CN105435868A - 定量检测全血中肌钙蛋白i的磁微粒化学发光微流控芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种定量检测全血中肌钙蛋白I的磁微粒化学发光微流控芯片，所述微流控芯片包括顶板(1)结构和底板(2)结构，其中顶板(1)上的气泵(3)、加样口(4)、样本填充区(12)、标记抗体存储池(5)和样本混合区(13)依次连接；底板上的过滤区(6)、磁颗粒包被区(7)、清洗区(14)、检测区(8)、液体释放通道(16)依次连接；底板的检测区(8)分别与清洗液存储池(9)和发光基底液存储池(10)通过液体释放通道(16)连接。

Description

定量检测全血中肌钙蛋白I的磁微粒化学发光微流控芯片

技术领域

本发明涉及一种利用磁微粒化学发光技术和微流控芯片技术实现全血样本中cTnI高灵敏定量检测的方法，特别公开了一种定量检测全血中肌钙蛋白I的磁微粒化学发光微流控芯片，可实现全血样本中cTnI的准确、高灵敏定量检测，属于微流控芯片化学发光免疫检测技术领域。

背景技术

当前我国心血管疾病的防控形势依然严峻，心血管疾病发病率呈不断上升态势。据统计，心血管病死亡率占人口死亡的40％，因此做好早发现、早预防、早救治，提高心血管病防治水平是关键。心血管疾病传统检测项目大多为心肌酶谱。但存在酶活性升高出现较晚、特异性较差和持续时间短等不足。而心肌肌钙蛋白是唯一存在于心肌的收缩蛋白，对心肌坏死有高度敏感性和特异性。

心肌肌钙蛋白是由cTnI、cTnC和cTnT三种，在肌肉舒张和收缩过程中起重要调节作用。但cTnC无心肌特异性，一般不用于心肌损伤检测。正常状态下cTnI和cTnT均不能穿透细胞膜进入血液，所以健康人血中cTnI和cTnT极低；如心肌细胞受损，cTnI和cTnT进人细胞间质和血液。在肾衰竭、肺炎和败血症等疾病中，血液中cTnT含量也可升高，所以其特异性不如cTnI。cTnI在发病后3～5小时升高，15～24小时达高峰，持续时间久，5～10天后可降至正常。cTnI是目前最好的心肌损伤标志物之一。

传统上多用酶联免疫法、化学发光法和免疫层析法(试纸条)等检测cTnI。但酶联免疫法操作复杂，检测时间长；化学发光法需配套大型昂贵仪器，测试时间长，不易实现快速即时检测。胶体金免疫层析法虽简便快速，但重复性差、灵敏度低，容易出现误判。

中国专利200780015772.0公布了一种肌钙蛋白高灵敏分析系统，采用微量滴定板(微孔板)进行检测，灵敏度高，但操作复杂、测试时间长、检测范围窄。中国专利200610028913.X描述了一种以胶体金免疫层析技术实现对cTnI检测的试剂盒，但只能进行定性检测，而无法定量。中国专利201010619731.6公开了一种全程定量检测cTnI的免疫层析试纸条，以荧光胶乳微粒替代胶体金，实现对cTnI的定量检测，但仍无法解决试纸条重复性差等缺陷。

因此开发快速、准确、灵敏度高的检测方法，具有巨大发展潜力和应用前景。与荧光和吸收光相比，化学发光没有外来激发光源背景信号干扰，交叉干扰小，灵敏度高、线性范围宽。微流控芯片技术把样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，可完成全过程分析。

针对现有cTnI检测方法的不足和缺陷，微流控磁微粒化学发光方法利用磁微粒化学发光和微流控技术，可实现对cTnI准确、高灵敏定量检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题为针对现有快速诊断方法灵敏度低、重复性差、受干扰明显，以及现有化学发光配套仪器昂贵、检测时间长的问题，提供一种定量检测全血中肌钙蛋白I的磁微粒化学发光微流控芯片，通过集成化芯片(把除测试样本外所有组分均集成到芯片内)并配套小型便携设备，从而实现现场全血样本中cTnI的快速、准确、高灵敏定量检测。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：

一种定量检测全血中肌钙蛋白I的磁微粒化学发光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括顶板(1)结构和底板(2)结构，其中顶板(1)上气泵(3)、加样口(4)、样本填充区(12)、标记抗体存储池(5)和样本混合区(13)依次连接；底板上过滤区(6)、磁颗粒包被区(7)、清洗区(14)、检测区(8)、液体释放通道(16)依次连接；底板的检测区(8)分别与清洗液存储池(9)和发光基底液存储池(10)通过液体释放通道(16)连接；

所述标记抗体存储池(5)存储预封装酶或发光剂标记抗cTnI抗体，磁颗粒包被区(7)包被预封装磁颗粒标记抗cTnI抗体，清洗液存储池(9)和发光基底液存储池(10)存储预封装清洗液和发光基底液；所述微流控芯片测试流程中，用磁铁操控磁颗粒移动或聚集；所述标记抗体存储池、清洗液存储池和发光基底液存储池为液体密封池，可通过外力挤压而局部破裂，释放液体；所述过滤区包含滤血膜所述顶板(1)与底板(2)用胶带(19和20)密封。

具体地，本发明所述的微流控芯片，发光基底液保质期少于1年时应分开，用发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)替代发光基底液存储池(10)，所述发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)通过预混合通道(25)连接。

具体地，本发明所用磁颗粒包含铁、钴、镍的化合物，主要包含但不限于三氧化二铁和四氧化三铁化合物。优选磁颗粒为聚苯乙烯为壳，三氧化二铁为核的颗粒，磁颗粒尺寸和磁铁的磁感应强度对检测结果有明显的影响。

具体地，所述磁颗粒标记抗cTnI抗体使用的磁颗粒尺寸为0.1～10μm；与磁珠匹配的磁铁磁感应强度为500～30000高斯。

优选地，所述磁颗粒标记抗cTnI抗体使用的磁颗粒尺寸为0.5～3μm，与磁珠匹配的磁铁磁感应强度为1000～8000高斯。

具体地，所述酶或发光剂标记cTnI抗体溶液、磁颗粒标记cTnI抗体溶液和清洗液均包含缓冲液、蛋白质、表面活性剂和防腐剂，且发光剂标记cTnI抗体溶液还包含甘油，磁颗粒标记cTnI抗体溶液还包含糖类。

具体地，所述酶标记cTnI抗体溶液包含牛血清白蛋白(BSA)、吐温-20和Proclin300的硼酸缓冲液；磁颗粒标记cTnI抗体溶液包含BSA、葡萄糖、吐温-20和Proclin300的硼酸缓冲液；所述清洗液包含BSA、吐温-20和Proclin300的硼酸缓冲液。

具体地，所述发光剂标记cTnI抗体溶液包含BSA、甘油、吐温-20、曲拉通X-100和叠氮钠的磷酸盐缓冲液；所述磁颗粒标记cTnI抗体溶液包含BSA、酪蛋白、蔗糖、吐温-20、曲拉通X-100和叠氮钠的磷酸盐缓冲液；所述清洗液包含BSA、吐温20、曲拉通X-100、聚乙二醇和叠氮钠的磷酸盐缓冲液。

具体地，所述发光基底液包含与酶对应的底物及发光增强液，可合并后注入发光基底液存储池(10)，或分别注入发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)。

具体地，所述发光基底液包含发光剂对应的双氧水溶液和碱性溶液，可合并后注入发光基底液存储池(10)，或分别注入发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)。

本发明所述微流控芯片制备方法如下：

步骤1)酶或发光剂标记抗cTnI抗体，磁颗粒标记抗cTnI抗体，这两种抗体可相同或不同；

步骤2)将酶或发光剂标记抗体溶液放入顶板的标记抗体存储池中，密封，将磁颗粒标记抗体溶液放入底板的包被区中，干燥，将清洗液和发光基底液分别注入清洗液存储池和发光基底液存储池中，密封，将顶板和底板组装成微流控芯片。

本发明提供的一种定量检测全血中肌钙蛋白I的磁微粒化学发光微流控芯片是一种以化学发光为基础、在微流控芯片上实现cTnI快速、准确、高灵敏检测的微流控芯片。

这种芯片是将抗cTnI抗体修饰酶，抗cTnI抗体修饰在磁颗粒上，利用抗原抗体作用，如双抗体夹心法原理结合磁颗粒富集、化学发光检测全血样本中是否含有cTnI，并准确分析其含量。

本发明中所述酶，包含但不限于过氧化氢酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)。发光基底液为酶对应的发光底物(如鲁米诺或金刚烷)和发光增强液(如苯衍生物等增强剂)，其中发光底物和发光增强液可合并，如图1所示混合均匀后注入一个发光基底液存储池(10)；但当混合液保质期少于1年时应分开，如图3所示分别注入发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)，如图3所示，测试时通过预混合通道(25)混合均匀，再流入检测区参与反应。本发明一个实施例采用辣根过氧化物酶(HRP)。

本发明所述发光剂，包含但不限于吖啶酯和吖啶磺酰胺。发光剂与发光基底液作用后，不需酶的催化作用，直接参与发光反应。本发明的一个实施例采用吖啶酯。发光基底液包含H₂O₂溶液和碱性溶液，可合并成碱性H₂O₂溶液，注入发光基底液存储池(10)；但混合后不稳定时，双氧水溶液和碱性溶液应分别注入发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)，如图3所示，测试时先通过预混合通道(25)混合均匀，再流入检测区参与反应。

本发明的cTnI抗体包含单克隆抗体和多克隆抗体。该抗体可与cTnI结合(如双抗体夹心法)。其中酶或发光剂标记的抗体与磁颗粒标记的抗体可以相同，也可以不同。

本发明的酶或发光剂标记抗体溶液和磁颗粒标记抗体溶液均包含缓冲液、蛋白质、表面活性剂和防腐剂，且磁颗粒标记抗体溶液还包含糖类。其中HRP标记抗体，缓冲体系中不能含有NaN₃；ALP标记抗体，缓冲体系不能是磷酸体系。

本发明的微流控芯片的顶板和底板的成型材料为聚合物，包含但不限于聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、环氧树脂等。双面胶带可由两张单面胶带代替。如图1所示，顶板结构由气泵(3)、加样口(4)、标记抗体存储池(5)、盖子(11)、样本填充区(12)和样本混合区(13)组成。底板结构由过滤区(6)、磁颗粒包被区(7)、检测区(8)、清洗液存储池(9)、发光基底液存储池(10)、清洗区(14)、废液池(15)和液体释放通道(16)。如图2所示，在发光基底液和清洗液存储池区域，以及磁铁滑轨区域，在顶板上需留出存储池和磁铁滑轨的让位孔(分别为17和18)，在双胶带上应留出存储池和样本混合液流入过滤区时的让位孔(分别为21和22)，让位孔的作用是让开一定的区域，不干扰液体流路，或配套仪器部件作用于微流控芯片的通路。

本发明的存储池为液体密封池，所用密封材料包含玻璃、塑料、橡胶、铝箔和高阻隔薄膜，其中密封材料可为同种材料组成，也可为多种材料组合而成。在物理挤压下，存储池可局部破裂，从而把密封的液体释放出来。其中酶标cTnI抗体存储池、清洗液存储池、发光基底液存储池可采用相同或不同材料和方法制作。在本发明的一个实施例中，酶标cTnI抗体存储池、清洗液存储池、发光基底液存储池均采用塑料和弹性橡胶密封而成。本发明的另一个实施例中，酶标cTnI抗体存储池采用塑料和弹性橡胶密封而成，而清洗液存储池、发光基底液存储池采用高阻隔薄膜密封而成。

本发明的过滤区包含滤血膜，其中滤血膜可通过物理孔径或生物/化学试剂使液体与细胞分离，实现血浆与红细胞分离，血浆流到磁颗粒包被区，而红细胞停留在滤血膜上，从而减少红细胞对试验结果的干扰。其中所述生物/化学试剂包含凝血剂等，可使红细胞间连接，形成凝块，增大尺寸，更容易被滤血膜的网状结构阻挡。

本发明的微流控芯片，当存在发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)，应在底板上增加发光基底液预混合通道(25)，该预混合通道可为蛇形通道或上下结构混合通道，如图3所示。

在一个实施例中，标记抗体存储池(5)封入HRP标记抗cTnI抗体，包被区包被磁颗粒标记抗cTnI抗体(与酶标抗体不同)，以磁微粒酶促化学发光法检测cTnI。另一个实施例中，标记抗体存储池(5)封入吖啶酯标记抗cTnI抗体，包被区包被磁颗粒标记抗cTnI抗体(与吖啶酯标记抗体不同)，以磁微粒酶促化学发光法检测cTnI含量。

本发明的清洗液，用于清洗磁颗粒，去除非特异性吸附的cTnI、酶标记物及其他影响检测结果的物质。清洗液主要包含缓冲体系、蛋白质和表面活性剂，其中缓冲体系包含但不限于硼酸盐、磷酸盐、Tris-HCl和醋酸盐等。清洗液pH6.0～10.0，当检测样本为强酸或强碱性时，pH范围可放宽。其中蛋白质包含但不限于牛血清白蛋白、酪蛋白等。其中表面活性包含但不限于可包括吐温20、吐温80、曲拉通X-100、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮等。

本发明的样本体积在10～500μl，优选20～100μl。作为优选，在实施例中加样体积为50μl。

本发明的微流控芯片为快速检测，检测时间应小于30分钟，作为优选，实施例中采用15分钟。

本发明的抗体仪器包含挤压气泵和存储池，磁铁移动，发光检测系统等功能，应可包含挤压装置、磁铁及移动装置、检测系统、控制分析模块和软件系统。

一种心肌肌钙蛋白I定量检测的磁微粒化学发光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片的测试流程包括：

步骤1)将样本滴入加样口后，盖上盖子，微流控芯片放入配套仪器中，酶或发光剂标记抗体释放后，气泵使样本和标记抗体混合均匀，然后注入底板过滤区，所述配套仪器为小型便携设备，包含挤压气泵和存储池，磁铁移动，发光检测系统等功能；

步骤2)样本经过滤区后，到达包被区，溶解磁标抗体，充分反应后磁铁收集磁颗粒，存储池释放清洗液，将磁颗粒清洗后，移至检测区，释放发光基底液，仪器检测系统检测发光信号强度，进而实现cTnI的定量检测。

本发明的核心是采用磁微粒化学发光免疫检测技术在微流控芯片实现目标物的快速、高灵敏度、准确定量检测。

微流控芯片技术是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。

本发明的微流控芯片将检测过程所需的所有试剂组分(酶标cTnI抗体、磁颗粒标记cTnI抗体、清洗液、发光基底液等)均集成、内置到微流控芯片中，并通过巧妙沟道设计，在配套仪器的操作下，实现微流控芯片的一键式检测(只需按开始键就能实现检测，无需复杂操作)，实现全血分离、免疫反应、清洗分离、化学发光检测，从而避免了现有微流控芯片中结构设计简单、检测时操作复杂等不足和缺陷。还克服了传统化学发光仪只能进行血清或血浆检测，而不能对全血样本进行检测的缺点。

由于磁颗粒易沉淀，传统化学发光仪采用手工混合，并以持续振荡维持磁颗粒的悬浮状态，但微流控芯片内磁颗粒混均操作难以在小型便携仪器中实现。

本发明将磁颗粒包被、干燥于微流控芯片沟道中，并设计了磁铁主动驱动磁颗粒(而传统微流控芯片一般采用流体驱动或电驱动)，从而使磁颗粒复溶，并在微流控芯片不同区域实现免疫反应、清洗、发光。此设计不仅解决了磁颗粒应用于微流控芯片时易沉淀、重复性差等问题，还实现了更可控的免疫反应和物理清洗，提高了灵敏度和重复性。

本发明中微流控芯片配套仪器与微流控芯片无液体接触，无需要清洗的部件，避免了传统大型化学发光仪需要搅拌或加样、清洗等操作而产生的交叉干扰及污染。

所以本发明并非简单叠加磁微粒化学发光技术和微流控芯片技术，而是通过液体密封设计、沟道设计，把检测所需所有化学组分集成、内置到微流控芯片中，并以磁铁主动驱动，实现一键式的磁微粒化学发光免疫检测，从而在便携配套仪器中实现全血中cTnI的快速、高灵敏度、准确定量检测。

本发明可应用于心血管疾病尤其是心力衰竭中cTnI的定量检测。

本发明的主要优点如下：

1)本发明采用化学发光方法，具有背景低、灵敏度高、线性范围宽的优点。

2)本发明采用磁颗粒技术，具有磁富集功能，增强并放大信号；并能利用磁铁把磁颗粒转移区域(如由包被区-清洗区-检测区)，减少样本基质的影响。

3)本发明采用微流控芯片技术，把样本混合、反应、分离和检测集成在芯片上，并把反应所需的所有试剂组分集成到芯片上。

4)本发明操作简便，检测时，只需加入样本，盖上盖子，把芯片放入小型便携配套仪器中即可。

5)本发明配套仪器是小型便携仪器，仪器只与芯片发生物理接触，芯片内液体不与仪器接触，不会污染仪器而产生交叉干扰。

附图说明

图1为脑钠肽定量检测微流控芯片主体结构示意图，其中1为顶板，2为底板，3为气泵，4为加样口，5为标记抗体存储池，6为过滤区，7为磁颗粒包被区，8为检测区，9为清洗液存储池，10为发光基底液存储池，11为盖子，12为样本填充区，13为样本混合区，14为清洗区，15为废液池，16为液体释放通道，17为发光基底液和清洗液存储池让位孔(于顶板)，18为磁铁滑轨让位孔。

图2为脑钠肽定量检测的完整微流控芯片结构示意图，其中1为顶板，2为底板，19为双面胶带，20为单面胶带，21为发光基底液和清洗液存储池让位孔(于双面胶带)，22为混合液流入过滤区时的让位孔。

图3为双发光基底液的微流控芯片底板结构示意图，其中23为发光基底液存储池A，24为发光基底液存储池B，25为预混合通道。

具体实施方式

本发明公开了一种cTnI定量检测的微流控磁微粒化学发光方法及其专用微流控芯片，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：酶促化学发光测定cTnI

(一)抗体标记

取50μgHRP溶解于1mL蒸馏水中，再加入10μmol新配NaIO₄溶液，室温避光反应20min后，以1mMpH4.4醋酸钠缓冲液透析纯化溶液。再以pH9.5碳酸盐缓冲液将pH调至9.0，加入100μg抗cTnI单抗，室温避光反应2h。加0.1mL4mg/mL新配NaBH₄，混匀后于4℃反应2h。将上述溶液装入透析袋，以0.15MpH7.4PBS透析，4℃过夜，得到HRP标记cTnI抗体。

向pH7.4磷酸缓冲液中加入1mg磁颗粒(直径为2μm)、10μgEDC和15μgNHS溶液和10～30μg抗cTnI单抗(与HRP标记的抗体不同)溶液，混合均匀并于室温下反应4h，加入1mg甘氨酸封闭。以磁铁富集纯化，去除未反应的cTnI单抗，得到磁颗粒标记cTnI抗体。

(二)微流控芯片组装

HRP标记cTnI抗体溶液中含1％BSA、0.2％吐温20和0.05％Proclin300的pH7.4硼酸缓冲液；磁颗粒标记cTnI抗体溶液为包含0.5％BSA、2％葡萄糖、1％吐温-20和0.05％Proclin300的pH7.4硼酸缓冲液。

将HRP标抗体溶液放入顶板标记抗体存储池中，密封。将磁标抗体溶液放入底板磁颗粒包被区中，室温干燥。

清洗液为0.3％BSA、0.2％吐温-20和0.03％Proclin300的pH7.2硼酸缓冲液。将清洗液注入清洗液存储池。发光基底液分为HRP底物(鲁米诺的双氧水溶液)和碱性增强液(苯衍生物的碱性溶液)，分别注入发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)中，密封。按图1所示，将过滤区粘入底板中。然后按图2所示，以单面胶带和双面胶带，将顶板和底板组装成微流控芯片。装入铝箔袋中，密封4°保存。

(三)样本检测

用正常人血浆作稀释液，将cTnI标准品稀释成如下浓度：0pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、500pg/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml和50ng/ml。

将50μl样本滴入加样口后，盖上盖子。将微流控芯片放入配套仪器(磁铁磁感应强度为6000高斯)中，仪器挤出HRP标记单抗，并使样本和HRP标记单抗混合均匀后注入底板过滤区。样本过滤后，到达微通道，并溶解磁颗粒标记单抗，磁铁加速样本反应，形成HRP标记单抗-cTnI抗原-磁颗粒标记单抗的三明治结构，然后磁铁收集磁颗粒。存储池释放清洗液，将磁颗粒清洗后，发光基底液释放，仪器检测系统检测发光信号强度。总检测时间15min。每个样本分别用3个微流控芯片测定3次，取平均值，绘制标准曲线。

将50μl全血样本滴入加样口，15分钟内仪器检测系统检测发光信号强度，依据标准曲线获得样本中cTnI浓度。

检测原理为：当全血加入微流控芯片后，全血先与HRP标记抗体混合，然后经过滤区后，混合了HRP标记抗体的血浆到达微通道，血浆溶解磁标记抗体。当血样中含有cTnI，则形成HRP标记抗体-cTnI-磁颗粒标记抗体的三明治结构(双抗体夹心法)。经清洗后，再发光基底液作用下发光，仪器检测系统测试发光信号。依据配套仪器获取的标准曲线，进而分析血样中cTnI浓度。样本中cTnI含量越高，则发光信号越强。

结果表明，其最低检测限为50pg/ml，最低定量限为200pg/ml，定量检测范围为0.05～50ng/ml，线性相关系数R²＞0.99；在检测范围内，未出现HOOK效应；且批内与批间重复性均小于10％。可为心梗心衰疾病诊断提供参考。

实施例2：直接化学发光测定cTnI

(一)抗体标记

向磷酸缓冲液中加入适量活化的吖啶酯和100μg抗cTnI单抗溶液，混合均匀后于室温下反应3h，加入1mg甘氨酸封闭。透析分离纯化，得到吖啶酯标记cTnI抗体。

向1ml10mMpH7.4磷酸缓冲液中加入1mg磁颗粒(直径为1μm)、20μgEDC和20μgNHS溶液和30μg链霉亲和素，混合均匀并于室温下反应4h，加入1mg甘氨酸封闭。以磁铁吸附富集，去除未反应的链霉亲和素，得到磁颗粒标记链霉亲和素。

将20μg抗cTnI单抗加入10μL0.25mg/mLSulfo-NHS-LC-biotin溶液中，反应1h。超滤离心纯化，去除未反应的生物素，得到biotin-cTnI抗体。

通过亲和素-生物素间的相互作用，把抗cTnI抗体连接到磁颗粒表面，得到磁颗粒标记cTnI抗体。其中亲和素标记的磁颗粒和生物素化的抗体比例在1∶10⁴～2∶10⁵。

(二)微流控芯片组装

吖啶酯标记cTnI抗体溶液中含0.5％BSA、1％甘油、0.2％吐温20、1％曲拉通X-100和0.1％叠氮钠的pH7.4磷酸盐缓冲液；磁颗粒标记cTnI抗体溶液为包含0.2％BSA、0.2％酪蛋白、1％蔗糖、0.5％吐温20、0.5％曲拉通X-100和0.1％叠氮钠的pH7.4磷酸盐缓冲液。将吖啶酯标记抗体溶液放入顶板标记抗体存储池中，密封。将磁标抗体溶液放入底板磁颗粒包被区中，室温干燥。

清洗液为0.3％BSA、0.5％吐温20、1％曲拉通X-100和0.02％叠氮钠的pH7.2磷酸盐缓冲液。将清洗液注入清洗液存储池。发光基底液分为包含双氧水溶液和碱性溶液，分别注入发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)，密封。按图1所示，将滤血膜粘入底板过滤区中，将存储池内置入底板。然后按图2所示，以单面胶带和双面胶带，将顶板和底板组装成微流控芯片。装入铝箔袋中，密封4°保存。

(三)样本检测

用正常人血浆作稀释液，将cTnI标准品稀释成如下浓度：0pg/ml、100pg/ml、500pg/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml和50ng/ml。

将50μl样本滴入加样口后，盖上盖子。将微流控芯片放入配套仪器(磁铁磁感应强度为4000高斯)中，仪器挤出吖啶酯标记单抗，并使样本和吖啶酯标记单抗混合均匀后注入底板过滤区中。样本过滤后，到达微通道，并溶解磁颗粒标记单抗，磁铁加速样本反应，形成吖啶酯标记抗体-cTnI抗原-磁颗粒标记抗体的三明治夹心结构，然后磁铁收集磁颗粒。存储池释放清洗液，将磁颗粒清洗后，发光激发液释放，仪器检测系统检测发光信号强度。总检测时间15min。每个样本分别用3个微流控芯片测定3次，取平均值，绘制标准曲线。

将50μl血浆样本滴入加样口，15分钟内仪器检测系统检测发光信号强度，依据标准曲线获得样本中cTnI浓度。

检测原理为：当全血加入微流控芯片后，全血先与吖啶酯标记抗体混合，然后经过滤区后，混合了吖啶酯标记抗体的血浆到达微通道，血浆溶解磁标记抗体。当血样中含有cTnI，则形成吖啶酯标记抗体-cTnI-磁颗粒标记抗体的三明治结构(双抗体夹心法)。经清洗后，发光激发液释放，经混合后与吖啶酯作用产生直接化学发光，仪器检测系统测试发光信号。依据配套仪器获取的标准曲线，进而分析血浆中cTnI浓度。血浆中cTnI含量越高，则发光信号越强。

结果表明，其最低检测限为80pg/ml，最低定量限为300pg/ml，定量检测范围为0.08～50ng/ml，线性相关系数R²＞0.99；在检测范围内，未出现HOOK效应；且批内与批间重复性均小于10％。可为心梗心衰疾病诊断提供参考。

实施例3：磁微粒颗粒尺寸筛选

其他的实验条件参见实施例2，磁颗粒尺寸和磁铁磁感应强度按照以下方案进行。

颗粒尺寸为0.1μm、0.5μm、1.0μm、2.0μm、2.4μm、3μm、10μm。磁铁磁感应强度为500高斯、1000高斯、4000高斯、8000高斯、12000高斯、30000高斯。分别以这六种磁铁分别驱动七种尺寸的磁颗粒。

实验结果显示：0.1μm磁颗粒和500高斯磁铁组合时，其最低检测限为500pg/ml，定量检测范围为0.5～50ng/ml，线性相关系数R²＞0.95；批内与批间重复性均小于20％。即：化学发光信号较弱，灵敏度不高，重复性较差。

10μm磁颗粒和30000高斯磁铁组合时，其最低检测限为400pg/ml，定量检测范围为0.4～5ng/ml，线性相关系数R²＞0.95；批内与批间重复性均小于20％。即：阴性样本信号较高(清洗不充分)，线性范围不宽。

0.5～3μm的磁颗粒为和1000～8000高斯的磁铁组合使用时，其最低检测限均小于150pg/ml，定量检测范围可达到0.15～50ng/ml，线性相关系数R²＞0.97；批内与批间重复性均小于12％。满足为临床心梗心衰疾病诊断提供参考的需要。

根据以上结果，磁颗粒尺寸优选0.5～3μm，磁铁磁感应强度优选1000～8000高斯；磁颗粒尺寸更优选1.0～3μm，磁铁磁感应强度4000～8000高斯。可根据磁颗粒所用尺寸，进一步确定磁铁磁感应强度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种定量检测全血中肌钙蛋白I的磁微粒化学发光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括顶板(1)结构和底板(2)结构，其中顶板(1)上的气泵(3)、加样口(4)、样本填充区(12)、标记抗体存储池(5)和样本混合区(13)依次连接；底板上的过滤区(6)、磁颗粒包被区(7)、清洗区(14)、检测区(8)、液体释放通道(16)依次连接；底板的检测区(8)分别与清洗液存储池(9)和发光基底液存储池(10)通过液体释放通道(16)连接；

所述标记抗体存储池(5)存储预封装酶或发光剂标记抗cTnI抗体，磁颗粒包被区(7)包被预封装磁颗粒标记抗cTnI抗体，清洗液存储池(9)和发光基底液存储池(10)存储预封装清洗液和发光基底液；所述微流控芯片测试流程中，用磁铁操控磁颗粒移动或聚集；所述标记抗体存储池、清洗液存储池和发光基底液存储池为液体密封池，可通过外力挤压而局部破裂，释放液体；所述过滤区包含滤血膜，所述顶板(1)与底板(2)用胶带(19和20)密封。

2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于发光基底液保质期少于1年时应分开，用发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)替代发光基底液存储池(10)，所述发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)通过预混合通道(25)连接。

3.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述磁颗粒标记抗cTnI抗体使用的磁颗粒尺寸为0.1～10μm；与磁珠匹配的磁铁磁感应强度为500～30000高斯。

4.如权利要求3所述的芯片，其特征在于，所述磁颗粒标记抗cTnI抗体使用的磁颗粒尺寸为0.5～3μm，与磁珠匹配的磁铁磁感应强度为1000～8000高斯。

5.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述酶或发光剂标记cTnI抗体溶液、磁颗粒标记cTnI抗体溶液和清洗液均包含缓冲液、蛋白质、表面活性剂和防腐剂，且发光剂标记cTnI抗体溶液还包含甘油，磁颗粒标记cTnI抗体溶液还包含糖类。

6.如权利要求1或5所述的微流控芯片，其特征在于，所述酶标记cTnI抗体溶液包含牛血清白蛋白(BSA)、吐温-20和Proclin300的硼酸缓冲液；磁颗粒标记cTnI抗体溶液包含BSA、葡萄糖、吐温-20和Proclin300的硼酸缓冲液；所述清洗液包含BSA、吐温-20和Proclin300的硼酸缓冲液。

7.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述发光剂标记cTnI抗体溶液包含BSA、甘油、吐温-20、曲拉通X-100和叠氮钠的磷酸盐缓冲液；所述磁颗粒标记cTnI抗体溶液包含BSA、酪蛋白、蔗糖、吐温-20、曲拉通X-100和叠氮钠的磷酸盐缓冲液；所述清洗液包含BSA、吐温20、曲拉通X-100、聚乙二醇和叠氮钠的磷酸盐缓冲液。

8.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述发光基底液包含与酶对应的底物及发光增强液，可合并后注入发光基底液存储池(10)，或分别注入发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)。

9.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述发光基底液包含发光剂对应的双氧水溶液和碱性溶液，可合并后注入发光基底液存储池(10)，或分别注入发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)。

10.一种心肌肌钙蛋白I定量检测的磁微粒化学发光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片的测试流程包括：

步骤1)将样本滴入加样口后，盖上盖子，微流控芯片放入配套仪器中，酶或发光剂标记抗体释放后，气泵使样本和标记抗体混合均匀，然后注入底板过滤区，所述配套仪器为小型便携设备，包含挤压气泵和存储池，磁铁移动，发光检测系统等功能；

步骤2)样本经过滤区后，到达包被区，溶解磁标抗体，充分反应后磁铁收集磁颗粒，存储池释放清洗液，将磁颗粒清洗后，移至检测区，释放发光基底液，仪器检测系统检测发光信号强度，进而实现cTnI的定量检测。