酸分子(所述核酸分子包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列)的载体转化的宿主在制备用于治疗和/或预防病症、疾病或病状的药物中的用途，所述病症、疾病或病状是由假单胞菌属特别是铜绿假单胞菌造成的，特别是对肠部的影响，特别是在婴儿中，脑膜的感染例如出血性脑膜炎(meningitishaemorrhagica)，中耳的感染，皮肤感染(坏疽性深脓疱病(Ecthymagangraenosum))，特别是烧伤，泌尿道感染，鼻炎，菌血性肺炎(bacteremicpneumonia)，特别是其中患者罹患囊性纤维化病或血液恶性肿瘤如白血病，或由于免疫抑制疗法而罹患嗜中性粒细胞减少症，败血症，特别是因为长期静脉内或泌尿道导管、侵入性外科手术方法和严重烧伤所致，心内膜炎，特别是其中患者是静脉内吸毒者(druguser)或罹患来自心内直视手术(openheartsurgery)的并发症的患者，高度破坏性的眼部感染(highlydestructiveocularinfection)，特别是在使用污染的眼科溶液或严重的面部烧伤之后，骨关节炎，特别是其为严重创伤或透过污染的衣服的刺伤时的结果时。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述病症、疾病或病状是由类鼻疽伯克霍尔德氏菌造成的，特别是类鼻疽(Whitmore’sDisease)，慢性肺炎，败血症，特别是其中患者具有创伤性皮肤损伤时。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述病症、疾病或病状是由鼠伤寒沙门氏菌或肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)造成的，特别是急性胃肠炎和局部脓性突起(purulentprocesses)，特别是骨髓炎、心内膜炎、胆囊炎，且特别是由鼠伤寒沙门氏菌造成的脑膜炎，特别是其中患者小于2周岁时。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述病症、疾病或病状是由伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)造成的，特别是伤寒。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述病症、疾病或病状是由副伤寒沙门氏菌造成的，特别是副伤寒。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述病症、疾病或病状是由鲍氏不动杆菌造成的，特别是支气管炎、肺炎、伤口感染和败血症，特别是作为静脉内导管的结果时。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述病症、疾病或病状是由大肠杆菌造成的，特别是肠外感染，特别是阑尾炎、脓性胆囊炎(purulentcholecystitis)、腹膜炎、脓性脑膜炎和泌尿道的感染，肠内大肠杆菌感染，特别是流行性肠炎、以及类似于痢疾、败血症、肠源性毒血症、乳腺炎和痢疾的感染性疾病。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述病症、疾病或病状是由肺炎克雷伯氏菌造成的，特别是肺炎、菌血症、脑膜炎和泌尿道感染。
优选地，如果待治疗(或预防)的感染是由多重抗性的细菌菌株，特别是针对一种或多种下述抗生素具有抗性的菌株造成时，将本发明的融合蛋白用于医疗，所述抗生素为：链霉素、四环素、头孢噻吩、庆大霉素、头孢噻肟、头孢菌素、头孢他啶或亚胺培南。此外，本发明的融合蛋白可通过将其与常规的抗菌剂如抗生素、硫醚抗生素、细菌素或细胞内溶素等组合给药而用于治疗方法。
本发明还涉及包含一个或多个隔室的药物包(pharmaceuticalpack)，其中至少一个隔室包含本发明的一种或多种融合蛋白和/或一种或多种经下述核酸转化的宿主或本发明的组合物，所述核酸包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列。
在另一个方面本发明涉及制备药物组合物的方法，所述方法包括将药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体与本发明的一种或多种融合蛋白和/或一种或多种经下述核酸转化的宿主混合，所述核酸包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列。
在甚至另一个方面本发明的组合物是美容用组合物(cosmeticcomposition)。几种细菌菌种可导致患者的身体暴露于环境的表面如皮肤的刺激。为了预防上述刺激或者为了消除所述细菌病原体的次要病候(minormanifestation)，可使用特定的美容用制备物，其包含足够量的本发明的融合蛋白以降解已经存在或新沉降的病原性革兰氏阴性细菌。
在另一个方面，本发明涉及本发明的融合蛋白作为诊断手段用于医药、食品或饲料或环境诊断，特别是作为诊断手段用于诊断细菌感染特别是由革兰氏阴性细菌造成的细菌感染。在此方面，本发明的融合蛋白可用作工具特异性降解病原性细菌，特别是革兰氏阴性病原性细菌。通过本发明的融合蛋白使得细菌细胞降解可通过添加去污剂如TritonX-100或其他减弱细菌细胞外膜(envelope)的添加剂如多粘菌素B来支持。需要特定细胞降解作为后续使用基于核酸的方法如PCR、核酸杂交或NASBA(基于核酸序列的扩增)，免疫方法如IMS、免疫荧光或ELISA技术，或其他依赖于细菌细胞的细胞成分的方法如使用对独特细菌组或种具有特异性的蛋白质的酶测定法(例如，β-半乳糖苷酶之于肠细菌，凝固酶之于凝固酶阳性菌株)对细菌进行特异性检测的起始步骤。
在另一个方面，本发明涉及本发明的融合蛋白用于处理、去除、减少或防止革兰氏阴性细菌对食物、食物加工装置、食物加工厂、与食物接触的表面如架子和食物储藏区域以及病原性、偶发病原性(facultativepathogenic)或其他不受欢迎的细菌可潜在地侵染食物材料的所有其他情况、医疗设备和医院和手术中所有类型的表面的污染时。
具体而言，本发明的融合蛋白可预防性地用作消毒剂(sanitizingagent)。所述消毒剂(sanitizingagent)可在手术之前或之后使用，或者例如在血液透析过程中使用。而且，早产婴儿和免疫妥协的个体，或有假体装置需要的那些受试者，可用本发明的融合蛋白治疗。所述治疗可为预防性的，或在急性感染过程中进行。在相同背景下，医院内感染，特别是由抗生素抗性菌株如铜绿假单胞菌(FQRP)，不动杆菌属菌种和肠杆菌科如大肠杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、柠檬酸杆菌属、爱德华氏菌属、肠杆菌属、哈夫尼菌属、克雷伯氏菌属、摩根氏菌属、变形杆菌属、普罗维登斯菌属、沙雷氏菌属和耶尔森氏菌属菌种造成的感染可预防性地或在急性期中用本发明的融合蛋白来治疗。因此，本发明的融合蛋白可用作消毒剂(disinfectant)且与其他可用于消毒溶液的成分如去污剂、tensid、溶剂、抗生素、硫醚抗生素或细菌素组合使用。
对于本发明的融合蛋白作为消毒剂例如在医院、牙科手术、兽医、厨房或浴室中的用途，所述融合蛋白可以以例如液体、粉末、凝胶或湿巾(wetwipe)或消毒薄片产品(disinfectionsheetproduct)成分的形式制备为组合物。所述组合物还可包含合适的载体、添加剂、稀释剂和/或赋形剂以分别用于其相应的用途和形式，但还可包含支持抗微生物活性的试剂如EDTA或增强融合蛋白抗微生物活性的试剂。所述融合蛋白还可与常见的消毒剂如醇类、醛类、氧化剂、酚类、季铵化合物或UV光一同使用。对于消毒例如表面、物品和/或装置，可将所述融合蛋白施于所述表面、物品和/或装置。该施用可例如用任何手段如布或抹布以所述消毒组合物润湿来进行，或通过喷雾、倾倒来进行。所述融合蛋白可根据相应的施用和“反应时间”而以不同的浓度使用以获得完全的抗微生物活性。
本发明的另一个方面是本发明可作为工具盒使用，即，任何上述公开的肽段可融合于任何本文中公开的细胞内溶素、自溶素或细菌素。因此，可以将相应的能够使得融合蛋白结合于相应细菌的肽段与抑制相应细菌生长的细胞内溶素、自溶素或细菌素相组合。因此，能够对于任何应消除的细菌构建合适的融合蛋白。
根据后文给出的具体描述本发明应用的其他范围将会是显而易见的，然而，应理解的是，具体的描述和具体实施例，虽然代表了本发明的优选实施方案，但仅作为例证而给出，因为在本发明的精神和范围内的多种变化和修饰对于本领域技术人员根据该具体描述将会是显而易见的。应理解的是，前述一般描述和后述具体描述均仅为例示性和解释性的，并不对权利要求书中要求保护的本发明有所限制。
下述实施例解释本发明，但并不视为限定性的。除非另行指出，使用如Sambrock等,1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork所述的标准分子生物学方法。
实施例1.用两亲肽修饰的gp144和gp188的克隆、表达和纯化
作为原理的证明，阐明了两亲肽的LPS破坏活性引导gp144和gp188通过外膜以及由此带来针对革兰氏阴性细菌的抗细菌活性的潜力。gp144和gp188为来源于铜绿假单胞菌噬菌体KZ和EL的模块性细胞内溶素，具有N端肽聚糖结合和C端催化域(Briers等，2007)。
为了用编码T4溶菌酶的两亲性α4螺旋(aa143-155：依照SEQIDNO:92，为Pro-Asn-Arg-Ala-Lys-Arg-Val-Ile-Thr-Thr-Phe-Arg-Thr)的基因片段延伸编码gp144或gp188的开读框的5’端，用延伸的5’引物和标准3’引物进行了TailPCR。将PCR产物克隆于pEXP5CT/表达载体(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。
所有构建体的表达是在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS细胞中进行的。所有蛋白质均通过使用C端6xHis标记的Ni2+亲和层析纯化。对于不同纯化的产率示于表4。显而易见，α4-KZ144产生对于宿主不具毒性，与KZ144相对，导致显著较高的产率。
纯化的储液为～90％纯。所有gp144衍生物显示多聚物形成，所述多聚物可通过添加β-巯基乙醇而转化为单体，表明相互连接的二硫键(interdisulfidebond)导致多聚化。
表4–用两亲肽修饰的细胞内溶素的重组纯化产率*
*显示了每升大肠杆菌表达培养物纯化的重组蛋白的总产率。该值是通过纯化的储液的分光光度法测量蛋白质浓度和总体积来确定的。gp188衍生物的纯化是在与gp144衍生物(50mM咪唑)相比更严格的条件(65mM咪唑)下进行的以确保高纯度。
用两亲肽修饰的gp144和gp188的表征
1.A.用两亲肽修饰的gp144和gp188的酶活性
为了评估修饰对gp144或gp188酶活性的影响，对经氯仿渗透的铜绿假单胞菌细胞测量了这些变体的比活性，并与相应的未修饰的细胞内溶素相比较。测试了所有修饰的细胞内溶素的不同递增量以确定相应的饱和曲线。该曲线线性区的线性回归的斜率是比活性的量度，并相对于未修饰的gp144或gp188的斜率表示(表5)。
表5–用两亲肽修饰的gp144或gp188的酶活性*
*不同变体的比酶活性是相对于同时测试的相应原始细胞内溶素的比活性(＝100％)确定和表示的。该测定的缓冲液条件是相应细胞内溶素的最适条件(对于gp144和gp188分别为KH2PO4/K2HPO4I＝120mMpH6.2和I＝80mMpH7.3)。
1.B.用两亲肽修饰的gp144和gp188的抗细菌活性
将指数期(～106/ml)铜绿假单胞菌PAO1细胞在室温用未修饰和修饰的gp144/gp188温育。在1小时之后，将细胞悬液稀释并铺板。在过夜温育之后对残余的菌落进行计数(表6)。未修饰的gp144gp188与阴性对照相比并未显著减少细胞数。该观察说明外膜作为屏障的效力。两亲性α4-螺旋的融合蛋白以对于α4-KZ144和α4-EL188分别为50±11和34±11％使指数期细胞失活。当使用具有100倍更高密度的稳定期细胞时，这些值是类似的(分别为35±18和32±17％)。尽管不同重复实验之间的较高差异，但这些值与未处理细胞有显著差异(α＝0.05)。一般而言，修饰的gp144衍生物与gp188衍生物相比趋于具有较高的抗细菌活性。
表6–细胞内溶素gp144和gp188及其衍生物的抗细菌作用*
*将指数生长的铜绿假单胞菌PAO1细胞稀释100x并用10μg未透析的蛋白质(终浓度100μg/ml，缓冲液：20mMNaH2P04-NaOHpH7.4；0.5MNaCl；0.5M咪唑)在室温温育1小时(终密度为～106/ml)。将等分试样稀释并铺板。抗细菌活性表示为相对失活率(％)(＝100-(Ni/No)*l00，其中N0＝未处理的细胞数而Ni＝经处理的细胞数)和对数单位(＝log10N0/Ni)。所有样品重复六次。表示为平均值/标准偏差。使用Studentt检验进行统计分析。
实施例2.用疏水肽修饰的gp144和gp188的克隆、表达和纯化
作为原理的证明，阐明了疏水五肽的LPS破坏活性引导gp144和gp188通过外膜以及由此带来针对革兰氏阴性细菌的抗细菌活性的潜力。gp144和gp188为来源于铜绿假单胞菌噬菌体KZ和EL的模块性细胞内溶素，具有N端肽聚糖结合和C端催化域(Briers等，2007)。
为了用编码5个疏水性残基(Phe-Phe-Val-Ala-Pro)的基因片段延伸编码gp144或gp188的开读框的5’端，用延伸的5’引物和标准3’引物进行了TailPCR。将PCR产物克隆于pEXP5CT/表达载体(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。
所有构建体的表达是在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS细胞中进行的。所有蛋白质均通过使用C端6xHis标记的Ni2+亲和层析纯化。对于不同纯化的产率示于表7。
纯化的储液为～90％纯。所有gp144衍生物显示多聚物形成，所述多聚物可通过添加β-巯基乙醇而转化为单体，表明相互连接的二硫键导致多聚化。
表7-细胞内溶素衍生物的重组纯化产率*
*显示了每升大肠杆菌表达培养物纯化的重组蛋白的总产率。该值是通过分光光度法测量蛋白质浓度和纯化的储液的总体积来确定的。gp188衍生物的纯化是在与gp144衍生物(50mM咪唑)相比更严格的条件(65mM咪唑)下进行的以确保高纯度。
用疏水五肽修饰的gp144和gp188的表征
2.A.用疏水五肽修饰的gp144和gp188的酶活性
为了评估修饰对gp144或gp188酶活性的影响，对经氯仿渗透的铜绿假单胞菌细胞测量了这些变体的比活性，并与相应的未修饰的细胞内溶素相比较。测试了所有修饰的细胞内溶素的不同递增量以确定相应的饱和曲线。该曲线线性区的线性回归的斜率是比活性的量度，并相对于未修饰的gp144或gp188的斜率表示(表8)。
表8-用疏水肽修饰的gp144或gp188的酶活性*
*不同变体的比酶活性是相对于同时测试的相应原始细胞内溶素的比活性(＝100％)确定和表示的。该测定的缓冲液条件是相应细胞内溶素的最适条件(对于gp144和gp188分别为KH2PO4/K2HPO4I＝120mMpH6.2和I＝80mMpH7.3)。
2.B.用疏水五肽修饰的gp144和gp188的抗细菌活性
将指数期(～106/ml)铜绿假单胞菌PAO1细胞在室温用未修饰和修饰的gp144/gp188温育。在1小时之后，将细胞悬液稀释并铺板。在过夜温育之后对残余的菌落进行计数(表9)。未修饰的gp144gp188与阴性对照相比并未显著减少细胞数。该观察说明外膜作为屏障的效力。用疏水五肽融合蛋白温育导致细菌细胞数的显著(α＝0.05)减少(对于修饰的gp144和gp188分别为83±7和69±21％)。一般而言，修饰的gp144衍生物与gp188衍生物相比趋于具有较高的抗细菌活性。
表9-细胞内溶素gp144和gp188及其衍生物的抗细菌作用*
*将指数生长的铜绿假单胞菌PAO1细胞稀释100x并用10μg未透析的蛋白质(终浓度100μg/ml，缓冲液：20mMNaH2P04-NaOHpH7.4；0.5MNaCl；0.5M咪唑)在室温温育1小时(终密度为～106/ml)。将等分试样稀释并铺板。抗细菌活性表示为相对失活率(％)(＝100-(Ni/No)*l00，其中N0＝未处理的细胞数而Ni＝经处理的细胞数)和对数单位(＝log10N0/Ni)。所有样品重复六次。表示为平均值/标准偏差。使用Studentt检验进行统计分析。
实施例3：用多种肽段在细胞内溶素N端修饰的KZ144和STM0016的克隆、表达和纯 化
SEQIDNO:25的KZ144是来自铜绿假单胞菌噬菌体KZ的模块性细胞内溶素，具有N端肽聚糖结合和C端催化域(Briers等,2007)。细胞内溶素KZ144由SEQIDNO:64的核酸分子所编码。对于SEQIDNO:64的核酸分子合成产生了核酸分子5’端的BamHI(5’-GGATCC-3’)限制性位点和核酸分子3’端的XhoI(5’-CTCGAG-3’)限制性位点。
STM0016是与大肠杆菌噬菌体N4细胞内溶素N4-gp61具有同源性的假想蛋白质。细胞内溶素STM0016由SEQIDNO:65的核酸分子所编码。合成产生了SEQIDNO:65的核酸分子，该核酸分子的5’端带有BamHI(5’-GGATCC-3’)限制性位点并且该核酸分子的3’端带有XhoI(5’-CTCGAG-3’)限制性位点。
N4-gp61是大肠杆菌N4噬菌体细胞内溶素。该细胞内溶素由SEQIDNO:91的核酸所编码。合成产生了SEQIDNO:91的核酸分子，该核酸分子的5’端带有BamHI(5’-GGATCC-3’)限制性位点并且该核酸分子的3’端带有XhoI(5’-CTCGAG-3’)限制性位点。
表10中的下述肽段用于产生与细胞内溶素KZ144或STM0016的融合蛋白：
表10：
合成产生了编码相应肽段的核酸分子，该核酸分子的5’端带有NdeI(5′-CATATG-3′)限制性位点并且该核酸分子的3’端的BamHI(5′-GGATCC-3′)限制性位点，但编码寿司1肽的核酸分子除外，对于其产生了在该核酸分子的5’端的NcoI限制性位点加上两个附加核苷酸(5′-CCATGGGC-3′)。
融合蛋白是通过如Sambrook等2001,MolecularCloning:ALaboratoryManual描述的标准克隆技术连接至少两个核酸分子来构建的。因此在用相应的限制性酶NdeI和BamHI的消化中切割这些编码肽段的核酸分子，而在编码肽段寿司1的核酸分子的情况下，用限制性酶NcoI和BamHI进行消化。然后将经切割的编码肽段的核酸连接入之前也用相应的限制性酶NdeI和BamHI消化而切割的pET21b表达载体(Novagen,Darmstadt,Germany)。将切割的编码肽段寿司I的核酸分子连接入之前也用相应的限制性酶NcoI和BamHI消化而切割的经修饰的pET32b表达载体(未修饰的载体可从Novagen,Darmstadt,Germany获得)。pET32b表达载体的修饰指缺失编码S标记和中央His标记的序列。
之后，在用限制性酶BamI和XhoI的消化中切割编码细胞内溶素KZ144的核酸分子，从而使得该细胞内溶素可分别连接入pET21b表达载体(Novagen,Darmstadt,Germany)和修饰的pET32b表达载体，所述载体之前也经相应的限制性酶BamHI和XhoI消化而切割。在用限制性酶BamI和XhoI消化中切割编码细胞内溶素STM0016的核酸分子和编码细胞内溶素N4gp61的核酸分子，从而使得相应的细胞内溶素可连接入pET21b表达载体(Novagen,Darmstadt,Germany)。
如此，将编码肽段的核酸分子在编码细胞内溶素KZ144或STM0016的核酸分子的5’端连接入相应的载体。此外，将编码细胞内溶素KZ144或STM0016的核酸分子连接入相应的质粒，从而使得编码由六个组氨酸残基组成的His标记的核酸分子与编码所述细胞内溶素的核酸分子的3’端相联。
因为一些融合蛋白可能在细菌中表达时具毒性，或由于蛋白降解而为非纯系的，策略可为将这些融合蛋白融合或连接于其他附加的蛋白质来进行表达。这些其他附加的蛋白质的实例是硫氧还蛋白，其显示在大肠杆菌中介导有毒的抗微生物肽的表达(TrxAmediatingfusionexpressionofantimicrobialpeptideCM4frommultiplejoinedgenesinEscherichiacoli.ZhouL,ZhaoZ,LiB,CaiY,ZhangS.ProteinExprPurif.2009Apr；64(2):225-230)。在融合蛋白由N端寿司1肽和细胞内溶素KZ144组成的情况下，将该寿司1肽连接入经修饰的pET32b表达载体，从而使得附加的硫氧还蛋白与寿司1肽的5’端相联。该硫氧还蛋白可使用肠激酶从表达的融合蛋白去除，因此在编码寿司肽的核酸分子和编码硫氧还蛋白的核酸分子之间导入肠激酶限制性位点。
细胞内溶素-肽-融合物的序列通过DNA测序来控制，并将正确的克隆转化入大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen,Darmstadt,Germany)以供蛋白表达。
SEQIDNO:77至90的融合蛋白的重组表达是在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS和大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Novagen,Darmstadt,Germany)中进行的。生长细胞直至达到0.5-0.8的OD600nm光密度。然后用1mMIPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导融合蛋白的表达，且表达在37℃进行4小时的时间。
大肠杆菌BL21细胞通过以6000g离心20分钟收获，并通过在冰上声处理来破坏。通过离心分离大肠杆菌粗提取物的可溶性和不溶性级分(Sorvall,SS34,30min,15000rpm)。所有的蛋白质通过Ni2+亲和层析(AktaFPLC,GEHealthcare)使用pET21b或pET32b载体编码的C端6xHis标记来纯化。
如上所述，一些融合蛋白是使用修饰的pET32b载体(缺失leS标记和中央His标记)来表达的，其在目标蛋白的N端融合了硫氧还蛋白。该载体还在目标蛋白之前包含肠激酶切割位点。该位点允许硫氧还蛋白和目标蛋白之间的蛋白质水解切割，目标蛋白可通过剩余的C端His标记纯化。对于融合蛋白寿司1-Kz144的抗微生物功能，可能需要通过蛋白质水解切割去除硫氧还蛋白。因此，用2-4单位/mg重组肠激酶(Novagen,Darmstadt,Germany)遵循生产商提供的实验方案切割融合蛋白以去除硫氧还蛋白。在肠激酶切割之后，通过如下所述的His标记纯化来纯化融合蛋白。
Ni2+亲和层析在4个下述步骤中进行，所有均在室温进行：
1.用多至10个柱体积的WashingBuffer(20mM咪唑,1MNaCl和20mMHepes,pH7.4)在3-5ml/分钟的流速平衡HistrapFF5ml柱(GEHealthcare)。
2.将总裂解液(含所需的融合蛋白)以3-5ml/分钟的流速加载于HistrapFF5ml柱上。
3.用多至10个柱体积的WashingBuffer洗涤柱以去除未结合的样品，继以用10％Elutionbuffer(500mM咪唑,0.5MNaCl和20mMHepes,pH7.4)以3-5ml/分钟的流速的第二洗涤步骤。
4.用4个柱体积的ElutionBuffer(500mM咪唑,0.5MNaCl和20mMHepes,pH7.4)的至100％的线性梯度以3-5ml/分钟的流速将结合的融合蛋白从柱洗脱。
如在SDS-PAGE凝胶上肉眼确定，融合蛋白在ElutionBuffer(20mMHepespH7.4；0.5MNaCl；500mM咪唑)中的纯化的储液为至少90％纯(数据未显示)。
实施例4：用多种肽段在N端修饰的细胞内溶素KZ144的抗微生物活性
如实施例1中所述构建由KZ144和肽段α4螺旋组成的融合蛋白。如实施例3中所述构建由KZ144和相应肽段组成的其他融合蛋白。
使用大肠杆菌DSMZ11753，鲍氏不动杆菌DSMZ30007和铜绿假单胞菌PAO1p细胞(烧伤分离物(Burnwoundisolate),QueenAstridHospital,Brussels；PirnayJP等(2003),JClinMicrobiol.,41(3):1192-1202)作为测试菌株。将过夜培养物在新鲜LB培养基中稀释10倍，并生长至OD600＝0.6。将培养物旋下(spindown)并在稀释缓冲液(10mMHEPES,0.5mMEDTA；pH7.4)中稀释10倍。将细菌在室温与每种10μg未透析的融合蛋白以缓冲液(20mMNaH2PO4-NaOHpH7.4；0.5MNaCl；0.5M咪唑)中100μg/ml的终浓度温育。在1小时之后在PBS中制备细胞稀释系列，并铺板于LB上。此外，阴性对照使用缓冲液(20mMNaH2PO4-NaOHpH7.4；0.5MNaCl；0.5M咪唑)铺板。在37℃过夜温育之后对残余菌落进行计数。基于计数的细胞数，以对数单位计算了抗细菌活性(＝log10N0/Ni，其中N0＝未处理的细胞数而Ni＝经处理的细胞数)(表11)。所有样品至少重复四次。
这些融合蛋白的抗微生物活性在下表中给出。
表11：用多种肽段修饰的KZ144针对革兰氏阴性细菌的抗微生物活性
缩写：±<1log；+：1log；++：2-3log；+++：4或更多log；n.d.意味着该菌株未用相应的融合蛋白测试。
实施例5：用多种肽段在N端修饰的细胞内溶素STM0016的抗微生物活性
如实施例3中所述构建由STM0016和肽段SarcotoxinIA或SMAP-29组成的融合蛋白。
使用大肠杆菌DSMZ11753，鼠伤寒沙门氏菌DSMZ17058和铜绿假单胞菌PAO1p细胞(烧伤分离物(Burnwoundisolate),QueenAstridHospital,Brussels；PirnayJP等(2003),JClinMicrobiol.,41(3):1192-1202)作为测试菌株。如实施例4中所述检查由细胞内溶素STM0016和肽SarcotoxinIA或SMAP-29组成的融合蛋白的抗微生物活性。这些融合蛋白的抗微生物活性在下表中给出：
表12：
缩写：+：1log；n.d.意指该菌株并未用相应的融合蛋白测试。
实施例6：用肽段在N端修饰细胞内溶素N4gp61的抗微生物活性
如实施例3中所述构建了由N4gp61和肽段SMAP-29组成的融合蛋白。
使用大肠杆菌DSMZ11753，鼠伤寒沙门氏菌DSMZ17058和铜绿假单胞菌PAO1p细胞(烧伤分离物(Burnwoundisolate),QueenAstridHospital,Brussels；PirnayJP等(2003),JClinMicrobiol.,41(3):1192-1202)作为测试菌株。如实施例4中所述检查由细胞内溶素N4gp61和肽SMAP-29组成的融合蛋白的抗微生物活性。这些融合蛋白的抗微生物活性在下表中给出：
表13：
缩写：+：1log；n.d.意指该菌株并未用相应的融合蛋白测试。
实施例7：用肽段在N端修饰细胞内溶素gp188的抗微生物活性
如实施例1所述构建由细胞内溶素gp188和肽段α4螺旋、SMAP-29或SarcotoxinIA组成的融合蛋白。使用大肠杆菌DSMZ11753，鲍氏不动杆菌DSMZ30007和铜绿假单胞菌PAO1p细胞(烧伤分离物(Burnwoundisolate),QueenAstridHospital,Brussels；PirnayJP等(2003),JClinMicrobiol.,41(3):1192-1202)作为测试菌株。如实施例4中所述检查由细胞内溶素gp188和相应的肽段组成的融合蛋白的抗微生物活性。这些融合蛋白的抗微生物活性在下表中给出。
表14：
缩写：±<1log；+：1log；++：2-3log；n.d.意指该菌株并未用相应的融合蛋白测试。
实施例8：用肽段SMAP-29在N端修饰的沙门氏菌属细胞内溶素的抗微生物活性
类似实施例3构建了由具有SEQIDNO:3氨基酸序列的沙门氏菌属细胞内溶素和肽段SMAP-29组成的融合蛋白。使用大肠杆菌DSMZ11753和鼠伤寒DSMZ17058作为测试菌株。如实施例4中所述检查融合蛋白的抗微生物活性。这种融合蛋白的抗微生物活性在下表中给出。
表15：
缩写：+：1log；
实施例9：用多种肽段在N端修饰的鲍氏不动杆菌细胞内溶素的抗微生物活性
类似实施例3构建了由具有SEQIDNO:5氨基酸序列的鲍氏不动杆菌细胞内溶素和肽段SMAP-29、Pseudin1和寿司1组成的融合蛋白。使用鲍氏不动杆菌DSMZ30007和铜绿假单胞菌PAO1p细胞(烧伤分离物(Burnwoundisolate),QueenAstridHospital,Brussels；PirnayJP等(2003),JClinMicrobiol.,41(3):1192-1202)作为测试菌株。如实施例4中所述检查融合蛋白的抗微生物活性。这些融合蛋白的抗微生物活性在下表中给出。
表16：
缩写：±<1log；+：1log；++：2-3log；n.d.意指该菌株并未用相应的融合蛋白测试。
亦用如上所述的活性测定测试不具有任何标记和接头的表11至16的融合蛋白。其均显示针对所用细菌菌株的抗微生物活性(数据未显示)。

Claims (25)

1.一种融合蛋白，包含具有降解革兰氏阴性细菌细胞壁活性的酶和在N端或C端或两端融合于该酶的肽段，其中所述肽段为两亲肽、寿司肽(sushipeptide)、防卫素、疏水肽或抗微生物肽。
2.权利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白呈现SEQIDNO:63至90的氨基酸序列。
3.权利要求1或2的融合蛋白，其中所述融合蛋白在N端呈现附加的氨基酸残基。
4.前述任一项权利要求的融合蛋白，其中所述融合蛋白在C和/或N端包含标记或其他蛋白质。
5.权利要求4的融合蛋白，其中所述标记或其他蛋白通过一个或多个附加的氨基酸残基连接于所述融合蛋白。
6.前述任一项权利要求的融合蛋白，其中所述肽段通过一个或多个附加的氨基酸残基连接于所述融合蛋白。
7.权利要求1的融合蛋白，其中所述酶是细胞内溶素、自溶素或细菌素。
8.权利要求7的融合蛋白，其中所述酶呈现SEQIDNO:22-25的氨基酸序列。
9.权利要求1的融合蛋白，其中所述两亲肽呈现SEQIDNO:6至16或26至31的氨基酸序列。
10.权利要求1的融合蛋白，其中所述寿司肽呈现SEQIDNO:32的氨基酸序列。
11.权利要求1的融合蛋白，其中所述疏水肽呈现SEQIDNO:28、33或35的氨基酸序列。
12.前述任一项权利要求的融合蛋白，其中所述革兰氏阴性细菌选自下组：
肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，
特别是埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、摩根氏菌属(Morganella)、变形杆菌属(Proteus)、普罗维登斯菌属(Providencia)、沙雷氏菌属(Serratia)和耶尔森氏菌属(Yersinia)，
假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，
特别是假单胞菌属(Pseudomonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和丛毛单胞菌属(Comamonas)，
奈瑟氏菌属(Neisseria)、莫拉氏菌属(Moraxella)、弧菌属(Vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)、布鲁氏菌属(Brucella)、弗朗西丝氏菌属(Francisella)、博德特氏菌属(Bordetella)、军团菌属(Legionella)、巴尔通氏体属(Bartonella)、考克斯氏体属(Coxiella)、嗜血菌属(Haemophilus)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、曼氏菌属(Mannheimia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、加德纳氏菌属(Gardnerella)，
螺旋体科(Spirochaetaceae)，
特别是密螺旋体属(Treponema)和疏螺旋体属(Borrelia)，
钩端螺旋体科(Leptospiraceae)，弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、螺菌属(Spirillum)、链杆菌属(Streptobacillus)，
类杆菌科(Bacteroidaceae)，
特别是拟杆菌属(Bacteroides)、梭杆菌属(Fusobacterium)、普雷沃氏菌属(Prevotella)和卟啉单胞菌属(Porphyromonas)，和
不动杆菌属(Acinetobacter)，
特别是鲍氏不动杆菌(A.baumanii)。
13.权利要求1的融合蛋白，其中所述两亲肽包含至少一种选自下组的荷正电的氨基酸残基：赖氨酸、精氨酸和组氨酸残基，结合于至少一种选自下组的疏水氨基酸残基：缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基。
14.权利要求1的融合蛋白，其中所述两亲肽中至少约70％的所述氨基酸残基是精氨酸或赖氨酸残基，且至少所述两亲肽中所述氨基酸残基的至少约30％是缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸或甘氨酸残基。
15.前述任一项权利要求的融合蛋白，其中所述肽段包含约5至约100个氨基酸残基，特别是约5至50个氨基酸残基，特别是约5至30个氨基酸残基。
16.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1至15任一项的融合蛋白。
17.一种载体，其包含权利要求16的核酸分子。
18.一种宿主细胞，其包含权利要求16的核酸分子或权利要求17的载体。
19.权利要求18的宿主细胞，其中所述细胞是细菌细胞或酵母细胞。
20.权利要求1至15任一项的融合蛋白作为药物、诊断手段或美容用物质的用途。
21.权利要求1至15任一项的融合蛋白用于治疗或预防革兰氏阴性细菌感染的药物的用途。
22.权利要求1至15任一项的融合蛋白用作消毒剂。
23.权利要求1至15任一项的融合蛋白用于处理和/或阻止食品、食物加工装置、食品加工厂、与食品相接触的表面、医疗装置、医院和手术中的表面的革兰氏阴性细菌污染的用途。
24.权利要求1至15任一项的融合蛋白作为诊断手段在医疗、食物或饲料或者环境诊断中的用途。
25.药物组合物，其包含权利要求1至15任一项的融合蛋白。
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